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LABORWELT

Nr. 3 / 2004 - Vol. 5 Das -Themenheft

Chip-PCR: Modulares

System mit integrierter

Probenvorbereitung

Leistungsfähigkeit des

GVO-Nachweises in

Lebensmitteln

PCR & DNA-Aufreinigung

Single Molecule PCR

und mitochondriale

Rekombination

Marktübersichten:

Thermocyler &

DNA-Aufreinigung

Ultraschnelle DNA-

Amplifikation mit

Rapid-PCR

Malaria- und SNP-

Detektion mit RT-PCR

DNA-Konzentration

mit TFF

BIOCOM AG


I N T R O

Zum Thema

Patente und der Markt

für PCR und Cycler

Streit gab es schon immer, wenn es um viel Geld geht. Zum Beispiel

um die Rechte an der Polymerase-Kettenreaktion – eines der wichtigsten

Verfahren der biologischen Forschung und molekularen Diagnostik.

Branchen-Turbulenzen verursachten unlängst Urteile der Beschwerdekammer

des Europäischen Patentamtes (EPA) und des Landgerichtes

Düsseldorf.

Konnten sich im März MJ Research und Biozym noch darüber freuen,

daß das EPA Applera ein „Thermocycler-Basispatent“ (EP 0 236

069) letztinstanzlich aberkannte, drehte sich der Wind im Juni. Das

Landgericht Düsseldorf stellte fest, daß die real-time-Systeme der

Firmen gegen Appleras Patent für real-time-Thermocycler (EP 0 872

562) verstoßen. Biozym stellte daraufhin den Vertrieb der real-time-

Geräte vorerst ein.

Derzeit fechten sieben Unternehmen das besagte Applera-Patent

vor dem EPA an. Direkte Auswirkungen gab es nach dem Urteil auch

auf unsere Marktübersicht Thermocycler (siehe S. 36 ff.): Angesichts

der neuen Faktenlage wurden zahlreiche Informationen zu real-time-

Thermocyclern geschliffen und vorsorglich geändert.

Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service: online unter

www.biocom.de oder auf unserer Fax-Seite (S. 53). Wenn

Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer ankreuzen,

Name und Adresse angeben und faxen/mailen – Sie

erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten.

Unbelassen von den Rechtsstreitigkeiten winken der real-time-Diagnostik

neue Kunden durch die Einführung der Kennzeichnungspflicht

für gentechnisch veränderte Lebens- und Futtermittel (siehe

Seite 8 ff.) – denn die meisten quantitativen Tests in Europa basieren

auf real-time-PCR.

Ob sich Mikrofluidik-Lösungen im PCR-Markt durchsetzen werden,

ist derzeit noch offen. Einen fortgeschrittenen Prototypen eines

neuen modularen PCR-on-the-Chip-Systems mit integrierter Probenvorbereitung

stellen wir Ihnen ab Seite 4 vor.

Doch auch weniger aufsehenerregende Innovationen könnten dort

Einzug in die Praxis halten, wo es um Tempo geht. Ein in Jena entwickelter,

patentierter neuer Thermocycler mit verbessertem Wärmetransfer

schafft locker die doppelte bis dreifache Heiz/Kühlrate konventioneller

Cycler und ist kompatibel mit Automationsplattformen.

Demnächst wird man wohl auch in High-Impact Journals darüber

lesen können. Einen Vorgeschmack, gemeinsam mit zahlreichen

Beiträgen zur PCR und Probenvorbereitung wie etwa der Nukleinsäureaufreinigung

(S.18, 35), finden Sie ab Seite 11 ff.

Eine interessante Lektüre wünscht Ihnen

Thomas Gabrielczyk


Elektronenmikroskopische Aufnahme der Bindung von

Streptococcus pyogenes an Kollagenfasern

Foto: Manfred Rohde, Gesellschaft für Biotechnologische

Forschung, Braunschweig

Kennziffer 11 LW 03 · Informationen ordern · www.biocom.de

INHALT

B L I T Z L I C H T

Modulares Chipsystem für schnelle PCR-Analysen 4

mit integrierter Probenpräparation

Dr. Klaus-Stefan Drese et al., IMM GmbH, Mainz

B L I T Z L I C H T

Nachweis von gentechnischen Veränderungen in 8

Lebensmitteln – Möglichkeiten und Grenzen

Hermann Broll et. al, Bundesinstitut für Risikobewertung, Berlin

B L I T Z L I C H T

Ultraschnelle DNA-Amplifikation mit Rapid-PCR 11

Dr. Hanno Hermann et al., Analytik Jena AG

B L I T Z L I C H T

Highly Flexible Expression Profiling of 15

Human Genes

Peter Mouritzen et al., Exiqon, Denmark

M A R K T Ü B E R S I C H T

DNA-Aufreinigung 18

B L I T Z L I C H T

Tangentialflußfiltration zur Aufkonzentrierung

und Umpufferung linearer DNA 25

Dr. Margarete Hannappel, Millipore GmbH, Schwalbach;

Florian Sack, Mologen AG, Berlin

B L I T Z L I C H T

Resistenznachweis in der Malariadiagnostik mit 28

Real-Time PCR

Sevim Duvar et al., GBF, Braunschweig

W I S S E N S C H A F T

Rekombination humaner mitochondrialer DNA 31

Prof. Dr. Wolfram Kunz et al., Universität Bonn

W I S S E N S C H A F T

Transkriptions- und Zellzyklus-Regulation in 32

normalem und tumorigenem Brustgewebe

Prof. Dr. Ralf Hass, Medizinische Hochschule Hannover

B L I T Z L I C H T

Erhöhte Ausbeute und kurze Aufreinigungs- 34

zeit bei der Nukleinsäure-Aufreinigung

Prof. Dr. Michael Lorenz, Molzym GmbH & Co. KG, Bremen

P R O D U K T E

Neuer THEQ-Thermocycler 35

M A R K T Ü B E R S I C H T

PCR-Thermocycler 36

Stellenmarkt 44

Verbände 49

Produktwelt 50

Fax-Seite 53

Termine/Impressum 54


LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 3


B L I T Z L I C H T

Miniaturisierung


Modulares Chipsystem für

schnelle PCR-Analysen mit

integrierter Probenpräparation

Dipl.-Ing. Götz Münchow und Dr. Klaus-Stefan Drese,

Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH

und ist durch die erwähnten Heizplatten in

drei Temperaturzonen eingeteilt. Hierdurch

wird ermöglicht, die eigentliche PCR auf weniger

als 10 Minuten zu reduzieren, da das

Probenvolumen schon auf dem Weg in die

nächste Temperaturzone entsprechend temperiert

wird. Bereits zuvor wurde mit Hilfe der

computerunterstützten Flüssigkeits-Simulation

(CFD) festgestellt, daß die Probe bei geeignet

ausgeformten Kanälen innerhalb von 0,1

Sekunden die Temperatur der darunterliegenden

Heizplatte annimmt. Auch eine weitere

Beschleunigung der Analysezeit auf etwa fünf

Minuten ist daher möglich. Dies geht aber mit

einer Reduzierung der amplifizierten DNA-

Seit der Entdeckung der Polymerase Chain Reaction (PCR) durch den Nobelpreisträger Kary B.

Mullis, 1986, hat sich diese als Analyse- und Diagnostikmethode immer weiter durchgesetzt.

Um den Anforderungen in biochemischen Labors gerecht zu werden, wurden inzwischen PCR-

Geräte entwickelt, in denen in Mikrotiterplattenmodulen parallel bis zu 384 Proben untersucht

werden können. Das Institut für Mikrotechnik Mainz (IMM) stellt hier ein Prototyp-System vor,

das vorerst nicht die Parallelisierung, sondern vielmehr die Komplettanalyse in den Vordergrund

stellt. Ziel ist ein Einwegchip, auf dem alle Prozeßschritte – von der Probenpräparation

über die PCR bis hin zur Detektion – automatisiert durchgeführt werden.

Bei der Entwicklung dieses mikrofluidischen

Systems wird das starre Konstrukt eines einzelnen

Lab-on-a-Chip aufgehoben, indem in

der Prototypphase mehrere Polymer-Chips

miteinander kombiniert werden (Abb. 1). Dabei

beinhaltet jeder Chip nur Teile der Gesamtfunktion.

Diese Aufteilung besitzt mehrere

Vorteile. Zum einen müssen bei einer späte-

Abb. 1: Ferrofluid-Aktuator. Gesamtaufbau des

modularen Mikrofluidiksystems. Dieses beinhaltet

bis zu zwölf Module, ferrofluidische Aktoren,

Mikropumpen sowie Ventile und Reservoirs.

ren Verifikation nur die mit der Probe kontaminierten

Einzelchips ausgewechselt werden.

Zum anderen kann, je nach Anforderung an

die Analyse, schnell ein geeignetes Chip-System

zusammengesetzt und auf Modifikationen

von Einzelelementen eingegangen werden.

Das Gesamtsystem bleibt in seiner

Grundstruktur erhalten. Dieser modulare

Ansatz bezieht sich dabei nicht nur auf die Probenpräparation

oder auf die amplifizierbaren

DNA- oder RNA-Proben, sondern auch auf

den Einsatz anderer Nachweismöglichkeiten,

z.B. mit immunologischen Assays. Des weiteren

bietet ein solches System den großen Vorteil,

daß bei der Entwicklung neuer Analysesysteme

den neuen, kritischen Aufgaben mehr

Aufmerksamkeit gewidmet und weitgehend

auf fertige Lösungen einzelner fluidischer Abläufe

zurückgegriffen werden kann.

Ein Kernziel der Entwicklung dieses PCR-

Systems auf der modularen Plattform ist die

Beschleunigung der PCR auf eine für Pointof-Care-Anwendungen

angemessene Zeit.

Konventionelle PCR-Geräte haben häufig den

Nachteil langer Einstellzeiten der für die Reaktion

nötigen Temperaturen. Die Ursache

dafür liegt in der thermischen Trägheit der Systeme.

In der Regel wird ein einzelner Temperaturblock

verwendet, der gemäß dem Protokoll

über eine elektronische Steuerung geheizt

und abgekühlt wird. Um diesem Problem entgegenzuwirken,

werden bei dem am IMM

entwickelten System die Reaktionstemperaturen

in drei voneinander getrennte Temperaturzonen

aufgeteilt, und anstatt die Probe an

einem festen Ort zu belassen, wird sie mit Hilfe

einer neuentwickelten Mikropumpe präzise

zu den einzelnen Temperaturbereichen transportiert

(Abb. 2). Dabei nutzt die Pumpe die

typischen Eigenschaften einer magnetischen

Suspension (Ferro- bzw. Magnetofluide) aus.

Das Ferrofluid ist auf einem eigens entwickelten

Chip in kleinen Kanälen eingeschlossen

und kann mit Hilfe eines Permanentmagneten,

der an einem Schrittmotor angebracht ist,

gezielt bewegt werden (Abb. 3).

Der mit dem Ferrofluid befüllte Chip ist

über ein luftgefülltes Kapillarsystem pneumatisch

mit einem zweiten Chip verbunden, zum

Beispiel dem für die PCR. Dieser PCR-Chip

enthält dabei das zu analysierende Material

Abb. 2: Transportprinzip des PCR-Systems. Durch

die Bewegung des Magneten erfolgt eine gleichzeitige

Bewegung des darüber liegenden Ferrofluids

sowie, aufgrund der pneumatischen Verbindung,

des Probenvolumens von Heizplatte zu

Heizplatte. Dabei besteht eine hohe Reproduzierbarkeit

des Probentransportes. Die Abweichung

der Start- zur Endposition liegt nach über 40 Zyklen

unter 100 µm.

Menge gegenüber einem konventionellen

PCR-Cycler einher. Die Verweildauer in den

einzelnen Temperaturzonen kann dabei auf

etwa eine Sekunde reduziert werden und

grenzt somit an die minimale, biochemische

Reaktionszeit eines PCR-Schrittes (Abb. 4). Die

Transportzeit von Heizplatte zu Heizplatte

nimmt im Moment etwa die Hälfte der Gesamtzeit

in Anspruch, kann aber durch Modifikation

der Ferrofluid-Mikropumpe noch

weiter beschleunigt werden. Das zur Zeit getestete

Probenvolumen, bestehend aus einem

konventionellen PCR-Kit (Sigma) und aufgereinigter

DNA, beträgt 8 µl und kann anschließend

mit einer normalen Agarose-Gelelektrophorese

und Ethidiumbromideinfärbung analysiert

werden. In weiteren Versuchen soll das

Probenvolumen reduziert und mit Hilfe des

Insight-Systems, einem Mikroskopsystem zur

molekularen Analyse der Firma Evotec, und

Fluoreszenzsignalen ausgelesen werden.

Durch die Verwendung von transparenten

Polymer-Chips und eines solchen Fluoreszenzmikroskopes

ließe sich auch eine Real-

Time-PCR durchführen.

Eine große Herausforderung ist die Untersuchung

von Wechselwirkungen der Reaktionsbestandteile,

z.B. der Primer oder Taq-Po-

Kennziffer 12 LW 03 · www.biocom.de


4 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


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B L I T Z L I C H T

Abb. 3: Ferrofluid-Aktuator für den Transport und

das Positionieren von Probenvolumina. Der Aktuator

ist über ein fluidisches Interface mit dem

PCR-Chip verbunden.

aktionsförderndes Umfeld für die PCR-Reagenzien

geschaffen. Andere Materialien, wie

etwa Glas oder Silizium, sind grundsätzlich

für eine PCR geeignet, stellen aus Kostengründen

jedoch kaum eine Alternative dar. Schafft

man es statt dessen, einen Chip komplett aus

einem Polymer zu entwickeln, kann dieser mit

Hilfe des Mikrospritzgusses günstig hergestellt

und als Einmal-Chip vertrieben werden.

lymerase, mit den Mikro-Kanalwänden aus

unterschiedlichen Polymermaterialien. Dabei

stellte sich heraus, daß bei der Verwendung

von PMMA (Polymethylmethacrylat) oder

COC (Cyclo Olefin Copolymer) eine Oberflächenmodifikation

notwendig ist. Nur durch

Verwendung biokompatibler Substanzen zur

Beschichtung der Kanalwände wurde ein remengt

und anschließend die Amplifikation

innerhalb des PCR-Chips durchgeführt. Der

Chip zur Probenaufbereitung befindet sich zur

Zeit in der Entwicklung, zeigt aber in ersten

Vorversuchen sehr gute Ergebnisse.

Abmessen von Flüssigkeitsvolumina

Das Abmessen von Flüssigkeitsvolumina

wird auch innerhalb eines Chips erfolgen.

Dafür wurde ein Verfahren entwickelt, das

es erlaubt, von einer Flüssigkeitsmenge ein

definiertes Volumen von 0,1 bis 10 µl im Chip

abzumessen. Dieses wird dann über geometrische

Strukturen blasenfrei mit einem anderen

Probenvolumen vermengt und anschließend

gemischt. Beim Mischvorgang

werden die beim Transport entstehenden

Randwirbel in einem Flüssigkeitstropfen ausgenutzt.

Diese entstehen durch das parabolische

Strömungsprofil, das von einem IMM-

Simulationsteam für diese Zwecke untersucht

wurde. Dieser Mischvorgang kann zusätzlich

durch geometrische Veränderungen

des Kanals unterstützt werden, wie etwa

Zickzack-Strukturen.

Die externe Steuerung sämtlicher Flüssigkeitstransporte

wird über einen Mikrokontroller

in Verbindung mit einem PC (Steuerungssoftware:

LabVIEW) kontrolliert. Ergänzt

wird das System durch externe Ventile

und konventionelle Mikropumpen, die auf

sogenannten Ventilinseln positioniert werden.

Sie verfügen über die gleichen Abmessungen

wie die Chip-Module selbst. Damit

ist es möglich, ausgewählte Probenvolumina

zu transportieren und den zeitlichen Ablauf

zu kontrollieren. Bei der Entwicklung

wird das System manuell über ein Steuerpanel

per Mausklick bedient. Ist ein geeigneter

Ablauf identifiziert, werden die einzelnen

Schritte in einem Unterprogramm festgelegt

und das System führt vollautomatisch die

einzelnen Aufgaben durch.

Anwendung, Service und Zielgruppe

Abb. 4: Temperaturverteilung und Flußgeschwindigkeiten

in einem im Mikrokanal eingeschlossenen

Flüssigkeitstropfen. Hierbei wird der Tropfen

von der kalten (blau) zur warmen Region (rot)

transportiert und innerhalb von 0,1 Sekunden

aufgeheizt.

Mit diesem „Chip-Based-Lab“ wird ein modulares

[1] C.W. Hirt and B.D. Nichols, J. Comput. Phys. 39, 201, 1981.

Konzept umgesetzt, welches es dem [3] B.C. Giordano, J. Ferrance, S. Swedberg et al., Anal. Biochem. 291, 124, 2001.

[2] M. Kopp, A. de Mello and A. Manz, Science 280, 1046, 1998.

IMM ermöglicht, neue Entwicklungen kostengünstig

[4] I. Schneegaß, J.M. Köhler, Reviews in Molecular Biotechnology 82, 101, 2001.

anzugehen. Die einzelnen Modu-

[5] J. Yang, Y. Liu, C.B. Rauch et al., Lab Chip 2, 179, 2002.

[6] M. Curcio and J. Roeraade, Anal. Chem., 75, 1, 2003.

Probenvorbereitung

le können auf den zwölf Modulpositionen frei [7] P.A. Auroux, P.J.R. Day, F. Niggli et al., Proceedings of Nanotech 2003, 55, 2003.

kombiniert und miteinander verbunden werden.

[8] S. Hardt, D. Dadic, F. Doffing, K. S. Drese, F. Jiang, G. Münchow, O.

Die durch die PCR zu analysierende DNA-

Probe kann ebenfalls auf Chipbasis aus wenigen

Mikrolitern Blut gewonnen werden. Dem

Patienten wird Blut abgenommen, zum Beispiel

mit Hilfe einer Kapillare aus dem Ohr.

Anschließend wird dieses auf einen im Chip

integrierten Filter aufgetragen und mit unterschiedlichen

Puffern gespült. Die Blutzellen,

die das Erbgut nicht enthalten, werden dabei

entfernt. In einem weiteren Schritt werden die

gewonnenen Zellen lysiert und die zur PCR

nötige DNA aus den Zellen extrahiert. Die isolierte

Die Chips werden im Spritzgußverfah-

ren hergestellt und liegen als Rohlinge in den

unterschiedlichsten Materialien vor. Die verwendeten

Strukturen werden in einem CAD

(Computer Aided Design)-Programm von

Entwicklungsingenieuren entworfen und – je

nach Strukturgröße – mit Hilfe einer CNC-

Maschine oder eines Lasers in den Polymer-

Chip übertragen. Abschließend werden die

Chips mit einer etwa 100 µm dicken Polymerfolie

gedeckelt. Somit wird aus der Idee schon

nach kürzester Zeit ein testfähiger Chip, der

Sörensen, eingereicht : Proc. of Nanotech 2004, Boston, March 7-11, 2004

Korrespondenzadresse

Dr. Klaus-Stefan Drese

IMM - Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH

Abteilung Fluidik und Simulation

Carl-Zeiss-Straße 18-20, D-55129 Mainz

Tel.: +49 (0)6131-990-170, Fax: -990-205

eMail: drese@imm-mainz.de

www.imm-mainz.de

DNA-Probe wird aufgefangen, in ent-

– einmal in die modulare Plattform eingesetzt

sprechendem Verhältnis mit dem PCR-Kit ver- – sogleich angesteuert und verwendet wer-

Kennziffer 13 LW 03 · www.biocom.de


den kann. Dies ermöglicht eine schnelle und

kostengünstige Realisierung von Machbarkeitsstudien

sowie die Anfertigung von mikrofluidischen

Prototypen. Sobald die Einzelaufgaben

gelöst und die Strukturen festgelegt

sind, werden diese mit Hilfe eines angepaßten

Spritzgußwerkzeugs auf einem einzelnen

Chip vereint, welcher in Kleinserie

produziert werden kann. Ziel ist es, den

wachsenden Entwicklungsbedarf der klinischen

und industriellen Analytik und Diagnostik

an Nachweisverfahren zu decken

und die Entwicklungszeit für ein Lab-on-a-

Chip-System zu beschleunigen.

Das modulare PCR-System wurde in der

IMM-Abteilung Fluidik und Simulation entwickelt

und entstand im Rahmen eines Verbundprojektes

des BMBF-Förderprogramms

Mikrosystemtechnik 2000+. Die Projektpartner

sind das Unternehmen Evotec OAI (Hamburg),

das diesen modularen Aufbau an das

oben erwähnte Fluoreszenzmikroskop adaptieren

und die PCR-Reaktionen im Chip weiter

austesten wird. Zum anderen wird anschließend

der dritte Projektpartner als erster

Nutzer, das Endokrinologikum Hamburg

Forschungsgesellschaft mbH in Hamburg,

das Gerät zu Forschungszwecken einsetzen

und im täglichen Gebrauch prüfen.

Literatur

6 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


TILLING : Automated

Reverse Genetics

®

Rapid acquisition of genomic

sequence data has elevated a new

discipline, functional genomics, which

focuses on determination of gene

function. Reverse genetics methodologies

are an important

part of functional genomics.

Traditional reverse genetic methods,

such as the use of transposons to

“knock out” a specific gene, can

accurately determine phenotype but

require time consuming transgenic or

sophisticated tissue culture methodologies

1 . Such “knockout” methods

are limiting because the entire gene

is knocked out – the effects of partial

loss of function of an active gene

cannot be observed.

DETERMINING GENE

FUNCTION THROUGH TILLING

To overcome the limitations of knocking

out an entire gene and to expand

knowledge of active gene mutations,

researchers from Fred Hutchinson

Cancer Research Center developed a

process for Targeting Induced Local

Lesions In Genomes, or TILLING 2 .

Elegantly simple, yet highly efficient,

TILLING uses chemical mutagenesis

to yield a traditional allelic series of

point mutations for virtually all

genes. The TILLING process is of

particular value for essential genes

where sublethal alleles are required

for phenotypic analysis.

GENERATING HIGH

QUALITY TILLING IMAGES

The new LI-COR 4300 DNA Analysis

System is uniquely suited for

TILLING because it uses two-color

infrared fluorescence detection to

generate two true gel images during

electrophoresis. Unprocessed image

data are critical for TILLING because

systems that highly process fluorescence

data during detection will likely

filter out most, if not all, mutations.

With the 4300 System as the

enabling technology, the following

TILLING performance results can be

achieved with a single instrument*:

• Up to 750,000 base pairs

screened per run.

• Up to 2000 samples screened

per day.

• Up to 2 million base pairs

screened per day.

• 1000 base pairs per sample.

* Results are dependent on species and other factors.

To Learn more about TILLING and

the LI-COR System, visit our web

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References

1. Colbert, T., Till, B.J., et al 2001. High Throughtput

Screening for Induced Point Mutations. Plant

Physiology 126: 480-484.

2. McCallum, C.M., et al 2000. Target Induced Local

Lesions In Genomes (TILLING) for Plant Functional

Genomics. Plant Physiology 123:439–442.

LI-COR Model 4300

DNA Analysis System

www.licor.com

LI-COR (Germany, Austria, Switzerland):

+49 (0) 6172 17 17 771

LI-COR UK Ltd.: +44 (0) 1223 422104

North America: 402-467-0700

TILLING is a registered trademark of Anawah, Inc.


B L I T Z L I C H T

GVO-Diagnostik


Nachweis von gentechnischen

Veränderungen – Möglichkeiten

und Grenzen

Tab. 1: Notwendige Kontrollen in der GVO-Analytik

Hermann Broll, Dr. Andreas Butschke und Dr. Jutta Zagon,

Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), Berlin

Lebensmittel, die aus gentechnisch veränderten Organismen (GVO) hergestellt werden, sind

bereits seit 1997 in der Europäischen Union (EU) im Handel. Bis heute nahm seitdem die

Fläche der Anbaufläche mit gentechnisch veränderten Pflanzen weltweit um das 35fache zu –

in Europa ist sie gleichwohl marginal, da bislang außer in Spanien ausschließlich experimentelle

Forschungsfreisetzungen die Praxis sind. In erster Linie werden weltweit gentechnisch

veränderte (gv) Soja- (ca. 62%), Mais- (ca. 21%, Baumwoll- (ca. 12%) und Raps-Pflanzen (ca. 5%)

in großem Stil angebaut 1 . Alle derzeit EU-zugelassenen gentechnisch veränderten Pflanzen

besitzen ausschließlich Gene, die Resistenz gegenüber Pflanzenschutzmitteln oder einen Insektenschutz

vor Fraßschädlingen bieten. Damit weisen diese nach Einschätzung der Autoren

überwiegend Vorteile für die Bauern auf,

Die Zulassung und Kennzeichnung solcher

Produkte ist bereits seit 1997 gesetzlich geregelt

2 – Lebensmittelprodukte mußten danach

immer dann gekennzeichnet werden, wenn

eine gentechnische Veränderung nachweisbar

war. Mit der seit dem 18. April diesen Jahres

geltenden neuen Verordnung (EG) Nr. 1829/

2003 hat sich die Kennzeichnungspflicht verschärft.

Nun müssen alle Lebens- und Futtermittelprodukte,

die aus GVO gewonnen wurden,

gekennzeichnet werden. Zudem wurde

der eingeführte Schwellenwert für eine unvermeidliche

und unbeabsichtigte Beimengung

von GVO zu gentechnikfrei hergestellten

Futter- und Lebensmitteln bezogen auf die

jeweilige Zutat von 1% auf 0,9% gesenkt. Alle

GVO-Anteile darüber müssen gekennzeichnet

werden. Auch für Saatgut werden europaweite

Regelungen ebenfalls mit sortenspezifischen

Schwellenwerten unterhalb von

0,9% GVO-Anteil vorbereitet.

Nachweisverfahren

Schritt Nukleinsäure- Nukleinsäureextraktion

amplifikation

Extraktionsblindprobe + (mindestens 1

alle 10 Proben)

Positive Extraktions- + (in regelmäßigen

kontrolle

Abständen)

Positive +

DNA-Zielkontrolle

Negative +

DNA-Zielkontrolle

Amplifikations- +

Reagenzkontrolle

PCR-Inhibitions-

0 (+, wenn sämtliche PCRkontrolle

Prüfungen der Probe negativ)

+ Verbindlich vorgeschrieben, 0 empfohlen

Zur Überprüfung der Kennzeichnung ist wegen

des Schwellenwertes der qualitative Nachweis

einer gentechnischen Veränderung nicht

ausreichend. Statt dessen muß der Anteil der

gentechnischen Veränderung bestimmt werden.

Als Methoden für die Überprüfung, ob die

Kennzeichnungsschwelle überschritten wurde,

sind mindestens drei unterschiedliche Ansätze

denkbar.

– Einerseits kann die zusätzlich eingeführte

DNA-Sequenz direkt mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion

(PCR, polymerase

chain reaction) vervielfältigt und anschließend

detektiert werden

– oder das neu exprimierte Protein kann

durch immunologische Verfahren wie dem

ELISA identifiziert werden.

– Denkbar ist aber auch der Nachweis eines

möglicherweise veränderten Fettsäuremusters

aufgrund der gentechnischen Veränderung

mit Hilfe gaschromatographischer

Methoden.

Während die DNA in allen Zellen eines Organismus

hinsichtlich der Basenabfolge

identisch ist, kann sich die Proteinexpression

von Gewebe zu Gewebe unterscheiden.

Beispielsweise wird in den Körnern der gentechnisch

veränderten Maislinie Bt 176 das

neueingeführte cry 1Ab-Gen nur zu 0,1% im

Vergleich zu den anderen Geweben exprimiert,

wodurch immunologische Verfahren

nur sehr begrenzt eingesetzt werden können.

Eine gentechnische Veränderung in Tomaten

der Firmen Calgene (Flavr Savr ® ) und

Zeneca basiert auf dem Blockieren der Expression

des tomateneigenen Polygalakturonase-Gens,

dessen Genprodukt für das

Auflösen der Zellwände im Zuge des „Matschigwerdens“

sorgt, durch die „Antisense“-

Technologie. Dies führt zur Verzögerung der

Reifung. Die Tomate , die daher auch als

„Antimatsch-Tomate“ bezeichnet wird, kann

später als bisher geerntet werden. Da auch

hierbei kein neues Protein synthetisiert wird,

ist der immunologische Nachweis nicht geeignet.

Der DNA-basierte PCR-Nachweis ist demgegenüber

fast uneingeschränkt einsetzbar.

Lediglich sehr stark verarbeitete Produkte

wie raffinierte Öle, Soja-Saucen oder ähnliches

enthalten nur noch DNA-Mengen unterhalb

der Nachweisgrenze. Diese Produkte

können daher nicht überprüft werden. Hier

muß gegebenenfalls eine Überprüfung der

Ausgangsstoffe oder eine Überwachung

während des Herstellungsprozesses erfolgen.

Probenahme

Unabhängig von der Nachweistechnologie

steht am Anfang der Analyse die repräsentative

Probenahme. Dazu sind unter Umständen

mehrere Stichproben zu nehmen,

um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, daß

die gezogene Probe tatsächlich repräsentativ

für das zu untersuchende Material ist.

Beispielsweise besteht nur eine Wahrscheinlichkeit

von 50%, daß das Vorhandensein

von 0,1% gentechnisch veränderten Sojabohnen

in einer Probe detektiert wird, wenn

dazu 700 Sojabohnen als Analysenprobe verwendet

werden und die Methode prinzipiell

eine gentechnisch veränderte Sojabohne

in 1.000 Sojabohnen nachweisen kann. Umso

geringer die Stichprobenanzahl ist, die analysiert

wird, um so größer wird die Wahrscheinlichkeit

einer nicht-repräsentativen

Probe für das zu untersuchende Material.

Weiterhin hat die Verteilung des gentechnisch

veränderten Materials einen entscheidenden

Einfluß. Handelt es sich um Rohwaren,

besteht eine sehr hohe Wahrscheinlichkeit,

daß eine heterogene Verteilung vorliegt,

das heißt, eine „Nesterbildung“ mit erhöhter

Konzentration des gentechnisch veränderten

Materials zu beobachten ist. Mit zu-

8 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


B L I T Z L I C H T

Abb. 1: Unterschiedliche Nachweisstrategien

nehmenden Prozessierungsgrad erfolgt auch

eine stärkere Homogeni-sierung des Materials,

was letztlich zu einer vereinfachten Probenahme

mit weniger Stichproben führt.

Zudem hat die nach der Probenahme zu erfolgende

Homogenisierung einen Einfluß auf

das Analyseergebnis. Je feiner die Probe zermahlen

wird, also je mehr Partikel pro Gewichtseinheit

in der Analysenprobe enthalten

sind desto größer wird die Wahrscheinlichkeit

eine nur geringe gentechnische Spur

noch zu detektieren. Sind zum Beispiel nur

100 Partikel in der Analysenprobe kann statistisch

keine 0,1%ige Verunreinigung mehr

identifiziert werden, da hierfür mindestens

1.000 Partikel notwendig wären.

PCR-Analyse

Im Anschluß an die Probenahme erfolgt bei

der PCR-Analyse die Extraktion der DNA.

Hierbei ist vor allem auf die Eliminierung

etwa vorhandener Inhibitoren zu achten. In

der Literatur sind zahlreiche Stoffe genannt,

die auch in Lebensmitteln enthalten sind und

in erster Linie inhibitorisch auf die Taq-DNA-

Polymerase wirken 7 . Zur Identifizierung einer

möglichen Inhibition muß nach jeder

Extraktion die isolierte DNA mit einem für

die Zutat spezifischen PCR-System untersucht

werden (Tab. 1).

Der PCR-Nachweis der gentechnischen

Veränderung erfolgt zumeist in Stufen (Abb.

1). Zunächst werden die Proben auf das Vorhandensein

bestimmter regulatorischer

DNA-Sequenzen hin untersucht. Bei den

derzeit in der Europäischen Union (EU) für

die Lebensmittelherstellung zugelassenen

GVOs ist zu 80% der Promotor 35S aus dem

Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) verwendet

worden. Daher werden Lebensmittelproben

meistens mit einem solchen „Screening“-

Verfahren untersucht. Im positiven Fall muß

jedoch eine für die gentechnische Verände-

Alternative in

PROTEOMELAB

FROM TISSUES TO TARGETS

der Proteomanalytik

Identify

Isolate

Fractionate

Characterize

Evaluate

Diagnose

ProteomeLab PF2D

Proteinfraktionierung mit zweidimensionaler

Chromatographie

• Intakte Proteine in flüssiger Phase

• Differential Display zum Auffinden

von Target Proteinen –

Ideal für Biomarker

• Kein Spot Picking oder Anfärben der

Proteine wie bei Gelen

Die

ProteomeLab PA800

Proteincharakterisierung

und

Qualitätskontrolle

• Isoelektrische

Fokussierung

• SDS PAGE zur Bestimmung der

molaren Masse

• Glykoprotein Mapping

• IgG Heteregonität von

Antikörpern

Abb. 2: Relativer Variationskoeffizient (RSD R

) des Roundup Ready-Sojabohnen (RRS)-Nachweises. Als

Grundlage dienten Ergebnisse aus insgesamt 17 Laboren. Der Gehalt an gentechnisch verändertem

Soja lag zwischen 0 und 5%. TVP= texturiertes Sojaisolat

Beckman Coulter GmbH

Europark Fichtenhain B13, 47807 Krefeld

Telefon: 0 21 51/33 3-5, FAX: 0 21 51/33 36 31

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www.beckmancoulter.com/proteomelab

LABORWELT Kennziffer 14 LW 035. · Jahrgang www.biocom.de | Nr. 3/2004 | 9


B L I T Z L I C H T

Tab. 2: Betrachtung von Fehlerquellen

Probe

DNA-Extrakt

PCR-Ansatz

Real-Time-PCR

Kennziffer 15 LW 03 · www.biocom.de

Upgrade your plasmid DNA

°

°

°

°

Service production of certified Research Grade

plasmid DNA

GMP Grade plasmid manufacturing for

clinical applications

CGE analysis and preparative separation of

plasmid topologies

New: Animal free plasmid DNA

production

– Unterschiedliche Degradation von Komponenten

(Lagerung, Prozessierung, enzymatischer Abbau)

– Unterschiedliche Zelldichte pro Gewicht

– Unterschiedliche Kopienzahlen der Ziel-DNA pro Zelle

(Ploidiegrad, multi-copy, reduzierter Chromosomensatz)

– Unterschiedliche Effizienz bei der Extraktion aus verschiedenen

Komponenten

– Pipettierfehler bei Verdünnung

– Pipettierfehler

– Gerätefehler (inhomogener Thermoblock, Optik)

– Unterschiedliche Effizienzen

– Inhibitionen in einzelnen Proben

– Mutationen im Primer-Anlagerungsbereich

–Kompetition, sterische Effekte

www.PlasmidFactory.com


rung spezifische DNA-Sequenz nachgewiesen

werden. Der zweifelsfreie Nachweis eines

bestimmten GVO kann bis dato ausschließlich

mit Hilfe der „Event“-spezifischen

PCR erfolgen, bei der der Übergang

zwischen dem genetischen Konstrukt und

dem Wirtsgenom amplifiziert wird. Nur mit

Hilfe dieses Ansatzes können GVO unterschieden

werden, die dasselbe Konstrukt

enthalten.

Für die amtliche Kontrolle ist weiterhin

eine Bestätigung des amplifizierten PCR-

Produkts mit Hilfe der RFLP, Sequenzierung

oder DNA-DNA-Hybridisierung notwendig.

Theoretisch ist eine einzelne Kopie der

DNA-Zielsequenz ausreichend, um zu einem

positiven Ergebnisse in der PCR zu

kommen. Um falsch-positive Ergebnisse

auszuschließen, müssen entsprechende

Kontrollen, wie in Tabelle 1 aufgeführt,

durchgeführt werden. Die im Rahmen der

GVO-Analytik entwickelten Verfahren haben

eine Nachweisgrenze (limit of detection,

LOD) von etwa 10 Kopien. Dies entspricht

ungefähr einem Gehalt von 0,01% gentechnisch

veränderte Bestandteile in einem Produkt

unter Standard-Analysebedingungen.

Einen entscheidenden Einfluß dabei hat –

wie beschrieben – der Prozessierungsgrad.

Je stärker das Produkt bearbeitet wurde, desto

geringer ist der Gehalt an DNA, und somit

sinkt auch die praktische Nachweisgrenze

in der zu analysierenden Probe. Dadurch

sinkt natürlich die Chance, eine potentielle

gentechnische Veränderung zu identifizieren.

Basierend auf diesem Prinzip sind PCR-

Verfahren für alle in der EU authorisierten

gentechnisch veränderten Maislinien entwickelt

und vom BfR validiert worden 4 .

Quantitativer Nachweis

Durch die Entwicklung der Real-Time PCR

ist auch die quantitative Bestimmung der

gentechnisch veränderten Bestandteile möglich.

Hierbei wird jeweils getrennt der Anteil

gentechnisch veränderter DNA-Sequenzen

und der Anteil der Spezies anhand von Standardkurven

bestimmt. Daraus kann der relative

Anteil gentechnisch veränderter Bestandteile

an einer Zutat bestimmt werden.

Für die Erstellung der Standardkurven werden

zertifizierte Referenzmaterialien (certified

reference material, CRM) basierend auf

gemahlenem Saatgut verwendet. Diese

CRMs sind für verschiedene GVOs in den

Konzentrationen 0 -5% (w/w) verfügbar (Institute

for Reference Material and Measurements,

IRMM, Geel, Belgien).

Validierungsstudien sowohl national als

auch international wurden in der Vergangenheit

erfolgreich durchgeführt. Dabei

wurden kodierte Proben mit unterschiedlichen

GVO-Anteilen untersucht. Es zeigte

sich, daß Abweichungen im Bereich von 25

bis 40% zu beobachten sind (Abb. 2). Wurde

bereits extrahierte DNA an die Teilnehmer

verschickt, lagen die Abweichungen zwischen

15% bis 20%. Dieser auch als Meßunsicherheit

bezeichnete Fehler ist daher bei

jeder Analyse mit der validierten Methode

in der Form (x ± b) anzugeben, wobei x den

gemessenen Wert darstellt und b die Meßunsicherheit.

Zur Bestimmung der Meßunsicherheit

existieren zahlreiche Veröffentlichungen

5 (Tab. 2). Auf der letzten Sitzung

des Codex-Komitees für Analyse- und Probenahme

(CCMAS) wurde beschlossen, daß

Ergebnisse nur noch in dieser beschriebenen

Art und Weise ausgedrückt werden. Management-Entscheidungen

sollten dann die

angegebene Meßunsicherheit des Ergebnisses

mit berücksichtigen.

Internationale Standardisierung

Im Rahmen des Europäischen Komitees für

Normung (CEN) wurde 1999 eine Arbeitsgruppe

gegründet (TC275/WG 11) die Verfahren

zum Nachweis von gentechnisch modifizierten

Organismen und ihren Produkten

standardisiert. Dabei werden Normen

erstellt, die sowohl immunologische Verfahren

als auch DNA-basierte Verfahren enthalten.

Die erste Norm ist im April 2004 erschienen

und beschreibt die Anwendung proteinchemischer

Verfahren für den Nachweis von

GVO und gentechnisch veränderten Bestandteilen

in Lebensmitteln. Im Anhang des Standards

ist beispielhaft eine bereits im Ringversuch

validierte Methode zur Identifizierung

der gentechnisch veränderten Roundup Ready-Sojabohne

der Firma Monsanto 6 aufgeführt.

Abschließend läßt sich sagen, daß bei der

Anwendung der hier beschriebenen Verfahren

von „Fehlern“ (Meßunsicherheit) in der

Größenordnung von mindestens 30% auszugehen

ist, das heißt der „wahre“ Wert einer

Probe 30% höher oder niedriger liegen

kann. Allerdings sind auch andere Analyseverfahren

mit Fehlern in dieser Größenordnung

behaftet; entscheidend für die korrekte

Anwendung ist daher die Berücksichtigung

des Fehlers bei anstehenden Entscheidungen.

Literatur

[1] Clive James. Preview: Global status of commercialized transgenic crops:

2003. ISAAA Briefs No 30. ISAAA: Ithaca, New York.

[2] Verordnung (EG) Nr. 258/97 des Europäischen Parlaments und des Rates

vom 27. Januar 1997 über neuartige Lebensmittel und neuartige Lebensmittelzutaten,

Amtsblatt der Europäischen Union L 43 vom 14.02.1997,

Seiten 1 - 7.

[3] Verordnung (EG) Nr. 1829/2003 des Europäischen Parlaments und des

Rates vom 22. September 2003 über genetisch veränderte Lebensmittel

und Futtermittel. Amtsblatt der Europäischen Union L 268 vom 18.10.2003,

Seiten 1 – 23.

[4] Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG;

Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen,

kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenständen. Loseblattausgabe,

Stand Mai 2004, Berlin, Köln, Beuth Verlag GmbH.

[5] “Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement”, ISO, Geneva,

1993.

[6] EN ISO 21572:2004 „Foodstuffs - Methods for the detection of genetically

modified organisms and derived products - Protein based methods (ISO

21572:2004)“.

[7] Rossen, Lone et al. Inhibition of PCR by components of food samples,

microbial diagnostic assays and DNA-extraction solutions. Int J. of Food

Microbiology, 17 (1992) 37-45.

Korrespondenzadresse

Hermann Broll

Dr. Jutta Zagon

Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)

Postfach 33 00 13

D-14191 Berlin

eMail: h.broll@bfr.bund.de

eMail: j.zagon@bfr.bund.de

10 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


B L I T Z L I C H T

Automation


Ultraschnelle DNA-Amplifikation

mit Rapid-PCR

Dr. Hanno Hermann, Claus Knippschild, Analytik Jena AG

Die Ansprüche an die Geschwindigkeit, Effizienz und Qualität der Ergebnisse der Polymerase-Kettenreaktion

(PCR) sind mit der steigenden Anzahl und Vielfalt der Anwendungen dieser

Schlüsseltechnologie größer geworden. Die hier vorgestellte, neue Rapid-Cycle-PCR-Technologie

ermöglicht jetzt substantielle Fortschritte bei der Einlösung der gestiegenen Anforderungen

an die PCR. Neben der Erläuterung der technischen Grundlagen werden hier die

Eigenschaften des „SpeedCycler“-Systems an Anwendungsbeispielen erläutert.

Key Words: PCR, Rapid-PCR, Spezifität, ultradünne Mikrotiterplatten, Speedcycler

Seit der Entwicklung der PCR-Methode 1985

durch Kary Mullis 1-2 und seine Mitarbeiter haben

stetige Innovationen dazu beigetragen,

daß aus der PCR eine Schlüsseltechnologie

für die biologische Forschung und Routine-

Diagnostik geworden ist. Meilensteine dabei

waren etwa der Einsatz hitzestabiler DNA-

Polymerasen wie der Taq-DNA-Polymerase 3

sowie die Entwicklung der Thermocycler, die

eine automatisierte und parallele Durchführung

der Polymerase-Kettenreaktion mit einer

Vielzahl von Proben erst ermöglichten.

Von Ende der achtziger Jahre an wurden

kommerzielle Thermocycler entwickelt, die

mit Standard-Mikrozentrifugen-Tubes als

Probenbehälter und temperierten Metallblökken

zur Aufnahmen der Tubes arbeiten. Unter

den für das Aufheizen und Kühlen des

Blocks genutzten Prinzipien (Wärmelampen,

die relativ geringen effektiven Heiz- und

Kühlraten von 1-2 °C/s innerhalb der Probe,

die durch großvolumige Metallblöcke und

die große Wandstärke der Plastik-Probengefäße

(200-300 µm) bedingt sind. Daraus resultieren

Zykluszeiten von 3 bis 8 Minuten

und ein Gesamtzeit-Bedarf von zwei bis drei

Stunden für übliche PCR-Experimente.

Da die Ansteuerung der Temperaturzyklen

eine zentrale Rolle in der Polymerase-Ketten-

Reaktion spielt, wurde schon bald nach Alternativen

mit einer schnelleren Prozeßführung

gesucht. Eine Reihe von Reaktoren und

Technologien für schnelle Temperaturführung

kleiner Probenvolumina wurde so getestet

4-5 . Wittwer (siehe LABORWELT 2/2000)

entwickelte ab 1989 eine sehr schnelle Thermocycler-Technologie

auf Grundlage der

Temperierung mit heißer oder kühler Luft

Abb. 1: Der Speedcycler als „personal thermocycler“ mit 36-well-Mikrotiterplatte

elektr. Widerstandsheizung, Wasserkühlung,

etc.) hat sich bei den heute geläufigen Thermocyclern

fast ausnahmslos die Verwendung

von Peltierelementen durchgesetzt, die eine

robuste und kompakte Bauweise der Geräte

ermöglichen. Ein weiterer Vorteil dieser PCR-

Geräte ist die Verwendbarkeit von Mikrotiterplatten

nach den SBS-Normen 96 oder 384.

Damit ist der Einsatz der üblichen manuellen

Pipettiertechnik und der Standard-Automatisierungslösungen

für ein PCR-set up

möglich. Als Nachteil erwiesen sich dagegen

und der Verwendung von Glaskapillaren als

Probengefäßen 6 . Die experimentellen Erfahrungen

mit diesem kommerziell verfügbaren

System führten zur Definition der ultraschnellen

PCR als „Rapid cycle PCR“ – 30

Amplifikations-Zyklen in weniger als 30 Minuten

7 . Auf Grund sehr hoher Heiz- und

Kühlraten (> 8 °C/s) dauert ein einzelner

Temperaturzyklus etwa 20 Sekunden, damit

sind PCR-Experimente mit einer Dauer von

rund 15 Minuten möglich. Neben der Verkürzung

der PCR-Experimente eröffnete die Ra-

pid-cycle-PCR als weiteren Vorteil eine verbesserte

Qualität der PCR-Produkte. Die

durch die schnelleren Kühlraten und kurze

Annealingzeiten erfolgte präzisere Primer–

Template–Paarung bedingt hierbei eine höhere

Spezifität der Amplikons. Diese spezielle

Rapid-PCR-Technologie weist aber auch

einige Nachteile auf. Das Befüllen der einzelnen

Kapillaren erwies sich als relativ kompliziert,

die Standard-Pipettiertechnik als mit

dem System nicht kompatibel. Dies limitiert

den Probendurchsatz – eine Automatisierung

der PCR mit marktüblichen Workstations ist

nicht möglich. Die relativ große Oberfläche

der Glas-Kapillaren kann zudem die Komponenten

des PCR-Ansatzes adsorbieren. Es

kann also etwa zum Verlust der Enzym-Aktivität

oder zur irreversiblen Bindung von

DNA an die Glasoberfläche kommen. Um

diese Effekte zu vermeiden, müssen dem Master-Mix

zusätzlich ein Carrier-Protein (BSA)

zugefügt und die Enzymkonzentration optimiert

werden.

Peltier-Rapid-PCR

in ultradünnen Mikrotiterplatten

Um neue Applikationen und experimentelle

Wege zu ermöglichen, mußte es das Entwicklungsziel

einer neuartigen PCR-Technologie

sein, die positiven Eigenschaften der beiden

beschriebenen Thermocycler-Klassen zu verknüpfen

und die Nachteile auszuschalten –

also Schnelligkeit und Automation zu vereinen.

Das neue SpeedCycler ® -System erreicht

dies durch Kombination eines mit Peltier-Elementen

betriebenen Block-Thermocyclers

und einer speziellen ultradünnen Mikrotiterplatte

aus Plastikmaterial, deren Probenbehälter

entsprechend der SBS-Norm angeordnet

sind (Abb. 1). Damit bietet das System

eine Kombination von hoher Geschwindigkeit,

Möglichkeit der Nutzung der in allen

Laboren vorhandenen Pipettier- und Automatisierungstechniken

und ein gemeinsames

Prozessieren der Proben in Gefäßen aus biokompatiblen

Kunststoffen.

Die hohe Geschwindigkeit des Systems

wird durch mehrere technische Merkmale

erreicht. Der Rapid-Thermocycler zeichnet

sich aus durch:

– Die Verwendung von modernen Hochleistungs-Peltierelementen,

die einen

– kleinvolumigen Metallblock mit geringer

thermischer Kapazität temperieren.

Die in den Metallblock eingesetzte Mikrotiterplatte

zeichnet sich aus durch:

– sehr dünne Wände der Probengefäße

(10fach dünner als Standard-Gefäße) und

– eine hohe Flexibilität der Wandungen während

der PCR.

Schnelle Regelalgorithmen steuern Peltierelemente

an, die den Rapid-Block fast verzögerungsfrei

temperieren. Die für das PCR-Experiment

entscheidende Übertragung der

Energie in die Probenlösung erfolgt durch

die dünne Folienwandung sehr effektiv.

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 11


B L I T Z L I C H T

Abb. 2: Schematischer Vergleich des Temperaturverlaufs eines PCR-Zyklus aus einem 1.000 bp-Protokoll.

Standard-Peltier-Thermocycler (blau) 30 s – 30 s – 60 s, Speedcycler (rot) 1 s – 1 s – 10 s (Denaturierung

– Annealing – Elongation). Der Rapid-Thermocycler ist durch wesentlich höhere ramprates und

sehr kurze stationäre Temperaturphasen deutlich schneller.

Durch die Termperaturerhöhung nach dem

Start eines PCR-Experimentes baut sich in

der Probenkammer ein Druck auf, der die

flexible Kunststoffwandung an den Metallblock

andrückt. Zudem begünstigt die konische

Form der Bohrungen im Block und

der einzelnen Probengefäße der Mikrotiterplatte

die schnelle Temperierung des PCR-

Reaktionsgemisches. In Summe der hier beschriebenen

Effekte, erreicht die „Speed-

Cycler“-Technologie eine sehr hohe thermische

Effektivität. Heiz- und Kühlraten von

deutlich über 8/6 °C/s ermöglichen Zykluszeiten

von 20 Sekunden und damit das

Durchführen von PCR-Protokollen mit 30

Zyklen in 10 bis 15 Minuten. Neben den vergleichsweise

hohen „ramprates“ des Rapid-

Thermocyclers (vgl. Marktübersicht Thermocycler,

S. 36 ff.) bestimmen auch die nur

kurzen, notwendigen Haltezeiten in den drei

Temperaturphasen der PCR (Denaturierung,

Annealing, Elongation) die Dauer der Rapid-Protokolle.

Während in Standard-Peltier-Thermocyclern

ein großer Teil der Zeit

für das Temperieren des Metallblocks und

der Plastik-Wandungen der Probengefäße

benötigt wird, kann die Zeit in den Temperaturstufen

im Speedcycler-System fast vollständig

für die chemischen (Denaturieren

des DNA-Doppelstranges) oder biochemischen

Prozesse (DNA-Synthese) genutzt

werden (Abb. 2).

Hohe Geschwindigkeit und Spezifität

Entscheidend für den Gebrauchswert eines

Thermocycler-Systems sind nicht allein die

physikalischen Leistungsparameter wie

Heiz- und Kühlraten oder thermische Effizienz.

Wichtiger sind die Merkmale des molekularbiologischen

Experimentes, wie Dauer

des PCR-Protokolls, Ausbeute und Qualität

der PCR-Produkte. Insbesondere in der

medizinischen Diagnostik oder bei forensischen

Applikationen ist die PCR oft noch der

geschwindigkeitsbestimmender Schritt in einer

Abfolge analytischer Methoden. Eine

hohe Spezifität der amplifizierten DNA ist

insbesondere bei der weiteren Verwendung

für Klonierungen oder Sequenzierungen

wünschenswert. Die folgenden experimentellen

Ergebnisse wurden mit dem Speed-

Cycler-System erzielt und zeigen exemplarisch

die Vorteile des Systems. Für das Ansetzen

der PCR-Reaktionen wurden Standard-Enzyme,

-Komponenten und -Puffer in

handelsüblichen Qualitäten von verschiedenen

Herstellern eingesetzt. Die Endkonzentrationen

der Komponenten im PCR-Mastermix

entsprachen ebenfalls normalen PCR-

Ansätzen. Spezielle Optimierungszusätze

oder die Verwendung von Enhancern waren

nicht notwendig, lediglich die übliche

Optimierung der Magnesium-Konzentration

für die spezifischen Template/Primer-

Kombinationen wurde durchgeführt. Von

den Probenvolumina von 10 bis 20 µl pro

well der 36-well-Mikrotiterplatte wurden jeweils

Aliquots in der Agarose-Gelelektrophorese

analysiert.

Der Auswertung der Ergebnisse sei noch

folgende Betrachtung vorangestellt. Nach einer

im Bereich der Standard-PCR genutzten

praktischen Faustregel wird für die Amplifikation

eines 1.000 Bp-DNA-Moleküls eine

Elongationszeit von etwa 1 Minute benötigt.

Die hochprozessive Taq-DNA-Polymerase

verlängert aber den DNA-Strang unter optimalen

Temperaturbedingungen von 70 °C bis

80 °C um 100 bis 150 Nukleotide/Sekunde.

Selbst bei 50 °C kann noch eine Verlängerungsgeschwindigkeit

von 25 Nukleotiden/

Sekunde gemessen werden. Der Unterschied

dieser Konstanten (ca. Faktor 16) ist offensichtlich

damit zu erklären, daß im konventionellen

Gerätesystem viel Zeit für die Temperierung

des Metallblockes und der Probengefäße

benötigt wird. Im Rapid-PCR-System

wird die Zeit dagegen effektiv für die Amplifikation

genutzt.

In Abbildung 3 ist die Amplifikation von

drei kurzen Fragmenten des menschlichen

Abb. 3: Amplifikation verschiedener

Fragmente (100, 200, 536 bp)

des beta-Globingens aus genomischer

DNA der menschlichen Placenta.

Drei zeitlich unterschiedliche

Protokolle (Denaturierung-

Annealing-Elongation, in s) wurden

mit unterschiedliche Template-Mengen

(v.l.n.r. 50ng/10ng/1

ng/100pg/10 pg/blank) gestartet,

um die Effektivität der Varianten

darzustellen. Kennziffer 16 LW 03 · www.biocom.de


12 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


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B L I T Z L I C H T

Competitor X

5 h

AJ SpeedCycler

3,25 h

Abb. 4: Amplifikation

eines 5 kb-

Fragmentes aus

Lambda-DNA. Der

Vergleich mit einem

Standard-

Thermocycler unter

Verwendung

eines Standard-

Protokolls zeigt

deutlich die höhere

Effektivität der

Amplifikation im

SpeedCycler.

Lambda. Das in diesem Experiment genutzte

Thermocycler-Protokoll entspricht mit

den Werten für Denaturierung 45 Sekunden

– Annealing 30 Sekunden – Elongation 5 Minuten

– einer Standard-PCR. Der Speed-

Cycler wurde hierbei mit einem Standard-

Thermocycler direkt verglichen. Im Ergebnis

zeigt der SpeedCycler nicht nur einen

schnelleren Verlauf des Experimentes, sondern

auch eine deutlich höhere Ausbeute an

PCR-Produkten. Gleichartige Ergebnisse

(hier nicht gezeigt) wurden im Vergleich mit

anderen Standard-Geräten erzielt, wobei die

Verwendung unterschiedlicher Enzym-Präparationen

und Reaktionskomponenten zeigen,

daß die positiven Ergebnisse tatsächlich

auf das Rapid-PCR-System zurückzuführen

sind.

Abbildung 5 zeigt den Aspekt einer verbesserten

Spezifität der amplifizierten DNA

bei Anwendung der Rapid-PCR-Technologie

des SpeedCyclers. In zwei Experimenten

wurden ein 4 kb Lambda-DNA-Fragment

und ein 24 kb-Fragment aus genomischer

DNA (human placenta) jeweils im direkten

Vergleich im Speedcycler und in einem

Standard-Thermocycler amplifiziert.

Bei der Analyse mittels Agarose-Gelelektrophorese

wurden gleiche Mengen an gewünschtem

PCR-Produkt aufgetragen. In

beiden Fällen zeigen die Ergebnisse des

Standard-Cyclers deutliche Mengen an Nebenprodukten,

die Proben aus dem Speed-

Cycler enthalten nur das spezifische Amplikon.

Da in beiden Experimenten ein Standard-PCR-Protokoll

angewendet wurde, ist

die höhere Spezifität der Ergebnisse aus dem

Speedcycler im wesentlichen auf die hohen

Kühlraten des Cyclers zurückzuführen. Die

Gesamtdauer des long-distance-Protokolls

im Standard-Cycler betrug 8 h 22 min im

Vergleich zu 5 h bei Verwendung des Speed-

Cyclers.

Beta-Globin-Gens auf der Basis von genomischer

DNA dargestellt. Mit den gewählten

Primern wird das Globingen als „singlecopy“-Gen

amplifiziert, wobei eine Templatemenge

von 10 pg etwa drei Kopien entspricht.

Wie sich zeigt, ist eine effiziente Amplifikation

der Fragmente mit den rund 18minütigen

Protokollen möglich. Die Verkürzung

der Elongationszeit von 10 Sekunden vermindert

die Ausbeute, aber auch mit einer Synthesezeit

von 4 s kann das 536 bp-Fragment

noch dargestellt werden. Offensichtlich kann

das SpeedCycler – Rapid-PCR-System die

Prozessivität der Taq-DNA-Polymerase in

hohem Maße nutzen. Ähnliche Ergebnisse

(hier nicht dargestellt) wurden mit anderen

Amplikons in der Größenordnung 100-200 bp

und sehr kurzen Protokollen (1-1-1, 0-0-0, sec)

erzielt.

Abbildung 4 zeigt die Amplifikation eines

5 kb-Fragmentes der DNA des Phagen

4 kb PCR

Template: Lambda DNA

24 kb PCR

Template: human genomic DNA

Fazit

Die von der Analytik Jena AG gemeinsam mit

Wissenschaftlern des Hans-Knöll-Instituts

für Naturstoff-Forschung entwickelte Rapid-Cycle-Technologie

„SpeedCycler“ ermöglicht

die ultraschnelle Amplifikation

von DNA-Fragmenten unterschiedlicher

Größe und Herkunft mit einer deutlich erhöhten

Spezifität der PCR-Produkte. Die

Vorteile einer Rapid-Cycle-PCR sind in dem

vorgestellten System mit den Vorteilen aus

der Anwendung der Peltier-Technik und der

Verwendung einer Mikrotiterplatte als Probenträger

verknüpft.

Literatur

[1] Saiki, R.K., et al., Science 230 (1985), 1350 ff

[2] Mullis, K.B., Scientific American (1990), 56 ff

[3] Saiki, R.K. et al., Science 239 (1988), 487 ff

[4] Kopp et al., Science 280 (1998), 1046-1048

[5] Belgrader et al., J. Forensic Science 43 (1998), 315-319

[6] Wittwer, C.T. et al., Nucl. Acid. Res. 17 (1989), 4353-4357

[7] Wittwer, C.T. et al., In Mullis, K. et al. (Eds.), The polymerase chain reaction.

Birkhauser, Boston (1994), 174 -181

Danksagung

Wir danken der Treff AG, Jenabioscience

GmbH und dem Hans-Knöll-Institut Jena

(Arbeitsgruppe Prof. Dr. Hans-Peter Saluz)

für die Zusammenarbeit.

Korrespondenzadresse

Abb. 5: Amplifikation eines 4 kb-Lambda-Fragments (links) und long-distance-PCR (rechts) eines 24

kb-Fragments aus genomischer DNA. Im Vergleich des SpeedCyclers mit einem Standard-Cycler zeigt

sich in beiden Fällen die höhere Spezifität der PCR-Produkte aus dem Experiment mit dem Rapid-

PCR-Cycler.

Dr. Hanno Hermann

Claus Knippschild

Analytik Jena AG

Konrad-Zuse-Str. 1

D-07745 Jena

Tel.: +49-(0)3641-7770

Fax: +49-(0)3641-779279

eMail: info@analytik-jena.de

www.analytik-jena.de

14 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


B L I T Z L I C H T

Real-time PCR


Highly flexible expression

profiling of human genes

Peter Mouritzen, Peter S. Nielsen, Nana Jacobsen, Mikkel Nørholm, Christian Lomholt,

Henrik M.Pfundheller, Niels B. Ramsing, Sakari Kauppinen, and Niels Tolstrup,

Exiqon, Vedbaek, Denmark

Quantitative real-time RT-PCR has become the method of choice for accurate expression profiling

of selected genes and validation of microarray data. The technique is especially suitable for

analysis of low abundant mRNAs and small samples. We report here on a novel concept for

real-time RT-PCR based on the development of a library of pre-validated detection probes, designated

as ProbeLibrary TM . The probes have been shortened to only 8-9 nucleotides by substitution

with the duplex stabilizing DNA analogue LNA, thereby ensuring adequate compatibility in

standard real-time RT-PCR assays. The use of the short recognition sequences, in turn, makes

it possible to use the same LNA enhanced probe to detect and quantify many different transcripts

thereby allowing targeting of the most frequently recurring short sequence tags in the

human transcriptome. By careful selection and validation of the most common 8- and 9-mer

recognition sequences, we have constructed a library of 90 detection probes with a high coverage

of 98 % of the human transcriptome in the RefSeq database. On average, each mRNA contains

binding sites for 16 ProbeLibrary TM probes, whereas each detection probe recognition sequence

is found in more than 7,000 of the approximately 38,000 human transcripts in humRefSeq. We

were successful in designing functional real-time PCR-based expression assays for 98% of the

80 most cited mRNA transcripts in the human RefSeq database.

Despite its widespread use in mRNA quantification,

real-time RT-PCR is still a complex

technique with many pitfalls associated with

its true specificity, sensitivity and reproducibility

1 . The design of functional real-time RT-

PCR assays is both time-consuming and laborintensive.

Thus, the time spent on assay design,

oligonucleotide synthesis, and assay vament

of a library of 90 pre-validated real-time

PCR detection probes, designated here as ProbeLibrary,

which have been shortened from

the conventional 20-30 nucleotide DNA detection

probes to only 8-9 nucleotides, thereby

allowing targeting of the most frequently recurring

short sequence tags in the human

transcriptome. To ensure compatibility with

BioDigital

2004

www.biodigital.de

International Trade Fair

and Conference on

IT and Instrumentation

for Pharmaceutical and

Systems Biology Research

October 13 - 15, 2004

Messe Freiburg

Freiburg i. Br. - Germany

Bioinformatics

Life Science IT / Software

Platform Technologies for

Drug Discovery

Computing +

IT Platforms / Hardware

Analytical Technologies

Lab Supply / Services

Figure 1: The coverage of the human ProbeLibrary.

lidation is often a bottleneck in the development

and implementation of new expression

profiling assays for large-scale analyses. Although

many commercially available, readyto-use

real-time RT-PCR assays are available,

they are expensive and lack flexibility, due to

the fact that they are highly transcript specific

and therefore each transcript requires a different

probe. Furthermore, these assays often target

single exons or exon-exon splice junctions,

and thus, quantification of mRNA splice variants

would require synthesis of several probes.

We report here on a novel concept for versatile,

real-time RT-PCR based expression profiling

of 98% of the human protein-coding

transcripts in the human RefSeq database at

NCBI. The method is based on the develop-

standard real-time RT-PCR methods, where

annealing and extension is carried out at 60 o C,

we have substituted the probes with the highaffinity

nucleotide analogue locked nucleic

acid (LNA) 2 . We have also developed a new

software, ProbeFinder, which enables fast

design of optimal real-time PCR assays for

gene expression analysis by combining the

ProbeLibrary probes with target-specific

PCR primers selected using the Primer3 software.

The specificity of each real-time RT-PCR

assay relies on the combination of gene-specific

PCR primes and the selected ProbeLibrary

detection probe, thus avoiding the many

Kennziffer 17 LW 03 · www.biocom.de


Partners

Organizers

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 15

Messe Freiburg


B L I T Z L I C H T

Fig. 2: Design of real-time RT-PCR assays using the ProbeFinder software. The software designs real-time PCR assays for the entered nucleotide sequence

and displays each assay in a table format by the ProbeLibrary probe identifier and the primer pair. An overview of the transcript is given with the

intron positions and the ProbeLibrary assays indicated along with the mRNA sequence. In addition, a detailed view of the real-time PCR assays depicts the

positions of the PCR primers as well as the detection probe binding sites within each PCR amplicon.

problems associated with unspecific real-time

PCR assays, such as SYBR Green assays.

Chemicals and reagents

The following Assay-on-Demand gene expression

products from Applied Biosystems

were used: Hs00184491_m1 ABCB1 for human

MDR gene; Hs00233463_m1 for human

ALOX5AP gene; and Hs99999905_m1 for human

GAPDH, together with TaqMan ® Universal

PCR Master Mix, No AmpErase ® UNG and

SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems,

USA). All assays were performed according

to the manufacturer’s instructions. In

addition the following reagents were used in

the study: QuantiTect Probe PCR Master Mix

(Qiagen, USA); the ROX Reference Dye and

SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen,

USA), Quantitative PCR Human Reference

Total RNA (Stratagene, USA), and human

ProbeLibrary detection probes (Exiqon,

Denmark).

Real-time RT-PCR

The real-time RT-PCR assays were designed

using the ProbeFinder software, accessible

at www.probelibrary.com. A standard method for

first strand cDNA synthesis was used employing

1 µg of a human total RNA pool of 10

cell lines (Quantitative PCR Human Reference

Total RNA, Stratagene, USA), random hexamer

primers and SuperScript II reverse transcriptase.

Following spin column purification,

the volume of the cDNA preparation was adjusted

to 100 µL per 1 µg input total RNA and

1 µL used as template in the real-time PCR reactions.

The real-time RT-PCR assays were

performed in triplicate in a 50 µL reaction volume

using QuantiTect Probe PCR mastermix

(Qiagen, USA) according to the manufacturers’

instructions with a primer concentration

of 0.2 µM and ProbeLibrary detection

probe concentration of 0.1 µM. The real-time

PCR assays were carried out on an ABI Prism

7000 using an enzyme activation step of 7 minutes

at 95°C, followed by 40 cycles of PCR

with a 20 second denaturation step at 94°C and

a 1 minute extension step at 60°C.

Data analysis

The performance of assays was validated on

the following parameters: shape of the realtime

PCR plots, development of fluorescence,

the derived cycle threshold (Ct) value, and

end-point analysis by gel electrophoresis for

Fig. 3: Comparison of ProbeLibrary realtime

RT-PCR assays with TaqMan Assay-ondemand

assays. Real-time PCR amplification

plots for human GAPDH (triplicates) derived

from five 10-fold serial dilutions of the same

human template cDNA pool, performed on the

ABI PRISM 7000. The ProbeLibrary-based

amplification plots are depicted in red and Assay-on-Demand-based

plots in green.

yield estimation and confirmation of amplicon

size. Assays were categorized as having

failed (i) if no increase in fluorescence (∆F) was

observed, (ii) if the real-time PCR amplification

plot had a non-sigmoid shape, (iii) if the

amplicon size was incorrect, (iv) if more than

one amplicon was generated, or (v) if the PCR

product yield was too low. The data (Rn and

Ct values) were exported to Excel for further

analysis to produce calibration curves and to

calculate PCR efficiencies.

Results and Discussion

Large-scale expression analysis is increasingly

important in many areas of biological research

aiming at deciphering complex biological systems,

thereby greatly facilitating the understanding

of basic biological processes as well

as human disease. Quantitative real-time RT-

PCR has become the method of choice for accurate

expression profiling of selected genes

and validation of microarray data, and is especially

suitable for analysis of low abundant

mRNAs and small samples 1,3 . However, realtime

RT-PCR is often hampered by the labourintensive

assay design and validation, which

significantly lowers its throughput compared

to genome-wide expression profiling by DNA

microarrays. In response to this, we have developed

a new method based on the development

of a library of 90 pre-validated real-time

PCR detection probes, which target the most

frequently occurring short sequence tags in the

human transcriptome. As demonstrated it is

possible to reduce the length of real-time RT-

PCR probes to only 8-9 nucleotides given the

significantly increased duplex thermal stability

of LNA substituted probes. In turn, the use

of the short recognition sequences makes it

possible to use the same LNA-enhanced pro-

16 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


B L I T Z L I C H T

be to quantify many different transcripts. On

average, each mRNA contains binding sites for

16 ProbeLibrary probes, whereas the recognition

sequence of each detection probe is

found in more than 7,000 of the 38,556 human

transcripts in the RefSeq database at NCBI. In

total, 98% of the RefSeq transcripts are targeted

by at least one probe and 90% of transcripts

are targeted near an exon-exon junction

according to Ensembl gene structure predictions

(Fig. 1). The latter enables design of intron

spanning assays, eliminating amplification

of genomic DNA that may contaminate

RNA samples. Based on the Ensembl gene

structure prediction, our calculations showed

that 35% of all exons in human transcripts are

targeted by a probe, and for a number of genes

this may facilitate design of assays for different

splice variants.

A new software, ProbeFinder (access at:

www.probelibrary.com), enables design of realtime

PCR assays for gene expression analysis

by combining the ProbeLibrary detection

probe concept with target-specific PCR primers

selected using the Primer3 software (Fig.

2). Once the mRNA of interest has been entered

into the ProbeFinder program, the software

identifies the intron positions and selects

the ProbeLibrary probes and primer

pairs for each real-time PCR assay. The intron

positions are identified within the transcript

with the aim of designing amplicons that span

exon-exon splice junctions for real-time PCR

assays, either by prediction, a look-up in Ensembl

or by the positions marked in the mRNA

sequence.

To compare the sensitivity of ProbeLibrary-based

real-time RT-PCR assays with those

of the Applied Biosystems Assay-on-Demand

TM assays, 10-fold serial dilutions of the

same human first-strand cDNA pool were

used as templates for human GAPDH realtime

PCR. The data obtained with the two

detection systems revealed nearly identical

amplification plots and Ct values (Fig. 3), indicating

that the performance of the two assay

types is highly comparable. Similar results,

including SYBR Green real-time PCR data,

were obtained for the human MDR1 and the

ALOX5AP transcripts (results not shown).

Next, we assessed the success rate of Pro-

Tab.: Evaluation of 80 human ProbeLibrarybased

real-time PCR assays designed by the

ProbeFinder software.

Assay Category

Result

Successful assays 1) 78 2)

Total number of failed designs 2 3)

Total number of validated assays 80

Assay Design Success Rate: 98%

1)

Real-time PCR plot sigmoid, fluorescence signal ample, and a single amplicon

of correct size, 2) 6 of these assays were successful in a second round in which

another assay was selected from the list of assays suggested by ProbeFinder‘.

3)

Low or insignificant amount of amplicon / No increase in fluorescence

beLibrary based real-time RT-PCR by designing

expression assays for the 80 most cited

mRNA transcripts in the human RefSeq database.

The RefSeq transcripts were selected

from the top of a list generated by sorting the

RefSeq entries according to the number of literature

citations within these. The assays were

designed by submitting the mRNA RefSeq

sequence IDs to the ProbeFinder software

with the intron spanning assay feature enabled

in the software in order to obtain splice

junction spanning PCR amplicons. Of the individual

assays designed for 80 different human

mRNAs, a total of 78 were successful –

72 of these in the first real-time PCR run –

which equals to an assay success rate of 98 %

(see Table). This clearly shows that the Probe-

Library probes combined with the ProbeFinder

design software provide a robust expression

profiling platform useful for high-throughput

expression analysis.

In conclusion, the results presented here

demonstrate that the ProbeLibrary assays

perform equally well in real-time PCR compared

to Assay-on-Demand assays, while simultaneously

providing a more flexible platform,

since a library of 90 detection probes can

be used to cover the entire human transciptome.

On the other hand, the ProbeLibrary

assays exhibit high assay specificity avoiding

the possible problems with primer dimer-derived

fluorescence, often associated with SYBR

Green real-time PCR assays. In the present study

we were successful in designing functional

real-time PCR-based expression assays for

98 % of the 80 most cited mRNA transcripts in

the human RefSeq database at NCBI. On average

each transcript in the RefSeq database is

targeted by 16 probes in the ProbeLibrary,

and thus, a failed real-time PCR assay was

easily replaced by selecting an alternative assay

suggested by the ProbeFinder software.

References

[1] Bustin SA, 2000. J. Mol. Endocrinol. 25: 169-193.

[2] Koshkin AA, Singh SK, Nielsen P, Rajwanshi VK, Kumar R, Meldgaard M,

Olsen CE and Wengel J, 1998. . Tetrahedron 54: 3607–3630.

[3] Liss B, 2002. Nucleic Acids Res. 30 (17) e89.

Contact

Peter Mouritzen, Ph.D., Manager

Department of New Technologies, Exiqon

Bygstubben 9,

DK-2950 Vedbaek, Denmark

Phone: +45-45-65040888

Fax: +45-45-661888

eMail: pm@exiqon.com

Kennziffer 18 LW 03 · Informationen ordern · www.biocom.de

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solution for DNA /RNA-preps from blood, tissue, bacteria, food, plants ...

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genotyping

virus detection

GMO-testing

expression profiling

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High speed, 15 min. for 96 blood samples.

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Arnold - Sommerfeld-Ring 2, D- 52499 Baesweiler, Fon +49(0)2401 - 80 55 00, Fax +49(0)2401 - 80 55 19

info@chemagen.com, www.chemagen.com

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 17


.

.

.

.

.

.

.

.

l

l

(

,

l

l

.

MARKTÜBERSICHT

Marktübersicht: DNA-Aufreinigung

Dr. Katharina Stein

GE Healthcare - Bio-Sciences

Amersham Biosciences Europe GmbH

Tel.: +49-(0)761-4903-490, Fax: -4903-405

eMail: cust.servde@amersham.com, www.gehealthcare.com

AG

Biopolymer-Technologie

chemagen

2

Arnold-Sommerfeld-Ring

D-52499 Baesweiler

Tel.: +49-(0)-2401-805500, Fax: -805519

www.chemagen.com, info@chemagen.com

Janke

Beckman Coulter GmbH

Europark Fichtenhain B13

D-47807 Krefeld

Ansprechpartner: Dietmar

Tel.: +49-(0)-02151-3335

Janke

1 Firmendaten, Ansprechpartner

Beckman Coulter Gmb H

Europark Fichtenhain B13

D-47807 Krefeld

Ansprechpartner: Dietmar

Tel.: +49-(0)-02151-3335

2 Produktname

0

Biomek

300

B iomek NX, Biomek F X

c hemagic Magnetic Separation Module I

GFX Micro Plasmid Prep Kit 27-9601-02 •

GFX96 PCR Purification Kit, 96 well, 25-6902-02

O ffenes automatisches Pipettiersyste

O ffene automatische Laborpipettiersystem e Innovativer Magnetseparator zur Nukleinsäure-

un d Vorgepackte GFX (Glasfasermatrix)-Säulchen zum

Proteinpräparation mittels Magnetpartikeln Gebrauch in der Tischzentrifuge, bzw. 96-well plate-

Format zum Einsatz in 96-well plate-Zentrifugen •

Aufreinigung nach dem Prinzip der modifizierten

alkalischen Lyse mit anschließender chaotroper

Salzbehandlung. Elution erfolgt in Niedrigsalz-Puffer

Molekulare Genetik und Biotechnologie

Pharmascreening • Molekulare Genetik und Probenvorbereitung mittels Magnetpartikeln bei Zur schnellen Extraktion von Plasmidoder

Cosmid-

Qualitätskontrolle in der Brauerei •

Biotechnologie • Zellkommunikation (Caspase, extremer Flexibilität der eingesetzten

D NA aus E . col i Eluierte DNA einsetzbar in PCR -

Zellkommunikation

Interleukine)

P robenvolumina von 1 µ bis 10 ml und bei hohe r Amplifikation, Restriktionsverdau, Subklonierung,

Geschwindigkeit • DNA- und mRNA-Aufreinigung Transformation oder Labelling

aus unterschied-lichsten biologischen

• Auch Proteinaufreinigung

3 Kurzbeschreibung des Produktes

m

4 Einsatzgebiet


Probenmatrices

möglich

Zell-Lyse mit Lösungen I-III, Zentrifugation in Mikrofuge,

Lysat wird anschließend an die Matrix gebunden, Matrix

waschen, Elution der DNA mit Wasser oder

Niedrigsalzpuffer

5 Arbeitsprinzip


18

zentrifugenabhängig: z.B.

min.• Im 96-well-Format

min durchführbar

Durchsatzbereich

Aufreinigungen pro

Aufreinigungen in

6 Durchsatzbereich/Durchsatz pro Tag

-

96

sind

ist

30


.

.

.

.

.

.

.

)

;

,

)

I

(

,

(

DNA-AUFREINIGUNG

7.

8.

1 Firmendaten, Ansprechpartner

Hamilton Deutschland Gmb H

Fraunhoferstr. 17, D-82152 Martinsried

Tel.: +49-(0)-89-552649-0, Fax: +49-(0)-89-552649-10

eMail: info.de@hamiltonrobotics.com

www.hamiltonrobotics.com

Ansprechpartner: Jürgen Dierdorf

2 Produktname

t

3 Kurzbeschreibung des Produktes

n

Invitek Gesellschaft für Biotechnik und

Robert-Rössle-Str. 10, D-13125 Berlin

Tel.: +49-(0)30-9489-3796

Fax: +49-(0)30-9489-3795

eMail: info@invitek.de, www.invitek.de

Ansprechpartnerin: Dr. Ockhardt

Biodesign

Invitek Gesellschaft für Biotechnik und

Robert-Rössle-Str. 10, D-13125 Berlin

Tel.: +49-(0)30-9489-3796

Fax: +49-(0)30-9489-3795

eMail: info@invitek.de, www.invitek.de

Ansprechpartnerin: Dr. Ockhardt

M icrolab STAR und Microlab STARle

M S B

® ® ®

HTS

Rapac e

I nvisor b RNA Cell HTS Kit

N ucleoSpin

Extract I

Liquid Handling-Workstations mit 4-16 unabhängig

Pipettierkanälen und optionalem 96er-Pipettierkopf

positionierbare

4 Einsatzgebiet

c

B iotech, Pharma, akademische Forschung, Veterinär, Forensics et Microarrayanwendungen, Sequenzierung ,

Klinische und molekular-biologische Forschung

klinische, molekularbiologische und forensische

Diagnostik, Veterinärmedizin,

Lebensmittelanalytik

5 Arbeitsprinzip

-

Liquid Handling-Workstation basierend auf

Pipettier-Prinzip – ohne Systemflüssigkeiten

dem Air Displacement

und Schlauchsysteme

6 Durchsatzbereich/Durchsatz pro Tag

h

Beschreibung Kit (Prinzip/Einsatzbereich/

DNA o. RNA-Qualität etc.)

®

I nvisorb RNA Cell HTS kombiniert ein extre m

schnelles Verfahren mit hohen reprodzierbaren

Ausbeuten an hochreiner total-RNA. Der mit

DNA beladene Träger wird nach der Lyse

mittels einer Prefilterplatte vom RNA-haltigen

Lysat abgetrennt. Anschließend RNA-Gewinnung

• kurze Präparationszeiten • hochreproduzierbare

Ausbeuten – gute RNA-Qualität •

®

g eeignet für Gebrauch auf Invisorb Vacuu m

Manifold, Zentrifuge oder auf Robotern

Zentrifuge: ca. 30 min für 1x96 Präparationen

Vakuum: ca. 40 min für 1x96 Präparationen

Roboter: ca. 50 min für 1x96 Präparationen

Invisorb-Technologie • Isolierung hochreiner

RNA frei von genomischer DNA, ohne DNase •

Verdau mit hohen und reproduzierbaren Aus-

5

b euten • Ausgangsmaterial: (50 - 5 x 10 )

humane oder tierische Zellen • exzellent e

Qualität: A260:A280; 1,8-2,0 • Ausbeute: (1 x

1 0

5 Z ellen NIH 3T3 6, 5 µ g MRC 1 µ g • Zeit -

dauer: 30–50 min • Downstream: quantitative

RT-PCR (einschl. TaqMan-Analysen, Light Cycler

etc. Expressionsprofiling, Knock-out-Studien,

Targetvalidierung, HTS-Drug-Screening

Microlab STAR mit 8 Pipettierkanälen: 8-16 Platten pro Tag (je nac

Applikation) • Microlab STARlet: mit 4 Pipettierkanälen 4-10 Platten pro

Tag (je nach Applikation)

Plasmid-DNA-Aufreinigung • PCR-Aufreinigung • Genomische DNA-

Isolierung aus Blut und Gewebe • RNA-Aufreinigung • Automatisierung

von Kits verschiedener Hersteller möglich

Beschreibung Robotiksystem

8 .1 Probengefäße

s

Röhrchen verschiedener

Blut • Eppendorf Cups

Zellen •

Positioniergenauigkeit in

Größe

oder MTP

oder

für

DW-Platten für

RNA-Isolierung

gDNA-Isolierung

aus Gewebe oder

8 .2 Ortsauflösung

m

8 .3 Liquid-Handling-Werkzeuge

-

X-Y-Z:

0,1m

au

Biodesign

einfach zu handhabendes und optimiertes

System für parallele Isolation von qualitativ

hochwertiger total-RNA aus 96 Proben

5

h umaner bzw. tierischer Zellinien (50 - 5 x 10 )

in nur 30min und ohne DNase-Verdau

®

N ucleoSpin Extract II für PCR Clean-up un d

Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarose-

gelen erlaubt die quantitative Extraktion sehr

k leiner DNA-Fragmente ≥ 65 bp) und ein

Aufkonzentrieren der DNA-Eluate (reduziertes

E lutionsvolumen, 15 µ l). Neben Verkürzung de r

hands-on-time und Kompatibilität zu den

gängigen PCR-Systemen erfolgt eine voll-

ständige Entfernung der Primer selbst von

kleinen PCR-Fragmenten. Einsatzgebiet: PCR-

Clean-up und Extraktion von DNA-Fragmenten

aus Agarosegelen

DNA-Bindung an eine speziell behandelte

Silikamembran unter Verwendung eines darauf

optimierten Bindungspuffers (chaotropes Salz).

Effiziente Entfernung von Kontaminanten durch

nur einen Waschschritt. Elution der DNA unter

Niedrigsalzbedingungen.

Klinische, immunologische, onkologische und

molekularbiologische Forschung, Expressionsprofiling,

Knock-out-Studien, Targetvalidierung

MSB-Technologie kombiniert Vorteile eines

schnellen Verfahrens mit hohen Rückge-

winnungsraten hochreiner PCR-Produkte •

Aufreinigung von PCR-Produkten ohne Waschen

und Trocknen • Rückgewinnungsraten nahezu

unabhängig von Additiven, dem PCR-Volumen und

der Fragmentgröße für ultra-HTS-Anwendungen

geeignet • Kit ist geeignet für Gebrauch auf

®

I nvisorb Vacuum Manifold, Zentrifuge oder au f

Robotern

Zentrifuge: ca. 15 min für 4x96 Präparationen •

Vakuum: ca. 10 min für 1x96 Präparationen •

Roboter ca. 10 min für 1x96 Präparationen

MSB-Technologie • Aufreinigung/Konzentrierung

von PCR-Produkten ohne Waschund

Trockungs-

schritt mit flexiblem Elutionsvolumen • Ausgangsmaterial:

Amplifizierte DNA-Fragmente

(80bp - 30kb) • Rückholrate 90% • Zeitdauer: 10-

15 min • Downstream: Sequenzierung,

Microarray-Anwendungen, Klonierung,

Hybridisierung, Labeling

8 .4 Steuerung


8 .5 Einsatzmöglichkeiten

,

9 Service/Anzahl Servicetechniker Deutschland

n

1 0. Basispreis (Euro)

0

M icrolab STARlet ab 43.00 g

M icrolab STAR ab 72.000 g

Z entrifuge for 2x96 preps 75 g • Vakuum for 2x9 6

p reps 57 g • Roboter for 2x96 preps 5 7 g • bis

zu 50x96 preps lieferbar

Z entrifuge for 2x96 preps 372 g • Vakuum fo r

2 x96 preps 358 g • Roboter for 2x96 preps 36 5

• bis zu 24x96 preps lieferbar

2

MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG

Technischer Support Bioanalytik

Neumann-Neander-Straße 6-8, D-52355 Düren

Tel.: +49-(0)-2421-969-270 oder -275

Fax: +49-(0)-2421-969 -279

eMail: tech-bio@mn-net.com, www.mn-net.com

für die parallele Aufreinigung und /oder Konzentrierung

von 96 PCR-Produkte (80bp-30kb) von

Nukleotiden, Primern, Additiven, Enzymen,

Mineralölen, Puffern und Salzen in 10-20 min

ohne Wasch-

und Trocknungsschritt

Applikationen in 1 Kit, nur 1 Puffer für PCR

Clean-up und Extraktion von DNA-Fragmenten

aus Agarosegelen, vollständige Entfernung von

Primern, hohe DNA-Wiederfindungsrate (> 90

% sogar für sehr kleine DNA-Fragmente ≥ 6 5

b p), reduziertes Elutionsvolumen (15 µ l) ,

Kompatibilität zu den gängigen PCR-Systemen,

schnelles Verfahren

®

N ucleoSpin Extract II, 10 Präparationen, 19. -

g , 50 Präparationen, 70. - g 250 Präparationen ,

Anzahl Pipettierkanäle (STAR): 4,8, 12 oder 16 mit Option für 96er

Pipettierkopf • Anzahl Pipettierkanäle (STARlet): 4 oder 8 •

Volumenbereich: 0,5ul – 1ml • Pipettierprinzip: Air Displacement-System

ohne Systemflüssigkeit und Schlauchsysteme • Gleichzeitiger Einsatz von

Tips und Stahlnadeln ist möglich dank CO-RE-Technologie • Liquid Level

Detection (LLD): sowohl kapazitive als auch druckbasierende LLD an jedem

einzelnen Kanal • Einzelkanalantrieb: freie Positionierung jedes Kanals in

y- und z-Richtung • Waschstation: erhältlich mit drei voneinander unab-

hängigen Waschmodulen für ein kontinuierliches Pipettieren ohne

Wartezeiten während des Waschens • Schutz vor Kreuzkontaminationen:

dank weicher Tipaufnahme und -abgabe mit CO-RE-Technologie praktisch

keine Verschleppung, falls sehr kritisch, können zusätzlich Filtertips

verwendet werden • Integration in Laborumgebungen: Fremdgeräte (Bsp.

Reader, Cycler, Platesealer etc.) können entweder mit internem Greifarm

oder zusätzlichem externem Greifarm integriert werden

Ansteuerung von Fremdgeräten wird in Hamilton-Software integriert

Integration in LIMS-Systeme ist möglich über Filehandling (Bsp. Excel

Tabellen, Access, Text-Dateien etc.)

zusätzliche Applikationen: PCR Setup, Sequenzierreaktionen, DNA-Verdau

Beladung von Gelen

5 Persone

5 Mitarbeiter im Servicebereic h

5 Mitarbeiter im Servicebereic h

3 19.- g

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 21


.

.

.

.

.

.

.

I

I

,

i

MARKTÜBERSICHT

1 Firmendaten, Ansprechpartner

MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. K G

Technischer Support Bioanalytik

Neumann-Neander-Straße 6-8

D-52355 Düren

Tel.: +49-(0)-2421-969-270 oder

Fax: +49-(0)-2421-969 -279

eMail: tech-bio@mn-net.com

www.mn-net.com

-275

PEQLAB

GmbH

Carl-Thiersch-Str.

D-91052 Erlangen

2

www.peqlab.de

Ansprechpartner: Dr.

Tel: +49 (0)9131-610

B

Karin

70

20,

Kriener

Fax:

+49

(0)9131-610

70

99,

info@peqlab.de

PlasmidFactory

Meisenstr. 96

GmbH

&

Co.

KG

D-33607 Bielefeld

Tel.: +49-(0)-521-2997350,

eMail: nfo@plasmidfactory.com

www.plasmidfactory.com

Ansprechpartner: Dr. Martin Schleef

2 Produktname

n

®

N ucleoSpi NA I I

R X iril Robotic Workstation s

Research Grade Plasmid DNA Production Servic e

3 Kurzbeschreibung des Produktes

n

®

N ucleoSpi RNA II zur Extraktion von Gesamt-RNA aus Zellen un d

Gewebe inklusive Vorfiltration des Lysates (Homogenisierung, Reduktion

der Viskosität) und optimierter DNase I-Behandlung direkt auf der

Silikamembran (Vorfilter und DNase im Kit enthalten).

Kostengünstige Hochleistungsroboter für Nukleinsäure-Aufreinigung und

weitere Applikationen. Vereinigen solide Technologie, hohe Präzision und

größtmögliche Flexibilität

4 Einsatzgebiet

e

I solierung von Gesamt-RNA aus Zellen und Geweb

I solierung von DNA und RNA aus verschiedensten Ausgangsmaterialie n Transfektionen, Virus-Produktion und VLP, siRNA, Referenzplasmide n

Kits, DNA-Vakzine und Gentherapie-Forschung

5 Arbeitsprinzip

-

RNA-Bindung an eine speziell behandelte Silikamembran unter

wendung eines darauf optimierten Bindungspuffers (chaotropes

Entfernung von genomischer DNA durch DNase I-Behandlung

Silikamembran sowie Entfernung der Kontaminaten durch

der

Waschpuffer

Ver

Salz).

direkt auf

spezifische

Plasmid-DNA für Forschung, Entwicklung, Prä-Klinik; Kultivierung Tierfrei

und ohne Antibiotika; CGE-Analyse der Plasmid-Topologie; Entfernung

von LPS-Endotoxinen, DNA, RNA, Proteinen

M agnetic bead-Separation bzw. Festphasenextraktion

Service (ähnlich Sequenzierservice: Kunde schickt eine kleine Probe de r

Plasmid-DNA und PlasmidFactory produziert die gewünschte Menge,

portioniert sie im Puffer der Wahl des Kunden und prüft die Qualität. Das

Produkt wird auf Trockeneis inkl. Qualitätskontrollbericht durch

Kurierservice ausgeliefert) • Mehrstufiges eigenes Chromatographie-

verfahren • Qualität: LPS-Endotoxin-, RNA-, DNA-, Protein- Entfernung

und Prüfung

6 Durchsatzbereich/Durchsatz pro Tag

n

®

N ucleoSpi RNA II ist auch im 8-well-

und 96-well-Format sowie al s

Midi-Kit erhältlich.

5 bis 10 96 well-Platten/Tag

Maßstab nach Bedarf (1 mg bis 25 g )

7.

Beschreibung Kit (Prinzip/Einsatzbereich/

DNA o. RNA-Qualität etc.)

®

N ucleoSpin -Filter zur Homogenisierung und Reduktion der Viskosität vo n

Lysaten enthalten • quantitative Entfernung von genomischer DNA durch

Behandlung der Silikamembran mit einem Puffer zur Membranentsalzung

und

somit optimierter, nachfolgender DNase I-Behandlung • DNase un d

z ugehöriger Reaktionspuffer sind im Kit enthalten • bis zu 70 µ g direk t

v erwendbarer Gesamt-RNA, A260/280: 1.9-2.1 • Bindungskapazität: 100 µg

R NA • Elutionsvolumen: 40 - 120 µ l (empfohlen: 6 0 µ l) • hands-on-time :

6

< 30 min/6 Präparationen • RNA aus bis zu 5x10 oder nur 10 kultivierte n

Zellen, 30 mg Gewebe • RNA direkt einsetzbar in gängigen

Nachfolgeapplikationen wie RT-PCR, TaqMan-Analyse, Blotting, Microarray

Isolation von hochreiner, hochmolekularer genomischer

Plasmid-DNA sowie von Total-RNA im 96-well-Maßstab;

direkt für sämtliche Nachfolgeanwendungen einsetzbar,

RT-PCR und Real Time-RT-PCR

DNA, von

DNA und

wie z.B.

RNA

PCR,

8.

Beschreibung

Robotiksystem

8 .1 Probengefäße

)

variabel

(z.B.

0,2

ml

Tubes,

96

well-Platten,

384

well-Platten,

Falcons

8 .2 Ortsauflösung

± Z

0.2

mm bei

X/Y/

8 .3 Liquid-Handling-Werkzeuge

0

b is zu 4 Pipettierkanäle/Arm mit 2-25 µ l - bzw. 10-10.00 0 µ l-Pumpe n

erhältlich; für abwaschbare Stahlspitzen und/oder Einwegspitzen; 96er-

Kopf ab Herbst 2004; Flüssigkeitserkennung durch Drucksensor;

Einzelkanalbetrieb möglich; Kanäle mit verstellbaren Spitzen-Abständen;

und Klümpchen-Erkennung unabhängig für jeden

Flüssigkeitsstand-

Kanal

8 .4 Steuerung

-

2–6 Hochgeschwindigkeits-CAN bus-Schnittstellen

ntegration; Steuerung über Lirix-Software-Paket

und MS VisualBasic)

zur Fremdgeräte

(basierend auf MS

I

+

C

+

8 .5 Einsatzmöglichkeiten

,

Verdünnungen,

u.v.m.

9 Service/Anzahl Servicetechniker Deutschland

r

v or Ort/ 2 Servicetechnike

Technischer Service für EU und DE in Bielefeld (Tel.: 0521 299 7350 )

1 0. Basispreis (Euro)

n

Vorbereitung von PCRs, Sequenzierungen und anderen Reaktionen

Nukleinsäure-Extraktion, Umpipettierungen, Verdünnungen und Vor-

Aliquotierung, Archivierung, Mischen von Flüssigkeiten

®

N ucleoSpi R NA II, 20 Präparationen, 76. - g , 50 Präparationen, 18 0 g 25 0

®

P räparationen, 786 g • NucleoSpin

8 RNA, 12 / 60 x 8 8-well strips, 320. -

®

g / 1.399. - g • NucleoSpin

9 6 RNA, 2 / 4 / 24 x 96-well Platten, 525. - g/

9 60.- g / 5.222. - g

G rundgerät ohne Zubehör ab 22.300,– g A b 29, – g /m g

22 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


.

.

.

.

.

.

.

.

:

:

DNA-AUFREINIGUNG

7.

1 Firmendaten, Ansprechpartner

Promega Gmb H

l 0

l 0

QIAGEN

GmbH

Qiagen-Straße

D-40724 Hilden

1

Ansprechpartnerin: Barbara Sürth

Tel.: +49-(0)-2103-29-12400, Fax:

eMail: techservice-de@qiagen.com

+49

(0)1033-29-22000,

QIAGEN

GmbH

Qiagen-Straße

D-40724 Hilden

1

Ansprechpartnerin: Barbara Sürth

Tel.: +49 (0)2103-29-12400, Fax:

eMail: techservice-de@qiagen.com

® ® ®

W izar SV

96 Genomic DNA Purification Syste m W izar d M agneSil

P CR Clean-Up Syste m

B ioRobot EZ1 Workstation und EZ1 Kit s

BioRobot M48 Workstation und M48 Kit s

4 Einsatzgebiet

g

5 Arbeitsprinzip

e

+49

(0)1033-29-22000,

6 Durchsatzbereich/Durchsatz pro Tag

A

Beschreibung Kit (Prinzip/Einsatzbereich/

DNA o. RNA-Qualität etc.)

vakuumbasiertes

Aufreinigung von

Format. DNA ist

geeignet.

Bind - Wash - Elute-System für

genomischer DNA im 96 well

für alle gängigen Applikationen

8 Beschreibung Robotiksystem

,

8 .1 Probengefäße

m

die

im

bp

Niedriger

Tag

MagAttract Virus Mini M48 Kit: Zur Aufreinigung von

Nukleinsäuren aus verschiedenen DNAund

RNA-

Viren aus Serum und Plasma für die hochsensitive

Detektion in Downstream-Applikationen • Parallele

Aufreinigung von 6-48 Proben auf dem BioRobot M48-

System ohne nachweisbare Kreuzkontamination •

Sensible Detektion einer Vielzahl von DNA-und RNA-

Viren. Lineare Nukleinsäure-Ausbeuten erlauben

genaue quantitative Analysen für niedrige und hohe

virale Titer.

System zur vollautomatisierten Aufreinigung von

Nukleinsäuren anhand von Magnetpartikel-

Technologie mit einer Vielzahl von spezialisierten

Applikationen (DNA/RNA-Aufreinigung, virale und

bakterielle gDNA)

6-48 Proben/Run, in 1,5- bzw. 2 ml-Proben- und

Elutionsgefäßen. Reagenzienvolumina werden

automatisch anhand der Probenanzahl berechnet.

geeignet für alle gängigen Automationsplattformen f ür gängige Liquidhandling-Plattformen geeignet System zur vollautomatisierten Aufreinigung vo n

entsprechende Scripte sind online verfügbar.

Nukleinsäuren (DNA von Blut und Gewebe, RNA von

Zellen und Gewebe, gDNA von Bakterien und viele

weitere Probentypen) anhand von Magnetpartikel-

Technologie

9 6-well-Mikrotiterplattensyste

9 6- und 384-well-Forma t

1-6 Proben/Run, in 1,5- bzw. 2 ml-Proben- un d

Elutionsgefäßen. Reagenzien werden in vorgefüllten

Reaktionskartuschen geliefert.

8.2 Ortsauflösung

8 .3 Liquid-Handling-Werkzeuge

t

8 .4 Steuerung

-

Mittlerer

Tag

Schildkrötstraße 15

D-68199 Mannheim

T e

. +49 (0)-621-8501-

Fax: +49 (0)-621-8501-222

eMail: de_techserv@de.promega.com

www.promega.com

2 Produktname

d

3 Kurzbeschreibung des Produktes

,

Promega GmbH

Schildkrötstraße 15

D-68199 Mannheim

T e

. +49 (0)-621-8501-

Fax: +49 (0)-621-8501-222

eMail: de_techserv@de.promega.com

www.promega.com

Aufreinigung genomischer DNA aus Gewebe

A ufreinigung von PCR-Fragmenten im 96-well-Format • Schnelle, automatisierte Niedrig-Durchsatz -

Vollautomatische Nukleinsäureaufreinigung einer

Zellkultur und Pflanzenmaterial im 96-well-Format

Nukleinsäure-Aufreinigung einer Vielzahl klinisch Vielzahl klinischer Proben. Die qualitativ hochwertigen

relevanter Probentypen. • Minimale Benutzer-

Nukleinsäuren sind fertig für den direkten Gebrauch

interaktion • Flexibel und vielseitig, für alle

in sensiblen Downstream-Applikationen.

verschiedenen Labortypen

geeignet für manuelle und automatisierte Aufreinigun v ollautomatisierte Aufreingung von PCR-Fragmenten G enexpressions-Analysen und klinische Forschun g Genexpressions-Analysen und klinische Forschun g

genomischer DNA im 96-well-Format

®

Bindung der DNA an Silica-Membran, Waschschritt B indung von DNA an MagneSil (paramagnetisch e • Aufreinigung von qualitativ hochwertigen

• Vollautomatisierte Nukleinsäure-Aufreinigung einer

durch Zentrifugation oder Vakuum, Niedrigsalzelution Partikel), Niedrigsalzelution, magnetische Aufreinigung, Nukleinsäuren von klinisch relevanten Probentypen, z.B. Vielzahl klinischer Proben, von 6-48 Proben per Run

keine Vakuum-

bzw. Zentrifugationsschritte notwendig Blut • 1-6 Proben werden innerhalb von

(in Vielfachen von 6) • Standardisierte Bearbeitung

15-20 Minuten verarbeitet. Magnetpartikel-Technologie und erprobte MagAttract-Magnetpartikel-Technologie

ermöglicht sehr schnelle Aufreinigung in einem Schritt. für gleichmäßige Ausbeuten und verläßliche

Dabei wird die Nukleinsäure im Lysat an die Silica-

Ergebnisse • Pipettenspitze wirkt als Reaktionsgefäß

Oberfläche der Magnetpartikel gebunden • Lieferung und erhöht dadurch die Effizienz der

aller Reagenzien in vorgefüllten EZ1-Reaktions-

Magnetseparation • Das BioRobot m48-System wird

Kartuschen, dadurch schnelles und einfaches Beladen mit gebrauchsfertigen MagAttract-Protokollen

des Gerätes • Protokolle werden auf

geliefert, die eine minimale Benutzerinteraktion

vorprogrammierten EZ1-Protokollkarten geliefert. Sie benötigen.

liefern die auf dem Bildschirm erscheinenden

Benutzerbefehle und Bedienungsbefehle des Gerätes. •

Die Anzahl an Kits und Protokollen für das BioRobot

EZ1- System wird ständig erweitert.

9 6 well / ca. 600 Isolationen von genomischer DN 3 0 min per 96 well plate, full walk away syste m

bis mittlerer Durchsatz/ bis zu 50 Proben a m

bis hoher Durchsatz/ von 48-120 Proben am

System für die Aufreinigung von PCR-Fragmenten

96- und 384-well-Format, Fragmente zwischen 150

und 23 kb werden mit hoher Ausbeute und Reinheit

aufgereinigt.

EZ1 RNA Tissue Mini Kit • Automatisierte Aufreinigung

qualitativ hochwertiger Gesamt-RNA aus bis zu 10 mg

Gewebe auf dem BioRobot EZ1-System • Schnelle

A ufreinigung von bis zu 30 µ g Gesamt-RNA aus eine r

Vielzahl von Gewebetypen • Einsatzbereiche der

aufgereinigten DNA: u.a. Genexpressionsanalysen

anhand von Real-Time RT-PCR und Microarray-

Technologien; Krebsforschung

Liquid-Handling erfolgt über 6 Kanäle (1/Probe), mi • Liquid-Handling erfolgt über 6 gleichzeitig

jeweils 1 Spitze (1/Probe) • Nur Y- und Z-Achsen-

arbeitende Kanäle, die die Aufnahme und Abgabe

Bewegung (keine X-Achsen-Bewegung), dadurch Schutz k leiner Flüssigkeitsmengen (25-1000 µ l) durc h

vor Kreuzkontamination

Einwegpipettenspitzen mit Filter (1-3/Probe)

ermöglichen. • Schutz vor Kreuzkontamination durch

Einsatz unter Pipettenspitzen bei Bewegung •

Oberflächendekontamination zwischen den Läufen

durch UV-Licht.

Steuerung: Input und Output erfolgt durch CSV

Steuerung: Input und Output erfolgt durch CSV-

formatierte Dateien

formatierte Dateien

Einsatzmöglichkeiten: Nukleinsäure-Aufreinigung Einsatzmöglichkeiten: Nukleinsäure-Aufreinigung

Klein und handlich, nur 30 cm breit und ohne

angegliederten PC, dadurch in jedem Labor einsetzbar

Z entrale in Mannhei

Z entrale in Mannheim

Technischer Service für anwendungsbezogene Frage n Technischer Service für anwendungsbezogene Fragen

(10 Personen)/ Feldservicetechniker für Geräte (6 (15 Personen)/ Feldservicetechniker für Geräte (10

Personen)

Personen)

1 91, g 1x96

preps, Großmengen auf Anfrag e 3 50, - g 4 x 96 preps, Großmengen auf Anfrag e

2 8.000, – g 7 0.000, – g

8 .5 Einsatzmöglichkeiten


9 Service/Anzahl Servicetechniker Deutschland

m

1 0. Basispreis (Euro)

-

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 23


MARKTÜBERSICHT

24 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT

Ansprechpartner

Firmendaten,

.

1 H

Gmb

Chemie

Sigma-Aldrich

5

Eschenstraße

Taufkirchen

D-82024

www.sigma-aldrich.com

Stadler

Margit

Dr.

mstadler@europe.sial.com

eMail:

089/6513-1399

Fax:

089/6513-1509

Tel:

GmbH

Chemie

Sigma-Aldrich

5

Eschenstraße

Taufkirchen

D-82024

www.sigma-aldrich.com

Stadler

Margit

Dr.

mstadler@europe.sial.com

eMail:

089/6513-1399

Fax:

089/6513-1509

Tel:

Corp.

Electron

Thermo

4-6

Steingrund

Im

Dreieich

D-63303

Wolkersdorfer

Magnus

Ulf

Ansprechpartner:

0172-9818862

Tel.:

Corp.

Electron

Thermo

4-6

Steingrund

Im

Dreieich

D-63303

Wolkersdorfer

Magnus

Ulf

Ansprechpartner:

0172-9818862

Tel.:

Produktname

.

2 r

ode

Midi-

Plasmid

(HP)

Performance

High

GenElute

Maxi-Kits

Kit

RNA Miniprep

Total

Mammalian

enElute

G r

ingFishe

K 6

9 r

ingFishe

K L

m

Produktes

des

Kurzbeschreibung

.

3 s

Maxiprep-Kit

und

Midiprep

Plasmid

HP

GenElute

Die

Plasmidhochreiner

Aufreinigung

die

ermöglichen

Minuten.

30

als

weniger

DNA in

und

Säugerzellen-

Gesamt-RNA aus

von

Isolierung

-geweben

oder

Kits

kommerziellen

von

Automatisierung

zur

Gerät

magnetischen

mit

Arbeitsabläufen

selbsterstellten

nutzbar

integriert

oder

Stand-alone-Version

Als

Beads.

Kits

kommerziellen

von

Automatisierung

zur

Gerät

mit

Arbeitsabläufen

selbsterstellten

oder

Stand-alone-Gerät

Beads.

magnetischen

Einsatzgebiet

.

4 -

Transfek

für

z.B.

Plasmid-DNA

von

Aufreinigung

automatischer

und

Ligation

Restriktionsverdau,

tionen,

Sequenzierung

Blots,

Northern

RT-PCR,

für

RNA geeignet

Gereinigte

Microarrayanalysen

aus

Zellen)

RNA (Proteinen,

DNA,

von

Aufreinigung

Quellen

verschiedensten

aus

Zellen)

RNA (Proteinen,

DNA,

von

Aufreinigung

Quellen

verschiedensten

Arbeitsprinzip

.

5 n

modifizierte

einer

werden

Zellen

Zentrifugierte

in

wird

Lysat

das

unterzogen,

SDS-Lyse

alkalischen

eine

DNA an

die

und

neutralisiert

Filterspritze

einer

werden

Kontaminationen

gebunden.

Silica-Membran

die

erfolgt

Anschließend

entfernt.

Waschschritt

mittels

DNA.

gebundenen

der

Elution

und

lysieren

Guanidinthiocyanat

in

Ausgangsmaterial

zu

RNAsen

inaktive

um RNA und

homogenisieren,

reinigen

Filtrationssäule

über

Lysat

entfernen,

auf

Filtrat

etc.),

Zellbestandteilen

von

(Entfernung

aufgeben,

RNA-Bindungskapazität

hoher

mit

Silicasäule

RNA

gebundenen

der

Elution

und

Waschschritt

dann

der

auf

beruht

Gerätes

des

Grundprinzip

Das

der

und

Beads

der

dem Waschen

Analytenbindung,

96-

von

Wells

verschiedenen

in

Analyten

des

Elution

die

durch

erfolgt

Probe

der

Rühren

Das


Well-Platten

(Tip).

Einweg-Kunstoffspitze

einer

Vertikalbewegung

Tip

den

in

Permanentmagneten

des

Eintauchen

Durch

reversibel

Tip

des

Außenseite

an

Beads

die

werden

in

Beads

der

Übertragung

eine

erfolgt

Es

immobilisiert.

der

Freisetzung

anschließender

mit

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nächste

das

Permanentmagneten

des

Herausfahren

durch

Beads

dem Tip

aus

der

auf

beruht

Gerätes

des

Grundprinzip

Das

der

und

Beads

der

dem Waschen

Analytenbindung,

5-

eines

Wells

verschiedenen

in

Analyten

des

Elution

durch

erfolgt

Probe

der

Rühren

Das


Well-Streifens

Einweg-Kunstoffspitze

einer

Vertikalbewegung

die

in

Permanentmagneten

des

Eintauchen

Durch

(Tip).

