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Foto: © Varian GmbH, Dramstadt

LABORWELT

IV/2001

Das Themenheft von

Aufreinigung

von Herzzellen

aus in vitro

differenzierten

embryonalen

Stammzellen

Marktübersicht

Zentrifugation

Bioseparation

Hochdurchsatz-

Aufreinigung von

Oligonukleotiden

Lasermikrosektion

in der

Zellanalytik

Bioseparation

in der Proteom-

Forschung

Proteomics:

Chips für die 2D-

Gelelektrophorese

Anreicherung

von Tumorzellen

mit FACS und

Beads

BIOCOM AG


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I N T R O

Zum Thema

Separationstechniken –

Grundlage zahlreicher

„Zukunftstechnologien“

Kommen jetzt die Stammzellen Dem US-Unternehmen Geron jedenfalls

ist es gelungen, zumindest die verfahrenstechnischen Grundlagen

für eine Züchtung des gleichermaßen hoffnungs- wie bedenkenstiftenden

Zellmaterials im großen Maßstab zu legen. Anfang Oktober berichteten

die Kalifornier in Nature Biotechnology, daß es ihnen gelungen sei, erstmals

die menschlichen embryonalen Zellen ohne direkten Kontakt zu einer

Schicht aus nährenden („feeder layer“) Mausfibroblasten zu kultivieren.

Sie nahmen statt dessen Medium, in das die darin zuvor gezüchteten

Mausfibroblasten ihre derzeit noch nicht bekannten Faktoren abgegeben

hatten. Diese bewirken, daß die Stammzellen sich ständig teilen,

nicht differenzieren und doch ihr großes Entwicklungspotential behalten.

Die Trennung von dem feeder layer lege die Grundlage, so schreiben die

Geron-Forscher, für eine Züchtung großer Stammzellmengen.

Eine mindestens genauso wichtige Frage ist, wie man die gewünschten

Zelltypen aus den Zelltypmosaiken (embryoid bodies) möglichst rein gewinnt,

die entstehen, wenn die pluripotenten Stammzellen ihr Differenzierungsprogramm

starten. Die Optimierung der Anreicherung, Abtrennung

und Vereinzelung zellspezifischer Vorläuferzellen ist eine der

vielen Aufgaben, die gelöst sein müssen, bevor man konkret daran denken

kann, Zelltransplantate auf Grundlage embryonaler Stammzellen

zur Geweberegeneration einzusetzen. Doch mit ausgefeilten Analyseund

Separationsstrategien kommt die Forschung auch auf diesem Gebiet

voran, wie im Bericht auf Seite 4 nachzulesen.

Auch auf anderen Forschungsgebieten, denen eine große Zukunft – oder

zumindest ein großer Markt – vorhergesagt wird, spielen Techniken zur

Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service – jetzt auch

online unter www.biocom.de:

Wenn Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer

ankreuzen, Name und Adresse angeben und faxen/mailen –

Sie erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten.

Auftrennung von Zellen (siehe Seite 20 und 23) und biologischen Molekülen

eine entscheidende Rolle. Ohne Auftrennung von Oligonukleotiden

etwa, können keine Chips gedruckt werden (s. Beitrag Seite 14). Das

ist der Grund, weshalb wir diese Bioseparationen zum Thema der aktuellen

Ausgabe von LABORWELT gemacht haben.

In der Proteomforschung etwa dominiert noch heute die 1975 von Klose

und O‘ Farrell entwickelte zweidimensionale Gelelektrophorese. Wissenschaftler

vom Mainzer IMM wollen diese nun automatisieren und haben

dazu mikrostrukturierte Chips entwickelt, auf denen sie die Proteine en

miniature auftrennen wollen. Daneben kommen durch neue Trägermaterialien

die guten, alten Chromatographie-Verfahren auf diesem Gebiet

voran. Lesen Sie dazu unsere Berichte auf den Seiten 12 und 19.

Übrigens finden Sie ab sofort, aufgrund der vielen Lesernachfragen,

einen neuen Service auf unserer Homepage www.biocom.de:

Für einen schnellen Produktvergleich können Sie sich jetzt alle LABOR-

WELT-Marktübersichten des laufenden Jahres als pdf-Datei herunterladen.

Wir freuen uns auf Ihren Internet-Besuch und wünschen Ihnen für

die aktuelle Ausgabe eine angenehme Lektüre.

Ihr LABORWELT-Team

4 REPORT

Aufreinigung von Herzmuskelzellen

aus

in vitro differenzierten

embryonalen Stammzellen

zur Transplantation

WOLFGANG FRANZ ET AL.,

KLINIKUM GROSSHADERN,

LMU MÜNCHEN

Inhalt

BLITZLICHT

Mikrosystemtechnik in der 12

Proteomanalyse

WOLFGANG DÖRNER ET AL.,

INSTITUT FÜR MIKROTECHNIK GMBH,

MAINZ

BLITZLICHT

14 High-Throughput-Reinigung

von Dimethoxytitryl-

Oligonukleotiden

ANDREA JUNKERT-BUCHHEIT,

VARIAN DEUTSCHLAND GMBH,

DARMSTADT

LABORTREND

19 Proteomics: Steigender Bedarf

an „Up-Stream-Technologien“

STEFAN MÜLLNER, HENKEL KGAA,

DÜSSELDORF

BLITZLICHT

20 Sampling Error in der

diagnostischen Molekularpathologie

– Bedeutung der

Lasermikrosektion

BIRGIT RENKE ET AL.,

KLINIKUM KASSEL

MARKTÜBERSICHT

26 Zentrifugation

33 Produktwelt

34 Impressum

REPORT

Tumorzellanalyse mit 23

kombinierter Magnetanreicherung,

Laser-Scanning-Zytometrie

und visueller Kontrolle

KATHARINA PACHMANN ET AL.,

LABOR FÜR SPEZIELLE IMMUNHÄMA-

TOLOGIE & GENDIAGNOSTIK, BAYREUTH

Information ordern Kennziffer 11 LW 04 / www.biocom.de

|transkript LABORWELT Nr. IV/2001 | 3


R E P O R T

Stammzellen

Aufreinigung von Herzmuskelzellen

aus in vitro differenzierten embryonalen

Stammzellen zur Transplantation

DR. ROBERT DAVID UND PD DR. WOLFGANG-MICHAEL FRANZ;

MEDIZINISCHE KLINIK UND POLIKLINIK I, KLINIKUM GROSSHADERN, MÜNCHEN

Eine Durchblutungsstörung (Ischämie) des Herzmuskels kann zu einem dauerhaften Verlust von

Kardiomyozyten führen, der mit einem substantiellen Rückgang der Herzleistung einhergeht. Als

etablierte Therapie der daraus resultierenden chronischen Herzinsuffizienz gilt seit Jahrzehnten die

Herztransplantation, welche aufgrund des Mangels an Spenderorganen deutlichen Limitationen

unterliegt. Als Alternative zur Organtransplantation bietet sich die Transplantation von Herzmuskelzellen

an, welche sich in jüngster Zeit aus pluripotenten embryonalen Stammzellen (ES-

Zellen) gewinnen lassen. Wir beschreiben hier die Markierung und Isolierung von ventrikulären

Kardiomyozyten mit Hilfe des zellspezifischen Promotors der ventrikulären Myosin-Leicht-Kette-

2 (MLC-2v). Bei diesem Ansatz wurden murine ES-Zellen stabil mit einem DNA-Konstrukt

transfiziert, das die Expression des Fluoreszenz-Markers EGFP (enhanced green fluorescent

protein) unter Kontrolle des ventrikelspezifischen 2,1 kb-langen MLC-2v-Promotors erlaubt. Eine

erhöhte Aktivität des Promotorfragmentes wurde durch den vorgeschalteten CMV-Enhancer

erzielt. Nach Differenzierung der ES-Zellen konnte in 25% der spontan kontrahierenden Kardiomyozyten

grüne Fluoreszenz beobachtet werden. Elektrophysiologische und pharmakologische

Analysen ergaben, daß es sich beim überwiegenden Teil dieser Zellen um ventrikuläre Kardiomyozyten

handelt. Die Aufreinigung der Zellen über Gradientenzentrifugation und Zellsorting führte

zu einer Population von 97% EGFP-positiven Kardiomyozyten. Die Ergebnisse zeigen, daß

ventrikuläre Kardiomyozyten in vitro aus ES-Zellen gewonnen und über eine MLC-2v-kontrollierte

Markergenexpression aufgereinigt werden können, was einen wesentlichen Schritt zur Zellersatztherapie

bei chronischer Herzinsuffizienz darstellen könnte.

Adulte Kardiomyozyten von Säugern beenden

im Gegensatz zu Skelettmuskelzellen

während ihrer Differenzierung den Zellzyklus

und sind somit nicht regenerierbar 1 ,

weshalb bei einer Nekrose des Myokards,

etwa infolge eines Infarktes, irreversible

Zell- und Funktionsverluste auftreten. Einen

möglichen Therapieansatz bieten Trans-

Abb. 1A: Strategie zur

Expression der cDNA eines

Markergens unter

der Kontrolle eines gewebespezifischen

Promotors

plantationen myogener Zellen in die infarzierten

Gewebeabschnitte, wodurch man

sich eine Verbesserung der Kontraktilität in

den betroffenen Arealen erhofft. Ein Hauptproblem

stellt jedoch das Fehlen myokardialer,

noch teilungsfähiger Zellen dar. In

Tierversuchen konnte gezeigt werden, daß

Zellen aus verschiedenen Donorgeweben

(Skelettale Myoblasten, Satellitenzellen und

Glatte Muskelzellen) für eine gewisse Zeit

im Empfängerorganismus überlebensfähig

sind und zu einer Verbesserung der Pumpfunktion

führen können 2-7 . Jedoch ist die

Ausbildung interzellulärer Verbindungen

wie „Gap Junctions“ und Desmosomen nur

für die Transplantation von Kardiomyozyten

beschrieben worden 8-11 . Die Überlegenheit

von Herzmuskelzellen für die klinische

Regeneration von Herzmuskelgewebe

wird auch durch ihre spezifischen elektrophysiologischen,

strukturellen und kontraktilen

Eigenschaften belegt. Da die Verfügbarkeit

humaner fetaler Kardiomyozyten

eng limitiert ist und diese somit für eine

klinische Anwendung kaum in Frage kommen,

könnte die in vitro-Gewinnung aus

Stammzellen eine wichtige Alternative darstellen.

Prädestiniert sind hierfür pluripotente

Stammzellen embryonalen Ursprungs.

Diese vermehren sich – in Mauszellkulturen

– in Gegenwart des „Leukemia Inhibitory

Factors“ (LIF) unter Kulturbedingungen,

ohne sich weiter zu differenzieren, wobei

ihr Potential erhalten bleibt, sämtliche

der rund 210 verschiedenen Zelltypen eines

Säugers zu bilden. Werden ES-Zellen

der Maus in Suspension gezogen, bilden

diese spontan Zellaggregate differenzierter

Gewebe, die man auch als „embryoid bodies“

(EB) bezeichnet. Unter anderem findet

man darin Herzmuskelgewebe vor, erkennbar

als Regionen spontan kontrahierender

Aktivität 12,13 . In Tierversuchen wurden

mittlerweile Kardiomyozyten, neurale

Zellen und β-Zellen des Pankreas transplantiert,

die aus murinen ES-Zellen gewonnen

wurden. In diesen Experimenten

konnte man beachtliche Erfolge bei der Behandlung

von Querschnittslähmung, Diabetes

mellitus und Herzinsuffizienz erzielen

11,14,15 .

0 100000 200000

LU/mg Protein

Abb. 1B: Herzmuskelspezifische

Expression des

Markergens Luziferase

unter der Kontrolle des

MLC-2v-Promotors in

transgenen Mäusen

Spezifische Markierung

der Kardiomyozyten

Entscheidend für eine zelltherapeutische

Verwendbarkeit bei chronischer Herzinsuffizienz

wird die spezifische Isolierung der

ventrikulären Kardiomyozyten aus den

„embryoid bodies“ sein, so daß differenzierte

Herzmuskelzellen dieses Subtyps

hochaufgereinigt für die Transplantation

in das Herzmuskelgewebe zur Verfügung

Kennziffer 12 LW 04/www.biocom.de Info

4 | Nr. IV/2001 |transkript LABORWELT


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R E P O R T

Abb. 2 Strategie zur Selektion von Kardiomyozyten

aus in vitro differenzierten, grün fluoreszierenden

ES-Zellen über die Expression des

Markergens EGFP unter der Kontrolle des

MLC-2v-Promotors. Zur Verstärkung der

Fluoreszenz wurde dem Promotor ein CMV-

Enhancer-Element vorgeschaltet.

stehen. Eine wichtige Basis hierfür wurde

durch experimentelle Arbeiten unserer

Gruppe geschaffen, unter anderem mit der

Charakterisierung des 2,1 kb-langen ventrikulären

„Myosin Light Chain-2“ (MLC-

2v)-Promotors an transgenen Tieren und

im adenoviralen Kontext 17,19 . In vier unabhängigen

transgenen Mauslinien wurde eine

Luziferase-Expression unter Kontrolle des

2,1 kb-MLC-2v-Promotors (Abb. 1A) ausschließlich

im Herzmuskel beobachtet (Abb.

1B). Die Experimente legten nahe, daß das

2,1 kb-Fragment des Promotors alle regulatorischen

Elemente enthält, welche in vivo

zur selektiven Genexpression in Herzmuskelzellen

erforderlich sind. Bemerkenswerterweise

war im Gegensatz zur Produktion

des endogenen Myosins die Expression der

Luziferase während der Embryogenese deutlich

gegenüber adulten Tieren erhöht 16 . In

einem weiteren Ansatz zur Etablierung gewebespezifischer

adenoviraler Vektoren

nutzten wir die 2,1kb-MLC-2v-Luziferase-

Kasette zur herzmuskelspezifischen Genexpression.

Es konnte gezeigt werden, daß im

adenoviralen System der 2,1kb-MLC-2v-Promotor

im Gegensatz zum α-MHC-Promotor

keine Koexpression in anderen Geweben aufweist

17 . Die Luziferase-Aktivität der Herzmuskel-spezifischen

Adenoviren wurde

überwiegend im ventrikulären Myokard

nachgewiesen 18 . Diese Ergebnisse wurden

mit weiteren Adenoviren mittels β-Galaktosidase-Expression

bestätigt 19 . All diese Daten

belegten, daß mit dem 2,1 kb-Fragment

des MLC-2v-Promotors ein hervorragendes

Werkzeug zur Überexpression von Genprodukten

im ventrikulären Herzmuskel

zur Verfügung steht.

Auf die Differenzierung von ES-Zellen übertragen,

bedeutet dies, daß sich der MLC-2v-

Promotor erst anschaltet, wenn sich eine

Zelle in vitro zu einer ventrikulären Herzmuskelzelle

differenziert und dementsprechend

das kontraktile Protein MLC-2v produziert.

Durch Expression eines Markergens

können dann die ventrikulären Kardiomyozyten

von dem heterogenen Gemisch

der übrigen im „embryoid body“

vorhandenen Zellpopulationen unterschieden

werden. Die oben dargestellten Markerproteine,

Luciferase und β-Galaktosidase

eignen sich jedoch nicht zur Aufreinigung

transplantierbarer Kardiomyozyten, da ihre

Detektion entweder die Herstellung eines

Zellysates oder die Fixierung der Zellen

voraussetzt und mit dem Zelluntergang einhergeht.

Eine Alternative bieten in vivo fluoreszierende

Proteine, wie etwa das „Enhanced

Green Fluorescent Protein“ (EGFP).

Dieses emittiert in der lebenden Zelle nach

Abb. 3: Klassifizierung der grün fluoreszierenden

Kardiomyozyten in verschiedene Subtypen

anhand der Ergebnisse aus elektrophysiologischen

und pharmakologischen Untersuchungen.

82% der EGFP-positiven Zellen

entsprechen dem ventrikulären Typ.

© FASEB J 2000; 14: 2540-8 [20]

UV-Anregung Licht sichtbarer Wellenlänge.

Zur Isolierung ventrikulärer Kardiomyozyten

aus kultivierten ES-Zellen der

Maus haben wir daher EGFP unter Kontrolle

des gut charakterisierten MLC-2v-Promotors

gestellt. Eine verstärkte Fluoreszenz

wurde durch Vorschalten der CMV-Enhancer-Sequenz

erzielt (Abb. 2), so daß neun

ES-Zellklone als EGFP-positiv identifiziert

wurden. Von diesen zeigten wiederum vier

eine besonders hohe Anzahl fluoreszierender

Zellen in den spontan kontrahierenden

Arealen der „embryoid bodies“ 20 .

Charakterisierung und

Anreicherung von Kardiomyozyten

Immunfluoreszenzanalysen mit muskulären,

kardiomyozytären und atrialen Antikörpern

gaben erste Hinweise auf eine ventrikuläre

Identität der fluoreszierenden

Herzmuskelzellen. Elektrophysiologische

Untersuchungen der schlagenden, fluoreszierenden

und nicht fluoreszierenden Zellen

belegten die ventrikulären Eigenschaften

der kontrahierenden Herzmuskelzellen.

Interessanterweise konnte unter Stimulation

mit Isoproterenol und Carbachol

das typische elektrophysiologische Verhalten

der fluoreszierenden Herzmuskelzellen

mittels „patch clamp“-Technik belegt

werden 20 .

Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse aus elektrophysiologischen

Analysen mittels Patchclamp-Technik:

Mehr als 80% der fluoreszierenden

Zellen waren aufgrund ihrer charakteristischen

Aktionspotentiale mit einer

relativ langen Plateauphase und einem stark

negativen diastolischen Potential als ventrikuläre

Kardiomyozyten identifizierbar.

Kennziffer 13 LW 04/www.biocom.de Info

6 | Nr. IV/2001 |transkript LABORWELT


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R E P O R T

Abb. 4A: Aufreinigungsschema

lebender, grün

fluoreszierender Kardiomyozyten,

deren Differenzierung

in vitro aus

ES-Zellen erfolgte.

(Abb. 4B). Die gereinigten Kardiomyozyten

zeigen die typischen kontraktilen Fasern

und ein intaktes Sarkomer (Abb. 5) 20 .

Damit ist die Identität der ventrikulären

Kardiomyozyten nach Zellsortierung belegt,

was Voraussetzung für eine erfolgversprechende

Transplantation ist. Die Ergebnisse

zeigten die hohe Spezifität des CMV-

MLC-2v-Promotorkonstruktes. Die neu etablierte

Expressionskassette ist damit den

Promotoren der Schweren Myosinkette

(α-MHC) und des α-Aktins, welche ebenso

zur Selektion von Kardiomyozyten eingesetzt

wurden, aber nicht zwischen den einzelnen

Subtypen von Herzmuskelzellen

diskriminieren 11,21 , bei der Selektion ventrikulärer

Kardiomyozyten überlegen. Grundsätzlich

ist davon auszugehen, daß die Verfügbarkeit

weiterer hochspezifischer Promotoren

zukünftig essentiell für die Selektion

spezifischer Zelltypen aus den differenzierten

Zellaggregaten der „embryoid

bodies“ sein wird. Die erfolgreiche Selektion

spezifischer Zelltypen eröffnet den Weg

zur Entwicklung zelltherapeutischer Strategien

zur Behandlung neurologischer, internistischer

und orthopädischer Erkrankungen.

Darüber hinaus können die Zelltransplantate

molekularbiologisch derart

verändert werden, daß biologisch aktive

Moleküle, wie etwa Wachstumsfaktoren

oder spezielle Angiogenesefaktoren, sezerniert

werden.

Die Carbachol-Gabe hatte keinen Einfluß

auf den Potentialverlauf, während Isoprenalin

die Plateauphase verkürzte und zu

einer Erhöhung der Potentialfrequenz führte,

die nach dem Auswaschen der Substanz

wieder rückläufig war 20 . Nach der immunologischen,

elektrophysiologischen und

pharmakologischen Charakterisierung erfolgte

die Etablierung eines Aufreinigungsverfahrens,

welches schematisch in Abbildung

4A dargestellt ist: Einige der Zellen

innerhalb der heterogenen Zellpopulation

der „embryoid bodies“ sind EGFP-positiv.

Nach enzymatischer Vereinzelung der Zellen

erfolgt die Anreicherung der EGFP-positiven

Kardiomyozyten mittels Dichtegradientenzentrifugation

um den Faktor drei

bis vier. Die Zellsortierung nach Grünfluoreszenz

führt zu einer hochgradig gereinigten

Population, welche zu 97% bis 98% aus

fluoreszierenden Kardiomyozyten besteht 20

Abb. 4B: FACS-Profile

der während der einzelnen

Aufreinigungsstadien

vorliegenden Zellpopulationen.

Nach der

Aufreinigung zeigen 97%

der gewonnenen Zellen

die Grünfluoreszenz.

© FASEB J 2000; 14:

2540-8 [20]

Abb. 5: Immunhistochemie

von gereinigten

schlagenden EGFP-positiven

Kardiomyozyten.

Grün fluoreszierende

Zellen exprimieren Sarkomer-typische

Proteine:

A. α−MHC, B. α-Akitinin,

C. F-Aktin und D.

Troponin I.

© FASEB J 2000; 14:

2540-8 [20]

Menschliche Kardiomyozyten

Die sich in den Tierversuchen abzeichnenden

Möglichkeiten zur Transplantation differenzierter

Zelltypen, die aus ES-Zellen

gewonnen werden, gaben den Ausschlag

für die zunehmende Etablierung von humanen

Zellinien 22-25 . Bei diesen Kulturen

handelte es sich um Zellen, die in der Regel

aus überzähligen, bei der in vitro-Fertilisation

angefallenen Embryonen stammten.

Auch für die humanen embryonalen

Stammzellen konnte gezeigt werden, daß

sie wesentliche Kriterien erfüllen: sie stammen

von prä- oder periimplantierten Embryonen

ab, proliferieren unter geeigneten

Bedingungen im undifferenzierten Zustand

über einen langen Zeitraum und können

„embryoid bodies“ (EB) mit Geweben aller

drei Keimblätter ausbilden 26 . Kehat et al.

(2001) konnten kürzlich erstmals die spontane

Differenzierung humaner embryonaler

Stammzellen zu Kardiomyozyten zeigen

27 (Abb. 6, 7): 8,1% der als „embryoid

bodies“ bezeichneten Zellaggregate wiesen

spontan kontrahierende Bereiche mit Herzmuskelzellcharakter

auf, wobei es sich um

Mischpopulationen verschiedener Subspezies

von Kardiomyozyten handelt, während

dagegen keine Skelettmuskelzellen gefunden

wurden 27 . Höchstwahrscheinlich können

die Kulturbedingungen künftig dahingehend

optimiert werden, daß der Anteil

der Herzmuskelzellen an den differenzierten

ES-Zellen noch deutlich steigt: So förderte

die Zugabe von Retinsäure die Reifung

der Kardiomyozyten 28 . Entsprechende

Daten waren zuvor bereits in unserer

Arbeitsgruppe für embryonale Stammzellen

der Maus erzielt worden 29 .

Das Ziel, menschliche Kardiomyozyten zu

Transplantationszwecken zu züchten und

in ausreichender Menge zu gewinnen, wird

nicht ohne weitere Forschungsarbeiten an

menschlichen embryonalen Stammzellen

auskommen, die sich in ihren Kulturbedürfnissen

und in ihrer Entwicklung zum

Teil signifikant von Mauszellen unterscheiden.

Daher gilt es , die ethische Herausfor-

Kennziffer 14 LW 04/www.biocom.de Info

8 | Nr. IV/2001 |transkript LABORWELT


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R E P O R T

Day 0 Day 10

Abb. 6: Stadien der Entwicklung von ES-

Zellen. Die ES-Zellen werden zunächst auf

sogenannten „Feeder-Zellen“ gezogen

(links). Um die Differenzierung zu induzieren,

werden die Zellen in Suspension überführt.

Sie aggregieren dabei und bilden

„Embryoid Bodies“ (Mitte). Nach zehn Tagen

in Suspensionskultur werden die Zellen

auf Gelatine-beschichteten Kulturschalen

ausplattiert, wo sie sich unter anderem zu

Kardiomyozyten differenzieren. Entsprechende

Areale sind durch ihre spontanen

Kontraktionen identifizierbar (Pfeil, rechts).

© J Clin Invest 2001; 108: 407-14 [27]

derung anzunehmen, die die Nutzung embryonaler

Stammzellen bedeutet, und eine

Lösung zu finden, bei der weder die Grenzen

der Forschung noch die Hoffnungen

der Patienten auf eine wissenschaftlich optimale

Behandlung aus dem Blick geraten.

Literatur

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cardiomyocytes from ES cells in vitro. FASEB J 2000;

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Abb. 7: Elektronenmikroskopische

Analyse von Kardiomyozyten,

die aus aus humanen

ES-Zellen gewonnen wurden.

(a) Ein Schnitt durch einen

„embryoid body“, 10 Tage

nach der Ausplattierung, zeigt

unorganisierte Bündel von

Myofibrillen in einigen Myozyten.

(b, c) Nach weiteren 17

Tagen ist die Entwicklung der

Sarkomerorganisation deutlich

fortgeschritten. In (c) sind Z-

Scheiben zu erkennen (Pfeil).

(d) Eine interzelluläre Verbindung

(„gap junction“) in einem

„embryoid body“ 16 Tagen

nach dem Ausplattieren (Pfeil).

(e) Desmosom in einem „embryoid

body“ desselben Entwicklungsstadiums

(Pfeil).

© J Clin Invest 2001 [27]

21. Kolossov E, Fleischmann BK, Liu Q, Bloch W, Viatchenko-Karpinski

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the three embryonic germ layers. Mol Med

2000; 6: 88-95.

27. Kehat I, Kenyagin-Karsenti D, Snir M, Segev H, Amit M,

Gepstein A, Livne E, Binah O, Itskovitz-Eldor J, Gepstein L:

Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes

with structural and functional properties of cardiomyocytes.

J Clin Invest 2001; 108: 407-14.

28. Schuldiner M, Yanuka O, Itskovitz-Eldor J, Melton DA,

Benvenisty N: From the cover: effects of eight growth factors

on the differentiation of cells derived from human

embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97:

11307-12.

29. Wobus AM, Kaomei G, Shan J, Wellner MC, Rohwedel

J, Ji G, Fleischmann B, Katus HA, Hescheler J, Franz WM:

Retinoic acid accelerates embryonic stem cell-derived

cardiac differentiation and enhances development of ventricular

cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol 1997; 29: 1525-

39.

Danksagung

Unser Dank gilt der Gruppe um Kehat et al. für

die Bereitstellung der Abbildungen 6 und 7

sowie Mr. Livingston vom Journal of Clinical

Investigation für deren unbürokratische Reprintgenehmigung.

Dr. S. Jacobson vom FASEB

Journal danken wir für die unbürokratische

Reprintgenehmigung für die Abbildungen 3,

4b und 5. Die Arbeiten an Embryonalen Stammzellen

wurden seit 1997 vom Bundesministerium

für Bildung und Forschung gefördert

(BMBF 01 KV 9547, BMBF 01 KV 9921/8).

Korrespondenzadresse

PD Dr. Wolfgang M. Franz

Medizinische Klinik und Poliklinik I

Klinikum Großhadern

Marchioninistraße 15

81377 München

Tel.: 089-7095-3094

Fax: 089-7095-6094

eMail: wfranz@helios.med.uni-muenchen.de

Kennziffer 15 LW 04/www.biocom.de Info

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Proteinseparation

Mikrosystemtechnik in der

Proteom-Analyse

Wolfgang Dörner, Anja Griebel, IMM - INSTITUT FÜR MIKROTECHNIK MAINZ GMBH

Während das Genom als identische Kopie in jeder Körperzelle vorhanden ist, kann der Proteinbestand

von Zelle zu Zelle und von Gewebe zu Gewebe stark variieren. Um diese Vielfalt zu erfassen und zu

charakterisieren, werden neue Technologien benötigt, mit denen in kurzer Zeit viele Proben parallel

bearbeitet werden können. Die Miniaturisierung und Automatisierung vorhandener Methoden sind

der Schlüssel dazu – eine Herausforderung für die Mikrotechnik, der sich auch das Institut für

Mikrotechnik Mainz stellt.

Der Aktienkurs der kalifornischen Lynx

Therapeutics Inc. stieg nach der Erteilung

eines „Proteomics“-Patentes (Patentnummer:

US 60313165) Anfang 2000 steil an.

Dieser Ausschlag im volatilen Geschäft der

neuen Märkte deutet auf top-aktuelle Analystentrends

hin. Hintergrund des „Proteomics“-Trends

ist der vermeintliche „Abschluß“

des Humangenom-Projektes mit der

Veröffentlichung einer Grobversion der

DNA-Sequenzdaten. Dieser Meilenstein hat

zugleich die Notwendigkeit einer leistungsfähigen

Proteinanalytik verdeutlicht, die zur

Genfunktionsanalyse erforderlich scheint.

Besonders von der Kombination aus genetischer

Information und solcher über Proteinexpression

versprechen sich viele Marktbeobachter

das Auffinden neuer Therapieansätze

in der Medizin. Die Mikrosystemtechnik

liefert dabei die Strukturen für neue 2D-

Elektrophoresetechniken.

Wie groß der Nachholbedarf bei der Proteinanalytik

ist, macht folgender Vergleich deutlich:

Während neben der fast vollständig

automatisierten DNA-Sequenzierung auch

die Detektion genetischer Veränderungen

mittels DNA-Arrays auf Chips mit sehr hohen

Informationsdichten zum Standard

avanciert, beruht das derzeit wichtigste Verfahren

zur Trennung komplexer Proteingemische

auf Publikationen von O’Farrell und

Klose aus dem Jahr 1975 1 . Die darin beschriebene

Analysenmethode liefert eine bisher

durch kein anderes Verfahren erreichte

Auflösung. Zwar wurde diese 2D-Gelelektrophorese

(2D-GE) beträchtlich verbessert ,

doch hat bislang eine Automatisierung des

Prozesses nicht stattgefunden, denn nach

wie vor sind zahlreiche manuelle Arbeitsschritte

zur Analyse einer einzelnen Probe

notwendig. Auch eine Parallelisierung steht

noch aus: mehr als 10 Proben können nicht

gleichzeitig mit einer Apparatur analysiert

werden. Diese Schwachpunkte bringen es

mit sich, daß das Verfahren bisher nur von

geschultem Fachpersonal durchgeführt werden

kann und darüber hinaus sehr zeitintensiv

ist.

Proteinanalytik setzt

zum Aufholen an

Abb. 1: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme

eines nach dem ASE-Verfahren geätzten

Siliziumwafers (oben). Die Struktur wurde

dann galvanisch in Nickel abgeformt (Mitte).

Mit Ni-Formeinsätzen können dann Elastomere

wie etwa Polymethylmethacrylat (PMMA)

durch Heißprägen mikrostrukturiert werden

(unten).

Es liegt nahe, das Erfolgskonzept der Miniaturisierung

aus der DNA-Analytik auf die

Proteinanalytik zu übertragen. Mit der Miniaturisierung

geht die Automatisierung einher:

Sehr geringe Proben- und Chemikalienmengen

können nicht mehr manuell aufgetragen

werden. Die Mikrosystemtechnik erlaubt

es, Strukturelemente wie Vorratsgefäße,

kapillare Trennstrecken und Elektrolytenreservoirs

zur Kapillarelektrophorese im

Größenbereich von einem bis zu mehreren

hundert Mikrometern zum Beispiel auf Glasoberflächen

unterzubringen. Diese Technik

fand ihre kommerzielle Umsetzung in dem

Agilent 2100 Bioanalyzer (siehe LABOR-

WELT 1/2000). Dessen Herzstück, ein mikrostrukturierter

Glaschip, besitzt eine

Trennstrecke, in der sequentiell bis zu zehn

Proteinproben abgearbeitet werden können.

Gegenstand des eingangs genannten Lynx-

Patentes ist ebenfalls eine mikrofluidische

Struktur, die allerdings zur 2D-Gelelektrophorese

eingesetzt werden soll.

Kunststoff statt Glas

Glas läßt sich durch Ätzen mikrostrukturieren.

Voraussetzung ist das Aufbringen einer

lichtempfindlichen Schicht (Resist), die nach

Belichtung durch Masken selektiv entfernt

werden kann. Das bedeutet aber, daß jeder

Chip photostrukturiert und geätzt werden

muß. Eine Alternative stellt photostrukturierbares

Glas dar, das ohne eine Resistschicht

auskommt. Dieses Glasmaterial hat

allerdings auch einen höheren Preis als konventionelles

Glas.

Für Analysesysteme auf der Basis von Einmal-Chips

sowie für das High-Throughput -

Screening ist die preisgünstige Herstellung

großer Chipzahlen unerläßlich. Daher wäre

es ideal, Chips aus Kunststoffen zu produzieren.

Spritzgießen und Spritzprägen sind

Verfahren, die zur Massenproduktion von

Kunststoffteilen sehr gut etabliert und mittlerweile

zur Mikrostrukturierung einsetzbar

sind.

Grundlage zur Produktion sowohl von Kleinserien

als auch von großen Stückzahlen sind

mikrostrukturierte Formeinsätze aus Metall.

Zu deren Herstellung (Abb. 1) kommt ein

photolithographisches Verfahren zusammen

mit ASE (Advanced Silicon Etching) zum

Einsatz: Das Layout einer Struktur wird

durch Belichtung auf Siliziumwafer mit Photoresistschicht

übertragen. Entfernen der

exponierten Resistflächen und anschließendes

Ätzen des Siliziums ergeben eine Positivstruktur

der Waferoberfläche (Abb. 1

oben). Nach dem Auftragen einer Startschicht

auf die Siliziumoberfläche erfolgt

eine galvanische Abscheidung, zum Beispiel

von Nickel. Wird dann das Silizium weggeätzt,

so bleibt eine Komplementärstruktur

im Metall erhalten (Abb. 1 Mitte), die zum

Abformen von Kunststoffteilen (Abb.1 unten)

einsetzbar ist.

Abbildung 2 zeigt eine solche Arbeitsstruktur

für die 2D-Kapillarelektrophorese in

Kunststoff. Sie wurde nach der beschriebe-

12 | Nr. IV/2001 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

nen Methode am IMM hergestellt. Das Kapillarfeld

zur Auftrennung der Proteinproben

beherbergt 300 Kapillaren (6,4 cm x 50

µm x 50 µm). Der Chip wurde durch Verkleben

einer mikrostrukturierten Folie mit einem

Deckel hergestellt, wobei geschlossene

Kapillaren entstehen.

Abb. 2: Arbeitsstruktur zur 2D-

Gelelektrophorese von Proteinen.

Die beiden großen Reservoirs am

rechten und linken Ende des

Chips sind durch 300 Kapillaren

miteinander verbunden (Foto:

IMM)

Materialien

verbesserungsbedürftig

Kunststoffe sind eigentlich ideal, um große

Stückzahlen von Elektrophoresechips kostengünstig

herzustellen. Allerdings verfügen

sie nicht über optimale Oberflächeneigenschaften.

Störende Einlüsse, wie der elektroosmotische

Fluß (EOF, Stofftransport

durch eine Kapillare beim Anlegen eines

elektrischen Feldes) in Gegenwart von SDS

müssen reduziert und Protein-Kapillarwand-Interaktionen

unterbunden werden.

Auch daran wird im IMM mit einem industriellen

Kooperationspartner (Serva Elektrophoresis

GmbH, Heidelberg) gearbeitet,

denn die Verfügbarkeit maßgeschneiderter

Polymermaterialien, zum Beispiel auf Polyacrylamid-

oder Dextran-Basis, wird der Kapillarelektrophorese

in Biochips als zukunftsträchtiges

Analyseverfahren zum Durchbruch

verhelfen.

Literatur

[1] O‘ Farrell, P.H., J. Biol.Chem 250 (1975); 4007

[2] Klose, J., Humangenetik 26 (1975): 231

Dank

Dr. Renate Konrad*

* Wesentliche Ergebnisse und Fortschritte im

dargestellten Projekt verdanken wir dem besonderen

persönlichen Engagement von Dr. Renate

Konrad, die seit 1996 für die Institut für Mikro-

technik Mainz GmbH tätig war und im April

2001 plötzlich und unerwartet verstarb.

Korrespondenzadresse

Anja Griebel

Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH (IMM)

Abt. Fluidik und Simulation / Biotechnik

Carl-Zeiss-Straße 18-20

D-55129 Mainz

Tel.: 06131-990-431

imminfo@imm-mainz.de

Mehr Informationen ordern Kennziffer 16 LW 04 oder www.biocom.de

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|transkript LABORWELT Nr. IV/2001 | 13


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DNA-Separation

High-Throughput-Reinigung

von Dimethoxytrityl (DMTr)-

Oligonukleotiden

DR. ANDREA JUNKER-BUCHHEIT, CONSULTANT FOR VARIAN ANALYTICAL SUPPLIES,

VARIAN DEUTSCHLAND GMBH, DARMSTADT

DIPL.-CHEM. ELISABETH KORTE-MCILWRICK, ANALYTICAL SUPPLIES,

VARIAN DEUTSCHLAND GMBH, DARMSTADT

Es wird ein neues Festphasen-Kartuschensystem für die High-Throughput-Reinigung von Trityl-on-

Oligonukletotiden (bis zu 50 mer) im Nanomol-Maßstab vorgestellt. TOP (Trityl-on oligonucletide

purification)-Kartuschen enthalten ein hochaffines Polymer, das eine optimale Bindung der

Dimethoxytrityl(DMTr)-Oligonukleotide direkt aus der ammoniakalischen Lösung ermöglicht. Sequentiell

durchgeführte Waschschritte und die anschließende in-situ-Abspaltung der DMTr-Schutzgruppen

führen zu einer hohen Reinheit des gewünschten Oligonukleotids (> 90 %). Sämtliche

Extraktionsschritte werden ohne Vakuum oder Druck durchgeführt. Das TOP-VersaPlate TM -Kartuschensystem

ist modular aufgebaut und besteht aus einer wiederverwendbaren 96-well-Basisplatte

und einzelnen Polypropylenkartuschen. Das Design ist so gestaltet, daß eine manuelle Arbeitsweise

mit Mehrkanalpipetten möglich ist oder automatisch arbeitende Pipettierroboter verwendet werden

können.

Key Words: Oligonukleotidsynthese, Reinigung von DMTr-Oligonukleotiden, Festphasenextraktion

ohne Vakuum oder Druck, 96-well-VersaPlate-Mikrotiterplattensystem, High-Throughput-Reinigung

Die pränatale Erkennung genetisch determinierter

Krankheitsdispositionen spielt in

der Molekulardiagnostik eine zunehmend

wichtige Rolle. Dabei wird eine DNA-Diagnostikmethode

verwendet, die auf der gegenseitigen

Erkennung zweier komplementärer

Nukleinsäurestränge beruht. Dieser

Prozeß wird als Hybridisierung bezeichnet

und eingesetzt, um beispielsweise ein Gen

nachzuweisen. Dazu wird ein Oligonukleotid

definierter Basensequenz benötigt, das

als Sonde mit dem zu bestimmenden Zielstrang

bindet. Ebenso werden sequenzdefinierte

Oligonukleotide benötigt, wenn Gene

gezielt durch ortspezifische Mutagenese verändert

werden sollen.

Demzufolge nimmt der Bedarf an sequenzselektiven

Oligonukleotiden in ausreichend

hoher Ausbeute und Reinheit zu. Für die

Oligonukleotidsynthese werden heute hocheffiziente,

automatisch arbeitende Oligonukleotid-Synthesizer

eingesetzt. Da eine hohe

Anzahl von Proben anfällt, sind Reinigungsverfahren

mit hohem Probendurchsatz gefordert.

Festphasensynthese von

Oligonukleotiden

Die Oligonukleotid-Festphasensynthese verfolgt

eine der Polypeptidsynthese analoge

Strategie. Ein mit Schutzgruppen ausreichend

geschütztes Nukleotid wird an das

wachsende Ende der trägergebundenen Oligonukleotidkette

gekoppelt, die Schutzgruppen

entfernt und der Reaktionszyklus solange

wiederholt, bis das Oligonukleotid in 5‘-

Richtung bis zur gewünschten Länge synthetisiert

ist. Eines der gebräuchlichsten Verfahren

zur Festphasensynthese von Oligonukleotiden

ist die Phosphoramidit-Methode

nach Caruthers, ein Prozeß mit vierstufiger

Reaktionsfolge 1 . Ausgangspunkt ist eine

wachsende Oligonukleotidkette, die an ihrem

3‘-Ende mit dem festen Träger (CPG,

controlled pore glass oder Polystyrol-Beads)

verankert und an ihrer 5‘-Hydroxylfunktion

mit einer Dimethoxytrityl(DMTr)-Schutzgruppe

geschützt ist. Zunächst wird die

DMTr-Schutzgruppe durch Säurebehandlung

entfernt (Detritylierung). Die freigewordene

5‘-OH-Gruppe koppelt dann an das 5‘-

DMTr-geschützte, 3‘-Phosphoramidit-Derivat

eines Desoxyribonukleosids, das die

nächste Position in der Kette einnehmen soll

(Coupling). Als Aktivierungsreagenz wird

Tetrazol verwendet. Fehlsequenzen, das

heißt die Verlängerung „falscher“ Oligonukleotide,

werden dadurch inaktiviert, daß

alle 5‘-Hydroxylfunktionen, die nicht reagiert

haben, durch Acetylierung blockiert

werden. So werden sie von nachfolgenden

Kopplungsreaktionen ausgeschlossen, und

es findet kein weiterer Nukleotideinbau statt

(Capping). Der bei der Kopplung entstandene

Phosphittriester wird zum Phosphotriester

durch Iod oxidiert; dadurch entsteht die

um ein Nukleotid verlängerte Kette (Oxidation).

Sobald ein Oligonukleotid mit der gewünschten

Länge hergestellt ist, muß es durch Zugabe

einer ammoniakhaltigen Lösung vom

Träger abgelöst und die 5‘-DMTR-Schutzgruppen

acidolytisch entweder vor oder nach

der Reinigung abgespalten werden.

Zur Reinheitskontrolle des synthetisierten

Oligonukleotids wird – neben HPLC (Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie)

und

PAGE-Gelelektrophorese – vorzugsweise die

Kapillarelektrophorese (CE) mit massenspektrometrischer

Detektion eingesetzt. Ein

Reinigungsschritt sollte in jedem Fall vorher

durchgeführt werden. Dabei sollte der gewünschte

Reinheitsgrad dem späteren Einsatz

des Oligonukleotids angepaßt sein.

Abb. 1: Das TOP-Versa-

Plate-Kartuschensystem

zur gleichzeitigen Reinigung

von bis zu 96 Oligonukleotiden

(15-50 mer)

im nmol-Bereich (mit

Sammelplatte)

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Tabelle 1: Gebräuchliche Reinigungsstechniken nach der Oligonukleotid-Festphasensynthese

Technik Typische Trityl-Modus* Vorteile Nachteile

Reinheit %

Entsalzen durch Aus- 60-70 Off geringe Kosten mäßiger Durchschluß-Chromatographie

leicht durchführbar, satz, geringe

(Gelfiltration) schnell Reinheit

HPLC 85-95 % Off ausreichende Rein- geringer Durch-

(Ionenaustausch-

heit f. kleine Mengen satz, nur für Oligos

Chromatographie)

< 50 Basen geeignet,

Entsalzen notwendig

nach HPLC,

kostenintensiv

HPLC

(Reversed phase- > 95 % On /off hohe Reinheit, geringer Durchsatz,

Chromatographie) quantitativ,einsetz- für Oligonukleotidbar

im präparativen sequenzen < 50

Maßstab

Basen, kostenintensiv

Gelelektrophorese (PAGE) 85-95 % off für Oligonukleotide nur qualitativ,

beliebiger Länge arbeitsintensiv

geringe Ausbeuten

Festphasen-Extraktion (SPE) 85-95 % on gebrauchsfertige limitiert auf be-

Kartuschen, direkt stimmte Oligolängeinsetzbar,mittlere

en, keine Trenn-

Reinheit, hoher Pro- ung von DMTrbendurchsatz,

ein- Oligos unterschiedfache

Durchführung licher Kettenlänge

*on: Reaktionsansatz mit DMTr-Schutzgruppen

*off: Reaktionsansatz ohne DMTr-Schutzgruppen

Reinigung von

Oligonukleotiden

Eine der am häufigsten eingesetzten

Methoden zur Aufreinigung von Oligonukleotid-Reaktionsansätzen

ist die Entsalzung

mittels Gelfiltration an Sephadex G25

(PHARMACIA), wobei es sich hierbei allerdings

nicht um eine Reinigungstechnik im

engeren Sinn handelt. Unerwünschte kürzere

Nukleotidsequenzen werden dabei

nicht entfernt. Bei Oligonukleotiden längerer

Sequenz (> 50 Basen) ist die Gelelektrophorese

geeignet. Allerdings ist dieses Verfahren

zeitraubend und liefert nur mäßige

Ausbeuten. Die HPLC an Spezialsäulen ergibt

die reinsten Oligonukleotide. Von

Nachteil sind geringer Probendurchsatz

und hohe Investitions- und Verbrauchsmaterialkosten.

Mit Hilfe der Reversed phase-

HPLC lassen sich DMTr- von DMTr-freien

Oligonukleotiden trennen, und eine Trennung

der Oligonukleotide ist auch nach

DMTr-Schutzgruppenspaltung möglich.

Zudem bietet die HPLC die Möglichkeit,

Oligonukleotide im präparativen Maßstab

aufzureinigen. Die Festphasenextraktion

(Solid-phase Extraction) von DMTr-Oligonukleotiden

an ausgewählten Sorbentien

stellt einen Kompromiß hinsichtlich gefordertem

Reinheitsgrad, Ausbeute und dem

möglichen Probendurchsatz dar. Eine Übersicht

der genannten Techniken ist in Tabelle

1 dargestellt.

TOP-VersaPlate TM -

Kartuschensystem: Hohe Reinheit

bei hohem Durchsatz

Varian bietet nun mit den TOP-Kartuschen

(Trityl-on oligonukletide purification) ein modulares

System für die effiziente Aufreinigung

von DMTr-Oligonukleotiden aus Syntheseansätzen

mittels Festphasenextraktion

an (Abb. 1). Im Gegensatz zu herkömmlichen

Festphasenkartuschen oder -Mikrotiterplatten,

ist das TOP-VersaPlate-System

so flexibel, daß es sowohl für die Reinigung

einer einzigen Probe als auch zum gleichzeitigen

Reinigen von bis zu 96 Proben verwendet

werden kann. Kennzeichen dieses neuen

Kartuschensystems sind:

ein modular aufgebautes 96-Well-Mikrotiterplattensystem

(VersaPlate) für hohen

Probendurchsatz, das aus einer Basisplatte

und einzelnen, gebrauchsfertigen Säulchen

besteht,

geeignet für manuelles Arbeiten mit Multi-

Channel-Pipetten und kompatibel mit automatisch

arbeitenden High-Throughput-

Pipettierrobotern,

kein Vakuum oder Druck,

mit hydrostatischem Druck wird ein gleichmäßiger

Fluß erreicht,

ein funktionalisiertes, pH-stabiles Polystyrol-Divinylbenzol-Polymer

als stationäre

Phase, das selbst die Aufgabe von ammoniakhaltigen

Probenlösungen ermöglicht,

Mehrfachaufgabe der Probe ist nicht notwendig,

weil bei einmaliger Probenauftragung

schon ausreichende Bindung der

Oligonukleotide erzielt wird,

das Polymer erlaubt eine einfache Probenreinigung

mit optimierten, gebrauchsfertigen

Puffern, die Bindung und Elution

erleichtern,

geringer Lösemittelbedarf beim Eluieren

– dadurch Zeitgewinn beim Lyophilisieren

und Kostenersparnis bei Be- und Entsorgung

von Lösemitteln,

Acetonitrilanteil im Eluenten beträgt 50 %

– damit wird Zeit beim Eindampfen im

Vergleich zu herkömmlichen Sorbentien

gespart,

geeignet für das Clean-up synthetisch hergestellter

Oligonukleotide mit einer Länge

von 15 bis 50 Nukleotiden,

mengenoptimierte Reinigung von Oligonukleotiden

(50 bzw. 200 nmol im Tritylon-Modus)

durch Verwendung von 25-

und 50 mg-Kartuschen.

Durchführung und Mechanismus

der Reinigung

Der Festphasenextraktion mittels TOP liegt

das Prinzip der Reversed phase-Chromatographie

zugrunde. Durch die DMTr-Schutzgruppe

in der 5‘-Position sind die Oligonukleotide

hydrophob, so daß sie selektiv an

der stationären Phase gebunden werden. Im

Gegensatz dazu werden kürzere „Falschsequenzen“,

die im Herstellungsprozeß anfallen

und keine DMTr-Gruppen tragen, nicht

fest gebunden. Diese können durch Spülen

mit einer geeigneten Waschlösung von dem

Sorbens entfernt werden. Auf der Säule findet

dann eine Detritylierung mit Trifluoressigsäurelösung

(TFA) statt, um die säurelabile

DMTr-Gruppen abzuspalten. Die Elution

der Oligonukleotide erfolgt mit einem

wäßrig-organischem Elutionslösemittel. Insbesondere

für eine automatisierte Probenvorbereitung

ist es wichtig, daß ohne Vakuum

gearbeitet wird.

Eine Zusammenfassung der Arbeitsschritte

findet sich in der Übersicht 2 (Tab. 2).

Die Probenvorbehandlung mit dem Bindungspuffer

hat zum Ziel, eine optimale

Bindung der DMTr-Oligonukleotide an der

stationären Phase zu erzielen. Dafür ist vor

allem die Erhöhung der Ionenstärke durch

Zumischen des Bindungspuffers zur Probe

verantwortlich.

Die Konditionierung der polymeren Festphase

erfolgt zunächst mit Acetonitril. Diese

Solvatation ermöglicht eine innige Wechsel-

Kennziffer 18 LW 04/www.biocom.de Info

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Abb. 2: Vollständige

Retention des DMTr-

Oligonukleotids nach

einmaliger Probenaufgabe

auf eine TOP-

Kartusche

wirkung zwischen Analyt und Sorbens und

bewirkt somit eine optimale Bindung der

DMTr-Oligonukleotide. Zudem wird das

Quellverhalten des Sorbens so beeinflußt,

daß hydrostatischer Druck genügt, um einen

gleichmäßigen, reproduzierbaren Probendurchlauf

zu erzeugen. Nachfolgendes

Spülen mit TEAA-Lösung sorgt dafür, daß

überschüssiges organisches Lösemittel entfernt

wird.

Bei der Probenaufgabe werden sowohl

DMTr-Oligonukleotide als auch DMTr-freie

„Fehlsequenzen“ gebunden; Salze und β-

Cyanoethylgruppen werden direkt von der

Säule gespült. Somit ist eine erste Reinigung

gegeben. Eine Mehrfachaufgabe der Probenlösung

– wie häufig bei anderen Sorbentien

notwendig – ist nicht erforderlich. Abbildung

2 zeigt, daß DMTr-Oligonukleotide

vollständig bei einer einmaligen Probenauftragung

gebunden werden. Die Analyse

wurde mittels HPLC durchgeführt.

Mittels einer Spüllösung von 10 % Acetonitril

in 0,1 mol/L TEAA-Lösung ist es möglich,

die schwach gebundenen „Fehlsequenzen“

ohne hydrophobe DMTr-Schutzgrup-

Tabelle 2: Reinigungsschritte

pen von der Säule zu waschen. DMTr-Oligonukleotide

werden unter diesen Bedingungen

nicht von der Säule eluiert. Höchste

Ausbeuten bei einer Reinheit von mehr als

90 % werden bei einem Anteil von 10 %

Acetonitril erhalten. Um längere Oligonukleotidketten

(> 40 Nukleotide) effektiv zu

reinigen, sollte der Acetonitrilgehalt in der

Waschlösung 20 % betragen.

Das Entfernen der DMTr-Schutzgruppen geschieht

durch Aufgabe von 2 %iger Trifluoressigsäurelösung;

überschüssige Säure wird

durch Nachwaschen mit 100 mmol/L TEAA-

Lösung und Wasser entfernt. Dabei sollte

für die Detritylierung eine Wartezeit von

fünf Minuten eingeplant werden. Unter den

hier beschriebenen Bedingungen werden die

abgespaltenen Dimethoxytrityl-Gruppen

nicht von der Säule eluiert.

Zur Elution wird eine 96-well-Sammelplatte

verwendet. Die Elution des gereinigten Oligonukleotids

geschieht mit 500 µL einer 1:1-

Lösemittelmischung von Acetonitril/Wasser.

Nach der Elution können die Eluate nun

weiter bearbeitet, zum Beispiel lyophilisiert

werden.

Schritt Verwendete Lösung Eingesetzes Volumen

Probenvorbehandlung Probe 1:1 mit Bindungspuffer Bis zu 1 mL/Kartusche

(5 % N,N-Dimethylformamid in

100 mg/mL NaCl) mischen

Konditionierung der 100 % Acetonitril 500 µL

Kartusche 100 mM TEAA (Triethylamin/ 500 µL

Eisessig); pH 7,0

Probenaufgabe Vorbehandelte Probe Bis zu 2 mL in 1 mL-Aliquoten

Reinigung 10 % Acetonitril in 100 mM TEAA 1 mL

Detritylierung Frisch angesetzte 2 % Trifluor- 1 mL

essigsäure-Lösung (TFA)

Spülschritt 1 100 mM TEAA; pH 7,0 1 mL

Spülschritt 2 Wasser 1 mL

Elution 50:50 Acetonitril/Wasser 500 µL

Zusammenfassung

TOP-Kartuschen bieten eine geeignete Möglichkeit,

DMTr-Oligonukleotide direkt nach

der Festphasensynthese zu reinigen. Es konnte

gezeigt werden, daß selbst bei manuellem

Arbeiten 96 Proben in 45 Minuten gereinigt

werden können und damit ein hoher Probendurchsatz

pro Tag möglich ist. Dieser

kann bei Verwendung hocheffizienter Robotsystemen

bei mehr als 1.000 Proben pro

Tag liegen. Im Vergleich zu anderen Reinigungsphasen

bestehen hier wesentliche Vorteile

darin, daß die ammoniakalischen Probenlösungen

direkt auf die Kartusche aufgetragen

werden können, und eine Einfachaufgabe

genügt, um optimale Retention der

Analyten zu erreichen. Bedienungsfreundlich

wirkt sich zudem aus, daß sämtliche

Extraktionsschritte ohne Anwendung von

Vakuum oder Druck durchgeführt werden.

Die 96-well-Basisplatte des Kartuschensystems

(VersaPlate) ist wiederverwendbar –

das spart Kosten und reduziert Abfall. Starterkits,

welche die Reinigung von Synthesemengen

im 5 bis 50 nmol- und 200 nmol-

Maßstab abdecken, erlauben, direkten Zugang

in diese wirtschaftliche Reinigungstechnik

zu finden.

Literatur

[1] D. Voet, J.G. Voet, Biochemie, VCH Weinheim,

1994, 841-843

[2] BioSolutions TOP User-Guide und TOP-Broschüre,

Varian Inc., 2001

Korrespondenzadresse

Dr. Elisabeth Korte-Mcllwrick

VARIAN Deutschland GmbH

Alsfelder Straße 6

64289 Darmstadt

Tel.: 06151-703-273

Fax: 06151-703-328

eMail: elisabeth.korte@varianinc.com

18 | Nr. IV/2001 |transkript LABORWELT


L A B O R T R E N D

Proteomics

Steigender Bedarf an besseren

„Up-Stream-Technologien”

DR. STEFAN MÜLLNER, HENKEL KGAA, DÜSSELDORF, PHENION GMBH, FRANKFURT/M.

Neue Begriffe und neue Technologien aus der

Biotechnologie, die in der Regel mit

-omics oder -chip enden, bestimmen derzeit

das Interesse der Medien und Investoren. Diese

in der Regel stark interdisziplinär geprägten

Arbeitsgebiete bestimmen mittlerweile den

Takt von Forschung und Entwicklung im Life-

Science-Bereich.

Dabei verlief die durch die großen öffentlichen

und kommerziellen Genomics-Projekte enorm

stimulierte Fortentwicklung und stetige Optimierung

klassischer Trennmethoden für Biomoleküle,

insbesondere der Elektrophorese und

Chromatographie, zunächst fast unbemerkt.

Dazu kommt, daß sich die möglichen Einsatzgebiete

konkretisiert und relativiert haben.

Wurde etwa der Kapillarelektrophorese

(HPCE) ein geradezu unbegrenztes Potential

für die schnelle und ressourcensparende Analyse

aller biologischer Fragestellungen zugeschrieben,

so hat sie sich heute zur Standardmethode

für die DNA-Sequenzanalyse entwickelt.

Und ohne Übertreibung läßt sich rückblickend

feststellen, daß die vollständige Sequenzierung

des Humangenoms in diesem

Zeitraum und mit dieser Präzision nur durch

HPCE möglich war. Erfolgreiche Anwendungsbeispiele

der HPCE aus Protein- und

Peptidanalytik sowie bei der Untersuchung

von Protein-Protein-Wechselwirkungen, bei

denen klar eine Überlegenheit gegenüber anderen

Technologien gezeigt werden konnte,

gibt es eher wenige oder sind lediglich von

akademischer Bedeutung.

Proteomics auf dem Vormarsch

Seitdem die DNA-Sequenz innerhalb des Human-Genomprojektes

ermittelt wurde, rücken

die Proteine immer stärker in den Mittelpunkt

der Forschungsaktivitäten. Proteine sind nicht

nur für nahezu alle Lebensfunktionen verantwortlich,

sondern zeichnen sich durch eine außerordentliche

Varianz ihrer chemischen und

physikalischen Eigenschaften aus. Die Arbeit

mit diesen Biopolymeren wird zudem dadurch

erschwert, daß für Proteine, im Gegensatz zu

DNA und RNA, keine „PCR-analoge”-Methode

zur Verfügung steht, um sie in beliebiger

Menge zellfrei zu vervielfältigen. Zellproteine

liegen lediglich in ihrer funktionellen Konzentration

vor, das heißt, jede Zelle enthält nur

jeweils die Anzahl von Kopien eines einzelnen

Proteins, wie für die Erfüllung der Funktion in

der Zelle erforderlich ist. Der Nachweis sehr

geringer Konzentrationen an relevanten Zellproteinen

(low abundance proteins) wie etwa

Transkriptionsfaktoren, neben Strukturproteinen

(high abundance proteins) wie Aktin, stellt

derzeit ein (noch) unlösbares Problem dar.

Dieser „Dynamic Range” der Proteine ist daher

derzeit die größte Herausforderung für

den Bioanalytiker und die Gerätehersteller.

Sicherlich bieten hier die Entwicklungen in

der Nano(bio)technologie neue Chancen für

innovative Problemlösungen. Während bei

allen bisherigen analytischen Verfahren der

erste Schritt immer die Homogenisierung der

jeweiligen biologische Matrix bzw. die vollständige

Zerstörung der gegebenen Gewebeoder

Zellstruktur war, müssen in Zukunft

Methoden, Technologien und Meßverfahren

bereitgestellt werden, um Transportmessungen

an/in Einzelzellen vorzunehmen oder die

zelluläre Kompartimentierung von Proteinen

zu verfolgen und zu dokumentieren.

Neue und „alte“ Technologien

Bei der Entwicklung und Ausarbeitung dieser

Verfahren wird die moderne Massenspektrometrie

die Schlüsselrolle weiter ausbauen, die

sie seit den vergangenen sechs Jahren im Bereich

der Proteinanalytik inne hat. Aber auch

die AFM (atomic force microscopy) wird an

Bedeutung zunehmen.

Mehr Informationen ordern Kennziffer 19 LW 04 oder www.biocom.de

In den letzten Jahren haben die Entwicklungen,

Anwendungsbeispiele und Investitionen

in „Down Stream Technologies”, insbesondere

Identifizierung von gereinigten Proteinspezies

mit Massenspektrometrie und Bioinformatik,

dominiert. Es wird daher höchste Zeit

für die Bereitstellung von neuen „Up-Stream-

Technologies”, so etwa im Bereich der artefaktfreien

(proteolysearmen) und verlustfreien

Probenvorbereitung, die zudem Automatisierungspotential

besitzen müssen.

Proteine liegen in der Zelle immer im Verbund

oder in direktem Kontakt mit anderen Proteinen

und Biomolekülen vor. Die Trennung von

Protein-Komplexen und Organellen nach einem

Zellaufschluß erfolgt seit jeher mit Hilfe

der Zentrifugation anhand der unterschiedlichen

Dichte. Andere Verfahren wie diverse

Fällungsverfahren, Immunpräzipitation, Chromatofokussierung,

Blue-Native-Elektrophorese,

selektive Solubilisierung und die Fraktionierung

mit Free-Flow-Elektrophorese haben

sich in einigen Teilbereichen stabil etablieren

können, sind aber kaum universell einsetzbar

und bieten lediglich geringe Möglichkeiten

zur Vernetzung mit anderen Verfahren und

der Automatisierung.

Chromatographische Trennverfahren sind

dagegen besonders gut automatisierbar und

leicht mit anderen Meß- und Analyseverfahren

zu koppeln. Problematisch war bislang der

verfügbare Trennraum – die maximale Anzahl

an Einzelkomponenten, welche sich in

einem Schritt trennen lassen –, Substanzverluste

durch Adsorbtion am Säulenmaterial und

das zeitintensive, weil sequenzielle Trennverfahren.

Mit dem Chromolith TM -Säulenmaterial

bringt die Merck KgaA eine eindrucksvolle

Innovation auf den Markt. Das monolithische

Silica-Material erlaubt nicht nur deutlich

schnelle Analysen, sondern arbeitet offenbar

weitgehend verlustfrei. Dies ist conditio sine

qua non für den Einsatz in automatisierten

Probenvorbereitungsprotokollen, kombinierten

chromatographischen Anreicherungs- und

Trennverfahren (hyphenated technologies)

und multiparallelen Analysen.

Durch intensive Evaluierung dieses neuen

Säulenmaterials, könnte sich die RP-Chromatographie

wieder als Innovationsmotor der

Proteinanalytik zurückmelden.

Korrespondenzadresse

Dr. Stefan Müllner

Henkel KGaA. Düsseldorf

eMail: Stefan.Muellner@denotes.henkel.de

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|transkript LABORWELT Nr. IV/2001 | 19


B L I T Z L I C H T

Zellseparation

„Sampling-Error“ als mögliche Fehlerquelle

in der diagnostischen Molekularpathologie –

Bedeutung der Laser-Mikrosektion

DR. BIRGIT RENKE, KLINIKUM KASSEL

LEICA MIKROSYSTEME VERTRIEB GMBH, BENSHEIM

„Sampling errors“ sind eine häufige Quelle falsch-positiver oder falsch-negativer Ergebnisse in der

diagnostischen Molekularpathologie. Bei Gewebeproben empfiehlt es sich, molekularbiologische

Daten nur zu nutzen, wenn die Menge des Gewebes, die Methode der Gewebeaufarbeitung und die

Pathomorphologie des Gewebes miteinbezogen werden. Denn es ist für die Diagnostik und für

Therapieentscheidungen essentiell, die molekularen Daten im Zusammenhang mit histomorphologischen

und klinischen Daten zu betrachten, um falsch-positive und falsch-negative Diagnosen

verhindern zu können und damit einen hohen Qualitätsstandard in der Molekularpathologie zu

sichern.

Ausdruck eines neoplastischen Wachstums

sein und wird bei Neubildungen des lymphatischen

Systems als ein mögliches Malignitätskriterium

herangezogen. So ergeben

die PCR-Produkte aus dem Bereich der Immunglobulingene

bei reaktiv vermehrten

lymphatischen Zellen, wie im Rahmen von

Infektionen, auf dem Gel keine unterscheidbaren

Banden, sondern ineinander verlaufende,

multiple Banden („Schmierstreifen“).

Bei neoplastischen, malignen lymphatischen

Neubildungen zeigt sich im typischen Fall

nur eine Bande, da alle Zellen von einem Klon

abstammen (Monoklonalität).

Molekulardiagnostische Tests sind in der

Klinischen Medizin heute weitverbreitet.

Dabei nehmen die PCR-Techniken (Polymerase-Ketten-Reaktion)

eine zentrale Rolle

ein. Bei dieser Art der Analyse von Gewebeproben

können falsch-positive oder falschnegative

Resultate auftreten, wenn die Pa-

Abb. 1: Gewebeschnitte. A. Illeum-Biopsie mit

hyperplastischen Lymphfollikeln. B. Rektales

Adenom mit einem fokalen Karzinom eines

HNPCC-Patienten (HNPCC=hereditary nonpolyposis

colrectal carcinoma), C. Rektales

Adenom. Die geschlossenen Pfeile weisen auf

diagnostische Krypten, die offenen auf dissezierte

Normalkrypten.

A

B

C

thomorphologie (Abb. 1) oder besondere

Aspekte der Gewebeaufarbeitung nicht beachtet

werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß

der Gewebeentnahme auf drei Standarduntersuchungen

in der molekularen

Diagnostik untersucht:

1. Bestimmung der Monoklonalität

bei B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen,

2. Analyse der Mikrosatelliten-Instabilität

(MSI) bei kolorektalen Neoplasien und

3. Nachweis von Mycobacterium tuberculosis.

Der Einfluß der Gewebeentnahme auf das

PCR-Ergebnis wurde systematisch geprüft:

Von Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten

Gewebeproben wurden 5 µm-dicke

histologische Gewebeschnitte angefertigt.

Die diagnostische PCR-Probe wurde entweder

mittels Laser-Mikrosektion oder ohne

besondere Sektion (manuell) gewonnen.

Die Laser-Mikrosektion bietet gegenüber der

manuellen Sektion den Vorteil einer weit

höheren Präzision. Mittels Laser-Mikrosektion

ist es möglich, gezielt Einzelzellen einer

weiteren PCR-Analyse zuzuführen. So ist

beispielsweise ein präzises Ausschneiden

von Tumorzellen von großer Bedeutung, da

jeder Eintrag unerwünschten DNA-Materials

während der PCR amplifiziert wird und

damit das Ergebnis verfälschen kann.

In der diagnostischen Molekularpathologie

ist der „sampling error“ eine Fehlerquelle für

falsch-positive oder falsch-negative Resultate.

Dies gilt insbesondere, wenn gewebespezifische

morphologische Eigenschaften wie

Probengröße, Fixierungszustand und die Heterogenität

der Läsion unbeachtet bleiben.

Monoklonalitätsuntersuchungen

Falsch-positive Monoklonalität

bei kleinen Biopsien des Dünndarms

Monoklonalität, also das Hervorgehen einer

Zellpopulation aus einer Stammzelle, kann

Abb. 2: Untersuchungen zur Monoklonalität

von B-Zellen. ST=Standard, PC=polyklonale

Kontrolle, MC= monoklonale Kontrolle

Es wurden B-Zell-Monoklonalitätsuntersuchungen

an verschiedenen Dünndarm-Biopsien

mit reaktiv hyperplastischen Lymphfollikeln

(Abb. 1A) durchgeführt. Die Gele (Abb

2.) zeigen, daß die meisten PCR-Produkte

oligoklonal (wenige Banden) waren, einige

sogar monoklonal (eine Bande). Kein Patient

litt jedoch unter einem malignen Lymphom.

Die Ergebnisse wurden somit als falsch-positiv

gewertet, das heißt als „pseudo-monoklonal“.

Analyse der MSI

bei kolorektalen Neoplasien

Falsch negative PCR-Ergebnisse

Ein falsch-negatives PCR-Ergebnis wurde bei

der MSI-Analyse eines erblichen rektalen

Adenoms mit einem fokalen Karzinom (Abb.

1B) erhalten, das schon metastasiert war. Zuerst

wurde der gesamte obige Schnitt der

Mikrosatelliten-Analyse unterzogen. Obwohl

das hochsensitive ABI-Gene-Scan-System

Kennziffer 20 LW 04/www.biocom.de Info

20 | Nr. IV/2001 |transkript LABORWELT


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B L I T Z L I C H T

Abb. 3: ABI-Gene-Scan-Analyse.

schwarz=APC, grün=Mfd15, blau=BAT25

(Fragmentanalyse mittels Fluoreszenzmarkierung,

DNA-Fragmentlänge (Bande) bis auf

Basenpaar bestimmbar, Abb. 3) verwendet

wurde, war keine eindeutige Mikrosatelliteninstabilität

festzustellen. Von zehn untersuchten

Loci zeigte nur einer (BAT25) eine

Bandenverschiebung, der jedoch noch keine

diagnostische Aussagekraft besitzt. Das Problem

hierbei ist die Heterogenität der Probe

bei der manuellen Sektion. Um festzustellen,

ob eine andere Diagnose getroffen werden

kann, wenn die zelluläre Heterogenität der

Läsion berücksichtigt wird, wurde der Tumor

lasermikroseziert. Dazu wurden 50 bis

200 Zellen ganz unterschiedlicher Lokalisierung

entnommen, die unterschiedliche Dysplasiegrade

aufwiesen.

Seziert wurden sowohl normale als auch verschieden

dysplastische Gewebeareale (niedriggradig,

mittelgradig und hochgradig). Eine

Silbergelanalyse zeigte auffällige Bandenverschiebung

im Vergleich zum Normalgewebe

(Abb. 4). Dies zeigt deutlich, daß sich durch

die Beachtung der zellulären Heterogenität

mit Hilfe der Laser-Mikrosektion die Sensitivität

eines molekularen Tests deutlich erhöhen

läßt. Ebenso wurde in einem anderen

Experiment ein mikrosatelliteninstabiles erbliches

Rektumadenom (Abb. 1C) als solches

erst nach Laser-Mikrodissektion erkannt.

Nachweis von

Mycobacterium tuberculosis

Falsch-negative PCR-Ergebnisse

Falsch negative PCR-Ergebnisse wurden in

einem Fall von Lymphknotentuberkulose

erhalten. Proben mit verkäsender granulomatöser

Lymphadenitis wurden verschiedenen

Gewebeaufarbeitungsprozeduren

unterzogen. Ein einzelner Lymphknoten

wurde zweigeteilt, wobei die eine Hälfte

tiefgefroren und die andere formalinfixiert

wurde. Klare eindeutige Banden, die spezifisch

für den Mycobakterium-Komplex waren,

konnten amplifiziert werden (Abb. 5),

die DNA wurde mittels Laser-Mikrosektion

aus einzelnen Schnitten des Frischgewebes

erhalten. Bei dem Formalin-fixierten

und Paraffin-eingebetteten Gewebe wurden

nur eindeutige Banden erhalten, wenn

DNA aus der gesamten Lymphknoten-Hälfte

extrahiert wurde. Bei der Untersuchung

einzelner, 5 µm-dicker Gewebeschnitte, ergaben

sich jedoch keine eindeutigen diagnostischen

PCR-Produkte.

Dies unterstreicht, daß speziell beim Nachweis

von Mycobacterium tuberculosis die für

die PCR eingesetzte Gewebemenge und deren

Qualität (Fixierung) eine wichtige Rolle

spielen.

Korrespondenzadressen

Dr. Birgit Renke

Klinikum Kassel

Tel.: 0561-9803209

eMail: renke@klinikum-kassel.de

Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH

Lilienthalstraße 39-45

D-64625 Bensheim

Tel.: 06251-136 0

Fax: 06251-136 155

eMail: vertrieb.bensheim@leicamicrosystems.com

ST 1 2 3 4 5 6 H 2

0

Abb. 5: TBC-Untersuchung eines Lymphknotens;

ST=Standard; 1,2 PCR von Frischgewebe-Schnitten;

5,6 PCR der Hälfte des

Paraffin-eingebetteten Lymphknotens

Glossar

Neoplasie = Echter Tumor aus körpereigenen

Zellen mit irreversiblem unkontrolliertem

Wachstum

Hyperplasie = Massenzunahme eines Gewebes

oder Organs durch reversible Zellvermehrung

Dysplasie = Schleimhautmetaplasie als Vorstadium

eines zur Aussaat im Körper

fähigen Karzinoms

Adenom = Gutartiger von drüsenbildendem

Epithel ausgehender Tumor

Fokales Karzinom = Umschriebene, örtlich

zerstörend wachsende und zur Aussaat

fähige bösartige Neoplasie.

Malignes Lymphom = Bösartige Erkrankung

(Neoplasie) des lympathischen Systems

kolorektal = auf Enddarm und Dickdarm

bezogen

Mikrosatelliteninstabilität = Genomische

Instabilität, bedingt durch Replikationsfehler

während der Tumorgenese

Abb. 4: Silbergel (A): APC.

B: MYCL;

N = Normalgewebe, D3 =

hochgradig dysplastisch,

D2 = mittelgradig

dysplatisch,

M = Metastase

© alle Abbildungen: Virchows Archiv, Vol. 439 No. 4,

Mit freundlicher Genehmigung des Springer-Verlags.

22 | Nr. IV/2001 |transkript LABORWELT


R E P O R T

Zellkonzentration

Tumorzell-Analyse mit kombinierter

Magnetanreicherung, Laser-Scanning-

Zytometrie und visueller Kontrolle

KATHARINA PACHMANN 1,2 , SVEN LYCHATZ 3 , GRIT OBLONCZEK 3 , BABETTE WILLEN 2

1

KLINIK FÜR INNERE MEDIZIN II DER FRIEDRICH-SCHILLER-UNIVERSITÄT JENA, 2 LABOR FÜR SPEZIELLE

IMMUNHÄMATOLOGIE UND GENDIAGNOSTIK, BAYREUTH, UND 3 LABSOFT DIAGNOSTICS AG, HALLE

MAINTRAC-Analyse zum Nachweis minimaler

Zahlen zirkulierender Tumorzellen

Abb. 1: Flußdiagramm zur Anreicherung und

Analyse zirkulierender Epithelantigen-positiver

Zellen

EDTA Blut

Magnetantikörper

Fluoreszenzantikörper

Erythrozytenlyse

Magnet

Abb. 2: Schematische Darstellung der

magnetischen Anreicherung

Magnet

magnetgebundene Zellen

auf Objektträger

Solide Tumoren, wie Bronchial- und Kolonkarzinome

und bei Frauen das Mammakarzinom,

sind nach Herz-Kreislauferkrankungen

die häufigste Todesursache in den Ländern

der westlichen Welt. Initialtherapie

der Wahl ist die chirurgische Entfernung

des Primärtumors, um möglichst viele Tumorzellen

aus dem Körper zu entfernen. In

der Praxis kann damit jedoch nur selten

eine Heilung erzielt werden. Letztlich lebensbedrohlich

sind hämatogene Absiedelungen

in verschiedene Organe, die schließlich

zum Versagen dieser Organe und zum

Tod führen. Ausgang für diese Metastasen

sind disseminierte Tumorzellen, die aus dem

Tumor ausgeschwemmt worden sind.

Deswegen wurde – in erster Linie beim Mammakarzinom

– die adjuvante Chemotherapie

etabliert. Ziel dieser Chemotherapie ist es,

bereits zirkulierende Tumorzellen zu eliminieren,

bevor sie sich als Metastasen absiedeln

können. Jedoch gab es bislang kein Verfahren,

um das Ansprechen der zirkulierenden

Tumorzellen auf diese Therapie direkt

zu überprüfen. Nur eine verringerte Rezidivrate,

die beim Mammakarzinom erst nach

mehreren Jahren objektivierbar ist, konnte

bisher als statistisches Maß für den Therapieerfolg

herangezogen werden. Für die einzelne

Patientin gibt es keine Möglichkeit zeitnah

zu kontrollieren, ob bei ihr die entsprechende

Therapie erfolgreich eingesetzt wird.

Über die Zahl und die Eigenschaften zirkulierender

Tumorzellen ist bisher sehr wenig

bekannt. Schon vor über 100 Jahren ging man

davon aus, daß solche Zellen vorhanden sein

müßten, durch ihre geringe Zahl entzogen

sie sich aber einem sicheren Nachweis.

Fortschritte wurden durch den Einsatz immunologischer

Nachweisverfahren erzielt 1 .

So konnte in den letzten Jahren vor allem

gezeigt werden, daß eine Korrelation besteht

zwischen den im Knochenmark nachgewiesenen

Zellen mit epithelialen Oberflächenmarkern

und der Metastasierungsrate 2 . Diese

Methoden sind aber sehr zeitaufwendig,

da große Zahlen normaler Blut- oder Knochenmarkszellen

gescreent werden müssen,

um einzelne nicht dem Blutkompartiment

zugehörige Zellen aufzufinden. Ein weiterer

Ansatz, zirkulierende Tumorzellen nachzuweisen,

ist die Anwendung der Durchflußzytophotometrie.

Diese Methode erlaubt es,

in kürzester Zeit zehntausende von Zellen

durchzumessen. Die Sensitivität der Durchflußzytometrie

liegt aber ohne zusätzliche

Sortierschritte im Bereich von einer Tumorzelle

pro 1.000 normalen Blutzellen.

Durch den Einsatz von immunmagnetischen

Anreicherungsverfahren und Immunmikrofluorimetrie

konnte die Nachweisempfindlichkeit

für im Blut zirkulierende epitheliale

Zellen erhöht und dahingehend weiterentwickelt

werden, daß ein qualitativer und

Tabelle 1: Vorteile der Methode

Anreicherung der gewünschten Zellen

bis zur Nachweisbarkeit

Minimaler Zellverlust

nur lebende Zellen gehen in die

Analyse ein

Auswertung automatisch

(beobachterunabhängig)

quantitativ (Zahl und Intensität

werden bestimmt)

Relokalisation: Visualisierung,

Reanalyse

quantitativer Nachweis tumorverdächtiger

Zellen möglich wird 3 .

Die tumorverdächtigen Zellen werden automatisch

und vom Untersuchenden unabhängig

erfaßt. Sie können einzeln wiederaufgesucht,

visuell verifiziert und, falls erforderlich,

mit weiteren Analyseverfahren bearbeitet

werden.

Anreicherung der

tumorverdächtigen Zellen

Die Anreicherung der disseminierten Tumorzellen

– bei soliden Tumoren meist Zellen

epithelialen Ursprungs – erfolgte über

funktionalisierte Magnet-Partikel (Labsoft

Diagnostics AG Halle) mit Hilfe von Antikörpern,

die gegen epitheliale Antigene (vor

allem gegen ein Epitop des EpCAM-Moleküls

auf der Zelloberfläche) gerichtet sind.

Für die Untersuchung werden 20 ml antikoaguliertes

Blut benötigt (Abb. 1), bei der Untersuchung

des Knochenmarkes etwa 5 ml

Aspirat in Ringer-Lösung verdünnt. Alle Proben

sollten spätestens 36 Stunden nach Entnahme

analysiert werden. Die Erythrozyten

wurden lysiert und die weißen Blutzellen

einschließlich der Tumorzellen durch Zentrifugieren

sedimentiert. Die Viabilität der Zellen

zu diesem Zeitpunkt lag zwischen 95 und

100%. Die Zellsuspension wurde mit den entsprechenden

Magnetpartikeln und einem

spezifischen fluorochrommarkierten Antikörper

inkubiert. Danach wurden die Zellen, an

die sich die Magnetpartikel gebunden hatten,

mit einem Magneten an die Wand des Röhrchens

gezogen, so daß die übrige von epithelialen

Zellen depletierte Zellsuspension entweder

abgegossen oder abpipettiert werden

kann (Abb. 2). Um möglichst wenige spezifisch

markierte Zellen zu verlieren, wurde

der Anreicherungsschritt nur einmal durchgeführt.

Eine wiederholte Anreicherung würde

zwar zu einer höheren Reinheit, zugleich

aber auch zu Zellverlust führen.

Nachweis der

tumorverdächtigen Zellen

Der Nachweis der Zellen erfolgte über den

fluorochrommarkierten Antikörper an

|transkript LABORWELT Nr. IV/2001 | 23


R E P O R T

Abb. 3: A. Verteilung der Zellen nach Anreicherung

und Aufbringen, links: mit den x- und

y-Koordinaten auf einem Objektträger, rechts:

deren maximale Fluoreszenzintensität in der

Grünfluoreszenz. Das blaue Fenster umfaßt

alle Zellen (Region 1), das rote Fenster Zellen

mit intermediärer Fluoreszenz, die nicht sichtbar

ist, und das grüne Fenster die eindeutig

positiven Zellen (Region 2).

Abb. 3 B. Relokalisierung einzelner Zellen. Der

Scanningtisch fährt nacheinander die einzelnen

Ereignisse im gewählten Fenster an. Die

Position jeder Zelle auf der x- und y-Achse

wird im linken Diagramm angezeigt, die Intensität

jeder Zelle in der Punktwolke wird durch

einen Kreis angegeben.

Abb. 4: Morphologie (links) und im Fluoreszenzbild

(rechts) die kappenförmige

Oberflächenmarkierung der in der Abbildung

3 angefahrenen Zelle

nichtfixierten, lebenden Zellen. Dies vermindert

unspezifische Bindungen, wie sie beim

Nachweis intrazellulärer Antigene nicht selten

sind, und stellt gleichzeitig sicher, daß

nur die relevanten, lebenden Zellen in die

Analyse einbezogen werden. Die spezifisch

gesuchten Zellen sind nun zwar höher konzentriert,

jedoch immer noch in nur in einem

Anteil von 1 bis 0,1% vorhanden. Bei diesen

niedrigen Zahlen ist es wichtig, daß jede einzelne

Zelle verifiziert wird. Dies geschieht

durch automatisierte Auswertung im Laser-

Scanning-Cytometer (LSC ® ) (CompuCyte,

Cambridge, Mass.). Die Vorteile dieses Vorgehens

sind in Tabelle 1 aufgelistet. Ein Laserstrahl

tastet das Präparat ab und erkennt

über Vorwärtsstreulicht die Zellen. Über jede

Zelle wird punktförmig über Areale von

0,5µm die Intensität gemessen und als Pixel

gespeichert (ca. 200 Messungen pro Zelle).

Beispielhaft sind die Ergebnisse einer solchen

Auswertung in Abbildung 3a dargestellt.

Jeder weiße Punkt im x-y-Koordinatensystem

repräsentiert eine Zelle. Die Intensitätsverteilung

ist in der rechten Punktwolke

dargestellt. Die Intensitätswerte können als

maximale Intensität oder als Integral der über

die Zelle gemessenen Intensität aufgelistet

werden. Dies ermöglicht eine vom Untersucher

unabhängige objektive Auswertung. Jede

Zelle mit einem bestimmten Intensitätswert

(beispielsweise die Zellen im grünen Fenster)

kann nun wiederaufgesucht werden, so daß

die Spezifität der Markierung und die Morphologie

der Zelle beurteilt werden können.

In Abbildung 3b ist gezeigt, wie der Scanningtisch

des LSC ® bis zu der Stelle vorrückt,

an der die eingekreiste Zelle im Präparat

liegt. Die in Abbildung 3b eingekreiste Zelle

ist in Abbildung 4 rechts einmal in der Fluoreszenzfärbung

mit der typischen kappenförmigen

Markierung abgebildet. Das Präparat

kann anschließend mit einer panoptischen

Färbung nachgefärbt werden und dieselbe

Zelle wiederaufgesucht werden (Abb. 4 links).

Klinischer Einsatz der Methode

Längsschnittanalysen der Zahlen zirkulierender

Epithelantigen-positiver Zellen bei Brustkrebspatientinnen

haben gezeigt, daß damit

unter adjuvanter Chemotherapie sehr gut

nachvollzogen werden kann, wie diese Zellen

mit einer Reduktion um zum Teil mehrere

Dekaden auf die Chemotherapie ansprechen

(Abb. 5). Bei einem nachgewiesenen soliden

Tumor ist davon auszugehen, daß die Mehrzahl

der zirkulierenden Epithelantigen-positiven

Zellen vom Tumor herrühren. Damit

scheint sich dieses Vorgehen für eine zeitnahe

Kontrolle des Therapieansprechens zu eignen.

Die Anreicherung und Reanalyse tumorverdächtiger

Zellen eröffnet neben der morphologischen

Begutachtung weitere Möglichkeiten

zur Charakterisierung dieser Zellen, von

denen die bei den Autoren bereits etablierten

in Tabelle 2 aufgelistet sind:

1. So können nach Färbung der Kerne mit

einem fluoreszierenden Kernfarbstoff (z.B.

Propidiumiodid) Zellzyklusanalysen selektiv

an den Epithelantigen-positiven Zellen

durchgeführt werden und damit das

Wachstumsverhalten dieser Zellen analysiert

werden.

2. Durch die Chemotherapie kommt es zur

Induktion von Apoptosewegen in den Zellen.

Es kann der Anteil der in Apoptose

befindlichen Zellen an den zirkulierenden

Zellen bestimmt werden und damit bereits

vor dem kompletten Absterben und Abräumen

der tumorverdächtigen Zellen der

Erfolg der Therapie in vivo frühzeitig festgestellt

werden.

3. Die körpereigene Immunantwort auf die

Tumorzellen kann in zweierlei Hinsicht

analysiert werden. Einerseits kann über

die Immunglobulinbeladung der Tumorzellen

die Effektivität und Stärke der B-

Zellantwort getestet werden. Des weiteren

sind bei den Patienten nicht selten Tumorzellen

mit rosettenförmig adhärierenden

T-Zellen zu finden. Inwieweit dies prognostisch

von Bedeutung ist, muß in weiteren

Untersuchungen geklärt werden.

4. Für die Planung des therapeutischen Vorgehens

ist der Nachweis der Her2/neu-

Überexpression in den Tumorzellen von

zunehmender Bedeutung. Diese wird bisher

noch am ursprünglichen Tumorgewebe

untersucht. Zielzellen der Therapie mit

dem Antikörper Herceptin werden aber

vor allem die zirkulierenden Tumorzellen

sein. Es kann bereits routinemäßig die Am-

Tab. 2: Reanalyse der lokalisierten Zellen

Untersuchung von:

Morphologie

Kernfärbung und Zellzyklusanalysen

Apoptose

Her2/neu-FISH

Abb. 5: Reduktion der Zahl zirkulierender tumorverdächtiger

Zellen bei sieben Patientinnen

unter adjuvanter Chemotherapie zum Teil

um mehr als zwei Dekaden.

plifikation des Her2/neu-Gens, das verantwortlich

für die Überexpression ist, an

den angereicherten Epithelantigen-positiven

Zellen durch FISH-Analyse (Fluoreszenz-in

situ-Hybridisierung) nachgewiesen

werden. Ein Beispiel für eine solche Analyse

ist in Abbildung 6 dargestellt. Links ist

mit Grünfilter die kappenförmige Grünfluoreszenz

für das Epithelantigen darge-

Kennziffer 21 LW 04/www.biocom.de Info

24 | Nr. IV/2001 |transkript LABORWELT


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:

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M A R K T Ü B E R S I C H T

Abb. 6: Eine Gruppe von Epithelantigen-positiven Zellen mit sehr starker

kappenförmiger Fluoreszenzmarkierung. Dieselbe Zellgruppe nach

Hybridisierung mit einer rotfluoreszierenden Sonde für das Her2/neu-

Gen zeigt pro Zelle zwischen 3 und über 20 Signale als Zeichen einer

Amplifikation des Her2/neu-Gens.

stellt, dieselben Zellen zeigen

mit Rotfilter (rechts) zwischen

drei und mehr als zwanzig

FISH-Signale für das Her2/

neu-Gen und damit eine Überexpression

in fast allen diesen

Zellen.

Ausblick

Erst mit einer Anreicherung seltener

Zellen in den Nachweisbereich

hinein und einem anschließenden

quantitativen Nachweisverfahren

kann die biologische

Relevanz unterschiedlicher Mengen

zirkulierender Tumorzellen

differenziert analysiert werden.

Die quantitative Analyse erlaubt

es, festzustellen, ob sich die Zahl

zirkulierender Tumorzellen unter

dem Einsatz von Zytostatika

ändert und ermöglicht damit erstmals

eine zeitnahe Erfolgskontrolle

der Chemotherapie in der

adjuvanten Situation, in der es

sonst keine andere Möglichkeit

gibt, das Therapieansprechen zu

kontrollieren. Im Rahmen der

neoadjuvanten Chemotherapie

kann überprüft werden, ob die

zirkulierenden Zellen im gleichen

Umfang wie der Primärtumor

ansprechen. Damit bietet sich

diese Methode als Werkzeug für

die Überwachung bei adjuvanten

und neoadjuvanten Chemotherapiestudien

an. In Zukunft

soll diese Analyse dem Patienten

unnötige oder in-effektive

Chemotherapien ersparen helfen.

Zusätzlich können die zirkulierenden

Tumorzellen selektiv auf

ihr Wachstumsverhalten mit Hilfe

von Zellzyklusanalysen untersucht

werden, ihre Absterberate

ist mit Apoptoseanalysen und

ihre Überexpression von Wachstumsgenen

mit Hilfe von Fluoreszenz-in

situ-Hybridisierung

analysierbar. Dies erlaubt es,

Tumorzellsubpopulationen zu

analysieren, die unterschiedlich

auf die Cytostase ansprechen,

und damit frühzeitig eine klonale

Selektion resistenter Zellen zu

erkennen und dieser therapeutisch

gegenzusteuern.

Danksagung

Für die kompetente technische

Hilfe sei Frau Dana Hüttig besonderer

Dank gesagt

Literatur

1. Pantel K, Felber E, Schlimok G. Detection

and characterization of residual

disease in breast cancer. J Hematother

1994; 3:315-322

2. Braun S, Hepp F, Sommer HL, Pantel

K. Tumour antigen heterogenity of disseminated

breast cancer cells: implications

for immunotherapy of minimal

residual disease. Int J Cancer 1999;

84:1-5

3. Pachmann K, Heiß P, Demel U, Tilz

G: Detection and quantification of

small numbers of circulating tumour

cells in peripheral blood using Laser

Scanning Cytometer (LSC ® ). Clin Chem

Lab Med 2001; 39:811-7

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. med. Katharina Pachmann

Abteilung für experimentelle

Hämatologie und Onkologie

Klinik für Innere Medizin II

Friedrich-Schiller-Universität Jena

Erlanger Allee 101, 07747 Jena

eMail: katharina.pachmann@med.

uni-jena.de

BECKMAN COULTER GMBH

Life Science Research

Siemensstr. 1, 85716 Unterschleißheim

Tel 089-35870-0, Fax: 089-35870-269

eMail: bioresearch.de@beckman.com

1 . Firmenanschrift/Ansprechpartner

BECKMAN COULTER GMB H

Life Science Research

Siemensstr. 1, 85716 Unterschleißheim

Tel 089-35870-0, Fax: 089-35870-269

eMail: bioresearch.de@beckman.com

2 . Gerätebezeichnung/Serie

T isch-Ultrazentrifuge Typ Optima Ma x

High-Performance-Zentrifuge Typ Avanti J-20XP I

7 3,7cm x 58,4cm x 58,4cm / 98kg

71,1 cm x 87,6cm x 86,5cm / 264k g

Gewicht

(kg)

des Systems

Höhe, cm)

Abmessungen

(Breite x Tiefe

3.

x

4 . Einsatzgebiet (Produktion/Forschung)

T isch-Ultrazentrifuge für biomedizinische Forschung, Routinediagnostik und Produktion im kleinen Maßsta b vielseitige und großvolumige Hochleistungs-Standzentrifug e

maximalen

für

verkürzter Beschleunigungs-/Verzögerungszeit

großvolumige Rotoren und DNA-Rotoren

gekühlte Hochleistungs-Standzentrifuge mit

Probendurchsatz, Einsatzmöglichkeit auch

größter Volumenbereich

maximierte Auflösung,

Tisch-Ultrazentrifuge,

minimierte Trennzeit,

und

Produktes/Systems

Kurzbeschreibung des

seiner Komponenten

5.

für

6 . Kühlung/Bereich ( ° C )

T hermo-elektrisches Kühlsystem ohne Kühlmittel, 0 ° C - 4 0 ° C - 1 0 ° C - 4 0 °C

1 30.000 rpm, 1.019.000 x g, minimaler k-Faktor ist k=7

26.000 rpm, 82.000 x g, minimaler k-Faktor ist k=9 1

(g)

Zentrifugalkraft

relative

(rpm)

Drehzahl

k-Faktor

7.

Rotoren

8.

für Festwinkel-, Near-Vertical- und Ausschwingrotoren,

Rotor-Sicherheitssystem, selbstgenerierendes Vakuumsystem

8 .1 Rotortyp(en)

insg.

16 verschiedene Festwinkel-, Vertikal-, Near-Vertical- und Ausschwingrotore n

insg. 30 verschiedene Festwinkel-, Ausschwing, Durchfluß- und Elutriationsrotore n

8 .2 Einsätze (Zahl/Vol.)

g roße Anzahl verschiedener Materialien und Adapter verfügbar, Quick-Seal-

und Opti-Seal-System verfügba r große Anzahl verschiedener Materialien und Adapter verfügba r

Liter

6

bis

1,5ml

von

Rotoren

8 .3 Beladung (min/max)

Festwinkelrotoren von 0,2ml bis 64ml, Ausschwingrotoren von 0,175ml-20ml, Near-Vertical-Rotoren 1,2m l

bis 64ml

beliebig

Anzahl

Verzögerungs-programme,

Beschleunigungs

PC-Software

25

durch

30 Anwender-Programme plus

erweiterbar durch Steuerung

9 . Programmsteuerung für …

10 Anwender-Programme plus 21 Beschleunigungs-/ Verzögerungsprogramme, optional Steuerung übe r

RS-232

1 0. Datendokumentation

I nformation auf Anfrag e

GMP/GLP-Software optional erhältlic h

1 1. Technische Daten

W ärmeabgabe < 0,6kW/Stunde, 220V-Anschlu ß

Wärmeabgabe < 2kW/Stunde, 220V und 380-Anschluß verfügba r

Wärmeabgabe, automatische Rotorerkennung,

großem Drehmoment, DNA-Rotoren verfügbar

der

mit

zur Minimierung

patentierter Antrieb

Friction-Reduction-System FRS

Rotor-Sicherheitsüberprüfung,

1 2. Extras/Besonderheiten

erste (und einzige!) Zentrifuge mit mehr als 1 Million x g, 10 Jahre Garantie auf Antrieb, wartungsfreie s

Vakuumsystem, Rotor-Sicherheitssystem

1 3. Preis (für eine typische Konfiguration) a uf Anfrag e

auf Anfrag e

26 | Nr. IV/2001 |transkript LABORWELT


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i

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Z E N T R I F U G A T I O N

1 . Firmenanschrift/Ansprechpartner

BBECKMAN COULTER GMB H

Life Science Research

Siemensstr. 1

85716 Unterschleißheim

Tel : 089-35870-0

Fax: 089-35870-269

eMail: bioresearch.de@beckman.com

Eppendorf

AG

Barkhausenweg

D-22339 Hamburg

1

Tel.: 040-53801-0, www.eppendorf.com

Dr. Clemens Blümel (Produktmanager Zentrifugen)

eMail: blümel.c@eppendorf.de

Dr. Thomas Uschkureit (Applikationsspezialist

Zentrifugen)

eMail: uschkureit.t@eppendorf.de

Eppendorf

AG

Barkhausenweg

D-22339 Hamburg

1

Tel.: 040-53801-0, www.eppendorf.com

Dr. Clemens Blümel (Produktmanager Zentrifugen)

eMail: blümel.c@eppendorf.de

Dr. Thomas Uschkureit (Applikationsspezialist

Zentrifugen)

eMail: uschkureit.t@eppendorf.de

Eppendorf

AG

Barkhausenweg

D-22339 Hamburg

1

Tel.: 040-53801-0, www.eppendorf.com

Dr. Clemens Blümel (Produktmanager Zentrifugen)

eMail: blümel.c@eppendorf.de

Dr. Thomas Uschkureit (Applikationsspezialist

Zentrifugen)

eMail: uschkureit.t@eppendorf.de

2 . Gerätebezeichnung/Serie

A llegra 25 R

Centrifuge 5810 R /

Centrifuges 5804, 5804R, 5810 und 5810R

Centrifuge 5417 R/

Centrifuges 5417 C und 5417 R

MiniSpin plus SPACE/Centrifuges MiniSpin, MiniSpin

plus und MiniSpin plus SPACE

3. Abmessungen des Systems

(Breite x Tiefe x Höhe, cm)

Gewicht

(kg)

65

cm x 68,5cm x 40,5cm / 124kg

70

x 61 x 35 9 9

31

x 60 x 25 3 5

23 x 24 x 12 4, 3

4 . Einsatzgebiet (Produktion/Forschung)

Tischzentrifuge

mit Kühlun g

Produktion

+ Forschun g

Forschun

g

Forschun g

5.

Kurzbeschreibung des

seiner Komponenten

Produktes/Systems

und

gekühlte Tischzentrifuge, vielseitig

speziell verfügbare DNA-Rotoren

molekularbiologische Labor

für

einsetzbar,

das

gekühlte Tischzentrifuge für sehr große Kapazitäten

®

( z.B. 20 x 50 ml Falcon Gefäße) inkl. Short-spin-

un d

Fast-cool-Funktion • flexible Adapter ermög-lichen die

Zentrifugation nahezu aller handels-üblichen Gefäße

von 1,5 bis 400 ml • herkömm-liche Filterplatten-

Systeme (Mikrotiter- /Deepwell-Platten) sind in

verschiedenen Ausschwing-Rotoren einsetzbar •

große Auswahl an Rotore: neben den Ausschwing-

Rotore gibt es Festwinkel-Rotore für Gefäße von 0,2

bis 85 ml, einen speziellen Rotor für PCR-Streifen

sowie einen Trommelrotor für bis zu 60 x 1,5/2 ml-

Reaktionsgefäße

gekühlte Mikrozentrifuge für alle üblichen

Applikationen in der molekularbiologischen/

biochemischen Forschung • einfachste Bedienung

u.a. durch Short-spin-

und Fast-cool-Funktion •

wahlweise Eingabe von RZB oder Drehzahl (ab 500

1/min in Schritten von 100 1/min) • aerosoldichter

R otor komplett bis zu 2 h bei 140 ° C autoklavierba r

Personal Centrifuge im Sternendesign: eine wirklich

„persönliche“ Zentrifuge • 12-Platz-Aluminiumrotor

extrem kurze Anlauf-

und Abbremszeiten • Drehzahl/

RZB-Umschaltung


6 . Kühlung/Bereich ( ° C )

- 2 0 ° C - 4 0 °C T emperatureinstellung von –9 bis 4 0 ° C, Fast-cool-

Funktion

T emperatureinstellung von –9 bis 40 ° C, Fast-cool-

Funktion

keine

Kühlung

7.

Drehzahl

k-Faktor

(rpm)

relative

Zentrifugalkraft

(g)

15.000

k=428

rpm,

25.160

x

g,

minimaler

k-Faktor

ist

14.000

11)

20.800

376

(Rotor;1,5

ml

tube)(

16.400

24-11)

25.000

503

(Rotor;1,5

ml

tube)

(

14.500

12-11)

14.001

615

(Rotor;1,5

ml

tube)

(

8.

Rotoren

8 .2 Einsätze (Zahl/Vol.)

große Anzahl verschiedener Materialien un d

Adapter verfügbar

0,2

3 Adapter (Volumenbereich: 0,2 bis 2 ml)

3 Adapter (Volumenbereich: 0,2 bis 2 ml)

8 .3 Beladung (min/max)

R otoren von 0,4ml bis 2 Lite r

4 x 800 g (im Rotor A-4-81 )

30

x 4 g

12 x 4 g

1 0. Datendokumentation

o ptional erhältlic h

Optional können alle Zentrifugenfunktionen auch übe r

-

e ine serielle Schnittstelle (RS 232c) bedient werden

1 1. Technische Daten

W ärmeabgabe < 2kW/Stunde, 220V-Anschlu ß max. Leistungsaufnahme: 1350 W • Netzanschluß :

230 V, 50 Hz

max. Leistungsaufnahme: 700 W • Netzanschluß:

230 V, 50 Hz

max. Leistungsaufnahme: 85 W • Netzanschluß: 230

V, 50 Hz

1 2. Extras/Besonderheiten

vollständige Abdeckung der m

molekularbiologischen Labor typischerweise

anfallenden Zentrifugationsschritte von Zellernte

DNA-Reinigung

bis

34 Programmspeicherplätze •

Bremsrampen für empfindliche

Kühlung

10

F-45-30-

FA-45-

F-45-

8 .1 Rotortyp(en)

insg.

5 verschiedene Rotore n

5 Festwinkel-, 5 Ausschwing- und ein Trommel-Roto r 4 Festwinkel- und ein Ausschwing-Roto r

1 Festwinkel-Roto r

Ausschwing-Rotore: 33 modular aufgebaute

Adapater (Volumenbereich: 1,2 bis 400 ml) •

Festwinkel-Rotore: 10 Adapter (Volumenbereich:

bis 85 ml) • Trommelrotor: 2 Adapter (Volumenbereich:

0,4 bis 2 ml)

9 . Programmsteuerung für …

Programmsteuerung für Anwender-Programme mit

10 unabhängigen Beschleunigungs-

/Verzögerungswerten

unterschiedlichste Parameter können in bis zu 34 -

Programmen gespeichert werden. Bei der Auto-

maten-Version dieser Zentrifuge, der 5810 RA, lassen

sich die Beladeöffnung, die Rotorpositionie-rung und

weitere Zentrifugenfunktionen über eine RS232-

Schnittstelle steuern

Anlauf-

Proben •

und

Stand-by-

automatische Unwuchterkennung • Soft-Taste

langsame Hochlauf-

und Bremszeiten • aerosoldichte

Zentrifugation möglich (bis zu 25.000 x

für

g)

limitierte

Auflage


ein

„g“

zusätzlich

1 3. Preis (für eine typische Konfiguration) a uf Anfrag e

i nkl. Mikrotiterplatten-Rotor A-4-62-MTP: EUR 637 1 inkl. 30-Platz-Aluminium-Rotor F-45-30-11 :

EUR 3532

inkl.

12-Platz-Aluminium-Rotor:

EUR 946

|transkript LABORWELT Nr. IV/2001 | 27


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M A R K T Ü B E R S I C H T

1 . Firmenanschrift/Ansprechpartner

Hettich-Zentrifugen GmbH & Co.K G

Gartenstr. 100

78532 Tuttlingen

Tel.: 07461-705 0

Fax: 07461-705 125

eMail: info@hettichlab.com

www.hettichlab.com

Ansprechpartner: Doris Jakobi

Hettich-Zentrifugen

Gartenstr. 100

GmbH & Co.KG

78532 Tuttlingen

Tel.: 07461-705 0

Fax: 07461-705 125

eMail: info@hettichlab.com

www.hettichlab.com

Ansprechpartner: Doris Jakobi

Hettich-Zentrifugen

Gartenstr. 100

78532 Tuttlingen

Tel.: 07461-705 0

Fax: 07461-705 125

www.hettichlab.com

info@hettichlab.com

Ansprechpartner: Doris

GmbH & Co.KG

Jakobi

Jouan GmbH

Kapellenstraße 22

82008 Unterhaching

Tel.: 089-611 4038

Fax: 089-611 3087

eMail: info@jouan.de

Internet: www.jouan.com

2 . Gerätebezeichnung/Serie

ROTANTA

46 *46 R / **46 S ***46 R S ROTIXA

50 S ROTIXA 50 R S

MIKRO 22 22 R

6 L - Kühlzentrifuge KR 4 i

3. Abmessungen des Systems

(Breite x Tiefe x Höhe, cm)

Gewicht

(kg)

58 x 69 x 41

81,5 x 69 x

***46 RS)

41

ca. 65 (ROTANTA 46 und **46 S)

ca. 95 (ROTANTA *46 R und

65 x 72 x 103

172 (ROTIXA

ca. 115 (kg kROTIXA **50 S), ca.

***50 RS)

33,3 x 39 x

ca. 16 36

27,8 33,3 x 62 x 27,8 (*MIKRO 22 R)

(*MIKRO 22 R)

78 x 90 x 94,5 cm (BxTxH)

346 kg

4 . Einsatzgebiet (Produktion/Forschung)

Sowohl für die „Routine“ in Kliniken un d

Laborgemeinschaften als auch für die

Grundlagenforschung in F & E-Labors

pharmazeutischer und biotechnologischer

Unternehmen

Genforschung, Virologie, Zytologie, Bakteriologie,

routinemäßige Untersuchungen in der Klinischen

Chemie. Aufgrund ihrer Leistung auch bestens für

die Probenaufbereitung bei der PCR geeignet.

Forschung und Routine

Universitäten, Industrie, Biotechnologie, Produktion,

Blutbanken

5.

Kurzbeschreibung des

seiner Komponenten

Produktes/Systems

und

Tischzentrifuge mit großer

Anwendungsbereiche in der

Analysentechnik in Medizin,

Forschung

Kapazität für

modernen

Wissenschaft

alle

und

Großvolumige Standzentrifuge

Leistungsspektrum

mit

breitem

Zentrifuge für hohe Probenkapazität für Life Science-

Industrie und medizinische Laboratorien, Trennungen

von z.B. Nahrungsmittelproben, Zellsuspensionen,

Niederschlägen aus chemischen Reaktionen,

Bodenproben, Blut und Blutbestandteilen

MIKRO 22 und MIKRO 22 R (*gekühlt) sind

Mikroliter-Zentrifugen mit herausragenden

Leistungsdaten und extrem kurzen An-

und

Auslaufzeiten

Großvolumige Zentrifuge für Volumina bis zu

Bedienung mittels Video-Bildschirm VIDEOset

Wartungsfreier Induktionsantrieb •

4 verschiedene Rotoren

6


L


6 . Kühlung/Bereich ( ° C )

- 2 0 ° C bis + 4 0 ° C stufenlos regelba r

- 2 0 ° C bis + 4 0 ° C stufenlos regelba r

- 2 0 ° C bis + 4 0 ° C stufenlos regelba r

- 8° C bis +4 0 ° C FCKW-fre i

7.

Drehzahl

k-Faktor

(rpm)

relative

Zentrifugalkraft

(g)

6.000

7.500

RS)

6.600

10.310

x

x

g

(ROTANTA

G (ROTANTA

46

und

*46

**46

R und

S)

***46

4.900

5.500 x g

18.000

31.876 x g

.900 min

4

1

7.300

x

-

g

8 . Rotoren

6 Stk .

6 Stk .

9 Stk. 14 Stk. (*MIKRO 22 R )

8 .1 Rotortyp(en)

3 Ausschwingrotoren und 3 Winkelrotore n 5 Ausschwingrotoren, 1 Scheibenroto r

Ausschwingrotoren, Winkelrotoren, 1 Topfrotor ,

1 Hämatokritrotor, 1 Zyto-Rotor

für Mikrolitergefäße, Blutabnahmegefäße, Röhrchen

mit und ohne Schraubverschluß, Falcon-Röhrchen,

Hämatokritkapillaren und Zytopräparate

8 .3 Beladung (min/max)

4 x 750 m l

4 x 1000 m l

60 x 1,5/2,0 ml 6 x 50 ml (*MIKRO 22 R )

9 . Programmsteuerung für …

Bei den Modellen ROTANTA 46 und *46 R könne n

3 komplette Laufprogramme gespeichert werden.

Die Modelle mit der erweiterten S-Steuerung

(ROTANTA **46 S und ***46 RS) erlauben die

Speicherung von bis zu 89 Programmen und

bieten eine Reihe weiterer Zusatzmöglichkeiten.

Beide Modelle sind serienmäßig mit

Steuerung ausgestattet und erlauben

von max. 89 Programmen

erweiterter S-

die Speicherung

3 komplette

werden

Laufprogramme

können

gespeichert

mProzessorsteuerung

über

Video-Bildschirm

1 0. Datendokumentation

Modelle mit S-Steuerung (ROTANTA **46 S un d

***46 RS) mit Schnittstelle zur PC-gesteuerten

Datendokumentation HETTINFO

Schnittstelle zur PC-gesteuerten

HETTINFO vorhanden

Datendokumentation

Datendokumentation

Schnittstellen

über

RS

und

RS

1 1. Technische Daten

Anschluß: 208 – 240 V, 50/60 Hz (ROTANTA 4 6

und **46 S) • 220 – 240 V, 50 Hz (ROTANTA *46

R und ***46 RS) • Anschlußwert: 1400 VA

(ROTANTA 46 und **46 S) • 1800 VA (ROTANTA

*46 R und ***46 RS) • Funkentstörung: EN

55011 ISM Klasse B

Anschluß: 208 – 240

220 – 240 V, 50/60

Anschlußwert: 2700

(ROTIXA ***50 RS)

ISM Klasse B

V,

Hz

VA


50/60 Hz (ROTIXA **50

(ROTIXA ***50 RS) •

(ROTIXA **50 S), 3700

Funkentstörung: EN 55011

S),

VA

Anschluß: 208 – 240

50/60 Hz (*MIKRO 22

900 VA (*MIKRO 22

ISM Klasse B

V,

R)

R)

50/60 Hz • 220 –

• Anschlußwert:

• Funkentstörung:

240 V,

700 VA

EN 55011

Aerosoldichter

Modell ist auch

lieferbar.

(nach TÜV-geprüft)

in verschiedenen

Becher. • Das

GMP-Ausführungen

QC-

Videobildschirm mit VIDEOset-Software

Software für Blutbank-

und industrielle

Qualitätssicherung


4 Ausschwingrotoren mit Rund-

und

Rechteckbechern mit 68 Adaptern für alle

Röhrchengrößen, Blutbeutel, Mikrotierplatten und

-blöcken, sowie RIA racks

8 .2 Einsätze (Zahl/Vol.)

für Mikrolitergefäße, Blutabnahmegefäße ,

Röhrchen mit und ohne Schraubverschluß, Falcon-

Röhrchen, Flaschen, Zellkulturflaschen, Mikrotiter-,

Kultur-, Deep Well und Filterplatten, Micronic-

Systeme

für Mikrolitergefäße, Blutabnahmegefäße, Röhrchen

mit und ohne Schraubverschluß, Falcon-Röhrchen,

Flaschen, ASTM-Gefäße, Schlenkrohre, Racks,

Mikrotiter-, Kultur- und Deep Well-Platten, Micronic-

Systeme, Blutbeutelsysteme und Zytopräparate

485-

232-

32 Anwenderprogramme speicherbar mit

Paßwortschutz • Integral-Zentrifugation für

lebenslange Reproduzierbarkeit • Timer von 0 bis

99h 59 min und Dauerbetrieb • 10 Beschleunigungsund

Bremsstufen

1 2. Extras/Besonderheiten

Aerosoldichte (nach TÜV-geprüft) Einsätze und ein

a erosoldichter Mikroliterrotor, der bis 142 °C

autoklaviert werden kann. • ROTINA 46 Zentrifugen

gibt es auch in Untertisch-

und Robotic-Versionen

1 3. