PDF Download - Laborwelt

B L I T Z L I C H T
DNA-Aufreinigung
Tangentialflußfiltration (TFF)
zur Aufkonzentrierung und
Umpufferung linearer DNA
A
Dr. Margarete Hannappel, Millipore GmbH, Schwalbach am Taunus
Florian Sack, Mologen AG, Berlin
Die Ultrafiltration im Tangentialflußmodus ist in industriellen Prozessen ein anerkanntes Verfahren
zur Separation biologischer Substanzen. Im Labormaßstab wurde untersucht, inwieweit
sich diese Technik zur Aufkonzentrierung und Umpufferung linearer, doppelsträngiger
DNA eignet. Membranen mit unterschiedlichen Ausschlußgrenzen (5 kD, 10 kD, 30
kD) wurden zunächst auf die Rückhaltung linearisierter Plasmide (1.600, 1.800 oder 2.100
Basenpaare) überprüft. Eine vollständige Retention wurde nur bei der 5 kD-Ultracel ® PLC-
Membran festgestellt. Die Aufkonzentrierung verdünnter Lösungen bis zu einer DNA-Konzentration
von 2 mg/ml war mittels Tangentialflußfiltration möglich, wobei der Prozeßverlauf
durch die Wahl der Membran beeinflußt wurde. Insgesamt erwies sich die TFF als ein Verfahren
zur Konzentrierung und Diafiltration linearer DNA in Lösung, das sich im Volumenbereich
zwischen 100 ml und 1.000 ml einsetzen läßt.
Key Words: lineare DNA, DNA-Aufkonzentrierung, DNA-Umpufferung, Tangentialflußfiltration,
TFF, Ultrafiltration
B
Abb. 2: Aufbau und Durchführung von
TFF-Versuchen. A. Membrankassette in einem
TFF-Komplettsystem (Labscale-TFF-System,
Millipore)
B. Membrankassette mit Einzelkomponenten zu
einem TFF-System zusammengestellt. Betriebsvolumen
in Abhängigkeit vom System 25 ml bis
1.000 ml
Lineare, doppelsträngige DNA-Moleküle (linearisierte
Plasmide, Vektoren) sind wichtige
Zwischen- oder Endprodukte bei der Entwicklung
und Produktion von DNA-Arzneimittelkandidaten
(zum Beispiel bei der Gentherapie
oder DNA-Vakzinierung). Innerhalb
des Entwicklungs- und Herstellungsprozesses
müssen diese häufig aufkonzentriert oder
in andere Puffer transferiert werden. Dabei
können die im Labormaßstab üblichen Methoden
wie Ethanolfällung oder Dialyse selten
angewendet werden, weil die Lösungsansätze
vergrößert oder die Verfahren für einen
späteren Produktionsprozeß unter GMP-
Bedingungen ungeeignet sind. In der biopharmazeutischen
Industrie ist die Ultrafiltration
im Tangentialflußmodus eine verbreitete
Methode zur Abtrennung und Aufkonzentrierung
biologischer Stoffe. In diesem Zusammenhang
wurde die Anwendung dieser
Aufreinigungs-Technik zur Konzentrierung
und Diafiltration von linearer, doppelsträngiger
DNA in Lösung untersucht und für Volumina
bis 1.000 ml getestet.
Ultrafiltration im Tangentialflußmodus
Abb. 1: Prinzip der Tangentialflußfiltration. Die Membranfläche wird tangential von der Produktlösung
überströmt. In Abhängigkeit vom angelegten Transmembrandruck (TMP: „Trans Membrane Pressure“)
wird ein Teil der Flüssigkeit durch die Membran auf die Filtratseite gepreßt. Moleküle, die aufgrund
ihrer Größe die Membranporen nicht passieren können, werden auf der Retentatseite zurückgehalten.
(P: Druck, ∆P: Differenzdruck)
Die Ultrafiltration trennt gelöste Moleküle
nach Molekülgröße aus Flüssigkeiten über
eine Membran. Ultrafiltrationsmembranen
werden gewöhnlich im Tangentialflußmodus
eingesetzt (Abb. 1).
Ultrafiltrationsmembranen werden von
den Herstellern nach ihrer Ausschlußgrenze
(nominelle Molekulargewichtsgrenze oder
„Cut-off“) klassifiziert und zur Trennung
oder Anreicherung von Stoffen zwischen
1.000 bis 1.000.000 Dalton eingesetzt. Für die
Zurückhaltung globulärer Proteine wird in
LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 25