Tip

des

Außenseite

an

Beads

die

werden

Tip

den

Übertragung

eine

erfolgt

Es

immobilisiert.

reversibel

anschließender

mit

Well

nächste

das

in

Beads

der

des

Herausfahren

durch

Beads

der

Freisetzung

dem Tip.

aus

Permanentmagneten

Tag

pro

Durchsatzbereich/Durchsatz

.

6 g

Verwendun

Bei

Minuten.

30

ca.

Präparationsdauer

oder

Midi-

24

zu

bis

können

Vacuum-Manifolds

eines

werden.

aufgearbeitet

gleichzeitig

Maxi-Preps

12

Minuten

30

in

Präparationen

18

bis

2

1 )

simultan

Proben

96

zu

(bis

Proben

-1.500

1 )

simultan

Proben

15

zu

(bis

Proben

1-240

(Prinzip/Einsatzbereich/

Kit

Beschreibung

7.

etc.)

RNA-Qualität

o.

DNA

350

zu

bis

usbeute:

A µ )

(Maxi

mg

1,2

und

(Midi)

g

Reaktionsschritte

Weniger

Plasmid-DNA •

hochreiner

vergleichbei

als

Plastikabfall

weniger

dadurch

und

Keine


Hersteller

anderer

HighSpeed-Kits

baren

Präzipi-


Alkohol

oder

Phenol/Chloroform-Extraktion

Kosteneffizienz

Hohe


notwendig

tation

zu10

bis

Gesamt-RNA aus

der

einigung

R 7 0

4

oder

Zellen

150

zu

bis

Ausbeute:


Präparation

pro

Gewebe

g

m µg

Präparation

RNA pro

hochreine

Liquor,

Gewebe,

Vollblut,

aus

mRNA/etc.

u.

DNA/gesamt

Futtermitteln,

u.

Lebens-

Proben,

forensichen

Stuhl,

Material,

paraffiniertes

Wattetupfern,

Pflanzen,

RNA simultan

DNA u.

Virale


PCR etc.

Gelen,

Bakterien,

zellfreien

weiteren

Tupfern,

Plasma,

Serum,

aus

Bioptaten

Körperflüssigkeiten,

Gewebe,

Vollblut,

aus

mRNA/etc.

u.

DNA/gesamt

u.

Lebens-

Proben,

forensichen

Stuhl,

Liquor,

paraffiniertes

Wattetupfern,

Pflanzen,

Futtermitteln,

DNA u.

Virale


PCR etc.

Gelen,

Bakterien,

Material,

weiteren

Tupfern,

Plasma,

Serum,

aus

RNA simultan

Bioptaten

Körperflüssigkeiten,

zellfreien

Robotiksystem

Beschreibung

.

8 d

un

Permanentmagneten

mit

Kopf

beweglicher

Vertikal

unabsind

Halter

und

Permanentmagnet

Halter,

Tip

horizontale

Die

beweglich.

gegeneinander

hängig

Das


Drehteller

einen

über

erfolgt

Plattenzuführung

(Mikro-

Platten

vorbefüllten

den

mit

direkt

wird

Gerät

Vorgang

Dieser

beladen.

PCR-Platten)

und

DWtiter-,

Roboterarm

einen

über

auch

als

manuell

sowohl

kann

Schritte

der

Abarbeiten

serielles

ein

erfolgt

Es

erfolgen.

Das


Platte

zu

Platte

von

Eluieren

Waschen,

Binden,

eine

integrierbar,

und

vollautomatisierist

Gerät

im Lieferumfang

ist

hierfür

Softwarekomponente

Gerätes,

des

Einfachheit

die

durch

Bedingt


enthalten

erforderlich.

Bedienung

dessen

für

Schulung

keine

ist

(im Lieferumfang)

Software

benutzerfreundliche

Eine

zu

Programme

eigene

selbständig

es

ermöglicht

erstellen

mit

Kopf

beweglicher

horizontal

und

Vertikal

Permanent-

Tip-Halter,

und

Permanentmagneten

gegeneinander

unabhängig

sind

Halter

und

magnet

vorbefüllten

den

mit

direkt

wird

Gerät

Das

beweglich.

serielle

eine

erfolgt

Es

beladen.

5-Well-Streifen

Eluieren

Waschen,

Binden,

Schritte

der

Abarbeitung

des

Einfachheit

die

durch

Bedingt


Well

zu

Well

von

Bedienung

dessen

für

Schulung

keine

ist

Gerätes,

(im

Software

benutzerfreundliche

Eine

erforderlich.

eigene

selbständig

es

ermöglicht

Lieferumfang)

erstellen

zu

Programme

Probengefäße

8.1

Ortsauflösung

8.2

Liquid-Handling-Werkzeuge

8.3

Steuerung

8.4

Einsatzmöglichkeiten

8.5

Deutschland

Servicetechniker

Service/Anzahl

.

9 2

1 2

1

(Euro)

Basispreis

0.

1 :

Preps

25

Kit

Midiprep

Plasmid

HP

GenElute

1NA0200

46,50

1 g t

Ki

Maxiprep

Plasmid

HP

GenElute

NA0310


demnächst

Giga-Kits

und

Mega-


328,30

Preps:

25

10

Kit

RNA Miniprep

Total

Mammalian

GenElute

RTN10

27,50

reps

P g r

lieferba

preps

350

auch


3.400

3 g 0

2.12

1 g


B L I T Z L I C H T

DNA-Aufreinigung


Tangentialflußfiltration (TFF)

zur Aufkonzentrierung und

Umpufferung linearer DNA

A

Dr. Margarete Hannappel, Millipore GmbH, Schwalbach am Taunus

Florian Sack, Mologen AG, Berlin

Die Ultrafiltration im Tangentialflußmodus ist in industriellen Prozessen ein anerkanntes Verfahren

zur Separation biologischer Substanzen. Im Labormaßstab wurde untersucht, inwieweit

sich diese Technik zur Aufkonzentrierung und Umpufferung linearer, doppelsträngiger

DNA eignet. Membranen mit unterschiedlichen Ausschlußgrenzen (5 kD, 10 kD, 30

kD) wurden zunächst auf die Rückhaltung linearisierter Plasmide (1.600, 1.800 oder 2.100

Basenpaare) überprüft. Eine vollständige Retention wurde nur bei der 5 kD-Ultracel ® PLC-

Membran festgestellt. Die Aufkonzentrierung verdünnter Lösungen bis zu einer DNA-Konzentration

von 2 mg/ml war mittels Tangentialflußfiltration möglich, wobei der Prozeßverlauf

durch die Wahl der Membran beeinflußt wurde. Insgesamt erwies sich die TFF als ein Verfahren

zur Konzentrierung und Diafiltration linearer DNA in Lösung, das sich im Volumenbereich

zwischen 100 ml und 1.000 ml einsetzen läßt.

Key Words: lineare DNA, DNA-Aufkonzentrierung, DNA-Umpufferung, Tangentialflußfiltration,

TFF, Ultrafiltration

B

Abb. 2: Aufbau und Durchführung von

TFF-Versuchen. A. Membrankassette in einem

TFF-Komplettsystem (Labscale-TFF-System,

Millipore)

B. Membrankassette mit Einzelkomponenten zu

einem TFF-System zusammengestellt. Betriebsvolumen

in Abhängigkeit vom System 25 ml bis

1.000 ml

Lineare, doppelsträngige DNA-Moleküle (linearisierte

Plasmide, Vektoren) sind wichtige

Zwischen- oder Endprodukte bei der Entwicklung

und Produktion von DNA-Arzneimittelkandidaten

(zum Beispiel bei der Gentherapie

oder DNA-Vakzinierung). Innerhalb

des Entwicklungs- und Herstellungsprozesses

müssen diese häufig aufkonzentriert oder

in andere Puffer transferiert werden. Dabei

können die im Labormaßstab üblichen Methoden

wie Ethanolfällung oder Dialyse selten

angewendet werden, weil die Lösungsansätze

vergrößert oder die Verfahren für einen

späteren Produktionsprozeß unter GMP-

Bedingungen ungeeignet sind. In der biopharmazeutischen

Industrie ist die Ultrafiltration

im Tangentialflußmodus eine verbreitete

Methode zur Abtrennung und Aufkonzentrierung

biologischer Stoffe. In diesem Zusammenhang

wurde die Anwendung dieser

Aufreinigungs-Technik zur Konzentrierung

und Diafiltration von linearer, doppelsträngiger

DNA in Lösung untersucht und für Volumina

bis 1.000 ml getestet.

Ultrafiltration im Tangentialflußmodus

Abb. 1: Prinzip der Tangentialflußfiltration. Die Membranfläche wird tangential von der Produktlösung

überströmt. In Abhängigkeit vom angelegten Transmembrandruck (TMP: „Trans Membrane Pressure“)

wird ein Teil der Flüssigkeit durch die Membran auf die Filtratseite gepreßt. Moleküle, die aufgrund

ihrer Größe die Membranporen nicht passieren können, werden auf der Retentatseite zurückgehalten.

(P: Druck, ∆P: Differenzdruck)

Die Ultrafiltration trennt gelöste Moleküle

nach Molekülgröße aus Flüssigkeiten über

eine Membran. Ultrafiltrationsmembranen

werden gewöhnlich im Tangentialflußmodus

eingesetzt (Abb. 1).

Ultrafiltrationsmembranen werden von

den Herstellern nach ihrer Ausschlußgrenze

(nominelle Molekulargewichtsgrenze oder

„Cut-off“) klassifiziert und zur Trennung

oder Anreicherung von Stoffen zwischen

1.000 bis 1.000.000 Dalton eingesetzt. Für die

Zurückhaltung globulärer Proteine wird in

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 25


B L I T Z L I C H T

A

B

PLC 5kD, keine DNA im Filtrat nachgewiesen.

Bei allen anderen Membranen wurde

während des gesamten TFF-Prozesses ein

kontinuierlicher Strom an DNA in das Filtrat

festgestellt. Die Stärke des DNA-Flusses wurde

mit steigender Ausschlußgrenze größer

und konnte zusätzlich durch Veränderungen

des Transmembran- und Differenzdruckes

gesteigert oder reduziert werden.

Aufkonzentrierung

linearer DNA mittels TFF

Abb. 3: Vergleich der DNA vor und nach der TFF-Durchführung. Lineare DNA-Fragmente in Lösung

wurden mittels TFF von 0,2 mg/ml auf 2 mg/ml aufkonzentriert. Für diese Anwendung wurden die

Membranen Ultracel ® PLC 5 kD (A) und Ultracel ® PLC10 kD (B) getestet. Die DNA-Proben wurden in

einem 1%igen Agarose-Gel analysiert (DNA-Proben: 1.600/1.800 Bp (A), 1.600/2.100 Bp (B).

Bahn 1: DNA-Marker (Gene Ruler, Fermentas), Bahn 2: DNA vor der Aufkonzentrierung mittels TFF,

Bahn 3: DNA nach der Aufkonzentrierung mittels TFF. (Bp: Basenpaare)

der Regel eine Membran mit einer 3- bis 5fach

kleineren Ausschlußgrenze als dem Molekulargewicht

des Produktes gewählt.

DNA-Moleküle mit rund 2.000 Basenpaaren

besitzen ein Molekulargewicht im Bereich

von 1,2 x 10 6 Dalton. In linearer Form handelt

es sich um dünne Molekülfäden mit einer

Länge von ungefähr 680 nm und einem

Durchmesser von 2 nm. Bei welchen Ausschlußgrenzen

diese Moleküle im Retentat

zurückgehalten werden, mußte zunächst ermittelt

werden. Dazu wurden Membranen

mit unterschiedlichen Porengrößen hinsichtlich

ihrer Durchlässigkeit gegenüber linearer

DNA getestet. Die verwendeten Testlösungen

enthielten jeweils zu gleichen Teilen zwei lineare

DNA-Fragmente (1.600/1.800 Basenpaare

oder 1.600/2.100 Basenpaare), die

durch Spaltung eines Plasmids erhalten wur-

den. Die Testfragmente lagen in Puffer (20

mM Tris/HCl pH 7,4, 900 mM NaCl) mit einer

Gesamtkonzentration von 0,2 mg/ml vor.

Zur Überprüfung der DNA-Qualität und

zum Nachweis eines DNA-Flusses durch die

Membran in das Filtrat wurden Retentat und

Filtratfraktionen gelelektrophoretisch analysiert.

Für die Versuche wurden Kassettenmodule

mit einer Membranfläche von 50 cm 2 (Pellicon

® XL-Kassetten, Millipore) gewählt. Sie

wurden zur Durchführung der TFF in ein

Komplettsystem eingesetzt oder mit Einzelkomponenten

zu einem TFF-System zusammengeschlossen

(Abb. 2).

Von den getesteten Ultrafiltrationsmembranen

1 (5 kD-Biomax ® -Membran, 5 kD, 10

kD und 30 kD Ultracel ® PLC-Membranen)

wurde bei einer einzigen Membran, Ultracel ®

Abb. 4: Filtratfluß in Abhängigkeit von der Konzentration. Der Filtratfluß wurde während der Aufkonzentrierung

gemessen. Die Ausgangskonzentration war 0,2 mg/ml.

Nach der Membranevaluierung wurde der

Aufkonzentrierungsprozeß bis zu einer finalen

DNA-Konzentration von 2 mg/ml näher

charakterisiert. Dazu wurden vergleichende

TFF-Versuche mit den Membranen Ultracel ®

PLC 5 kD und Ultracel ® PLC 10 kD durchgeführt.

Bei Verwendung der 10 kD-Ultracel ®

PLC-Membran war in den Vorversuchen ein

DNA-Fluß durch die Membran festgestellt

worden. Dieser lag in Relation zum Gesamtprodukt

weit unter 1%.

Durch Anwendung der TFF konnte die

DNA mit beiden Membranen problemlos von

0,2 mg/ml auf 2 mg/ml aufkonzentriert werden.

Die DNA selbst wurde durch den TFF-

Prozeß in ihrer Qualität und Zusammensetzung

nicht verändert. Im Agarose-Gel war

kein Unterschied zwischen der Ausgangslösung

und der konzentrierten Probe zu erkennen

(Abb. 3).

Ein weiterer wichtiger Prozeßparameter ist

der Filtratfluß. Er wurde während der Konzentrierungsphase

in bestimmten Abständen

gemessen. Um eine Veränderung in Abhängigkeit

von der steigenden Produktkonzentration

aufzuzeigen, wurden die ermittelten Filtratflüsse

gegen den Konzentrationsfaktor

(VCF: „Volumetric Concentration Factor“) in

einem Diagramm graphisch dargestellt (Abb.

4). Hierbei wurde ein unterschiedliches Verhalten

zwischen den Membranen Ultracel ®

PLC 5 kD und Ultracel ® PLC 10 kD sichtbar.

Im Falle der 10 kD-Membran nahm der Filtratfluß

vom Beginn bis zum Ende der Konzentrierungsphase

ab. Insgesamt wurde der

Filtratfluß um rund 30% reduziert. Bei Einsatz

der 5 kD-Membran blieb dagegen der Filtratfluß

bis zu einer DNA-Konzentration von ungefähr

1 mg/ml (VCF=5) stabil und sank erst

danach ab. Werden die Daten aus anderen

Aufkonzentrierungsversuchen hinzugezogen,

so ist bei der 30 kD-Membran ebenfalls über

den gesamten Prozeß eine abnehmende Tendenz

des Filtratflusses zu erkennen. Bei der 5

kD-Ultracel ® PLC-Membran wurde der anfängliche,

konstante Filtratfluß bei niedrigen

und hohen Druckeinstellungen beobachtet.

Der Verlauf des Filtratflusses bei den Membranen

Ultracel ® PLC 10 kD und 30 kD deutet

auf eine allmähliche Verblockung der Membran

hin. Möglicherweise verfangen sich die

langen Molekülfäden bei der Membranpassage

in den Durchgängen, bleiben hängen und

verstopfen diese allmählich. Bei der 5 kD-Ul-

26 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


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Kennziffer 19 LW 03 · Informationen ordern · www.biocom.de


tracel ® PLC-Membran können die DNA-Moleküle scheinbar nicht in

die Membranporen eindringen. Die Reduzierung des Filtratflusses nach

einer konstanten Anfangsphase ist hier höchstwahrscheinlich auf Polarisationseffekte

zurückzuführen. Dies bedeutet, daß der Filtratfluß

durch erhöhte Produktkonzentration an der Membranoberfläche behindert

wird. Unterstützt werden diese Annahmen durch Ergebnisse

aus Fouling-Tests und Daten zur Membranreinigung. Ein Maß für den

Reinigungsgrad einer Membran stellt das Erreichen der ursprünglichen

Permeabilität für reines Wasser dar. Dieser als NWP


B L I T Z L I C H T

real-Time PCR


RT-PCR-Resistenznachweis

in der Malariadiagnostik

Hier bieten „Rapid Diagnostic-Tests“, die

auf immunologischen oder molekularbiologischen

Techniken basieren, Alternativen zur

klassischen Malariadiagnostik 1 . Hinsichtlich

einer verbesserten Sensitivität und Spezifität

erreichen einige PCR-Tests Nachweisgrenzen

von weniger als 5 Parasiten/µl Blut bei einer

Spezifität von nahezu 100% 2 . Auch das erste

kommerzielle real-time PCR-Testkit zum generellen

Screening von Malariaparasiten, das

RealArt ® Malaria LC PCR Kit der Firma artus,

zeigte eine gute Routinetauglichkeit in einer

unabhängigen Studie 3 . Das Kit ist inzwischen

entsprechend der EU-Richtlinie für die in-vitro-

Diagnostik (IVD) von EDTA-Vollblut CEzertifiziert.

Eine umfassende Malariadiagnostik erfaßt

auch existierende Chemoresistenzen. Insbesondere

die Ausbreitung Chloroquin-resistenter

(CQR) Malariastämme ist von großer Bedeutung.

Hier ergaben sich durch die Klärung

der funktionellen Rolle des PfCRT-Proteins mit

der in allen untersuchten CQR-Stämmen von

P. falciparum gefundenen K76T-Mutation neue

diagnostische Möglichkeiten 4 . Außerdem erwiesen

sich die Sequenz des pfcrt-Gens und

die der CQR zugrundeliegenden Mechanismen

als artspezifisch für P. falciparum 5 . Danach

Nicole Kasdepke und Rainer Söller, artus GmbH, Hamburg

Ein spezifischer und sensitiver Schnelltest zum kombinierten Nachweis von Plasmodium falciparum

und einer möglichen Resistenz gegen Chloroquin wird vorgestellt. Der Test weist mit

Hilfe der real-time PCR das pfcrt-Gen von P. falciparum sowie in einer anschließenden Schmelzkurvenanalyse

dessen K76T-Punktmutation als Ursache der Chloroquin-Resistenz nach. Chloroquin-resistente

und -sensitive Stämme von P. falciparum zeigen gut unterscheidbare Schmelzkurven,

die auch in Doppelinfektionen erkannt werden. In einer laufenden Untersuchung an

klinischen Proben importierter Malaria zeigte die PCR-Methode 100% Übereinstimmung mit der

Artbestimmung nach Routinediagnostik. Die Vorteile der real-time PCR liegen in einer sicheren

Bestimmung von P. falciparum – auch in Fällen von Doppelinfektionen mit einer zweiten Malaria-Art

oder bei niedriger Parasitämie von P. falciparum in der frühen Infektionsphase. Der Test

bietet somit eine schnelle und sichere Diagnostik von P. falciparum und ein Monitoring möglicher

Chloroquin-Resistenzen in einem Ansatz.

Key Words: Malaria tropica, Plasmodium falciparum, real-time PCR, Chloroquin-Resistenz

In der Routinediagnostik der Malaria ist die

Mikroskopie weltweit immer noch der “Gold-

Standard”. Allerdings stößt diese klassische

Analysemethode an ihre Grenzen, wenn qualifiziertes

Personal fehlt und viele Blutproben

mit potentiell niedriger Parasitämie zu analysieren

sind. Dabei sind Blutproben mit niedriger

Parasitämie grundsätzlich ein Problem, da

die durchschnittliche Sensitivitätsgrenze der

meisten Routinelabore nur zwischen 50 und

500 Parasiten/µl beim “dicken Tropfen” liegt,

im Blutausstrich sogar nur bei 5000 Parasiten/

µl 1 . Zusätzlich kann die Sicherheit der mikroskopischen

Analyse von Faktoren wie persönlicher

Erfahrung des Personals, dem Vorhandensein

möglicher Doppel- oder Mehrfach-

Infektionen verschiedener Plasmodium-Arten

sowie dem Fehlen eindeutiger Entwicklungsstadien

relativ stark beeinträchtigt werden.

Abb. 2: Partielles Alignment von DNA-Sequenzen der K76T-Region des pfcrt-Gens von P. falciparum

(Codons 71-81 des PfCRT-Proteins). Das für CQR oder CQS verantwortliche Codon 76 ist eingerahmt und

die entscheidende Transversion A/C fett markiert. Nr. 1 und 3-7 wurden durch Sequenzierung der CQ-

PCR-Produkte aus klinischen Blutproben gewonnen. Die Sequenzen Nr. 1-5 sind aus [5]* bekannt, Nr. 2

wurde in dieser Studie noch nicht gefunden und das PCR-Produkt zu Kontrollzwecken daher synthetisch

hergestellt (Geneart, Regensburg). Punkte im Alignment bedeuten dasselbe Nukleotid wie in Nr.

1, abweichende Basenpositionen sind im IUPAC Code angegeben. Unter [MT] und [TM] sind die

Schmelzkurven-Typen (R=CQR, S=CQS) und die experimentell bestimmten Schmelzpunkte in °C angegeben

(siehe Abb. 3). * Genbank-Nummern af468006, af233065, af233067, af233064, af233066.

Abb. 1: Orientierung und Funktion von Primern

und Sonden der CQ-real-time PCR aus [7] nach

dem Prinzip von [9]. Der intern mit LC640 markierte

reverse Primer dient nach Verlängerung

während der PCR als Anker-Sonde. Die spezifische

Anregung von LC640 erfolgt nach Hybridisierung

der am 3’-Ende mit Fluorescein markierten

Sensor-Sonde. Die Sensor-Sonde erlaubt

eine sehr sensitive Differentialdiagnostik der

CQR-Allele durch Schmelzkurvenanalyse im

LightCycler nach der PCR. Die relative Lage der

für die CQ-Resistenz verantwortlichen Transversion

A/C ist eingezeichnet.

wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen

unterschiedliche PCR-Tests zum Nachweis der

K76T-Mutante in CQR-Stämmen von P. falciparum

vorgestellt 6-8 .

Entwicklung

des real-time PCR-Systems

Die hier vorgestellte CQ-PCR ist eine Weiterentwicklung

der real-time PCR von de Monbrison

et al. 7 , wobei die relative Orientierung

und Fluoreszenzmarkierung von Primern und

Sonde beibehalten wurde (Abb. 1). Nur mit

dieser erstmals von Lay et al. 9 für den

LightCycler beschriebenen Variante von markierter

Sensor-Sonde und dem in der PCR verlängerten

markierten Primer als Anker-Sonde

war in der A/T-reichen Zielsequenz um die

K76T-Mutation eine stabile real-time-PCR mit

Schmelzkurvenanalyse realisierbar. Obwohl

die PCR und Schmelzkurvenanalyse mit den

publizierten Sequenzen von Primern und Sonde

prinzipiell funktionierte, wurden beide für

diese Studie im Hinblick auf eine sichere Differenzierung

aller bisher bekannt gewordenen

Schmelzkurventypen weiter optimiert. Im

Rahmen der PCR-Entwicklung wurden zunächst

die Sequenzen von Primern und Sonde

aus [7] in einem Alignment mit den pfcrt-

Sequenzdaten aus [4] verglichen. Dabei ergab

sich das Problem die für die CQR entscheidende

Transversion „A/C” an der zweiten Position

des K76T-Codons möglichst unabhängig

von weiteren, sich stromaufwärts anschließenden

Punktmutationen nachzuweisen. Daher

28 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


B L I T Z L I C H T

wurden verschiedene Sequenzvarianten der

Sonde mit angepaßten Primern an klinischen

Proben importierter Malaria tropica aus der

Routinediagnostik des Bernhard-Nocht-Instituts

für Tropenmedizin (Prof. Tannich, Hamburg)

getestet und sequenziert, um ein möglichst

klares Bild der auftretenden Sequenzvariationen

in der K76T-Zielregion zu erhalten.

Aus diesen Daten wurde dann ein routinetaugliches

PCR-System zum differentiellen

Nachweis aller Allele der K76T-Zielregion

vorgeschlagen.

Funktionalität

des real-time PCR-Systems

Mit dem ausgewählten PCR-System ließen

sich alle bisher in klinischen Blutproben 10 gefundenen

Allele der CQR- und CQS-Stämme

von P. falciparum sicher unterscheiden (Abb.

3) und in unbekannten Proben selbst in Doppelinfektionen

mit anderen Plasmodien-Arten

wieder erkennen. Im Rahmen dieser Studie

konnte bislang noch keine Probe mit dem

CQS-Allel „1S“, entsprechend Nr. 2 in Abbildung

2 und 3, gefunden werden. Daher dient

das ursprünglich zu Kontrollzwecken synthetisch

hergestellte PCR-Produkt bis auf weiteres

als Positivkontrolle in jedem PCR-Lauf.

Zur Bewertung der Ergebnisse einer CQreal-time-PCR

und einer möglicherweise daraus

abzuleitenden Therapie zählt nur, ob sich

nach der PCR eine Schmelzkurve mit einem

Schmelzpunkt in der Nachbarschaft (± 1° C)

einer der beiden CQR-Schmelzkurventypen

(1R, 2R) zeigt. Dies ist zur Bewertung der gelegentlich

auftretenden Doppelinfektionen mit

mehr als einem CQ-Allel essentiell. In den

beiden Beispielen der nicht-eindeutigen

Schmelzkurven Nr. 6 und 7 in Abbildung 3 ist

dies der Schmelzpunkt des CQR-Schmelzkurventyps

„2R”. In Zweifelsfällen ist immer von

der Anwesenheit eines CQR-Allels in niedriger

Kopienzahl auszugehen – entsprechend

einer niedrigen Parasitämie der CQR-Malarialinie.

Das bedeutet die Anwesenheit mindestens

eines CQR-Allels in der Probe, was den

sinnvollen Einsatz von CQ als mögliches Antimalariamittel

ausschließt.

Eine Bestätigung des resistenten Genotyps

durch DNA-Sequenzierung aus dem PCR-

Produkt, wie bei den Proben Nr. 6 und 7 durchgeführt,

ist nur bei Proben mit noch gut sichtbaren

Schmelzkurven möglich. In Fällen geringerer

Kopienzahlen des CQR-Allels mit

sehr kleinen bis nur noch ansatzweise sichtbaren

Schmelzkurven kann die DNA-Sequenzierung

nicht erfolgen. In diesen Fällen wird

der „vorsorgliche Verzicht” auf den Einsatz

von CQ empfohlen.

Malaria-Artbestimmung

In allen Blutproben, die mit anderen Testsystemen,

wie zum Beispiel dem generellen Malaria-PCR-Kit

von artus, Malaria-positiv getestet

wurden, kann mit dem Nachweis einer

Schmelzkurve in der CQ-real-time PCR auch

eine sichere Artbestimmung von P. falciparum

erfolgen. Zeigt eine Malaria-positive Blutpro-

Abb. 3: Schmelzkurvenanalyse nach einer CQreal-time

PCR. Die Kurven 1-5 zeigen die

Schmelzkurventypen von CQR (1R, 2R) und CQS

(1S, 2S) Malariaproben, die Nummerierung entspricht

den in Abb. 2 gezeigten Genotypen. Die

Schmelzkurven 6 und 7 entsprechen keinem eindeutigen

Schmelzkurventyp und erwiesen sich

nach Sequenzierung der PCR-Produkte als Überlagerung

der Kurven von 2R und 2S (Doppelinfektion

aus CQR- und CQS-Stämmen von P. falciparum).

Die Schmelzpunkte der „reinen“ Schmelzkurventypen

sind durch die farbigen, senkrechten

Linien markiert und die Temperatur unten angegeben.

be nach der CQ-PCR keine Schmelzkurve,

kann eine P. falciparum-Infektion ausgeschlossen

werden. So wurden bisher alle mikroskopisch

als P. falciparum bestimmten Proben der

laufenden Studie 10 durch eine Schmelzkurve

in der CQ-PCR bestätigt. Darüber hinaus ergaben

sich in 40 von 45 mikroskopisch als Malaria-positiv

bestimmten Proben von P. vivax,

P. malariae oder P. ovale kein Signal in der CQ-

PCR und Schmelzkurvenanalyse. Die restlichen

fünf Proben zeigten in der CQ-PCR zwar

schwache, aber eindeutige Schmelzkurven. In

einer der Proben konnte bislang durch Sequenzierung

des PCR-Produkts aus einer generellen

Malaria-PCR eine Doppelinfektion von P.

vivax und P. falciparum erkannt und das Ergebnis

der CQ-PCR nachträglich bestätigt werden.

Die Sequenzierung der anderen Proben steht

noch aus, kann aber wegen der schwachen

Parasitämie von P. falciparum und einer hohen

Parasitämie der anderen Plasmodium-Art

auch ergebnislos bleiben. In diesen Fällen wird

dann ebenso wie oben der “vorsorgliche Verzicht”

auf den Einsatz von CQ empfohlen.

Zusammenfassung

Der vorgestellte real-time PCR-Test für den

LightCycler ist ein kombiniertes Nachweissystem

für P. falciparum-Infektionen und CQR.

Er stellt eine Ergänzung zum Malaria-PCR-Kit

der Firma artus dar und wird in Kürze als

kommerzielles PCR-Kit unter dem Markennamen

„RealArt ® Malaria CQ Resistance LC PCR

Kit” vertrieben werden.

Literatur

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[9] Lay, M. J., Wittwer, C. T., Clin. Chem. 43 (1997), 2262-2267.

[10] Farcas, G. A., Söller, R., Kasdepke, N., Kain, K. C., Manuskript in Vorbereitung.

Korrespondenzadresse

Dr. Rainer Söller

artus Gesellschaft für molekularbiologische

Diagnostik mbH

Königstraße 4a, D-22767 Hamburg

Tel.: 040-41364753, Fax: 040-41364710

eMail: soeller@artus-biotech.de

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LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 29


2004

together with the SBCF

8 th International World Congress of Cell Biology

NICE

NICE 4 - 8 September, 2004

France

Minisymposia

Endocytic routes

Harold Stenmark (Oslo)

Richard Pagano (Rochester)

Autophagy

Beth Levine (New York)

Patrice Codogno (Villejuif)

Signals in membrane traffic

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Blanche Schwappach (Heidelberg)

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of the cell nucleus

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Denis Duboule (Geneva)

Vincent Laudet (Lyon)

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R. Scott Poethig (Philadelphia)

Polarity in plants and animals

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Thomas Lecuit (Marseille)

ECM and development

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Cell biology of infectious diseases

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Peter Rottier (Utrecht)

Neurogenesis

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Nobukata Hirokawa (Tokyo)

Cell physiology and homeostasis

Martin Bootman (Babraham)

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Tissue repair

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Sabine Werner (Zurich)

New technologies in cellular processes

Herman Gaub (Munich)

Daniel Mueller (Dresden)

Special Sessions:

Cinema of the Cell: a festival of BioClips

http://www.bioclips.com

European Life Scientist Organization

Information, Registration and Abstract Submission:

http://www.ELSO.org

Plenary Sessions

Rob Parton (Brisbane)

Judith Klumperman (Utrecht)

Aki Kusumi (Nagoya)

Axel Ullrich (Munich)

Helena Edlund (Umea)

Phil Cohen (Dundee)

Pernille Rorth (Heidelberg)

Laura Machesky (Birmingham)

Rong Li (Cambridge, USA)

Maria Carmo-Fonseca (Lisbon)

Geneviève Almouzni (Paris)

Titia de Lange (New York)

Mark Krasnow (Stanford)

Markus Affolter (Basel)

Jaques Prost (Paris)

Jonathan Knowles (Basel)

Michel Lazdunski (Nice)

Norma Andrews (New Haven)

Hans-Georg Kraeusslich (Heidelberg)

Pascal Cossart (Paris)

Kazuhiko Kinosita Jr (Okazaki)

Steve Harrison (Cambridge, USA)

Wolfgang Baumeister (Munich)

Local Organizers:

C. Sardet, SBCF council and

Nice Committee

In collaboration with

SOCIETE de BIOLOGIE CELLULAIRE

de FRANCE

http://sbcf.snv.jussieu.fr/


W I S S E N S C H A F T

Paternale Vererbung


Rekombination humaner

mitochondrialer DNA

Yevgenya Kraytsberg 1 , Marianne Schwartz 2 , Timothy A. Brown 3 , Konstantin Ebralidse 1 ,

Wolfram S. Kunz 5 , David A. Clayton 3 , John Vissing 4 , und Konstantin Khrapko 1

1

Harvard Medical School, Boston, MA, USA, Departments of 2 Clinical Genetics and

4

Neurology, National University Hospital Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark

3

Howard Hughes Medical Institute, Chevy Chase, MD, USA, 5 Department of Epileptology,

University Bonn, Bonn, Germany

Die humane mitochondriale DNA ist eine 16,5 kB große DNA-Sequenz die 13 Proteine (7 Untereinheiten

der NADH:CoQ-Oxidoreduktase, das Cytochrom b, 3 Untereinheiten der Cytochrom

c-Oxidase und 2 Untereinheiten der H + -ATPase), 22 tRNAs und 2 rRNAs kodiert. Die

hohe Kopienzahl dieses Genoms, eine relativ konstant hohe Mutationsrate von etwa einer

Mutation pro site pro Million Jahren und der maternale Erbgang machen Untersuchungen

von Sequenzvariationen dieser DNA für Evolutionsbiologen außerordentlich interessant. Eine

bisher allgemein akzeptierte Eigenschaft tierischer mitochondrialer DNA ist die klonale Vererbung

und das Fehlen von Rekombination, die im Gegensatz dazu an vielen Pflanzen-, Pilzen-

und Protozoaarten nachgewiesen wurde 1 . Nachdem die Rekombination von mitochondrialer

DNA auch an Muschel- und Fischarten gezeigt wurde 2 , stellte sich die Frage nach der

möglichen Rekombination der mitochondrialen DNA des Menschen. Um dieses Problem zu

lösen, haben wir DNA-Proben des einzigen bisher in der Literatur dokumentierten Individuums

mit paternaler Vererbung der mitochondrialen DNA untersucht 3 . In dessen Skelettmuskel

koexistieren paternale und maternale mtDNA-Moleküle nebeneinander und können somit

rekombinieren. Um mögliche Rekombinanten zu detektieren, haben wir eine long-range

PCR-Methode angewendet, die es erlaubt, einzelne mtDNA-Moleküle zu amplifizieren. Durch

ein Screening von 450 individuellen klonalen PCR-Produkten konnten wir 33 rekombinante

mtDNA-Moleküle nachweisen. Die molekulare Struktur dieser Moleküle erlaubt einen Rückschluß

auf den Mechanismus des genetischen Transfers zwischen unterschiedlichen menschlichen

mtDNA-Molekülen 4 .

Wenige rein paternale PCR-Produkte (BsrBIund

ApaLI-positiv, 14793G und 73G) wurden

ebenfalls nachgewiesen, die auf nicht-kompletten

initialen BsrBI-Verdau hinweisen. Zusätzlich

dazu erhielten wir 33 PCR-Produkte,

die BsrBI-negativ, aber ApaLI-positiv waren.

Diese wurden als ‚potentielle‘ rekombinante

Moleküle einem detaillierten Sequenzier- beziehungsweise

Restriktionsmapping unterzogen

(mindestens zweimal pro Markerposition,

siehe Abbildung). Ihre Sequenzen enthielten

alternierende maternale und paternale Segmente,

was eindeutig auf mtDNA-Rekombination

hindeutet. Ein zusätzlicher Beweis für

das in vivo-Entstehen der rekombinanten Moleküle

waren Kontrollexperimente, die mit einer

10 zu 1-Mischung von paternaler und

maternaler DNA durchgeführt wurden. In einem

Screening von 150 PCR-Produkten, die

auf identische Weise erhalten wurden, wurden

keine BsrBI-negativen und ApaLI-positiven

PCR-Produkte gefunden.

Der Mechanismus der

mtDNA-Rekombination

Die rekombinanten mtDNA-Moleküle gehören

zwei strukturellen Klassen an (siehe Abbildung)

– Klasse 1, mit einer kurzen paternalen

Sequenz, die in ein überwiegend maternales

Molekül eingefügt ist und Klasse 2, mit

einer maternalen Sequenz, die von paternalen

Sequenzen flankiert wird. Zusätzlich dazu

scheinen die Wechsel zur alternierenden Sequenz

(siehe Abbildung, weiß dargestellt) in

„Hot spots“ zu clustern, die auf einen möglichen

Rekombinationsmechanismus hindeuten.

Der erste „Hot spot“ (bei etwa np 12000)

Nachweis von rekombinanten

mtDNA-Molekülen

Um nach möglichen rekombinanten Molekülen

zu suchen, wurde die Skelettmuskel-DNA,

die paternale und maternale mtDNA in einem

Mischungsverhältnis von 10 zu 1 enthielt, mit

einem großen Überschuß der Restriktionsendonuklease

BsrBI verdaut, die die paternale

mtDNA an der Position 14793G spaltet (siehe

Abbildung). Danach wurde eine Einzelmolekül-PCR

durchgeführt, um jeweils 7 kb oder 9

kb große klonale PCR-Produkte zu erhalten:

zwischen np 11206 und np 1490 (7 kb-Produkt)

oder zwischen np 9036 und np 1490 (9 kb-Produkt).

Eine ähnliche Technik wurde bereits

angewendet, um nukleäre DNA-Rekombinanten

zu isolieren 5 . In der Einzelmolekül-PCR ist

jedes PCR-Produkt ein Klon identischer Moleküle,

die von einer einzelnen DNA-Matritze

stammen. Wir erhielten 300 solcher 7kb-

PCR-Produkte und 150 der 9 kb-PCR-Produkte,

die mit BsrBI und ApaLI auf das Vorhandensein

von Schnittstellen bei np 14793 (Bsr-

BI) und np 73 (ApaLI) untersucht wurden. Wie

zu erwarten, war die überwiegende Zahl der

PCR-Produkte BsrBI- und ApaLI-negativ

(14793A und 73A) und somit rein maternal.

Strukturelle Karte der 33 rekombinanten DNA Moleküle im Skelettmuskel des Patienten mit paternaler

mtDNA Vererbung (© Science, modifiziert nach 4 ).

Die paternalen Segmente sind blau, die maternalen Segmente sind rot dargestellt. Segmente die paternale

und maternale Bereiche verbinden (‘breakpoints’) sind weiß. Nichtuntersuchte Bereiche sind grau.

Die dicken vertikalen Linien stellen die Restriktionsstellen für BsrBI und ApaLI dar, die zum Screening

nach rekombinanten mtDNA-Molekülen verwendet wurden.

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 31


W I S S E N S C H A F T

liegt nahe eines alternativen ‚mtDNA lightstrand‘

Replikationsbeginns (O L

(alt), siehe

Abbildung), der eine ‚mtDNA heavy-strand‘

Replikationspausenstelle ist. Die mtDNA-Replikationspause

in dieser Region könnte ein

rekombigenes 3‘-Ende hervorbringen, welches

ein Nachbar-mtDNA-Molekül invadiert und

somit durch Replikationsabschluß ein rekombinantes

Molekül der Klasse 2 generieren

würde. Zwei andere Hot spots (bei etwa np

147 und np 190) co-lokalisieren mit dem 5’-

Ende der 7S-DNA – einem kurzen mtDNA-

Fragment, welches durch frühzeitige mtDNA-

Replikationstermination in der D-loop entsteht.

Deshalb läßt sich vermuten, daß die

mtDNA-Rekombinanten der Klasse 1 durch

ein sogenanntes ‚7S DNA-template-switching‘

entstanden sind, bei dem paternale 7S-DNA

von der D-loop freigesetzt wird und danach

maternale mtDNA invadiert.

Konsequenzen der mtDNA-

Rekombination beim Menschen

Der mögliche Einfluß des Nachweises von

mtDNA-Rekombination beim Menschen auf

Untersuchungen zur molekularen Evolution

hängt von mehreren Faktoren ab, deren quantitative

Bedeutung zum gegenwärtigen Zeitpunkt

noch schwer abzuschätzen ist 2 . So gibt

es zur Zeit nur grobe Schätzungen zur Häufigkeit

des ‚paternalen leakage‘ (10 –3 bis 10 –4

pro Befruchtung bei Mäusen 6 ), die Häufigkeit

beim Menschen ist dagegen unbekannt.

Zudem ist für einen Austausch von genetischer

Information zwischen verschiedenen

mtDNA-Molekülen von entscheidender Bedeutung,

daß die mtDNA-Moleküle tatsächlich

miteinander in Kontakt kommen und

nicht in separaten Entitäten wie Zellen, Mitochondrien

oder Nucleoiden segregieren.

Weitere Untersuchungen sind daher erforderlich,

um die Auswirkungen des Nachweises

von mtDNA-Rekombination beim Menschen

auf Evolutionsuntersuchungen und auf die

Vererbung von pathogenen mtDNA-Mutationen

abschätzen zu können.

Literatur

[1] Gillham, Organelle Genes and Genomes, Oxford University Press (1994)

[2] Rokas et al. Animal mitochondrial DNA recombination revisited, Trends

Ecol. Evol. 18, 411-417 (2003)

[3] Schwartz and Vissing, Paternal inheritance of mitochondrial DNA, N Engl J

Med 347, 576-580 (2002)

[4] Kraytsberg et al. Recombination of human mitochondrial DNA, Science

304, 981 (2004)

[5] Yauk et al. High-resolution sperm typing of meiotic recombination in the

mouse MHC Ebeta gene, EMBO J 22, 1389-1397 (2003)

[6] Gyllensten et al. Paternal inheritance of mitochondrial DNA in mice, Nature

352, 255-257 (1991)

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Wolfram S. Kunz

Bereich Neurochemie

Klinik für Epileptologie, Universität Bonn

Sigmund-Freud-Str. 25

D-53105 Bonn

Östrogenrezeptor Signaling


Transkriptions- und Zellzyklus-

Regulation in normalem und

tumorigenen Brustgewebe

Ralf Hass, AG Biochemie und Tumorbiologie (OE6410), Medizinische Hochschule, Hannover

Diskussionen über den Einsatz einer Östrogen- (ERT) oder allgemeiner einer Hormonersatztherapie

(HRT) zur möglichen Reduktion eines Brustkrebsrisikos sind derzeit mehr denn je in

den wissenschaftlichen und öffentlichen Focus gerückt. Die Substitution mit diesen Steroidhormonen

beeinflussen vorzugsweise die metabolischen Aktivitäten von Endometrium, Ovar

und Mamma. Eine Reihe wissenschaftlicher Daten lassen die Interpretation zu, daß diverse

Risikofaktoren neben anderen negativen metabolischen Begleiterscheinungen das Karzinomrisiko

favorisieren. Insbesondere Frauen mit früher Menarche, später erster Schwangerschaft

und später Menopause tragen ein erhöhtes Risiko. Das Bundesinstitut für Arzneimittel und

Medizinprodukte (BfArM, Bonn) hat Mitte Mai – nach Beschränkung des Anwendungsgebietes

„Wechseljahresbeschwerden“ auf die Behandlung ausgeprägter Formen im August 2003

– auch die Zulassung von Hormonersatztherapie-Arzneimitteln zur Osteoporose-Prävention

auf Ausnahmefälle begrenzt. Änderungen in den Risikohinweisen müssen bereits zum 1. Juli

2004 umgesetzt werden.

In einigen großen klinischen Studien wurden

bei postmenopausalen Frauen, bei welchen

später ein Mammakarzinom auftrat, höhere

freie Östradiolspiegel gemessen als bei

gesundgebliebenen Frauen. Durch eine Überexposition

wird vermutlich eine zellbiologische

Kaskade normales Wachstum – Hyperplasie

– Neoplasie ausgelöst. Dies läßt vermuten,

daß das Risiko proportional zur kumulativen

Östrogenexposition der Zelle ist.

Allerdings gestalten sich die Daten aus diesen

Studien teilweise sehr widersprüchlich

bezüglich einer möglichen Assoziation zwischen

Hormonersatz und Brustkrebs, da im

Gegensatz zu der häufig vorgenommenen

Pauschalisierung der Ergebnisse unbedingt

eine differenziertere und detaillierte Betrachtungsweise

erforderlich ist. Diese ergibt sich

insbesondere hinsichtlich der Hormondosis,

der Kombination verschiedener Hormongruppen

und ihrer Derivate (Östrogene, Gestagene,

Androgene) sowie dem Applikationszeitpunkt

(Alter der Patientinnen, pharmakokinetische

und chronobiologische Unterschiede).

Darüber hinaus wird derzeit anstatt

einer Monotherapie eher die Kombinationstherapie

(zum Beispiel Östrogen + Gestagen)

favorisiert, wobei gerade hierfür, aufgrund

der komplexen metabolischen Interaktionsmöglichkeiten

keine ultimativen Daten

vorliegen.

Komplexe Signaltransduktion

Die Komplexität dieses Systems beginnt bereits

bei den Rezeptoren, wobei sowohl für

Östrogene, als auch für Gestagene oder etwa

Androgene jeweils zwei Typen von Rezeptoren

aus der Familie der nukleären Steroidhormonrezeptoren

bekannt sind. Obwohl die

verschiedenen Rezeptoren gewebsspezifisch

verteilt sein können, bewirkt die Co-Expression

im gleichen Zelltyp häufig synergistische

oder antagonistische Effekte 1 . Allgemein –

dafür aber auch pauschalisiert – gilt, daß die

Östrogen- oder Progesteronrezeptor-Aktivierung

über Dimerisierung eine hormoninduzierte

Transkriptionsmaschinerie in Gang

setzt. Aus der Komplexität des bereits sehr

simplifizierten schematischen Rezeptoraufbaus

erkennt man jedoch sehr schnell, daß

die Signalkaskade so ‚einfach’ sicher nicht

sein kann.

Neben diversen Bindungsstellen und Interaktionspartnern,

welche die Funktionalität

von Aktivatoren und/oder Repressoren

darstellen und für unterschiedlichste Modifikationen

in Form von Methylierung, Acetylierung

oder Phosphorylierung sorgen

können, existieren eine Reihe sekundär gekoppelter

Signalmechanismen parallel zur

Rezeptormodifikation, die direkt auch eine

Chromatin-Umstrukturierung vornehmen

können 2 oder in die Regulation der Zellzyklusprogression

eingreifen 3 . Dabei können

diese Signalmechanismen biphasisch ablaufen.

Einige dieser Effekte sind transient und

laufen innerhalb eines raschen engen Zeitfensters

ab, so daß die Langzeitwirkungen

der Hormone weitere metabolische Umstellungen

beinhalten müssen. Gerade beim

Östrogen werden unmittelbar schnelle Hormonsignale

(steroid receptor fast-action

complex) und langanhaltende metabolische

32 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


W I S S E N S C H A F T

Östrogenwirkungen unterschieden. Entsprechend

müssen die Signale des Östrogens

vom Extrazellularraum in den Nukleus der

Zielzellen transportiert werden, um dort

über die Dimerisierung des nukleären Östrogenrezeptors

(nER) unter anderem die transkriptionale

Aktivität zu entfalten. Dies wird

erreicht über plasmamembranassoziierte

cytoplasmatische Östrogenrezeptoren

(mERs). Es gibt aktuell eine Reihe von Hinweisen,

daß sich die mERs von den nERs

unterscheiden: durch alternative Splice-Varianten

4 , durch Aminosäuresubstitutionen 5

oder durch Acylierungen 6 , die für die Plasmamembranassoziation

verantwortlich

sind. Die östrogenvermittelte Aktivierung

des mER beinhaltet dann eine G-Protein gekoppelte

Signalkaskade über eine Gai-Untereinheit

zur Aktivierung des MAP-Kinase-

und weiter des Akt/Proteinkinase B-Signalsystems

7 . Darüber hinaus konnte aktuell

gezeigt werden, daß die Hormonproduktion

sowie die Rezeptoraktivierung entwicklungsabhängig

funktioniert. Diese ‚in vivo’-

Studien des aktivierten Östrogenrezeptors

ergaben weiterhin, daß eine rezeptorunabhängige

Wirkung der Hormone existiert beziehungsweise

eine hormonunabhängige

Rezeptoraktivierung erfolgen kann 8 .

Multiple Signalkaskade

Diese aktuellen Ergebnisse zeigen, daß

Östrogen und Progesteron eine multiple

Kaskade von Signalen induzieren können,

die in Abhängigkeit von den assoziierten Interaktionspartnern

eine unterschiedliche

metabolische Wirkung entfalten können.

Weitere Parameter verkomplizieren dieses

System wie etwa die Abhängigkeit vom Entwicklungszustand,

von der Hormonrezeptorexpression

oder vom Zelltyp – insbesondere

Unterschiede zwischen normalen

Brustepithelzellen und Brusttumorzellen.

Kürzlich veröffentlichte Studien dazu haben

sich genau mit der Charakterisierung dieser

zentralen Parameter beschäftigt. Neben

einer Primärkultur von normalen humanen

Brustepithelzellen (HMEC) werden Brusttumorzellinien

(MDA-MB-231, T47-D und der

rezeptortragende Subklon der MCF-7 Zellen)

in vitro mit verschiedenen Östrogenkonzentrationen

einmalig oder permanent über

einen längeren Zeitraum miteinander verglichen.

Die Auswertung dieser zweidimensionalen

Experimentreihe zeigte bedeutende

Unterschiede hinsichtlich der Morphologie,

der Zellzyklusprogression und biochemisch-metabolischer

Parameter zwischen

den normalen und den tumorigenen Brustzellen

9 . So konnte in den Brusttumorzellen

eine signifikant verstärkte transiente proteolytische

Aktivität durch eine selektive Aktivierung

des 20S-Proteasomsystems im Vergleich

zu hormonbehandelten normalen

Brustzellen nachgewiesen werden, was unter

anderem auf eine erhöhte Akkumulation

von oxidativen Streßprodukten in den

Tumorzellen hindeutet 9 . Vor kurzem wurde

in diesem Zusammenhang in einer unabhängigen

Arbeit bestätigt, daß Östrogen über

den plasmamembranassoziierten mERa

durch eine G-Protein-vermittelte Signalkaskade

in der Tat oxidativen Streß mittels des

eNOS-Systems induzieren kann 10 .

Im weiteren Verlauf des Vergleichs von

östrogeninduzierten normalen und tumorigenen

Brustzellen konnte gezeigt werden,

daß die östrogenvermittelten morphologischen

Unterschiede bei den Brustkrebszellen

(MCF-7) im Vergleich zu den normalen

tung der Tumorzellen entwickeln, wäre dies

im Grunde ein diagnostischer Nachweis für

die ‚weniger maligne’ Population der Tumorzellen,

da diejenige Subpopulation, deren

Cytokeratine durch MMPs und andere

Extrazellularmatrixproteasen reduziert wurden,

bedeutend höhere metastatische Kapazität

besitzen sollten.

Neben diesen Resultaten läßt sich daher

allgemein resümieren, daß eine Reihe weiterer

detaillierter Experimentreihen und differenzierter

Schlußfolgerungen zur Wirkungsweise

und dem komplexen crosstalk

von Steroidhormonsignalen und der dabei

Simplifizierter schematischer Aufbau und Assoziationspartner am Beispiel des Östrogenrezeptors

Brustepithelzellen (HMEC) mit einer unterschiedlichen

Expression von Matrixmetalloproteinasen

(MMPs) korreliert. So zeigten

Brustkrebszellen eine signifikante Induktion

von MMP-1 und MMP-7 nach Östrogenstimulation,

wogegen diese Zn 2+ -abhängigen

Extrazellularmatrix-Proteasen in normalen

Brustepithelzellen nach Östrogenstimulation

deutlich herunterreguliert werden 9 .

Diese gegensätzlichen Wirkungen von

Östrogen in Brustkrebszellen im Vergleich

zu den HMECs werden auch durch das unterschiedliche

Adhärenzverhalten der verschiedenen

Zellpopulationen unter dem Einfluß

von Östrogen bestätigt. In diesem Zusammenhang

könnten Östrogene eine nicht

unbedeutende Rolle für das Metastasierungsverhalten

bestimmter Brusttumore

spielen. Diese Resultate haben auch diagnostische

Konsequenzen in der Hinsicht, daß

beispielsweise die Charakterisierung von

Mamma-Tumorzellen und insbesondere von

Mikrometastasen im Knochenmark weitgehend

über die Expression von Cytokeratinen

vorgenommen wird. Da diese Extrazellularmatrixproteine

aber die Funktionalität

von Adhärenz und damit eine lokale Anhefrezeptorvermittelten

intrazellulären Signalkaskade

unbedingt notwendig sind, da sie

eine enorme pharmakokinetische und klinische

Bedeutung beinhalten.

Literatur

[1] Hewitt and Korach; Rev. Endocrinology & Metabol. Disorders 3:193-200

(2002)

[2] Chen et al., Cell 98:675-686 (1999)

[3] Chen et al., Mol. Cell 6:127-137 (2000)

[4] Figtree et al., Circulation 107:120-126 (2003)

[5] Razandi et al., Mol. Cell Biol. 23:1633-1646 (2003)

[6] Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:4807-4812 (2003)

[7] Chambliss und Shaul, Endokr. Rev 23:665-686 (2002)

[8] Ciana et al., Nature Med. 9:82-86 (2003)

[9] Hass and Sohn, Signal Transduction 1-2:9-17 (2003)

[10] Chambliss and Shaul, Endokr. Rev 23:665-686 (2002)

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Ralf Hass

Biochemistry and Tumor Biology (OE6411)

Medical School

Carl-Neuberg-Str. 1

D-30625 Hannover

Tel.: +49-511-532-6080

Fax: +49-511-532-6081

eMail: hass.ralf@mh-hannover.de

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 33


B L I T Z L I C H T

Nukleinsäure-Separation


Erhöhte DNA-Ausbeute und

kurze Aufreinigungszeit

Dr. Claudia Disqué, Helge Mühl, Prof. Dr. Michael Lorenz,

Molzym GmbH & Co.KG, Bremen

laren DNA-Bande oberhalb der 23 kb-Bande

des Markers (M, oberste Bande). Zudem sind

in Präparat 3 die in diesem Stamm vorhandenen

low copy number-Plasmide durch die

extrem hohe DNA-Ausbeute deutlich zu erkennen

(Abb. 1, Pfeile). Als Ergebnis des Reinigungsverfahrens

wird genomische DNA

mit einer molekularen Größe von >50 kb gewonnen.

Im Vergleich dazu wurde mit dem

Kit eines Wettbewerbers DNA-Abbau beobachtet,

sichtbar an dem “Schmier” unterhalb

der hochmolekularen Bande (Abb. 1).

Die Molzym GmbH & Co.KG hat eine Mini Spin-Kit-Serie zur schnellen, einfachen und hocheffizienten

DNA-Extraktion und Reinigung entwickelt und auf den Markt gebracht. Die Eigenschaften

dieser Kits – Schnelligkeit, hohe Ausbeuten und Qualität der DNA – beruhen auf

einer Kombination aus verbesserten Lysebedingungen und einem neuen Reinigungsverfahren,

das sich die zum Patent angemeldete „Cationen Complexation Technology“ und neuartige

Bindematrices zunutze macht. Angeboten werden Kits zur DNA-Reinigung aus Bakteriophagen,

Bakterien, Hefen, Pilzen, Pflanzen, Böden, Nahrungsmitteln, Gewebe, Blut und Zellkulturen.

Neu ist auch ein Universal-Kit zur Reinigung von genomischer und Plasmid-DNA. Ein

besonderes Merkmal der Kits ist, daß ein uniformes DNA-Reinigungsprotokoll für alle Arten

der genannten Probenmaterialien verwendet wird. Mit diesem Protokoll können aus Lysaten

Gesamt-Nukleinsäuren in 10 Minuten, hochmolekulare genomische DNA durch RNase A-

Behandlung in 15 min gereinigt werden. Die DNA-Ausbeuten aus zum Beispiel 100 mg bestimmter

Gewebearten können 80 µg überschreiten. Damit erreichen die PrestoSpin D Mini

Spin-Kits den Midi-Maßstab von Ausbeuten (>20 µg-100 µg).

Key Words: DNA-Reinigung, Mini Spin Verfahren, genomische DNA

Die gereinigte genomische DNA ist für alle

Downstream-Anwendungen geeignet einschließlich

PCR und Hybridisierung zur genotypischen

Analyse sowie Klonierung. Dabei

wurden Verfahren zur effizienten und

schnellen Lyse (Tab. 1) mit einer neuen Trenntechnologie

zur Reinigung von Nukleinsäuren,

„Cation Complexation Technology“

(CCT), verbunden 1.

Die Lyseprotokolle sind darauf abgestimmt,

das Probenmaterial vollständig aufzulösen

bzw. eine optimale Freisetzung der

Nukleinsäuren zu bewirken. Dies erfolgt entweder

durch

– eine enzymatische Vorbehandlung mit anschließender

Lyse in chaotropem Puffer

– enzymatischen Verdau in Lysepuffer oder

– direkten Einsatz von chaotropen Puffern

(Tab. 1).

Die chaotropen Puffer verhindern effizient

den Abbau der Nukleinsäuren. Abbildung 1

verdeutlicht dies anhand verschiedener Bakterien

(DNA-Präparate 1-4, Molzym) durch

das Auftreten einer distinkten, hochmoleku-

Abb. 1: Agarosegel-Elektrophorese von bakterieller

DNA, die durch den PrestoSpin D Bug-Kit

isoliert wurde (je 1 ml Kultur). 1: Bacillus subtilis,

2: Escherichia coli, 3: Pseudomonas stutzeri, 4:

Halomonas sp. Als side-by-side-Vergleich wurde

DNA mit einem Mini Spin-Kit eines Wettbewerbers

isoliert. Aufgetragen wurden jeweils 10 µl

der Präparate (100 µl Eluat). Pfeile: Plasmid-

Banden. M: Molzym Lambda HindIII-DNA-Marker

(oberste Bande 23 kb).

Tab. 1: Lyse verschiedener Materialien und DNA-Isolierungszeiten mit der PrestoSpin D-Mini

Spin-Kit-Serie

Material Maximale Menge Behandlung Gesamte DNA-

Isolierungszeit **

(Wettbewerber)

Bakterien* 2 x 10 10 Zellen Lysozym, 35 - 65 min

oder 6 ml E. coli dann Lysepuffer (90 min)***

Hefen 2 ml Lyticase, 70 min

bei OD 600

>10 dann Lysepuffer (150 min) ***

Pilze 200 mg Mörsern, 40 min

dann Lysepuffer (50 min) ****

Pflanzen 150 mg frisch, Proteinase K 50 min

50 mg getrocknet in Lysepuffer (55 min) ****

Gewebe inkl. 200 mg Proteinase K 90 - 180 min

Mausschwanz bzw. 1 cm in Lysepuffer (180-280 min) ***

Vollblut 200 µl Proteinase K 30 min

in Lysepuffer (30 min) ***

Lambda 5 x 10 12 Phagen Lysepuffer 70 min

aus 10 ml Lysat (270 min) ***

Zellkulturen 10 7 Zellen Lysepuffer 25 min (30 min) ***

* Gram-positiv (z.B. Bacillus) und Gram-negativ (z.B. Escherichia), ** Lyse plus Reinigung; 4 parallele Proben, *** Wettbewerber Q, **** Wettbewerber M

Für den DNA-Isolierungsschritt werden die

Lysate durch ein Bind-Wash-Elute-Reinigungsregime

geschickt. Besonderheit der PrestoSpin

D-Kits ist, daß für jede Art von Material

immer dasselbe DNA-Reinigungsprotokoll

verwendet wird. Das Lysat wird mit einem

Bindepuffer vermischt, der die Bedingungen

für die Adsorption von genomischer DNA

an die Matrix einstellt. Das Bindeprinzip und

die Reinigungsprozedur (CCT) unterscheiden

sich von der Anionenaustausch-Chromatographie

und dem Aussalzeffekt auf Silika- oder

Glasfasermembranen. Gemäß CCT bindet

DNA über die Komplexierung von multivalenten

Kationen wie Magnesium-Ionen an

negativ geladene Oberflächen 1 . Nach nur zwei

kurzen Waschschritten mit einer eingebundenen

RNase A-Behandlung auf der Säule wird

die DNA in 50 bis 150 µl Elutionspuffer hochkonzentriert

und in reiner Form gewonnen.

In Kombination mit CCT werden neue Bindematrices

verwendet, die unter anderem aus

einer Mischung aus Sand und Tonmineralen,

34 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


B L I T Z L I C H T

Tab. 2: Typische Ausbeuten genomischer DNA mit der PrestoSpin D-Kitserie (RNase-Behandlung;

Elutionsvolumen 100 µl) im Vergleich zum Wettbewerb (Mini Spin-Säulenkits)

Material Ausbeute(E 260 nm

) Qualität(E 260/280 nm

)

Molzym Wettbewerber Q Molzym Wettbewerber Q

Bakterien (1 ml)

E. coli (Gram-negativ) 18,0 µg 4,1 µg 1,77 1,72

B. subtilis (Gram-positiv) 15,5 µg 14,1 µg 1,86 1,94

Hefen (1 ml)

S. carlsbergensis 9,1 µg 3,3 µg 2,11 2,09

S. boulardii 22,7 µg 2,7 µg 2,08 2,34

Pflanzenblätter (100 mg)

Tomate 8,9 µg 2,9 µg 1,90 1,73

Arabidopsis 10,6 µg 10,3 µg 2,12 2,26

Weizen 33,6 µg 13,6 µg 1,89 1,89

Gewebe (30 mg)

Mausschwanz (1 cm) 48,5 µg 21,6 µg 1,80 1,81

Rattenlunge 21,8 µg n.b.* 1,80 n.b.*

Rattenleber 85,1 µg 12,8 µg 1,81 1,49

Vollblut (100 µl) 2,0 µg 2,4 µg 1,79 1,84

Lambda (6 x 10 11 Phagen) 6,0 µg 4,4 µg ** 1,77 1,84 **

* n.b. = nicht bestimmbar (gefärbtes Eluat)

** Gravitations-Durchflusssäule (Austauscher)

organopolymeren geladenen Faserfiltern oder

Diatomeenerde bestehen können. Ein Vorteil

vieler dieser Matrices ist, daß auch hochvis-

kose Lysate innerhalb eines Zentrifugationsschritts

von nur 30 Sekunden leicht passieren,

während die Nukleinsäuren binden. Ein weiterer

Vorteil ist die extrem hohe Bindekapazität

der Matrices in Verbindung mit CCT (> 80

µg DNA) und die damit resultierende hohe

Ausbeute (Tab. 2), die deutlich in den Midi-

Bereich der DNA-Mengenkategorisierung

reicht (>20 – 100 µg). Bei solch hohen Ausbeuten

ist die DNA-Menge nicht mehr limitierender

Faktor für Anwendungen wie Hybridisierungen.

PrestoSpin D-Kits werden innerhalb

Deutschlands von Omnilab Life Science

(www.omnilab.de) vertrieben. Zur Auswahl stehen

Spezial-Kits zur Reinigung von genomischer

bzw. Plasmid-DNA im Midi-Maßstab als

auch ein universeller Kit zur Reinigung von

genomischer und Plasmid-DNA.

Literatur

[1] Lorenz, M. Laborwelt Nr. 4 (2003), 40-41

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Michael Lorenz

Molzym GmbH & Co.KG

Leobener Strasse, UFT, Raum 1340

D-28359 Bremen

Tel.: +49-(0)421-218-8780, Fax: -218-8781

eMail: info@molzym.com, www.molzym.com

PCR


Neuer THEQ-Thermocycler

MWG Biotech hat einen neuen Thermocycler

entwickelt – den MWG THEQ Lifecycler

(Abb. 1). Die Basis des THEQ Lifecyclers bildet

die Quad Circuit Thermal Engine, die Temperatursteuerung

des Systems mit vier unabhängig

voneinander ansteuerbaren Temperaturzonen.

Acht Peltier-Elemente, die von

vier Sensoren kontrolliert werden, stellen eine

präzise Temperatursteuerung, -verteilung

sowie eine optimale Temperaturhomogenität

sicher.

Zur Vermeidung unspezifischer Bindungen

während der Deckelaufheizphase kommt

die sogenannte THEQ ASP(Active Sample

Protection)-Technologie zum Einsatz: Nach

dem Start werden die Proben aktiv auf 4°C

gekühlt. Erst wenn die Polymerase durch die

Kühlung auf „Pause“ gestellt wurde, wird

der Deckel aufgeheizt. Dadurch kann die

Deckeltemperatur nicht mehr die Proben

undefiniert erwärmen und dadurch unspezifische

Bindungen verursachen. Ist die Zieltemperatur

für den Deckel erreicht, werden

die Proben aktiv auf die erste Zieltemperatur

erwärmt und die PCR kann starten.

Durch Verwendung eines integrierten PCs

und eines 18,4 Zoll-Monitors mit Touchscreen-Funktion

läßt sich die Software des

THEQ bedienen wie ein Windows-Programm.

Zudem speichert das Program

Wizard die bei der PCR-Programmierung

wiederkehrenden Berechnungen – es müssen

nur noch Primer-Sequenzen, Template-Länge

und DNA-Typ eingegeben werden.

Das System ist in verschiedenen Konfigurationen

verfügbar:

– 3+1Server/Satellite-Kombination: Bis zu

vier Thermocycler können von einem Server-THEQ

mit integriertem PC und

Touchscreen betrieben werden.

– PC-basierte Thermocycler-Bedienung: Da

PC- und Cycler-Software identisch sind,

können bis zu 48 THEQ von einem einzigen

Steuer-PC aus bedient werden.

– USB Plug and Play-Verbindung: Netzwerk-Cycler

werden über USB-Sticks verbunden

– Nutzer-Management: Der Administrator

kann Nutzerprofile mit unterschiedlichen

Zugriffsrechten definieren. So können etwa

die Rechte für das Löschen oder Editieren

von Programmen erteilt oder versagt werden.

– Es stehen zwei Report-Typen zur Auswahl:

Labbook Report – kurze Laufbeschreibung

im ASCII-Format und GLP-

Report – detaillierter Report im verschlüsselten,

nicht editierbaren Format

– Barcode-Option: Barcodes können mit einem

Handscanner gelesen und dokumentiert

werden. In Kürze wird eine barcodeabhängige

PCR-Programmauswahl zur

Verfügung stehen.

Das neue Gerät wird mit 196-well-Gradient-

Block (für 96 x 0,2 ml-Tubes und 96 well-Platten),

mit 96-well-Gradient-Kombi-Block (für

48 x 0,5 ml96x 0,2ml Tubes und 96-well-Platten)

sowie mit 384-well-Hochdurchsatz-Block

angeboten. Die Blöcke können ohne Werkzeug

ausgetauscht werden.

Information

Holger Eggert

Internationaler Produktmanager THEQ

eMail: heggert@mwgdna.com

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 35


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T

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MARKTÜBERSICHT

Marktübersicht: PCR-Thermocycler

1 Firmendaten, Ansprechpartner

Analytik Jena A G

www.analytik-jena.com/

Ansprechpartner Alexander Berka

Tel.: +49-(0)-3641-777132

Fax: +49-(0)-3641-779279

eMail: a.berka@analytik-jena.de

Biometra

GmbH

Rudolf-Wissell-Str.

D-37079 Göttingen

30

Tel. +49-(0)551-50686-0

Fax +49-(0)551-5068666

eMail: biometra.info@whatman.com,

Ansprechpartner: Dr. Markus Kapp

www.biometra.de

Biometra

GmbH

Rudolf-Wissell-Str.

D-37079 Göttingen

30

Tel. +49-(0)551-50686-0

Fax +49-(0)551-5068666

eMail: biometra.info@whatman.com,

Ansprechpartner: Dr. Markus Kapp

www.biometra.de

Bio-Rad Laboratories GmbH

Heidemannstr. 164

D-80939 München

www.bio-rad.de

Ansprechpartner: Dr. Marcus Neusser

Tel.: +49-(0)89-31884-132, Fax: +49-0)89-31884-123,

eMail: marcus_neusser@bio-rad.com

2 Produktname

r

SpeedCycle

T3000

Thermocycle r

TGradien

t

Cycler Q

i

M

3 Standfläche

m

B 300mm; T: 410mm; H: 210m

30

cm x 38 cm (B x T )

2 5 cm x 34 cm (B x T )

26 x 55 x 23 cm (W x D x H )

4.

Thermocycler oder

Kurzbeschreibung

PCR-System:

Thermocycler

einem Gerät.

Programme

mit drei

Es können

gleichzeitig

unabhängigen Blöcken

drei unterschiedliche

abgearbeitet werden.

in

T

r

5 Anzahl der Blöcke/Austausch möglich

r

1 Block/ohne Werkzeug austauschba

3 Blöcke / Austausch nicht möglic h

1 Block / Blockwechsel möglic h

4 Thermoblockformate auswechselbar (96well ,

2x48well, 60well, 384well)

6.

Kapazität

titerplatten,

der

C.

Blöcke: A. Tubes,

Objektträger, D.

36er und 96er

Objektträger

Block,

Mikrotiterplatten,

Tubes,

A: T3000 Thermocycler 20:

T3000 Thermocycler 48: 3 x

T3000 Thermocycler Kombi:

bzw. 48 Gefäße à 0,2ml

B: T3000 Thermocycler 48

Mikrotiterplatte

C: keine

D: T3000

Streifen

Thermocycler

48

3

x

48

3

20 Gefäße à 0,5ml •

Gefäße à 0,2ml •

18 Gefäße à 0,5ml

x

+ Kombi:

und

Kombi:

6

A:

96

B:

C:

D:

TGradient 48:

Gefäße à 0,2

TGradient 96:

in situ-Modul

TGradient 96:

48 Gefäße à 0,5 ml • TGradient

ml

96-well-Mikrotiterplatte

für 4 Objektträger erhältlich

12 x 8er Streifen

96:

A.

B.

D.

(8er

stripes,

12er

stripes)

7.

Temperaturgradient

S chritte in ° C

über

Block

anlegbar

nein

n ein

T emperaturgradient möglich, max. 4 0 °C T emperaturgradient 1-2 5 ° C über die Reihen A- H

8 eingesetzte Heiz/Kühltechnik

r

High Power-Peltierelemente;

goldbeschichteter Silberblock

massive

Peltiertechnologie

Peltiertechnologi

e

Peltier/Luf t

9 Temperaturbereich (von …bis ° C )

0

0 -10 °C 3

– ° C bis 99, 9 °C 3

– ° C bis 99, 9 °C 4 ° C -10 0 °C

10.

Größtmögliche

Regeltemperaturabweichung

± 0 , 2 °C emperaturuniformitä t

T ± 5

R egelgenauigkeit ± 0 , 1 °C

0 , ° C ,

± 0 , 3 °C

11.

H eizrate/Kühlrate [ ° C /s ]

0

1 ° /s (0,1-1 0

M ax Heizrate: 4 ° C /s • Max Kühlrate: 3 ° C/

s 3 , 3 ° C /s Heizen 2, 0 ° C/s Kühle n

12.

Deckel beheizbar, sonstig e

Eigenschaften

J a, bis zu 110 ° C, autom. Anpressen an den Block ,

Anpreßkraft wählbar

Deckeltemperatur frei wählbar zwischen

° C, Smart Lid Technology für definierte n

Anpreßdruck

30

und

110

Deckeltemperatur frei wählbar zwischen

° C, Smart Lid Technology für definierte n

Anpreßdruck

30

und

110

D eckel beheizbar bis 110 °C

1 3. Real-Time-Detektion: integriert/aufrüstbar

n

n ein/nei

k .A .

k.A .

14.

Probenvorbereitung:

möglich

integriert/extern/nicht

e xterner Probengeber möglich

k .A .

k .A .

Probenvorbereitung exter n

15.

n ein/ja/RS 232

S chnittstelle: Seriell RS23 2

S chnittstellen: Seriell RS232, parallel Centronic s PCR Optimierungsprogramme :

Thermogradientenfunktion zur

Sopftware upgrades: Diskette

w ww.bio-rad.com/amplification/ •

Geräteschnittstellen: seriell, parallel

PCR-Optimierung

oder download von


1 6. Extras

e

200

Begrenzung

Programme

im Gerät

speicherbar,

im PC

ohn

Drei

Lid

unabhängige

Technology

Blöcke

in

einem Gerät


Smart

rapid PCR-Thermocycler: ein System, das die PCR-

Zeiten deutlich verringert • bis zu 10fach höhere

Geschwindigkeit im Vergleich zu konventionellen

Thermocyclern • SAC-Technologie • Temp./Zeit

Increment • autom. Anpressen des Deckels und

einstellbarer Anpreßdruck • SPS – Sample Protection

System • Heizblockwechsel ohne Werkzeug • PC

Steuerung mgl. • Cycler-Netzwerke mgl

M

Thermocycler

mit Gradientenfunktion

iCycle

r modulares PCR-Thermocyclersystem zu

Kombination mit unterschiedlichen Thermoblock-

formaten (96well, 2x48 well, 60 well, 384well) für

die konventionelle PCR

B. Mikro-

Sonstige

48-well-

8erx

T emperaturuniformität ± 0 3 ° C innerhalb von 1 5

sec,

R egelgenauigkeit 0/- 0,1 °C

C ° C /s) / 6 ° C /s (0,1- 6 ° C/s

)

T 3000 Thermocycler 20: HR 2, 1 ° C /s/ KR 1, 7 ° C/s •

T 3000 Thermocycler 48: HR 2,2 ° C /s/ KR 2, 0 ° C/s •

T 3000 Thermocycler combi: HR 1,4 ° C /s/ 1, 2 ° C/ s

PCR-Optimierungsprogramme/Software-

Upgrades/Geräteschnittstellen

Goldbeschichteter Silberblock für hohe

Geschwindigkeit und eine sehr gute Temperatur-

u niformität • Temperaturgradient bis 40 ° C • Smar t

Lid Technology

Bio-Rad

PCR-Reagenzien

17. Garantie/Service/Anzahl Servicetechniker

Deutschland

1 Jahr Gewährleistung/Ja/22

24 Monate Garantie/Servicezentrale mit dre i

Technikern in Göttingen

24 Monate Garantie/Servicezentrale mit drei

Technikern in Göttingen

Garantie: 1 Jahr/Service: nach Bedarf und

Serviceverträge möglich/–

1 8. Basispreis (Euro)


8 .500, g a b 9.350, – g a b 5.950, – g 7 .690,–

g mit 96-well-Thermogradientenbloc k

36 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


.

.

.

.

.

.

,

.

,

:

.

T H E R M O C Y C L E R

1 Firmendaten, Ansprechpartner

Bio-Rad Laboratories Gmb H

Heidemannstr. 164

D-80939 München

www.bio-rad.de

Ansprechpartner: Dr. Marcus Neusser

Tel.: +49-(0)89-31884-132, Fax: +49-0)89-31884-123,

eMail: marcus_neusser@bio-rad.com

2 Produktname

r

M

M yCycle

T

r

3 Standfläche

)

Biotage AB

Tel.: +46 18 565900

eMail: info@biotage.se

Biozym Diagnostik GmbH

Postfach

D-31833 Hessisch Oldendorf

Tel.: +49-(0)5152-52430

Fax: +49-(0)5152-524320

eMail: support@biozym.com

www.biozym.com

Ansprechpartner: Helmut Prechel

P ersonal Cycle

C orbett Research Rotor-Gen e 3 00 0

Biozym/MJ Research MultiCycler-System PTC 200, PTC 220 Dyad, PTC 22 1

Disciple, PTC 240 Tetrad 2

2 5 x 44 x 21 cm (W x D x H

3 8 cm x 48 c m

24 x 33 cm (PTC 200) bis 48 x 61 cm (PTC 240 Tetrad 2 )

4.

6.

7.

Thermocycler oder

Kurzbeschreibung

PCR-System:

M

M

5 Anzahl der Blöcke/Austausch möglich

)

Kapazität

titerplatten,

der

C.

Temperaturgradient

S chritte in ° C

Blöcke: A. Tubes,

Objektträger, D.

über

Block

anlegbar

8 eingesetzte Heiz/Kühltechnik

t

T

-

R eal-Time DNA Detection System

Thermocycler-System, bestehend aus vier Basiseinheiten und 1 0

Reaktionsblocktypen. Basiseinheiten können mit den vorkalibrierten

Wechselblöcken frei kombiniert werden.

1 Thermoblockformat (96well

N / A

PTC 200: 1 Reaktionsblock • PTC 220 Dyad/PTC 221 Disciple: 2

Reaktionsblöcke • PTC 240 Tetrad 2: 4 Reaktionsblöcke • 10

Reaktionsblocktypen, Austausch in < 10 Sek. möglich

A B. D. (8er stripes, 12er stripes)

D 72 tube s

Monoblöcke: A: 60 0,5 ml Tubes • 96 0,2 ml Tubes •

B: 96 Well MT-Platte • 384 Well MT-Platte •

C: 4 Slides/Microarrays

Dualblöcke: A: 2 x 30 0,5 ml Tubes • 2 x 48 0,2 ml Tubes

Tubes + 30 0,5 ml Tubes

B: 2 x 48 Well MT-Platte

C: 2 x 16 Slides/Microarrays

T emperaturgradient 1-25 ° C über die Reihen A- H

N /A. One of the key features is temperature uniformit y

T emperaturbereich zwischen 30 und 10 5 ° C • Gradient definierba r

z wischen 1 und 24 ° C, inkl. Dynamic Ramping (Zieltemperaturen de s

Gradienten werden zur gleichen Zeit erreicht, d.h. konstante

Inkubationszeiten)

P eltier/Luf

A ir heated/coole d

MJ-Modul/Peltier + Joule-Heate r


48

0,2

ml

9 Temperaturbereich (von …bis ° C ) 4 ° 0

10.

Größtmögliche

Regeltemperaturabweichung

11.

H eizrate/Kühlrate [ ° C /s ]

5

C -10 °C 5-9 9

2 °C - 5 bis 10 5 °C

± 0 , 5 °C ± 0 .0 1 ° C sample-to-sample variation (deviation between samples run a t

t he same time), ± 0 1 ° C precision (deviation between samples run a t

different times)

2 ° C /sec. heizen 1. 5 ° C/sec.

kühle n

A ir temperature: 5 ° C /s, sample temperature: 2. 5 ° .

± 0 , 3 ° C bei 9 0 °C

C/s

M ax. 3 ° C/ s

12.

Deckel beheizbar, sonstig e

Eigenschaften

1 3. Real-Time-Detektion: integriert/aufrüstbar

r

D eckel beheizbar bis 110 °C H eated lid, centrifugal forma t

Ja, Blöcke mit motorbetriebenem Öffnungsmechanismus un d

programmierbarer Anpreßdruck-Justierung für Roboterintegration

verfügbar

n icht aufrüstba

Integrated detectio n

14.

15.

Probenvorbereitung:

möglich

integriert/extern/nicht

P robenvorbereitung extern

Corbett Robotics CAS-120 0

1 6. Extras

-

17.

Garantie/Service/Anzahl

Deutschland

Servicetechniker

1 8. Basispreis (Euro)


Bio-Rad-PCR-Reagenzien

update


Thermogradientenfunktion

mittles

Software

yCycler Personal Cycler kompaktes PCR-System mit großem VGA

Display zur übersichtlichen und leichten Bedienbarkeit mit intuitiver

Programmierung. Algorithmische- und Block-Temperatursteuerung des

96-well-Thermogradientenblocks. Speicherung von 99 onboard-

Protokollen. GLP-konforme Dokumentation der Validierungsprotokolle.

B. Mikro-

Sonstige

PCR-Optimierungsprogramme/Software-

Upgrades/Geräteschnittstellen

PCR-Optimierungsprogramme: Thermogradientenfunktion zur PCR-

O ptimierung • Sopftware-upgrades: Diskette oder download von www.bio -

r ad.com/amplification/ • Geräteschnittstellen: US B

U nlimited copies of software, free software upgrades

Intuitive Editorfunktionen zur Programmerstellung • Gradient Calculato r

Screen • Touchdown-, Extend und Increment-Funktion • Externe

Steuersoftware „EasyEngine" zur Fernsteuerung und Protokollierung von

Laufdaten (PTC 200, PTC 221 Disciple, PTC 225 Tetrad) • Netzwerkfähig

(PTC 200, PTC 225 Tetrad) • VGA-Farbgrafikdisplay mit Echtzeitanzeige der

Temperaturmeßwerte (PTC 220 Dyad, PTC 240 Tetrad 2) • Software-

Upgrades kostenlos/Schnittstellen: RS-232, teilweise parallel bzw. USB-

Port

Mehrfeld-Heiz-/Kühlsystem • Multisensor-Technologie •

Roboterintegration vorbereitet (Systeme sind vollständig fernsteuerbar)

Blöcke mit motorbetriebenem Öffnungs-/Verschlußmechanismus

erhältlich • Inkubation von Objekträgern (in situ-Applikationen) und

Microarrays • HTP-Anwendung mit 384-Well-Blöcken (Spezial-

Oberflächenbeschichtung)

G arantie: 1 Jahr/Service: nach Bedarf und Serviceverträge möglich/– 2 years warranty, 3 technicians in German y

2 Jahre Garantie, Wartungsverträge möglich, Validierung un d

Zertifizierung, vier Servicetechniker

4 950, g o hne Thermogradientensoftwar e

P lease request a quotation from in fo@biotage.s e

< 10.000,– bis 48.000, – g je nach Modell und Ausstattun g


LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 39


.

.

.

.

.

.

MARKTÜBERSICHT

4.

6.

7.

1 Firmendaten, Ansprechpartner

Biozym Diagnostik Gmb H

Postfach

D-31833 Hessisch Oldendorf

Tel.: +49-(0)5152-52430

Fax: +49-(0)5152-524320

eMail: support@biozym.com

www.biozym.com

Ansprechpartner: Helmut Prechel

2 Produktname

0

3 Standfläche

m

Thermocycler oder PCR-System:

Kurzbeschreibung

Cepheid s.a.

Vira-Solelh

81470 Maurens-Scopont, France

Tel.: +33-(0)-563-825300, Fax: +33-(0)-563-825301

www.cepheid.com

Ansprechpartner: Dr Andreas Eckelt

Tel.: +49-(0)2174-791909

Fax: +49-(0)2174-791908

eMail: eckelt@cepheid.com

Cepheid s.a.

Vira-Solelh

81470 Maurens-Scopont, France

Tel.: +33-(0)-563-825300, Fax: +33-(0)-563-825301

www.cepheid.com

Ansprechpartner: Dr Andreas Eckelt

Tel.: +49-(0)2174-791909

Fax: +49-(0)2174-791908

eMail: eckelt@cepheid.com

Ltf-Labortechnik

Obere Ebenhalde 19

D-88142 Wasserburg

Tel.: +49-(0)-8382-98520, Fax:

eMail: info@labortechnik.com

www.labortechnik.com

Biozym/MJ

Research MaxiCycler PTC 10

Genexper

t

S martcycle r

INSYTE „real-time PCR System “

24

x 28 c

ca.

30x30x3 0

3 0x30x3 0

44 x 46 x 60 cm (Breite x Tiefe x Höhe )

T hermocycler mit fest installiertem Block

Real-Time-PCR-System. (bis zu 4 I-CORE/DNA -

Extraction-Modulen, Dell Computer, Software)

5 Anzahl der Blöcke/Austausch möglich

C

Kapazität

titerplatten,

der

C.

Temperaturgradient

S chritte in ° C

Blöcke: A. Tubes,

Objektträger, D.

über

Block

anlegbar

PTC 100-60, PTC 100-96V, PTC

100-16ms: je 1 Reaktionsblock

Reaktionsblocktypen, Austausch

A: 60x0,5 ml Tubes • 96x0,2 ml

B: 96-Well MT-Platte • 48-Well

C: 16 Slides/Microarrays und 24

Objekträger (Aufsatz für Block

8 eingesetzte Heiz/Kühltechnik

r

9 Temperaturbereich (von …bis ° C )

0

10. Größtmögliche

Regeltemperaturabweichung

11.

H eizrate/Kühlrate [ ° /s ]

C 5

12.

Deckel beheizbar, sonstig e

Eigenschaften

1 3. Real-Time-Detektion: integriert/aufrüstbar n

14. Probenvorbereitung: integriert/extern/nicht

möglich

15.

1 6. Extras

d

17.

Garantie/Service/Anzahl

Deutschland

Servicetechniker

2

100-96VHBGold, PT

vier

im Service möglich

Tubes

MT Plate

0,2 ml Tubes oder

96 bzw. 60)•

4

Real-Time-PCR-System. Separate Temperatur- und

Zeitansteuerung für jedes Tube ermöglicht simultane

oder zeitversetzte real-time-PCR-Assays mit

unterschiedlichen Protokollen. Komplettsystem

(Processing-Block mit 16 I-CORE-Modulen, Dell

Computer, Software, Mikrozentrifuge, Gefäßständer)

1 -4 Reaktionen

16-96 Reaktionen (bei 6 Blöcken je 16 Tubes/Block) •

Blöcke austauschbar

+49-(0)-8382-9852-32

ultraschnelles real-time PCR-System im 96-well-

Format • ECP-Technologie mit Heiz-

und Kühlraten

v on 15 ° C und mehr • jedes der 96 wells stellt ein

autarkes Mini-PCR System dar, das mit völlig

unterschiedlichen Temperaturprofilen und Farbstoffen

gefahren werden kann • höchste Fluorophor-

Flexibiltät: für alle auf dem Markt befindlichen

Farbstoffe geeignet • perfekte Temperaturauflösung

( 0,01 ° C )

96er-Format

A nwendungsspezifische Extraktionskartuschen T ubes für 25 bzw 10 0 µl ECP Striptubes, Einzeltubes und ECP96er-Tray s

v orinstallierte Protokolle

f reie Temparaturwahl für jede Reaktio n

Temperaturgradient horizontal und vertikal über de n

9 6er-Tray • Maximalgradient über 40 ° C (0, 1 °C

Auflösung) E

M J-Module/Peltie

e lektr. Heizplatte • Keramik-Kühlgebläs e

e lektr. Heizplatte • Keramik-Kühlgebläs e

CP-Heiztechnik/ highspeed turbulence air

0 bis 10 °C 0

R aumtemperatur-10 °C aumtemperatur-10 0

Nei

Intergrier

t

ntergrier t

Vollautomatische Probenaufarbeitung mit integrierter E xtern siehe Genexpert

Probenvorbereitung extern (automatisiert )

Real Time-PCR-Analyse. Details siehe

www.cepheid.com

S oftware für FDA/CE-zertifizierte Assays von Cepheid USB-Schnittstelle: Numerische und graphische Daten - Softwareupgrades kostenlos/ Schnittstellen on

analyse • Simultane wählbare Darstellung von Analy-

demand

separametern, Protokollen und Ergebnissen aller oder

einzelner Assays • Graphische Darstellung der 2. Ableitung

des Cycle thresholds (ct) • Threshold automatisch

oder manuell einstellbar • Normalisierung gegen frei

wählbaren internen Standard • PCR-Protokolle in bis

zu 10 Untergruppen aufteilbar • Schmelzkurvenanalyse

automatisch nach ct-Wert möglich • Automatische

und manuelle Threshold-

und Hintergrundsubtraktion •

Exportfunktion der numerischen Daten in MS Excel und

der graphischen Daten als JPEG • Automatische druckfertige

Reporterstellung • Zugriffsbeschränkung zur

Datenbank für mehrere Benutzer einstellbar

T ransportkiste

Transportkiste, Batterieadapter, Flexibilität (Rando m extrem schnelles, integriertes Computersystem, Flash

Access)

memory card • 32-Channel Multikanal PMT (510-710

nm)(bei Option mit Real time) • für alle am Markt

erhältlichen Techniken und Farbstoffe • high speed

cycling: 35 Zyklen in 15 Minuten

Jahre Garantie/ 48 h europaweiter Kundendienst/ 2 Jahre Garantie/ 48 h europaweiter Kundendienst/ 1 Jahr/mit Verlängerungsoption/ full Service/

technische Mitarbeiter

5 technische Mitarbeiter

Applikations-Support/ 5 Servicetechniker

Flexibel programmierbare Aufheiz-

un

Abkühlgeschwindigkeit • Slide Griddle: Aufsatz für vier

Objektträger • Einfache Programmierung mit Extend-,

Increment- und Slope-Funktion • Programmspeicher

für ca. 320 Programme • stabiles Metallgehäuse

Jahre Garantie/Wartungsverträge möglich,

Validierung und Zertifizierung/vier Servicetechniker

R °C a mbient – 10 0°C

0 ,1 °C

1 5 ° C/se c

Spezial

nötig

ECP-Deepreach-Deckel

I real-time-Detektion integrier t


Deckelheizung

B. Mikro-

Sonstige

± 0 , 5 ° C bei 6 0 °C Z eit- und Temperaturuniformität : ± 1.0 s de r

programmierten Zeit •

± 0 . 5 ° C von 6 0 ° C bis 9 5 °C

M ax. 2, ° C/s

(PTC 100-96VHB Gold )

H eizrate:1 0 ° C /s von 5 0 ° C bis 9 5 ° C • Kühlrate: 2. 5 ° C/ s

v on 95 ° C bis 5 0 °C

J a, mit justierbarer Andruckplatte

Auch als portables System mit Batteriebetrieb fü r

Außeneinsatz erhältlich

Z eit- und Temperaturuniformität: ± 1.0 s de r

programmierten Zeit •

± 0 . 5 ° C von 6 0 ° C bis 9 5 °C

H eizrate:10 ° C /s von 5 0 ° C bis 9 5 ° C • Kühlrate: 2. 5 ° C/ s

v on 95 ° C bis 5 0 °C

Auch als portables System mit Batteriebetrieb für

Außeneinsatz erhältlich

PCR-Optimierungsprogramme/Software-

Upgrades/Geräteschnittstellen

2

5

nicht

1 8. Basispreis (Euro)


< 6.000, g je

nach Modell und Ausstattun g

3 5.000-75.00 0 g 1-4

Modul e

0

3 5.00 g 3.900,. –

2 g SYNCHRON (ohne real-time-Option )

8 9.000,– g INSYTE (mit real-time-Option )

40 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


.

.

.

.

.

.

.

,

;

,

,

;

;

T H E R M O C Y C L E R

4.

6.

7.

1 Firmendaten, Ansprechpartner

Ltf-Labortechnik

Obere Ebenhalde 19

D-88142 Wasserburg

Tel.: +49-(0)-8382-98520, Fax:

eMail: info@labortechnik.com

www.labortechnik.com

2 Produktname

1

+49-(0)-8382-9852-32

Apollo

ATC-40

r

3 Standfläche

)

Thermocycler oder

Kurzbeschreibung

PCR-System:

Eppendorf AG

D-22331 Hamburg

www.eppendorf.de

Ansprechpartner: Dr. Jens Klabunde

Tel.: +49-(0)-40-53801118,

eMail: klabunde.j@eppendorf.de

®

M astercycle p

(Marketing)

PEQLAB GmbH

Carl-Thiersch-Str. 2B,

www.peqlab.de

Ansprechpartner: Dr.

Tel: +49 (0)9131-610

info@peqlab.de

D-91052

Karin

70

20,

Kriener

Fax:

Erlangen

+49

(0)9131-610

70

99,

PEQLAB GmbH

Carl-Thiersch-Str. 2B,

www.peqlab.de

Ansprechpartner: Dr.

Tel: +49 (0)9131-610

info@peqlab.de

D-91052

Karin

70

20,

Kriener

Fax:

Erlangen

+49

(0)9131-610

® ® ®

e P rimus 25 advance d

P rimus 96 advance d / Primus 96 advance d Gradien t

2 3 x 24 x 22 cm (Breite x Tiefe x Höhe

2 6 cm x 41 cm x 30,5 cm (B x T x H )

2 2,5 x 28,0 x 24,5 cm (B x T x H )

31,5 x 31,5 x 29,5 cm (B x T x H )

H ochwertiger Gradientencycler (20 ° C Gradient) mit

Wechselblöcken (5 verschiedene Blöcke zur Auswahl) •

großer Farb-TFT-Touch-Screen (5,7 Zoll) • motorisierter

Heizdeckel mit einstellbarem Anpreßdruck • Datenport

für GLP-konformen Ergebnisreport

5 Anzahl der Blöcke/Austausch möglich

-

Kapazität

titerplatten,

der

C.

Temperaturgradient

S chritte in ° C

Blöcke: A. Tubes,

Objektträger, D.

über

Block

anlegbar

8 eingesetzte Heiz/Kühltechnik

r

Single-Block

well-Gradient

(96 x 0,2 ml

9 Temperaturbereich (von …bis ° C ) 4° 0

10.

Größtmögliche

Regeltemperaturabweichung

11.

H eizrate/Kühlrate [ ° C /s ]

3° s

12.

Deckel beheizbar, sonstig e

Eigenschaften

Gerät/austauschbar (96-well-Gradient/ 48

/ 384–well/ In Situ-Flat Block/ Combiblock

und/oder 48 x 0,5 ml)

1

Thermocyclerfamilie aus drei unterschiedlichen

Blockvarianten (96-well Aluminiumblock, 96-well

Silberblock, 384-well Aluminiumblock), die über ein

externes Control Panel (VGA-Farbdisplay) angesteuert

werden

Block pro Thermomodul, Varianten:

Aluminiumblock • 96-well-Silberblock

Aluminiumblock

Austausch möglich: „Advanced Block

Exchange

Concept"

T ubes/ Mikotiterplatten/ Objektträger (je nach Block) 96-well-Block (Alu oder Silber): 96 x 0,2 ml PCR-Gefäß e

oder 1 PCR-Platte 96 • 384-well-Alublock: 1 PCR-Platte

384

Linearer Temperaturgradient

0,5-Grad-Schritte

durch

spez

Blockdesign

/

Temperaturgradient über 12 Reihen (96-well Block) bzw.

2 4 Reihen (384-well Block): von 1 ° C bis 2 0 ° C (96-well -

b zw. 384-well-Aluminiumblöcke); von 1 ° C bis 2 4 ° C (96 -

well-Silberblock) • Temperaturbereich des Gradienten:

3 0 ° C bis 9 9 ° C • Eingabeschritte: 0, 1 °C

Kompakter

Probenzahlen

Thermocycler

für

kleine

bis

mittlere

Zuverlässige Thermocycler

Probendurchsatz

für

mittleren

bis

70

99,

hohen

1 Block; Austausch möglich

1 Block/Cycler; Austausch möglich; mehrere Blöck e

verfügbar

A. Universalblock für 25 x 0,2

ml-Tubes mit flachem Deckel

ml-Tubes

• B. Nein

oder

• C.

13 x

Nein

0,5

A. Universalblock für 96 x 0,2

ml-Tubes mit flachem Deckel

Platten mit oder ohne Rand;

• C. In situ-Block verfügbar

®

N ein

B ei Primus 96 advance d Gradient; maximale r

G radient von 39,8 ° C zwischen 35 und 10 5 ° C 0, 1 ° C -

Schritte möglich

Peltie

Peltier-Element

e

Peltie

r

Peltie r

C bis 10 °C T emperaturbereich: 4° C bis 9 9 °C 4 bis 10 5°C 4 bis 10 5°C

± 0 , 4 °C R egelgenauigkeit : ± 0 , 2 °C R egelgenauigkeit

± 0 1 ° C Blockuniformitä t ± 0 7 ° C (be i

C/

eizrate: 6

beheizbarer

Anpreßdruck

Deckel

1 3. Real-Time-Detektion: integriert/aufrüstbar

n

14.

15.

Probenvorbereitung:

möglich

integriert/extern/nicht

mit

einstellbarem,

motorisiertem

® ®

keine

Real-time-Detektio

M astercycle r e p gradient und Mastercycle r e p

gradient S: aufrüstbar für real-time PCR

®

P robenvorbereitung extern (CAS-1200 PCR-System) E xterne Probenvorbereitung durch epMotio n 5070 ode r

®

e pMotion 5075 Liquid Handling-Workstatio n

GLP-

Gradientenkonform

und Run-Reports über

exportierbar/Printerport

Schnittstelle

J a; Deckeltemperatur zwischen 70 und 120 °C

einstellbar; Deckelheizung abschaltbar; automatische

Höhenanpassung des Deckels; Deckelverriegelung

während des Laufes einstellbar; optional mit High-

Pressure Lid (HPL) oder Motor Lid erhältlich

PCR-Optimierungsprogramme/Software-

Upgrades/Geräteschnittstellen

1 6. Extras

e

17.

Garantie/Service/Anzahl

Deutschland

Servicetechniker

1 8. Basispreis (Euro)

-

Temperatur-Ramping

• Printer • Farbiges


TFT

BlockTemperatur-Kontrollsond

7 2 ° C )

2 ° C/

s

2 ° C/ s

E SP-Heizdeckel-Technologie, motorisierbar

J a; Deckeltemperatur zwischen 70 und 12 0 °C

einstellbar; Deckelheizung abschaltbar; automatische

Höhenanpassung des Deckels

PCR-Optimierung durch Gradienten-PCR,

Upgrades via Internet, Schnittstellen: 1 x

1 x RS 232, Control Panel, je 1 x CAN_in

/

2 Jahre Garantie/Austauschservice/5 Servicetechniker 2 Jahre Garantie/Technischer Service in Deutschlan d

(Tel.: 01803-355911)/k.A.

®

5 900. g inkl.

Bloc k

M astercycle r e p gradient (incl. Control Panel): 7.95 0 g •

®

M astercycler ep gradient S (incl. Control Panel): 8.95 0

®

g • Mastercycle r e p 384 (incl. Control Panel): 8.30 0 g

(deutsche Listenpreise)

Nein/Nein

Nein/Nein

extern

exter n

Nein/möglich/RS232

Druckeranschluß

3

für

PC-Anschluß,

GLP-Reports für lückenlose Aufzeichnung

Optional: Software zur Ansteuerung durch

Vernetzung von bis zu 30 Thermocyclern

Centronics

für

aller Läufe;

PC;

möglich

R egelgenauigkeit ± 0 1 ° C Blockuniformitä t ± 0 ,3 5 °C

( bei 72 ° C )

96-well-

• 384-well-

B. Mikro-

Sonstige

ml-Tubes oder 48 x 0,5

• B. 96 well-PCR-

384 well-Block verfügbar

H ° C (96-well-Silberblock) bzw. 4 ° C (96-well -

u nd 384-well-Aluminiumblock) • Kühlrate: 4,5 ° C (96 -

w ell-Silberblock) bzw. 3 ° C (96-well- und 384-well -

Aluminiumblock)

Nein/möglich/RS232 für

Druckeranschluß, PS/2

PC-Anschluß, Centronics

für externe Tastatur

für

24 Monate/ Service-Verträge

Verlängerung gegen Aufpreis

techniker in Deutschland

Garantie-

Service-

erhältlich;

möglich/3

Software-

Centronics,

CAN_out

®

L izensiert und autorisiert für PCR • Mastercycler e p

®

C ycleManager (Steuerungssoftware für Mastercycle ep -

Netzwerk, aus bis zu 30 Thermocylern und GLP-

konforme Dokumentation relevanter PCR-Daten) •

Impuls PCR-Technologie für die „geräteseitig

unterstützte“ Hot Star- PCR • Externes Control Panel

mit VGA-Farbdisplay und graphischer Benutzer-

oberfläche• "Mini Satelliten-System" (Ein Control Panel

steuert bis zu fünf verschiedene Thermomodule)

®

P rimus 96 advanced zu Gradientencycler nachrüst -

bar; Erstellen, Editieren und Kopieren von Pro-

grammen während eines Laufes möglich; GLP-

Reports für lückenlose Aufzeichnung aller Läufe;

Optional: externe Speicherkarte für bis zu 50 Programme;

Optional: Software zur Ansteuerung durch

PC; Vernetzung von bis zu 30 Thermocyclern möglich;

®

b ei Primus 96 advanced Gradient: einfache Über -

nahme der optimalen Annealing-Temperatur in ein

Standard-PCR-Programm

Garantie-

24 Monate/ Service-Verträge erhältlich;

Verlängerung gegen Aufpreis möglich/

Servicetechniker in Deutschland

2 .465,– g 4 .165,-

g b zw. 5.865, - g (mit Gradientenfunktion )

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 41


.

.

.

.

.

.

MARKTÜBERSICHT

1 Firmendaten, Ansprechpartner

Roche Diagnostics Gmb H

Mannheim

Tel.: +49-(0)621-759-8568

Stratagene

www.stratagene.com

Kontakt: Technischer Service

Tel.: 00800-74007400/0031

eMail: tech_europe@stratagene.com

Stratagene

www.stratagene.com

Kontakt: Technischer Service

Tel.: 00800-74007400/0031

eMail: tech_europe@stratagene.com

Techne AG

Obere Hauptstraße 67b

D-09235 Burkhardtsdorf

Ansprechpartner: Dr. Jens

Tel.: +49-(0)-3721-271888

Rösler

2 Produktname

m

LightCycler

PCR-Syste

0

MX400

X3000 P

M Personal-Cycler TC-31 2

3 Standfläche

C

2 8 x 50,5 cm plus P

7 6 x 46 x 51 cm, 50 K g

3 3 x 46 x 43 cm, 20 K g

(LxBxH): 33 x 17 x 19 c m

4.

Thermocycler oder

Kurzbeschreibung

PCR-System:

5 Anzahl der Blöcke/Austausch möglich

h

P robenkarussell, Austausch möglic

1 Block, 96x 0,2 ml tubes oder Mikrotiterplatte, nich t

auswechselbar

1 Block, 96x 0,2 ml tubes oder Mikrotiterplatte, nicht 1 Block, Austausch möglich

auswechselbar

3 2 Kapillaren

A: 20 x 0,5 ml tubes oder 25 x 0,2 ml tube s

7. Temperaturgradient über Block anlegbar

S chritte in ° C

nicht

zutreffend

kein

Gradien t

kein

Gradien t

nein

8 eingesetzte Heiz/Kühltechnik

t

Luf

Hybride

Peltie r

Hybride

Peltie r

Peltiertechnik

9 Temperaturbereich (von …bis ° C )

8

4 0 bis 9 °C 9

4 -9 °C 2 5-9 5° ,

C 4 ° C bis 9 9 °C

10.

Größtmögliche

Regeltemperaturabweichung

0 ,15 °C B lockuniformität : ± 0 ,2 5 °C B lockuniformität : ± 0 ,2 5 °C ± 0 , 5 °C

11.

H eizrate/Kühlrate [ ° C /s ]

0

b is 2 ° pro

Sekund e

M ax 1, 7° C/,

dynamisc h

D ynamisch, Max 2, 5° s

C/

3 , 0 ° C /2, 0 °C

12.

Deckel beheizbar, sonstig e

Eigenschaften

1 3. Real-Time-Detektion: integriert/aufrüstbar

e

integriert,

6 Kanäl

a

j ja

nein

14.

Probenvorbereitung:

möglich

integriert/extern/nicht

extern

nein

nein

exter n

U pdates/Software-Service enthalten.

Neue Softwareversionen werden kostenlos zu r

Verfügung gestellt

Neue Softwareversionen werden kostenlos zur kostenlose Software-Upgrades, RS-232-Schnittstellen

Verfügung gestellt

1 6. Extras

e

System für Real-time online-PCR

Real-time

PC R

R eal-time PC R

handlicher Personal-Cycler • integrierter beheizbare r

Deckel temperiert die Proben gleichmäßig • Steuerung

und Programmierung über alphanumerische

Tastatur • Paßwortschutz möglich

6. Kapazität der Blöcke: A. Tubes, B. Mikrotiterplatten,

C. Objektträger, D. Sonstige

nicht

erforderlich

ja

j a

ja, ein-

und ausschaltbar, stufenlos höhenverstellbar •

w ählbare Deckeltemperatur: 100 ° C bis 11 5 °C

15. PCR-Optimierungsprogramme/Software-

Upgrades/Geräteschnittstellen

Auswertesoftware für absolute und relativ

Quantifizierung, qualitative Detektion, Schmelzkurvenanalysen

– Genotypisierung und Tm calling

Verwendung aller verfügbaren Chemien und Farbstoffe,

innerhalb des Emissionsspektrums von 350-380 nm,

Multiplexing mit bis zu vier verschiedenen Proben •

Dynamischer Bereich: 9 Größenordnungen. Intuitive

Software zur Quantifizierung (komparativ, quantitativ),

Schmelzkurvenanalyse und Allel-Diskriminierung. •

Robuste Kommunication zwischen PC und Instrument.

Uniformes und schnelles Thermocycling

Verwendung

innerhalb des

Multiplexing

Dynamischer

aller verfügbaren Chemien und Farbstoffe

Emissionsspektrums von 350-700 nm,

mit bis zu 4 verschiedenen Proben. •

Bbereich: 7 Größenordnungen

17. Garantie/Service/Anzahl Servicetechniker

Deutschland

Garantie 1 Jahr, verlängerbar. System wartungsfrei/

Service zentral, auf Wunsch Austauschgerät während

Reparaturzeit

G arantie/Service 2 Jahre

G arantie/Service 2 Jahre/lieferbar ab Septembe r 2 Jahre auf das Gerät sowie 4 Jahre auf den Block be i

max. 80.000 Zyklen/kompletter Service in Deutschland

1 8. Basispreis (Euro)

e

auf

Anfrag

0

6 9.00 g 9.50 0

2 g Preis auf Anfrag e

42 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


.

.

.

.

.

.

:

:

.

T H E R M O C Y C L E R

1 Firmendaten, Ansprechpartner

Techne A G

Obere Hauptstraße 67b

D-09235 Burkhardtsdorf

Ansprechpartner: Dr. Jens

Tel.: +49-(0)-3721-271888

Thermo Electron GmbH

Bioscience Technologies Division

Im Steingrund 4-6

Rösler

D-63303 Dreieich

Ansprechpartner: Frau Miriam Wolf

Tel: +49-(0)-6103-408-1267

Fax: +49 (0) 6103-408-1212

eMail: miriam.wolf@thermo.com

Thermo Electron GmbH

Bioscience Technologies Division

Im Steingrund 4-6

D-63303 Dreieich

Ansprechpartner: Frau Miriam Wolf

Tel: +49-(0)-6103-408-1267

Fax: +49 (0) 6103-408-1212

eMail: miriam.wolf@thermo.com

2 Produktname

2

G radienten-Cycler TC-51

)

M ultiblocksystem (MBS

Px 2

3 Standfläche

m

24 x 25 x 39 cm (Breite, Höhe, Tiefe)

4.

Thermocycler oder

Kurzbeschreibung

PCR-System:

Gradienten-Cycler für hohen

Touchscreen • graphische

und des Gradienten • Blöcke

Lieferung mit Speicherkarte

Probendurchsatz • Steuerung über

Anzeige der Temperaturentwicklung

in Sekundenschnelle austauschbar

großen

im Block


Der Px2 ist ein flexibler Thermocycler für den manuellen Betrieb mit

großem übersichtlichen Display. Er besteht aus einer Bedieneinheit und

einem austauschbaren Block. Es sind fünf verschiedene Blöcke erhältlich.

Durch die aktive Temperaturkontrolle im Röhrchen können die

Inkubationen sekundengenau ausgeführt werden.

5 Anzahl der Blöcke/Austausch möglich

h

1 Block, Austausch möglic

Bis zu 30 Blöcke pro Steuereinheit (=PC), Blöcke sind einfach z u

installieren und auszutauschen.

Einblocksystem, Block austauschbar

6.

Kapazität

titerplatten,

der

C.

Blöcke: A. Tubes,

Objektträger, D.

A:

C:

96 x 0,2 ml tubes oder

In-situ-Objektträger •

60

D:

x

384

0,5 ml tubes • PB:

well-PCR-Platten

PCR-Platten

96well


Kapazität: abhängig vom Block-Typ:

HBMBS(G)05: 48 Röhrchen 0,5 ml oder 96

Platte 0,3 ml • HBMBS(G)02: 96 Röhrchen

HBMBS384: 384-Well-Platte

Röhrchen

0,2 oder



7. Temperaturgradient über Block anlegbar

S chritte in ° C

G radient bei TC-512 möglich, Schritte 1 °C 0 –1 5° C bei Gradientenblöcke n

0 –1 5° C bei Gradientenblöcke n

8 eingesetzte Heiz/Kühltechnik

k

P eltiertechni

P eltier-Element e

Peltier-Element e

9 Temperaturbereich (von …bis ° C ) 4 ° 9

C bis 9 °C 9

4 –9 °C 4 –9 9°C

10.

Größtmögliche

Regeltemperaturabweichung

± 0 , 4 °C ± 0 . 4 ° C innerhalb von 15 Sekunde n

± 0 4 ° C innerhalb von 15 Sekunde n

11.

H eizrate/Kühlrate [ ° C /s ]

0

H eiz-/Kühlrate: 3, ° C /1, 3 °C H eizrate: maximal 3° C /s • Kühlrate: maximal 2 ° C/

s

H eizrate: maximal 3° C /s • Kühlrate: maximal 2 ° C/ s

12.

Deckel beheizbar, sonstig e

Eigenschaften

höhenverstellbar


wählbare

b eheizbarer Deckel

beheizbarer Deckel, Deckeldruck einstellba r

1 3. Real-Time-Detektion: integriert/aufrüstbar n

n ei

n ein

nein

14. Probenvorbereitung: integriert/extern/nicht

möglich

e xtern

Komplette Automation inklusive Probenaufarbeitung lieferbar •

extern

Integrierbar in vorhandene Probenvorbereitungssystemenein

( L x B x H): 42 x 22 x 26 c

Standardblöcke 20 x 29 x 30 cm (Breite, Höhe, Tiefe) nebeneinande r

stapelbar • Roboterblöcke 34 x 24 x 54 cm (Breite, Höhe, Tiefe) nebenund

übereinander stapelbar

Herzstück des Multiblocksystems ist ein spezielles Computerprogramm

zur unabhängigen Ansteuerung von bis zu 30 unterschiedlichen Thermo-

blöcken. Einmal gestartet arbeitet der jeweilige Block unabhängig vom

Computer sein Programm ab, der Status aller Blöcke und die aktuelle

Temperaturkurve einzelner Blöcke können online beobachtet werden. Für

jeden Lauf wird ein komplettes Temperaturprofil als log-file abge-

speichert. Für den hohen Probendurchsatz sind roboterkompatible,

stapelbare Blöcke erhältlich

B. Mikro-

Sonstige

0,3 ml oder 96-Well-

96-Well-Platte 0,2 ml

96-Well-

0,2 ml

Kapazität: abhängig vom Block-Typ:

HBPXB(G)05: 48 Röhrchen 0,5 ml oder 96 Röhrchen 0,3 ml oder

Platte 0,3 ml • HBPXB(G)02: 96 Röhrchen 0,2 oder 96-Well-Platte

HBMBS384 384-Well-Platte • HBPXBFB vier Objektträger

ja, ein-

und ausschaltbar, stufenlos

D eckeltemperatur: 100 ° C bis 11 5 °C

15. PCR-Optimierungsprogramme/Software-

Upgrades/Geräteschnittstellen

k ostenlose Software-Upgrades, RS-232-Schnittstellen

R S485-Schnittstelle für Computersteuerung • Software-updates erhältlic h RS 232-Schnittstelle für Software-updat e

1 6. Extras

t

Spezielle aktive Temperaturkontrolle im Röhrchen

Sekundenprotokolle • Online-Kontrolle über bis zu

Blöcke per Computer

ermöglich

30 verschiedene

Spezielle aktive Temperaturkontrolle im Röhrchen ermöglicht

Sekundenprotokolle

17. Garantie/Service/Anzahl Servicetechniker

Deutschland

Zwei Jahre auf das Gerät sowie vier Jahre auf den Block bei max. 80.000

Zyklen/kompletter Service in Deutschland

1 Jahr Garantie/3 Personen für Thermocycler zuständig

1 Jahr Garantie/3 Personen im Service für Thermocycler zuständig

1 8. Basispreis (Euro)

e

P reis auf Anfrag

E inblock-Startup (Computer, Software, 1 Standard-Block) 8.49 0 g •

W eitere Standard-Blöcke 5.450 g • Roboterkompatible Blöcke 8.72 0 g

k ompletter Thermocycler mit Bedieneinheit und Block 5.810 g •

A ustauschblock 1.620 g

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 43


S T E L L E N M A R K T

Akademischer Stellenmarkt

Veröffentlichen Sie Ihre Stellenanzeigen zielgruppengerecht in unserem akademischen Stellenmarkt, der allen öffentlich-rechtlichen Instituten für ihre Stellenausschreibungen

kostenlos zur Verfügung steht. Bitte senden Sie dazu ihre Anzeige (1/4 Seite 90 mm breit x 122,5 mm hoch, Logo – jpg oder tiff, 300 dpi

Auflösung) an schnell@biocom.de. Annahmeschluß für die nächste LABORWELT-Ausgabe 4/04 (Erscheinungstermin 18.08.2004) ist der 6. August.

zu besetzen.

In der Abteilung Klinische Pharmakologie, Fachbereich

Medizin, RUHR-UNIVERSITÄT BOCHUM ist ab

sofort eine

Postdoc-Stelle

(Dotierung bis C2) auf dem Gebiet der

kardiovaskulären Grundlagenforschung

Es handelt sich um eine universitätsinterne Stelle mit Limitationen gemäß

HRG. Gesucht wird ein/e Post-Doktorand/in mit nachgewiesener eigener

Projekterfahrung und Publikationsleistung, idealerweise mit Erfahrungen

im Umgang mit Thrombozyten, Endothel- oder glatten Gefäßmuskelzellen.

Bisheriger Schwerpunkt der Arbeitsgruppe ist die Signaltransduktion

glatter Gefäßmuskelzellen bei Proliferations- und Differenzierungsprozessen.

Der Postdoc sollte neben der Durchführung eigener Projekte

an der Anleitung junger Wissenschaftler (Diplomanden und Doktoranden)

Interesse zeigen und diese in seine Projekte integrieren. Neben ausreichendem

Laborplatz stehen technische Assistenz und Verbrauchsmittel

zur Verfügung.

Ihre Bewerbungsunterlagen richten Sie bitte an:

Prof. Dr. Peter Reusch

Abteilung Klinische Pharmakologie

Universitätsstraße 150

D-44801 Bochum

Tel.: 0234 32-24884

e-mail: peter.reusch@rub.de

The Schools of Veterinary Medicine and

Medicine of the Justus Liebig University

Giessen, Germany, invite applicants for

their joint

Ph.D. program.

The Ph.D. program consists of a three-year graduate curriculum combined

with an experimental project. Seminars and courses are conducted

in English; however, German courses are offered to our international students.

A Master’s Degree or equivalent is required for entry into the program.

Applicants may choose between four main tracks: Molecular

Veterinary Medicine, Vascular Biology, Cell-Cell Interaction in Reproduction,

and Molecular Biology and Medicine of the Lung. The names

of prospective supervisors as well as materials required for the application

are listed on

http://www.med.uni-giessen.de/phd2004

Applicants must contact supervisors before submitting their application.

Your application (postmarked by July 15, 2004) should be sent to the

following address:

Office of the President, Justus Liebig University Giessen, Attn.:

Ph.D. Program, PO Box 11 14 40, D-35390 Giessen, Germany

UNIVERSITÄTSKLINIKUM WÜRZBURG

BAYERISCHE JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITÄT

The Clinical Research Program Attention

Deficit/Hyperactivity Syndrome

(ADHD) is a joint initiative of the Departments

of Child/Adolescence and

Adult Psychiatry. The competence

center which is funded by the German

Research Foundation (DFG) investigates

the relationship between molecular and functional mechanisms

in the pathogenesis and therapy of ADHD with focus on the

long-term course of the disorder with interdisciplinary strategies.

Applications are invited for a

Junior Group Leader

in the area of “Genomic Imaging”

with focus on functional imaging and clinical electrophysiological

techniques (fMRT, SPECT, PET, NIRS). Integration of neuropsychological,

neurophysiological, and imaging as well as molecular genetic

strategies is the ultimate goal. The position is immediately

available for an initial period of 3 years, with an option of continuation

on a tenure track. Funding includes the group leader position

(salary BAT Ia, approx. C 70.000/year), and on the basis of a research

plan, 1 post-doc or 2 graduate students, one technician,

consumables and equipment.

Also immediately available are several

Postdoctoral Positions

Applicants must have completed a Ph.D. and should have two years

of postdoctoral experience with one of the following approaches:

Human molecular genetics (linkage/haplotype mapping) or advanced

molecular neurobiology techniques relevant to mouse genetics and

behavior (gene targeting & transgenics). The successful candidate

will join a multidisciplinary environment with rich collaborative opportunities

in basic and clinical research (www.uni-wuerzburg/

nervenklinik/psychobiologie). Salary according to BAT IIa (approx.

C 58.000/year).

Please send cv & bibliography, a description of research experience,

and the names of three references to: K.P. Lesch, M.D., Department

of Psychiatry and Psychotherapy, Füchsleinstr. 15, 97080

Würzburg, Germany, E-mail: kplesch@mail.uni-wuerzburg.de

44 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


S T E L L E N M A R K T

GRADUIERTENKOLLEG MOLEKULARE VETERINÄRMEDIZIN

Im Graduiertenkolleg Molekulare Veterinärmedizin am Fachbereich Veterinärmedizin

der Justus-Liebig-Universität Gießen sind zum 01.10.2004 folgende

Stellen zu besetzen:

1. Nach den Vergaberichtlinien der Deutschen Forschungsgemeinschaft

10 Graduiertenstipendien (Promotion)

Das Kolleg bietet Promotionsarbeiten mit zell- und molekularbiologischer

Fragestellung an, die für zunächst 2 Jahre mit der Möglichkeit der Verlängerung

um 1 weiteres Jahr vergeben werden. Wir empfehlen Ihnen, sich projektbezogen

zu bewerben. Nähere Informationen über die 15 angebotenen

Promotionsthemen sowie das Ausbildungsprogramm können unter http://

www.vetmed.uni-giessen.de/grad-kolleg abgefragt werden. Sie müssen ein

abgeschlossenes Studium der Veterinärmedizin, Biologie, Humanmedizin,

Ernährungswissenschaft, Agrarwissenschaft oder sonstiger Naturwissenschaften

mit qualifiziertem Abschluß vorweisen.

2. Für 2 Jahre

1 Wiss. MitarbeiterIn BAT IIa

für ein/e promovierte/n Wissenschaftler/in mit Expertisen auf dem Gebiet der

Herstellung transgener Tiere (k.o. Mäuse Cre-loxP-Methode, u. ä.). Weitere

Informationen auf der Homepage siehe oben.

Die Aufnahme in das Kolleg erfolgt nach persönlicher Vorstellung voraussichtlich

in der 30.-31. Woche 2004.

Bitte richten Sie Ihre schriftliche Bewerbung mit den entsprechenden Zeugnissen

und Studienunterlagen bis zum 01.07.2004 an:

Herrn Prof. Dr. E. Petzinger, Fachbereich Veterinärmedizin,

Graduiertenkolleg Molekulare Veterinärmedizin, Frankfurter Straße 94,

35392 Gießen (Fax 0641/99-38409).

Center for Life Science Automation

University of Rostock

As an international center of expertise, CELISCA offers an ideal environment for effective

interdisciplinary research and development projects. Under CELISCA's roof, engineers and

natural scientists will closely cooperate on finding innovative solutions for current and future

problems and tasks. CELISCA concentrates, promotes, and combines results and insights from

various disciplines (Automation & Engineering, Chemistry & Biotechnology, Screening &

Analytics, Real Time Information Technologies and Automation Assessment) in order to increase

knowledge and to develop better procedures and products for the life sciences more quickly than

ever.

For the development of a junior research group with focus on catalysis and drug development

and testing we are offering the position

Research Group Leader “Life Science Automation - Technologies”

Research topics of the group will include flexible automation of Life Science Processes, HTS-

Microreaction Technology, Liquid-/Solid Delivery Systems, HTS-Analysis methods, Laboratory

Information- and Management Systems, Modelling / Simulation for automated processes in

Drug Development as well as distributed systems and sensor networks.

You have …

• an outstanding PhD (Chemistry, Electrical

Engineering, Information Technology,

Physics)

• research experience in one or more of the

described topics

• experience in project oriented and funded

Research

• scientific occupation abroad / experience

in international cooperation

We offer …

• excellent research facilities in direct

neighborhood of one of Germany’s most

beautiful seaside resorts

• strong existing research experience in the

described topics

• funding for five years upon BAT regulations

• complete laboratory set-up, consumables

and additional scientific and technical

personnel

We also expect experience in leading research groups, flexibility and the ability to work under

pressure, independend work, team spirit and social competence as well as interdisciplinarity.

For further information please contact: Kerstin.Thurow@celisca.de • www.celisca.de

Applications should be addressed to: CELISCA • Prof. Dr.-Ing. habil. Kerstin Thurow

Friedrich-Barnewitz-Str. 4 • 18119 Rostock

Germany

Institut für Molekulare Biotechnologie e.V.

MITGLIED DER

WISSENSCHAFTSGEMEINSCHAFT

GOTTFRIED WILHELM LEIBNIZ E.V.

Jena / Thüringen

PhD student position

for the subject

“Cell type specific action of the Glucocorticoid Receptor”

Applications are invited for the position of a Ph.D. Student (BAT-O IIa/

2) to join a dynamic and independent research group (Molecular Biology

of Tissue-specific Hormone Action, group leader Jan Tuckermann)

at the Institute of Molecular Biotechnology in Jena.

Our research group is interested in the impact of the Glucocorticoid

receptor and interacting transcription factors such as AP-1, NFκB

and STAT5 in the immune system (Cell 93:531-541, J Cell Biol.

147:1365-1370, EMBO J 20:7168-73), bone metabolism (osteoporosis)

and the self-renewal/differentiation of haematopoietic stem cells.

The successful candidate will be expected to work with cell type

specific mouse mutants generated by the cre-loxP system employed

in animal models for inflammatory diseases, osteoporosis and haematopoietic

differentiation. These studies will be complemented by

the analysis of primary cells and embryonic stem cells derived from

those mice to explore the tissue specific regulation of cellular processes

by glucocorticoids. Glucocorticoid-regulated target genes identified

by micro-array analysis will be functionally evaluated by over

expression- and knock down-studies in primary cells by gene transfer

with lentiviral vectors.

Applicants for the Ph.D. student position should be highly motivated

with genuine interest in both basic biological questions and in disease-oriented

research projects. Previous experience in molecular,

biochemical and cell biological methods would be favourable.

The position is available initially for two years with possible extension.

The research group of Jan Tuckermann is a part of the new research

focus “Ageing and age related Diseases” of the Institute of

Molecular Biotechnology (IMB, Director Prof. Dr. Peter Herrlich) in

Jena, which contains a number of highly interacting groups, and

thereby creates a fruitful research environment.

If interested please send a short application including CV, statement

of research experience and interests, and names of two referees to

j.tuckermannn@imb-jena.de,Tel: +49-3641-65-6134, Fax: +49-

3641-656335. Full applications including certificates and two letters

of recommendation should be sent to:

Dr. Jan Tuckermann

Institute of Molecular Biotechnology

Beutenbergstr. 11

D-07745 Jena

Deadline for applications is July 2, 2004. Interviews will be conducted

in early July. Starting date is August 1, 2004, or later. IMB is an

equal opportunity employer.

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 45


S T E L L E N M A R K T

Center for Life Science Automation

University of Rostock

As an international center of expertise, CELISCA offers an ideal environment for effective

interdisciplinary research and development projects. Under CELISCA's roof, engineers and

natural scientists will closely cooperate on finding innovative solutions for current and future

problems and tasks. CELISCA concentrates, promotes, and combines results and insights from

various disciplines (Automation & Engineering, Chemistry & Biotechnology, Screening &

Analytics, Real Time Information Technologies and Automation Assessment) in order to increase

knowledge and to develop better procedures and products for the life sciences more quickly than

ever.

For the development of a junior research group with focus on catalysis and drug development

and testing we are offering the position

Research Group Leader “Life Science Automation - Applications”

Research topics of the group will include Drug Development, Leads, Biocatalysis /

Chemocatalysis, Assay-Development, High-Content Screening as well as Human-Machine

Interfaces and Automation Assessment.

You have …

We offer …

• an outstanding PhD (Chemistry, Biology,

Electrical Engineering, Information

Technology, Physics)

• research experience in one or more of the

described topics

• experience in project oriented and funded

Research

• scientific occupation abroad / experience

in international cooperation

• excellent research facilities in direct

neighborhood of one of Germany’s most

beautiful seaside resorts

• strong existing research experience in the

described topics

• funding for five years upon BAT regulations

• complete laboratory set-up, consumables

and additional scientific and technical

personnel

We also expect experience in leading research groups, flexibility and the ability to work under

pressure, independend work, team spirit and social competence as well as interdisciplinarity.

For further information please contact:

Kerstin.Thurow@celisca.de • www.celisca.de

Applications should be addressed to: CELISCA • Prof. Dr.-Ing. habil. Kerstin Thurow

Friedrich-Barnewitz-Str. 4 • 18119 Rostock

Germany

Im Institut für Zytobiologie und Zytopathologie,

Zentrum für Hygiene und Med. Mikrobiologie

des Fachbereichs Medizin der

Philipps-Universität Marburg, ist eine

Doktorand(inn)enstelle BAT IIa/2

ab sofort für die Dauer von zunächst 2 Jahren zu besetzen (Drittmittelprojekt

finanziert durch die DFG).

Das Aufgabengebiet umfaßt wissenschaftliche Dienstleistungen zur Organisation,

Vorbereitung und Durchführung von Forschungsaufgaben,

insbesondere die Durchführung von Experimenten zur Biogenese von

Zymogengranula und zur Charakterisierung Granula-spezifischer Membranproteine

in den Azinuszellen des exokrinen Pankreas unter Verwendung

zellbiologischer und biochemischer Methoden.

Einstellungsvoraussetzung ist ein abgeschlossenes Hochschulstudium

mit geeignetem Schwerpunkt (Humanbiologie, Biologie, Biochemie/Chemie).

Gewünscht sind Erfahrungen im Bereich Zellbiologie, Biochemie

und Molekularbiologie.

In vielen Bereichen der Universität sind Frauen unterrepräsentiert. Deshalb

sind Bewerbungen von Frauen besonders willkommen und werden in

Arbeitsbereichen, in denen Frauen unterrepräsentiert sind, bei entsprechender

Qualifikation im Rahmen der rechtlichen Möglichkeiten mit Vorrang

berücksichtigt. Bei gleicher Eignung werden bei der Auswahl

Schwerbehinderte bevorzugt.

Bewerbungen mit den üblichen Unterlagen sind zu richten an:

Dr. M. Schrader, Institut für Zytobiologie und Zytopathologie,

Robert-Koch Str. 6, 35037 Marburg,

eMail: schrader@mailer.uni-marburg.de

Am Institut für Biochemie der

Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig ist eine

Doktorand(inn)enstelle Bat-O IIa/2

Biochemie/Biologie

zum nächstmöglichen Zeitpunkt für die Dauer von 2 Jahren zu besetzen

(Drittmittelprojekt finanziert durch die Wilhelm Sander-Stiftung).

Thema: 6-Phosphofructo-2-kinase/Fructose-2,6-bisphosphatase –

Regulatorprotein im Glucosestoffwechsel gliogener Hirntumoren

Im Projekt wird am Modell gliogener Hirntumoren untersucht, ob die hohe aerobe

Tumorglycolyse auf eine Überexpression der ubiquitären 6-Phosphofructo-2-

kinase/Fructose-2,6-bisphosphatase (PFK2/FBPase2), ein Enzym mit protoonkogenen

Eigenschaften, zurückzuführen ist. Es sollen das Vorkommen gliomspezifischer

Isoformen der PFK2/FBPase2 auf Proteinebene und deren posttranslationale

Modifikationen mit MALDI-TOF Massenspektrometrie analysiert

werden. Die „Tandem Affinity Purification“ (TAP) –Methode soll etabliert werden,

um Interaktionspartner der PFK2/FBPase2 in Gliomzellen zu identifizieren. Die

Ergebnisse sollen Möglichkeiten aufzeigen, den gestörten Zellstoffwechsel in

Gliomen auf der Ebene der PFK2/FBPase2-Expression sowie vor- und nachgeschalteter

Signal- und Stoffwechselwege gezielt therapeutisch zu beeinflussen.

Angewandte Methoden:

Molekularbiologie (PCR, Klonierung)

Zellkulturen

Proteinreinigung (Immunopräzipitation, Affinitätschromatografie)

2D-Elektrophorese

MALDI-TOF-Massenspektrometrie (Peptidmassen-Fingerprinting)

Kontakt: Prof. Dr. Klaus Eschrich, eMail: eschrich@uni-leipzig.de

Bitte senden Sie (nach E-Mail-Kontakt) Ihre Bewerbungsunterlagen an:

Prof. Dr. Klaus Eschrich, Institut für Biochemie,

Medizinische Fakultät Universität Leipzig, Liebigstr. 16, 04103 Leipzig

A PhD student position or a MD/PhD

opening within a Graduate Program on Antigenspecific

Immunotherapy is available by August 1 in the

Department of Hematology & Oncology at the

Johannes Gutenberg-University to study a variety of

aspects in T Cell Receptor Gene Therapy (Nature

Immunol 2001, 2: 962-970), such as signaling, T cell

memory pool formation, gene modified mice models,

and preclinical development. Due to grant regulations,

only members of EU countries are eligible.

Please send your application including cover letter, cv,

publication list, and names of up to three referees

(including email address & phone number) to:

Matthias Theobald, M.D.

José Carreras Leukemia Foundation Professor

Department of Hematology & Oncology

Johannes Gutenberg-University

Langenbeckstr. 1 • 55101 Mainz / Germany

Phone (49) 6131 - 175 047 • Fax (49) 6131 - 393 3364

theobald@3-med.klinik.uni-mainz.de

46 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


S T E L L E N M A R K T

TECHNISCHE

UNIVERSITÄT

MÜNCHEN

Am Lehrstuhl für Botanik der TU München ist

ab dem 01.12.04 im Rahmen der Projekte Wachstumsregulation

und Signaltransduktion von Abscisinsäure in Arabidopsis,

Funktionsanalyse von regulatorischen Proteinen

eine Doktorandenstelle - Vergütung nach BAT -

zu besetzen.

Voraussetzungen:

Studium der Biologie, Biochemie oder Molekularen Biotechnologie;

Erfahrungen in molekularbiologischen Techniken erforderlich.

Bewerbungsschluss: 31.08.04

Ihre Bewerbung richten Sie bitte an:

Prof. Dr. E. Grill

Lehrstuhl für Botanik - TUM

Biologikum - Weihenstephan

Am Hochanger 4, 85354 Freising

Fachbereich Biowissenschaften, Lehrstuhl für Biophysik

Im Rahmen des BfS-Forschungsprojektes „Untersuchungen

zu Wirkmechanismen an Zellen unter Exposition mit hochfrequenten

elektromagnetischen Feldern der Mobilfunktechnologie.

A Demodulation/Kommunikation“ suchen wir ab sofort

einen/eine Doktorand/Doktorandin

Ihr Aufgabenbereich umfaßt die wissenschaftliche Mitarbeit im o.g. Projekt.

Dazu zählen Abschätzungen zur subzellulären Feldabsorption, die Modellierung

der elektrischen Zellstruktur sowie Messungen an Einzelzellen.

Einstellungsvoraussetzung ist ein Hochschulabschluß in einem naturwissenschaftlichen

Fach, möglichst mit Erfahrungen auf dem Gebiet der Biophysik.

Idealerweise verfügen Sie über Erfahrungen mit der Technik der Messung und

Theorie elektrischer Zell- und Gewebeeigenschaften sowie Kenntnisse in der

aktuellen Literatur zur Wechselwirkung elektromagnetischer Felder mit biologischen

Materialien. Hohe Eigenständigkeit bei der Zusammenarbeit mit den Projektmitarbeitern

wird erwartet.

Die Stelle ist bis zum 30.06.2006 befristet. Die Vergütung erfolgt nach BAT (0,5

BAT-O IIa).

Die Universität Rostock strebt eine Erhöhung des Anteils von Frauen am wissenschaftlichen

Personal an und fordert qualifizierte Frauen nachdrücklich auf, sich

zu bewerben. Schwerbehinderte werden bei der Stellenbesetzung im Rahmen

der geltenden gesetzlichen Bestimmungen bevorzugt behandelt. Bewerbungsund

Fahrtkosten können vom Land Mecklenburg-Vorpommern nicht übernommen

werden.

Anfragen und Bewerbungen richten Sie bitte an:

Prof. Dr. J. Gimsa, Fachbereich Biowissenschaften, Lehrstuhl für Biophysik

Universität Rostock, D-18051 Rostock, Tel.: (0381)494 2037

PAUL-EHRLICH-INSTITUT

Das Paul-Ehrlich-Institut ist eine wissenschaftliche Einrichtung des Bundes,

die als Bundesoberbehörde für die Zulassung und Chargenprüfung

immunbiologischer Arzneimittel zuständig ist und auf den damit verbundenen

Gebieten der Lebenswissenschaften (z.B. Virologie, Bakteriologie,

Allergologie, Immunologie, Hämatologie, Medizinische Biotechnologie)

Forschung betreibt.

Im Fachgebiet – Virusimpfstoffe – der Abteilung Virologie ist zum nächstmöglichen

Zeitpunkt die Position einer/eines

Wissenschaftlichen Angestellten

(Virologin/Virologen/)

Stellenbewertung:

BAT IIa / Ib zu besetzen.

Aufgabenprofil:

Durchführung und Überwachung aller Laborvorgänge zur

staatlichen Chargenprüfung von Lebendvirus-Impfstoffen

Organisation der prüfungsbegleitenden Forschung

Wissenschaftliche Betreuung und Anleitung des Laborpersonals

Mitarbeit bei der Bewertung von nationalen und europäischen

Zulassungsanträgen und dem damit assoziierten administrativen

Umfeld

Kooperation mit anderen europäischen Zulassungs- und

Prüfbehörden

Mitarbeit bei der Durchführung von Ringversuchen und Studien zum

Nachweis der Laborkompetenz

Mitarbeit bei der Etablierung eines hausinternen Qualitätskontrollund

Sicherungssystems

Anforderungsprofil:

Abgeschlossenes naturwissenschaftliches Hochschulstudium

Promotion mit Schwerpunkt Virologie

Umfangreiche Erfahrungen im biologischen Sicherheitslaborbereich,

insbesondere im Umgang mit Gewebekulturzellen und Lebendviren

Umfangreiche Erfahrungen im tierexperimentellen Bereich, insbesondere

zur Sicherheits- und Wirksamkeitsbestimmung von Impfstoffen

Kenntnisse zu den Herstellungsprozessen von Lebendvirusimpfstoffen

Erfahrung in der Anleitung von Laborpersonal

Fließendes Englisch in Wort und Schrift

Sicherer Umgang mit Statistikprogrammen und Standard

Computer-Software

Team- und Integrationsfähigkeit

Das Beschäftigungsverhältnis ist zunächst auf 3 Jahre befristet;

die wöchentliche Arbeitszeit beträgt 38,5 Std./Wo.

Die Eingruppierung erfolgt gemäß den tariflichen Bestimmungen des

Bundesangestelltentarifvertrages (BAT).

Auswärtigen Bewerbern ist das Amt bei der Wohnraumbeschaffung behilflich.

Trennungsgeld und Umzugskosten werden nach den gesetzlichen

Vorschriften gewährt. Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung

bevorzugt berücksichtigt.

Bewerbungen mit Lebenslauf, Lichtbild und kurzer Darstellung des beruflichen

Werdegangs sowie Zeugnisabschriften richten Sie bitte bis zum

02.07.2004 an das Personalreferat des Paul-Ehrlich-Instituts.

Paul-Ehrlich-Institut | Paul-Ehrlich-Straße 51 - 59 | 63225 Langen

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 47


S T E L L E N M A R K T

TECHNISCHE

UNIVERSITÄT

MÜNCHEN

Am Lehrstuhl für Botanik der TU München ist

ab dem 01.12.04 im Rahmen des Projektes Xenobiotika-Stoffwechsel

bei Pflanzen

eine Doktorandenstelle - Vergütung nach BAT -

zu besetzen.

In diesem Projekt soll die Detoxifizierung von Fremdsubstanzen

mit molekularbiologischen Methoden an der Modellpflanze

Arabidopsis analysiert werden.

Voraussetzungen:

Studium der Biologie, Biochemie oder Molekularen Biotechnologie;

Erfahrungen in biochemischer Analytik und in molekularbiologischen

Techniken erwünscht.

Bewerbungsschluß: 31.08.04

Ihre Bewerbung richten Sie bitte an:

Prof. Dr. E. Grill

Lehrstuhl für Botanik - TUM

Biologikum - Weihenstephan

Am Hochanger 4, 85354 Freising

In der Abteilung Molekulare und Experimentelle

Chirurgie der Chirurgischen Klinik

ist eine Postdoc-Stelle zu besetzen.

POSTDOC IN MOLEKULARER ZELLBIOLOGIE

MENSCHLICHER ERKRANKUNGEN

Erforscht werden molekulare Mechanismen der Angiogenese und Endothelzellaktivierung

bei Entzündungserkrankungen und Virusinfektionen. Ein Schwerpunkt

liegt auf Untersuchungen zur Funktion des Guanylat-Bindungsproteins-1

(GBP-1) und auf der Entwicklung von Methoden zum Einsatz von GBP-1 für die

anti-angiogene Tumortherapie. Weitere Informationen unter: Guenzi et al., EMBO

J. (2001, 2003); Lubeseder-Martellato et al., Am. J. Pathol. (2002); Naschberger

et al., Biochem. J. (2004); http://www.gsf.de/imv/vascul/staff.html.

Der/die erfolgreiche Bewerber/in wird eine von drei Untergruppen mit jeweils 1-

2 Doktoranden und einem technischen Mitarbeiter in sehr gut und modern ausgestatteten

Laborräumen leiten.

Kandidaten sollten über mehrjährige Postdoc-Erfahrung in Molekularbiologie,

Virologie, Zellbiologie, Immunologie oder Biochemie verfügen. Sie sollten hohe

Kompetenz in molekularbiologischen und zellbiologischen Techniken und sehr

gute analytische und kommunikative Fähigkeiten besitzen.

Die Bezahlung erfolgt nach BATIIa/C1. Die Position steht für 5 Jahre zur Verfügung.

Nach zwei Jahren erfolgt eine Zwischenevaluation. Die Position ist ab 1.

Juli 2004 verfügbar.

Bitte richten sie ihre Bewerbung mit Curriculum Vitae, Zusammenfassung ihrer

Forschungstätigkeit, drei Sonderdrucken sowie Namen und Anschriften von zwei

Referenzen an:

Prof. Dr. Michael Stürzl, Abteilung Molekulare und Experimentelle Chirurgie

Chirurgische Klinik mit Poliklinik der Friedrich-Alexander-Universität

Schwabachanlage 10 91054 Erlangen

eMail: michael.stuerzl@chir.imed.uni-erlangen.de

Technische Universität Berlin

Juniorprofessor/in

Besoldungsgruppe W 1 für das Fachgebiet „Methoden der Lebensmittelbiotechnologie“, Fakultät III: Prozeßwissenschaften der Technischen Universität Berlin, Institut

für Lebensmitteltechnologie und Lebensmittelchemie

Besetzbar ab 01.11.2004

Aufgabengebiet: Wahrnehmung der Lehre und Forschung auf dem Gebiet der Lebensmittelbiotechnologie. Schwerpunktthemen können sein: Moderne Methoden

der Lebensmittelbiotechnologie pflanzlicher Zell- und Gewebekulturen unter dem Aspekt gesundheitsbezogener Lebensmittel sowie Stressmechanismen von Zellen.

Durchführung von Lehrveranstaltungen, auch in englischer Sprache, auf dem Gebiet der Lebensmittelbiotechnologie, insbesondere für die Studierenden der Lebensmitteltechnologie,

Lebensmittelchemie und Biotechnologie.

Anforderungen: Erwünscht ist Erfahrung in Lehre, Forschung und Entwicklung. Tiefergehende Kenntnisse über moderne Aspekte und zukünftige Entwicklungen

auf dem Gebiet der Lebensmittelbiotechnologie sind notwendig.

Der/Die Stelleninhaber/in soll Aufgaben in Wissenschaft, Forschung und Lehre in dem Fach selbständig wahrnehmen. Die Arbeitsbedingungen sollen, soweit allgemeine

dienst- und haushaltsrechtliche Regelungen nicht entgegenstehen, den Rechten und Pflichten der Professoren/innen entsprechen. Das Berufungs- und Einstellungsverfahren

ist an die Bestimmungen des Berliner Hochschulgesetzes über die Berufung von Professoren/innen angelehnt.

Einstellungsvoraussetzungen sind – neben den allgemeinen dienstrechtlichen Voraussetzungen – ein abgeschlossenes Hochschulstudium der Fachrichtung, pädagogische

Eignung für die akademische Lehre sowie die besondere Befähigung zu vertiefter selbständiger wissenschaftlicher Arbeit, die in der Regel durch eine

herausragende und zügig abgeschlossene Promotion nachgewiesen wird. Sofern vor oder nach der Promotion eine Beschäftigung als wissenschaftliche/r Mitarbeiter/in

erfolgt ist, sollen Promotions- und Beschäftigungsphase zusammen nicht mehr als 6 Jahre betragen haben (Mutterschutz-, Erziehungs- bzw. Elternzeiten

werden auf diese Frist nicht angerechnet).

Die TU Berlin ist sehr daran interessiert, qualifizierte Frauen für den Einstieg in die Hochschullehrerinnenlaufbahn zu gewinnen. Wir möchten daher Wissenschaftlerinnen

ausdrücklich zu einer Bewerbung ermutigen. Bei gleicher Qualifikation werden Frauen bevorzugt eingestellt (dies gilt für Bereiche, jeweils bezogen auf Besoldungs-,

Vergütungs- oder Lohngruppen, in denen mehr Männer als Frauen beschäftigt sind). Schwerbehinderte werden bei Eignung bevorzugt.

Technische Universität Berlin

TU Berlin, Service-Center der Fakultät III, Sekr. MA 5-11, Straße des 17. Juni 136, D-10623 Berlin

Berufungskommission o.E. der FK III zur Besetzung der Junior-Professur „Methoden der Lebensmittelbiotechnologie“

Tel.: +49/(0)30/314-24102 2, Fax: +49/(0)30/314-25965, eMail: melanie.geiler@tu-berlin.de

48 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


S T E L L E N M A R K T

eines/-r

Im Institut für Anatomie und

Zellbiologie der Medizinischen

Fakultät der Martin-Luther-

Univerität Halle ist die Stelle

wissenschaftlichen Mitarbeiters/-in

zu besetzen.

Bewerber sollten über sehr gute Kenntnisse in allen Teilgebieten

der Anatomie, theoretische Kenntnisse in zell- und

molekularbiologischen Untersuchungstechniken und über

Kenntnisse des Energiestoffwechsels bei Säugetier-Embryonen

verfügen.

Eine Beteiligung bei der Durchführung von Lehrveranstaltungen

ist erwünscht.

Voraussetzung ist ein abgeschlossenes Studium der Medizin

oder gute medizinische Kenntnisse nach einem Hochschulabschluß

in einem naturwissenschaftlichen Studium.

Kontaktadresse:

Institut für Anatomie und Zellbiologie

Große Steinstraße 52

D - 06097 Halle / Saale

eMail: bernd.fischer@medizin.uni-halle.de

Postdoctoral research position

Opening for a postdoctoral research associate at the

Martin-Luther-University Halle-Wittenberg, Germany

A position for a postdoctoral research associate will

become available in the group of molecular genetics of

sex determination. The research project will be in the area of molecular mechanism of sexual

regulation and transcription differences of instinctive behavior.

Topic: Genetics, molecular and cellular characterization of the CSD Protein activation and its

interaction with a downstream target gene. CSD is the initial signal of sexual regulation in a

number of insects. Sexual differentiation in these organisms is governed by allelic composition

of the csd gene and not by the presence of sex specific chromosomes. We have isolated

the novel gene by positional cloning in the honey bee. The aim of the research project is to

elucidate the molecular mechanisms by which CSD allelic combinations activate a downstream

target gene. The project include the development of reporter gene and splicing assays

and co-immunoprecipitation techniques. These approaches will give new insight of how sex is

regulated in these organisms and how this relates to other sex-determining mechanisms e.g.

in Drosophila. This research project is part of our major goal to understand principles of molecular

decision making, the processes of molecular adaptation and the differentiation of regulative

hierarchies.

In another project candidate genes for honey bee behavior are identified by microarray analyses.

The identified genes will be a basis to further elucidate the molecular nature of instinctive

driven behavior. The development of diagnostic transcription profiles will enhance specific

selection programs of honey bees.

Molecular biology and genetics in honey bees is a new and fast evolving field with the opportunity

to establish various research fields. The upcoming completed honey bee genome sequence

will be a splendid tool to address various fundamental biological questions.

Candidates should have excellent research and distinctive molecular technique experience

preferably in protein binding, splicing reaction assays and microarray techniques (data analysis

and management).

Starting: as soon as possible, for 2 years at first , Salary: Post-doc (Postdoktorandenstelle BAT IIa)

An application should include a cover letter explaining the particular interest in the field, CV,

copies of academic certificate, selected reprints and addresses from two references to:

beye@zoologie.uni-halle.de

Dr. Martin Beye, Martin-Luther-Universitaet Halle-Wittenberg,

Inst Zoologie, Raum 2.21, Biozentrum, Weinbergweg 22, 06120 Halle, GERMANY

phone ++49 345 55 21627 or 21631, fax ++49 345 55 27230

http://www.biozentrum.uni-halle.de/Bienengenetik/index.htm

Kontakt zu Verbänden

Neu: Im Jahr 2004 erscheint LABORWELT zweimonatlich. Alle Abonnenten des Branchen-Magazins |transkript sowie die Mitglieder der nachfolgenden

Gesellschaften erhalten LABORWELT regelmäßig mit freundlicher Empfehlung ihrer Organisationen. Wer sich darüber hinaus für einen Beitritt

interessiert, erreicht die Gesellschaften unter folgenden Kontaktdaten:

DECHEMA

Fachsektion Biotechnologie

Theodor-Heuss-Allee 25

D-60486 Frankfurt/Main

Tel.: +49-(0)-69-7564-289

Fax: +49-(0)-69-7564-272

www.dechema.de

Deutsche Gesell. für Proteomforschung

c/o MPI für Biochemie

Am Klopferspitz 18a

D-82152 Martinsried

Tel.: +49-(0)-89-8578-3964

Fax: +49-(0)-89-8578-2802

c.kleinhammer@dgpf.org

www.dgpf.org

Österreichische Gesell. für Biotechnologie

c/o Boehringer Ingelheim

Austria GmbH

Dr. Boehringer-Gasse 5-11

A-1121 Wien

Tel.: +43-(0)-1-80105-2311

Fax: +43-(0)-1-80105-9311

www.boku.ac.at/oegbt/

Verband Deutscher Biologen

Corneliusstr. 6

D-80469 München

Tel.: +49-(0)-89-26024573

Fax: +49-(0)-89-26024574

info@vdbiol.de

www.vdbiol.de

Deutsche Gesellschaft für Genetik

c/o Genetisches Institut der

Universität Gießen

Heinrich-Buff-Ring 58-62

D-35392 Gießen

Tel.: +49-(0)-641-99-35463

Fax: +49-(0)-641-99-35469

www.gfgenetik.de

Gesellschaft für Signaltransduktion

c/o Prof. Dr. Ralf Hass

Med. Hochschule Hannover

AG Biochemie u. Tumorbiol.

D-30625 Hannover

Tel.: +49-(0)-511-906-3649

Fax: +49-(0)-511-906-3433

www.sigtrans.de

Nationales Genomforschungsnetz

c/o DLR – Koblenzerstr. 112

53177 Bonn-Bad Godesberg

Tel.: +49-(0)-228-3821-331

Fax: +49-(0)-228-3821-332

pm-ngfn@dlr.de

www.ngfn.de

Deutsche Gesellschaft für Neurogenetik

c/o Institut für Humangenetik

Uni Gießen/Schlangenzahl 14

35392 Gießen

Tel.: +49-(0)-641-99-41600

Fax: +49-(0)-641-99-41609

www.med.uni-giessen.de

/genetik/dgng.html

Netzwerk Nutrigenomforschung

Arthur-Scheunert-Allee 114

14558 Bergholz-Rehbrücke

Tel.: +49-(0)-33200 88 385

Fax: + 49-(0)-33200 88 398

verein@nutrigenomik.de

www.nutrigenomik.de

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 49


P R O D U K T W E L T

Kennziffer 24 LW 03 · Informationen ordern · www.biocom.de

Standardisierte cRNA-Target-Präparationen


Kennziffer 25 LW 03 · www.biocom.de


Analyse von Genfunktionen

Mit Einführung des BioRobot Gene Expression

Systems mit dem “GeneChip Target Preparation

Specialist Pack” bringt QIAGEN

eine vollständig automatisierte Lösung für

Standard-Präparationen von cRNA-Targets

für Affymetrix ® GeneChip ® Arrays auf den

Markt. Dieses System automatisiert die Präparationsschritte

von der Erststrang-cDNA-

Synthese bis zur cRNA-Fagmentierung.

Bis zu 96 Proben – in Vielfachen von 8 –

können pro Durchlauf parallel verarbeitet

werden. Ausgehend von 5 µg Gesamt-RNA

als Matrize pro Probe, synthetisiert das Bio-

Robot-System daraus zunächst die cDNA, anschließend

die cRNA, welche dann fragmentiert

wird. Das System ermöglicht cRNA-

Ausbeuten von mehr als 20 µg bei Konzentrationen

von mindestens 0,625 µg/µl. Die

cRNA-Ausbeuten sind rein, mit A260/A280-

Ratios größer als 1,8.

Das System besteht aus einer Robotik-Arbeitsstation,

die über einen Roboterarm externe

Hardware integriert, die für die GeneChip

Target-Präparation benötigt werden. Das Gesamtsystem

wird über einen Computer mit

dem QIAsoft 4.2-Betriebssystem und der

CLARA -Software zur Ablaufplanung gesteuert.

Geprüfte Software-Protokolle, die mit

dem „Specialist Pack“ ausgeliefert werden, ermöglichen

einfachste Systembedienung und

reproduzierbare Probenverarbeitung.

TILLING (targeting induced local lesions in

genomes) ist eine moderne Methode zur genomweiten

Identifizierung von Punktmutationen.

Die wichtigsten Vorteile dieser Technik

liegen darin, daß sie universell einsetzbar

ist, sie ohne zeitaufwendige transgene

Schritte auskommt, Gene nicht nur komplett

sondern auch teilweise ausgeschaltet werden,

und daß diese genetischen Veränderungen

vererbbar sind. Eine schnelle und kostengünstige

Variante zur Identifizierung von natürlichen

Polymorphismen stellt das „Ecotilling“

dar.

Das Instrument der Wahl für TILLING &

Ecotilling ist das DNA Analysis-System von

LI-COR ® Biosciences. Die besondere Eignung

stellt das System am Modellorganismus Arabidopsis

unter Beweis: Pro Tag können bis zu

2.000 Proben und bis zu 2 Millionen Basen

zuverlässig gescreent werden.

Kennziffer 26 LW 03 · www.biocom.de

Nanoliter-Immunoassays


Kennziffer 27 LW 03 · www.biocom.de

SNP-Detektions-Service


Kennziffer 28 LW 03 · www.biocom.de


Biomagnetische Separationen

Mit Hilfe einer neuen Technologie der Firma

Gyros AB können unterschiedliche Laborapplikationen

verkleinert, beschleunigt und integriert

werden. In Gyrolab -Mikrolaboratorien,

in der Form einer Compact-Disk, erfolgt

die Analyse Hunderter von Proben parallel

und unter Kontrolle eines Vollautomaten, der

Gyrolab -Workstation.

Kapillar- und Zentrifugalkräfte bewegen Proben

und Agenzien durch spezielle Mikrostrukturen,

beispielsweise zum Aufbau von

Sandwich-Immunoassays an funktionalisierten

Beads. Die Produktivität eines Labors läßt

sich im Vergleich zum Einsatz konventionellen

Assays deutlich erhöhen. Lediglich Nanoliter-Mengen

an Reagenzien und Probenmaterial

sind notwendig, um Datenpunkte zu

generieren. Das flexible Assaydesign ermöglicht,

Proteine nach Wunsch zu quantifizieren

und eigene, für die jeweilige Anwendung

optimierte Reagenzien einzusetzen. Besondere

Vorteile bietet die miniaturisierte und automatisierte

Analyse, wenn Seren kleiner Versuchstiere

wie von Mäusen untersucht werden

sollen.

Das Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung

weitet seine Dienstleistungen

rund um die GeneChip ® -Technologie von

Affymetrix weiter aus. Als Affymetrix-Service-Provider

bietet das RZPD die Analyse

des Human Mapping 10K-Arrays an.

Diese neuartige Array-Technologie zur

SNP-Detektion ermöglicht das parallele Screening

von mehr als 11.500 SNPs auf einem einzigen

Human Mapping 10K Array. Genomweite

Analysen können innerhalb einer Woche

durchgeführt werden. Lediglich geringe

Mengen Ausgangsmaterial werden benötigt.

Im Vergleich zu Mikrosatelliten-Analysen liefert

das Verfahren wesentlich mehr genetische

Informationen. Die SNP-Array-Technologie

kann für Kopplungsanalysen, Assoziationsoder

sogenannte „Loss-of-Heterozygosity

(LOH)“-Studien eingesetzt werden.

Die kürzlich auf der Analytica vorgestellte

Biomagnetic Workstation MCB-LH ist eine

Weiterentwicklung des bereits erfolgreich in

den Markt eingeführten MCB 1200. Sie erlaubt

eine kostengünstige und einfach zu

handhabende Automatisierung von Magnetic-Beads-Applikationen

für bis zu 12 Proben,

wie bei der DNA-Extraktion aus Blut oder Gewebe.

Die Pipettierschritte wie Zugabe und

Absaugen der Pufferlösungen erfolgen mit

Hilfe eines automatischen Waschkamms. Das

System richtet sich an Anwender, die kleine

bis mittlere Probenaufkommen zu bewältigen

haben und nach einer effizienten Automatisierungslösung

suchen.

Kennziffer 29 LW 03 · www.biocom.de

Neues „Proteomics RIMS“

Brukers Bioinformatik-Lösung “Proteomics

RIMS“ kombiniert und integriert Daten, Informationen

und Ergebnisse, die in der Proteomik

mit verschiedenen MS- und Röntgen-

Kristallographie-Verfahren gewonnen wurden.

Proteomics RIMS ermöglicht neue Erkenntnisse

zu proteomischer Interaktion und

zu Strukturdaten, die von Oberflächenplasmonenresonanz-MS

(in Zusammenarbeit mit

Biacore) und Kernspinresonanzspektroskopie

(NMR, in Zusammenarbeit mit Bruker

BioSpin) geliefert werden. Es kombiniert ProteinScape

und LIMS-Applikationen.


50 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


P R O D U K T W E L T

Kennziffer 30 LW 03 · Informationen ordern · www.biocom.de

Neues Biomek ® NX-System für mittleren Durchsatz


Kennziffer 31 LW 03 · www.biocom.de

Neues Magtration ® 8Lx


Mit der Biomek NX stellt Beckman Coulter

eine Laborautomations-Workstation der

nächsten Generation vor. Sie hat eine kompaktere

Stellfläche als die komplexere Biomek

FX und ist mit einer Acht-Sonden-Vorrichtung

sowie einem Mehrkanalpipettierer für

Volumina bis 500 µl ausgestattet. Für maximale

Flexibilität beim Platzieren und Entfernen

von Laborinstrumenten kann das Span-

8-Gehäuse mit einem optionalen um 360°

drehbaren Greifer ausgerüstet werden. Die

Mehrkanal-Konfiguration wird mit 96er- und

384er- Pipettierköpfen angeboten.

Biomek NX arbeitet mit denselben Automated

Labwere Positioners (ALP) wie das

Biomek FX-System. Ein optionales Barcode-

Lesegerät ermöglicht das Ablesen der Platten

direkt während des Arbeitsvorgangs in

einem Schritt mit der Plattenbewegung.

Eine neue Koagulationserkennungsfunktion

reagiert auf Fibrinkoagel und sorgt gegebenenfalls

für eine Wiederholung des Dispensiervorgangs,

während eine neue Membranperforationsfunktion

die Probenahme aus

geschlossenen Röhrchen ermöglicht, wie

beim sogenannten „Closed-Tube-Sampling“.

Das System kann sowohl fest angebrachte als

auch Einwegspritzen verwenden. Biomek NX

arbeitet mit derselben Steuerungssoftware

wie Biomek FX und das ebenfalls neue Modell

Biomek 3000.

Kennziffer 32 LW 03 · Informationen ordern · www.biocom.de


96-Well Polypropylen-Mikroplatten für die Real-Time PCR

Precision System Science hat das Magtration ®

System 8Lx präsentiert, ein neues 8-Kanal

Laborgerät zur vollautomatisierten High-

Yield genomischen DNA-Extraktion aus Vollblutproben,

das Probenvolumen bis zu 10 ml

und ein Handlingsvolumen von bis zu 50 ml

beherrscht. Es verwendet die Magnetic-Beads-

Technologie, welche mittlerweile den de facto

Standard für hocheffiziente genomische DNA-

Aufreinigung darstellt. Der typische DNA-Ertrag

aus 7 ml Vollblut beträgt bis zu 150µg.

Das Magtration ® System 8Lx ist eine echtes

„Walk-Away" Gerät unter der Verwendung

von vorbefüllten Reagenzien-Kits und einem

integrierten PC mit Touch-Screen-Display zur

einfachen Bedienung.

Aufgrund Barcode-gesteuerten Prozeßkontrolle

und Automatisierung können menschliche

Fehlbedienungen weitgehend ausgeschlossen

werden. Weiterhin sind Cross-Kontaminationen

durch diese Prozesstechnologie

auf ein Minimum reduziert. Am Ende eines

Prozessablaufs von etwa 50 Minuten Dauer

steht eine konzentrierte, aufgereinigte DNA

zur Verfügung, die direkt weiterverendet

werden kann.

Greiner Bio-One hat sein Angebot um optimierte

Microplatten für Real-Time-PCR-Geräte

ergänzt. Die neuen 96-Well PCR-Microplatten

mit seitlichem Halbrand und seitlichen

Aussparungen sind aus dünnwandigem,

mattiertem Polypropylen gefertigt und ermöglichen

eine optimale Temperaturübertragung

zwischen Thermoblock und Reaktionsgemisch.

Durch die mattierte Oberfläche eignen

sie sich besonders für Real-Time-Messungen,

da die Überstrahlung von Fluoreszenzsignalen

minimiert wird. Verschlossen werden

können die Microplatten mit speziellen

Real-Time-Deckelketten aus hochtransparentem

Polypropylen, Standard-Deckelketten,

oder Abdeckfolien, wie zum Beispiel VIEWseal

für die Real-Time PCR oder POWERseal

und SILVERseal. Die neuen Real-

Time-PCR-Microplatten sind, frei von DNasen,

RNasen, humaner DNA und Pyrogenen.

Kennziffer 33 LW 03 · Informationen ordern · www.biocom.de

Hochempfindliche Tumorzellselektion und Analyse


Kennziffer 34 LW 03 · www.biocom.de

Universeller Roboterarm


Das AdnaTest Cancer-System detektiert disseminierte

Darm- und Brustkrebstumorzellen

in peripherem Blut mittels immunomagnetischer

Zellselektion und Nachweis der tumorzellspezifischer

Genexpression. Es kombiniert

eine effiziente Selektion/Anreicherung von

Tumorzellen mittels Antikörper-beschichteter

Magnetpartikel (AdnaTest CancerSelect) mit

anschließender molekularer Diagnose dieser

Zellen über eine Multiplex-RT-PCR (AdnaTest

CancerDetect).

Die einfach zu handhabenden AdnaTest

Cancer-Testsysteme ermöglichen eine hochempfindliche

und schnelle Detektion disseminierter

Tumorzellen im Blut. Die verwendeten

Antikörper- und Primermixe sind speziell

auf die jeweilige Tumore (Darm- und

Brustkrebs) abgestimmt. Durch die Kombination

verschiedener Selektions- und Tumormarker

werden sowohl der Heterogenität der

Tumorzellen als auch den möglichen individuellen

oder therapiebedingten Schwankungen

im Expressionsmuster Rechnung getragen.

Die Nachweisempfindlichkeit der AdnaTest

Cancer-Kits liegt bei 2 disseminierten

Tumorzellen pro 5 ml peripheres Blut. Das

AdnaTest Cancer ist den meisten Methoden

zum Nachweis von Krebs hinsichtlich der

Sensitivität deutlich überlegen. Somit ist eine

sehr viel frühere Detektion und Behandlung

von Krebs sowie ein besseres Monitoring der

Krebstherapie möglich.

Der Butler LB 930 von Berthold Technologies

ist ein universeller Roboterarm zur Handhabung

von Mikroplatten. Seine Einsatzbereiche

reichen vom Beladen von Bertholds Mikroplatten-Leser

bis hin zur Verwendung als zentrale

Einheit einer Workstation für Anwendungen

im Wirkstoffscreening, der Reformatierung

von Mikroplatten, DNA-Isolierung und

PCR-Aufbereitung, Target-Identifizierung,

zellulären Assays sowie forensischen Diagnostik.

Für Bertholds Mikroplatten-Leser stehen

vorbereitete Methoden zur Verfügung. Weitere

Einheiten wie Dispenser, Wascher und Inkubatoren

können eingebunden werden. Das

System steht vorkonfiguriert für 20, 100 sowie

platzsparend für 100 Platten zur Verfügung.

LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 51


P R O D U K T W E L T

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SCHOTT Nexterion Slide E für kovalente Sonden-Anbindung

Kennziffer 36 LW 03 · www.biocom.de

Neuer Quant-iT -Assay


SCHOTT Nexterion hat in Zusammenarbeit

mit dem Microarray-Slide-Hersteller Duryea

seine Anwendungserfahrung ausgebaut und

stellt seine Kenntnisse Mikroarray-Anwendern

zur Verfügung. Für Einsteiger steht außerdem

ein Starter-Kit mit optimierten Reagenzien

zum Spotten und Hybridisieren zur

Verfügung.

Die aktive Schicht aus reaktiven Epoxygruppen

bindet alle nukleophilen Gruppen

der Sonden ohne UV-Crosslinking oder Reduktion

sofort und irreversibel kovalent.

Eine Amino-Modifizierung der Oligonucleotide

ist nur beim Spotten kurzer Oligos (≤25

Basen) erforderlich. Nexterion Slide E ermöglicht

auch das Spotten von kleinen Spots und

somit hochdichter Microarrays mit gleichmäßiger

und reproduzierbarer Spot-Morphologie.

Die Beschichtung ist stabil und bleibt

auch bei langen Spotting-Prozessen reaktiv.

Für das Spotten von PCR-Produkten bietet

SCHOTT Nexterion Slides mit Aminosilan-

und Aldehyd-Oberflächen an. Besonders

flexibel ist die Anwendung der Aminosilan-Slides

Nexterion Slide A und Nexterion

Slide A+. Auf diese Oberflächen können

unter Verwendung des gleichen Protokolls

PCR-Moleküle und auch längere Oligos (≥ 50

Basen) gespottet werden. Da beide Slide-Typen

mit gängigen PCR-Protokollen funktionieren,

können Anwender anderer Aminosilan-Slides

problemlos auf Slides von Schott

Nexterion umsteigen, ohne den Assay-Prozeß

aufwendig neu optimieren zu müssen.

Alle beschichteten Slides von SCHOTT Nexterion

sind aus einem speziellen Borosilikatglas

gefertigt. Die geringe Eigenfluoreszenz

des Glassubstrats in Verbindung mit der homogenen

Beschichtung der verschiedenen

Slidetypen ermöglicht eine ausgezeichnete

Analyseempfindlichkeit und gleichmäßige,

optimale Spots in Microarray-Experimenten.

Die neuen Quant-iT -Assays von Molecular

Probes sind Quantifizierungssysteme für

DNA-, RNA- und Proteine. Die Fluoreszenz-

Kits sind jüngster Bestandteil der Invitrogen-

Produktpalette. Die Assays sind vielfach

empfindlicher als derzeitige UV-Absorbanzmethoden

und benötigen lediglich 1 bis 20

Mikroliter Probenflüssigkeit. Das Quant-iT

RNA-Assay-Kit ist der erste homogene Assay,

der RNA in Gegenwart von DNA quantifizieren

kann.

Quant-iT ist in drei Kits erhältlich: Für

kleine DNA-Mengen eignet sich das DNA-

Assay-Kit, High Sensitivity – etwa zur Quantifizierung

von PCR-Produkten, viraler DNA

oder zu klonierender DNA-Fragmente. Konzentrierte

Proben wie genomische DNA oder

Mini-Preps können mit dem DNA-Assay-Kit,

Broad Range ohne vorherige Verdünnung

verarbeitet werden. Für RNA steht das RNA-

Assay-Kit zur Verfügung – beispielsweise

zum Messen von Proben für Microarray-, RT-

PCR- und Northern-Blot-Analysen. Der

Quant-iT Protein-Assay-Kit ist ein einfach

durchzuführender Protein-Assay auf Fluoreszenzbasis.

Häufig auftretende Verunreinigungen

haben keinen Einfluß auf das Signal.

Kennziffer 37 LW 03 · www.biocom.de

Erweitertes Produktportfolio


Kennziffer 38 LW 03 · www.biocom.de

Epidermis-Modell EST-1000


Kennziffer 39 LW 03 · www.biocom.de

ADME-Rationalisierung


Mit dem neuen Finnigan ProteomeX LTQ

ist erstmals eine integrierte Proteomics-Workstation

kommerziell erhältlich. In dem System

kommt ein neuer Hochleistungs-Proteomics-Autosampler,

der Thermo Micro ASTM,

zum Einsatz. Eine Vielzahl von Säulen- und

Methoden-Kombinationen ermöglicht die

Anpassung an spezielle Applikationen wie

Protein-Mapping im Hochdurchsatz, maximaler

Sequenzabdeckung, Mapping von

Phosphorylierungsstellen und der Multidimensional

Protein Identification Technology

(MudPIT).

Eine spezielle, für Proteomics-Methoden

entwickelte Software ermöglicht die komplette

Integration aller Komponenten und erlaubt

die Durchführung von intuitiven, automatisierten

Programmläufen. Die neue vMAL-

DI -Ionenquelle ist ein voll integriertes intermediate-vacuum-MALDI-System

für die Finnigan

LTQ Linear Ion Trap. Die schnelle Data

Dependent MS/MS-Analyse von verdauten

Proteinen und Proteinmischungen kann in

einem einzigen Experiment durchgeführt

werden. Erstmals ermöglicht der vor kurzem

eingeführte Finnigan LTQ FT Hybrid FT-ICR-

Massenspektrometer die Routine FT-MS im

chromatographischen Zeitmaßstab.

Ein Epidermis-Modell von CellSystems ® vereinfacht

Hautverträglichkeitsuntersuchungen

neuer Produkte. Der zelluläre Aufbau

des EST-1000 entspricht dem der natürlichen

Haut. Toxische und reizende Wirkungen

können anhand von Multiparameteranalysen

bestimmt werden. Es wird in laborüblichen

12-Well-Zellkulturschalen angeboten,

die eine einfache Applizierung der Substanzen

auf die rekonstituierte Haut erlauben.

Schon mit AST-2000 (epidermalen Schichten

auf einem korrespondierenden Dermis-

Äquivalent) hat CellSystems ® das erste kommerziell

erhältliche Vollhautmodell eingeführt.

Mit diesen Systemen bietet CellSystems ®

Lösungen sowohl für die toxikologische Routineanalyse

als auch für die Untersuchung der

komplexen Vorgänge bei der Hautirritation.

Ein beliebter Service bei ADME-Evaluierungsverfahren

ist der Cloe-Screen. Für dieses

Hochdurchsatz Verfahren zum Wirkstoffscreening

bietet Millipore die MultiScreen

Caco-2 Assay-Platten an, um einen große Anzahl

von Wirkstoffkandidaten schnell hinsichtlich

der Permeabilität des Darmkanals

zu untersuchen. Hierbei ist Schnelligkeit entscheidend,

um den steigenden Anforderungen

immer aggressiverer Testzyklen zu entsprechen.

Die Platte ist geeignet für steriles

Arbeiten und automatisierte Messungen der

permeabilität.

Im Vergleich zu Verfahren mit 24-Well-Platten

bietet Millipores 96-Well-System Schnelligkeit,

Effizienz und konstante Ergebnisse.

Das MultiScreen Caco-2 Assay-System wurde

optimiert, um monomoleklulare Caco-2

Zellschichten von großer Integrität wachsen

zu lassen und mit Nährstoffen zu versorgen.

Es enthält die notwendigen Wachstumsplatten,

Kulturplatte und die Platte für den Transport

und die Analyse. Es ermöglicht das

Wachstum bis hin zur Analyse in ein- und

derselben Platte. Der Aufbau der innovativen

MultiScreen Caco-Platte ist für optimale Leistung

auf verschiedenen Automationssystemen

konzipiert.

52 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT


LABORWELT

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Institution: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Anschrift: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Tel./Fax: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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S E R V I C E

Impressum

LABORWELT (ISSN 1611-0854)

erscheint zweimonatlich im Verlag der

BIOCOM AG

Stralsunder Str. 58-59

D- 13355 Berlin

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eMail: laborwelt@biocom.de

Internet: www.biocom.de

Redaktion:

Dipl.-Biol. Thomas Gabrielczyk

Tel.: 030/264921-50

Anzeigenleitung:

Oliver Schnell

Tel. 030/264921-45, eMail: schnell@biocom.de

Leserservice:

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Bildtechnik und Layout:

Heiko Fritz

Graphik-Design:

Michaela Reblin

Druck

Mayer & Söhne, D- 86551 Aichach

Mitglieder der DECHEMA-Fachsektion

Biotechnologie, der Österreichischen

Gesellschaft für Biotechnologie ÖGBT, der

Gesellschaft für Genetik GfG, der Deutschen

Gesellschaft für Proteomforschung DGPF, des

Verbandes Deutscher Biologen vdbiol, der

Deutschen Gesellschaft für Neurogenetik

DGNG, der Gesellschaft für Signaltransduktion

STS, des Vereins zur Förderung der Nutrigenomforschung,

der Biotechnologischen

Studenteninitiative e.V. (btS) sowie die

Wissenschaftler des Nationalen

Genomforschungsnetzes NGFN erhalten die

Zeitschrift im Rahmen ihrer Mitgliedschaft.

Für einen regelmäßigen Bezug von

LABORWELT ist eine kostenlose Registrierung

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53) erforderlich.

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AG darf kein Teil in irgendeiner Form reproduziert

oder mit elektronischen Systemen verarbeitet,

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28.06.04: Biotechnologie im Brennpunkt:

Hochschulausbildung – am Bedarf vorbei,

Frankfurt am Main

Info: Ilona Schmidt, DECHEMA e.V. Frankfurt a. M.

(Tel.: +49-69-7564 254, Fax: +49-69-7564 304,

eMail: schmidt@dechema.de,

Web: www.i-s-b.net/brennpunkt)

29.06.04: 4. Fachtagung der Themenreihe

Pharma Diagnostics „Biobanking“, Regensburg

Info: Dr. Jens Reiter, Byern Innovativ GmbH

(Tel.: +49-911-20671 334, eMail: reiter@bayern-innovativ.de,

Web: www.forum-medtech-pharma.de/biobanking.htm)

01.-02.07.04: Technology Seminar „Novel

Technologies to Obtain and to Optimise the

Functionality of Proteins vom Milk, Whey and

Egg“, Weihenstephan

Info: Birgit Weber, TU München (Tel.: +49-8616-714 205,

Fax: +49-8616-714 348, eMail: Birgit.Weber@wzw.tum.de,

Web: www.food-process-engineering.de)

01.07.04: 2. Niedersächsischer Life-Science-Tag,

Hannover

Info: Annette van Ost, BioRegioN GmbH, Hannover

(Tel.: +49-511-9357 940, Fax: +49-511-9357 963,

eMail: annette.vanost@bioregion.de, Web: www.bioregion.de)

02.-03.07.04: „Blaue Biotechnologie – unsere

Zukunft liegt im Meer“, Enkenbach

Info: Dr. Katrin Platzer, Ev. Akademie der Pfalz, Speyer

(Tel.: +49-6232-6020 0, Fax: +49-6232-6020 22,

eMail: eapfalz@t-online.de, Web: www.eapfalz.de)

05.-06.07.04: Downstream-Processing,

Weihenstephan

Info: Bayern Innovativ GmbH (Tel.: +49-911-20671-350,

Fax: +49-911-20671-744,

eMail: baytech@bayern-innovativ.de,

Web: www.baytech.de)

06.07.04: Pharmazeutisches Kolloquium –

Targets und Arzneistoffe der Zukunft, Greifswald

Info: Dr. Hans-Hartwig Otto, Institut für Pharmazie, Greifswald

(Tel.: +49-3834-864 875, eMail: ottohh@uni-greifswald.de,

Web: www.idw-online.de)

06.-07.07.04: Micro- and Nano-Technologies in

the Life Sciences, Zürich

Info: Hicham Abghay, Steinbeis-Europa-Zentrum Stuttgart

(Tel.: +49-711-123 4022, Fax: +49-711-123 4011,

eMail: abghay@steinbeis-europa.de,

Web: www.steinbeis-europa.de)

06.-09.07.04: 4 th Internationales Meeting –

Substrate-Integrated Micro Electrode Arrays

2004, Reutlingen

Info: NMI - Natural and Medical Sciences Institute at the

University Tübingen (Tel.: +49-7121-515 30 0,

Fax: +49-7121-515 3016 , eMail: meameeting@nmi.de,

Web: www.nmi.de/meameeting2004/index.php)

07.-09.07.04: 6 th International Conference on

Catalysis in Membrane Reactors 2004, Lahnstein

Info: Claudia Hermsdörfer, DECHEMA e.V., Frankfurt a. M.

(Tel.: +49-69-7564 295, Fax: +49-69-7564 304,

eMail: iccmr6@dechema.de, Web: www.dechema.de)

08.-09.07.04: 6 th Fresenius Agro-Konferenz

„Behaviour of Pesticides in Air, Soils and Water –

Fate, Exposure and Regulatory Issues“, Köln

Info: Monika Stratmann, Akademie Fresenius GmbH

(Tel.: +49-231-7589 648, Fax: +49-231-7589 653,

eMail: mstratmann@akademie-fresenius.de,

Web: www.akademie-fresenius.de)

11.-14.07.04: 15 th International Conference on

Arabidopsis Research, Berlin

Info: Isabell Witt, University of Potsdam

c/o Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

(Tel.: +49-331-5678 308, Fax: +49-331-5678 983 08,

eMail: witt@mpimp-golm.mpg.de,

Web: www.arabidopsis2004.de)

22.-26.08.04: CHISA 2004 – 16 th International

Congress of Chemical und Process

Engineering, Prag

Info: Dr. Jan Novosad, Organizing Committee

Tel.: +420 221 082 366, eMail: org@chisa.cz,

Web: www.chisa.cz/2004)

27.08.-01.09.04: Biocat 2004 – International

Congress on Biocatalysis, Hamburg

Info: Gerlinde Loebkens, TUHH-Technologie GmbH, Hamburg

(Tel.: +49-40-7661 8012, Fax: +49-40-7661 8018,

eMail: loebkens@tutech.de,

Web: www.tutech.de/veranstaltungen)

31.08.-03.09.04: Applications of Biocalorimetry

(ABC IV), Budapest, Hungary

Info: MicroCal, Central Milton Keynes

(Tel.: +44-1908-309 490, Fax: +44-1908-309 499,

eMail: info@microcal.eu.com,

Web: www.microcalorimetry.com)

05.-09.09.04: EURADH 2004 – 7 th European

Adhesion Conference, Freiburg i. Br.

Info: Andrea Köhl, DECHEMA e.V., Frankfurt a. M.

(Tel.: +49-69-7564 235, Fax: +49-69-7564 441,

eMail: euradh2004@dechema.de,

Web: www.euradh.org)

06.-08.09.04: 5 th caesarium – Advances in

Biomedicine, Bonn

Info: Center of advanced european studies and research, Bonn

(Tel.: +49-228-9656-102, Fax: +49-228-9656-111,

eMail: caesarium@lemmens.de,

Web: www.caesar.de/caesarium.0.html)

08.-11.09.04: ESBES-5 – 5 th European

Symposium on Biochemical Engineering Science,

Stuttgart

Info: Beate Witteler-Neul, Kompetenznetz Verfahrenstechnik

Pro3 e.V. (Tel.: +49-711-6586 297, Fax: +49-711-6586 371,

Web: www.ibvt.uni-stuttgart.de/esbes-5/)

08.-10.09.04: BioCon Valley – Life Science for

the Future, Rostock

Info: Gerd Fuchs, Neue Messe GmbH, Rostock

(Tel.: +49-381-4051 514, Fax: +49-381-4051 515,

eMail: fuchs@neue-messe-rostock.de,

Web: www.neue-messe-rostock.de)

12.-15.09.04: ABIC 2004 – „AgBiotech goes

Europe“, Köln

Info: Dr. Peter Welters, Phytowelt GmbH, Nettetal

(Tel.: +49-2162-778 59, Fax: +49-2162-892 15,

eMail: contact@abic2004.org, Web: www.abic2004.org)

14.-16.09.04: Nanofair 2004 – Nano Conference

2004, St. Gallen

Info: Olma Messen St. Gallen (Tel.: +41-71-2420 4444,

eMail: info@nanofair.ch, Web: www.nanofair.ch)

19.-21.09.04: Herbsttagung der Gesellschaft für

Biochemie und Molekularbiologie, Münster

Info: GBM, Frankfurt am Main

(Tel.: +49-69-660 5670, Fax: +49-69-660 567 22,

eMail: info@gbm-online.de,

Web: www.gbm-online.de)

19.-22.09.04: Biocatalysis in the Food and Drinks

Industries, Stuttgart

Info: Universität Hohenheim, Stuttgart

(Tel.: +49-711-459 3407, Fax: +49-711-459 4267,

eMail: info@biocatalysis-hohenheim.de,

Web: www.biocatalysis-hohenheim.com)

19.-22.09.04: ICMP 2004 – 13. International

Conference on Pharmaceutical Medicine, Genf

Info: René Haller, MCI Suisse SA, Geneva

(Tel.: +41-22-339 96 26, Fax: +41-22-339 96 21,

eMail: rene.haller@mci-group.com,

Web: www.icpm2004.org)

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54 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT

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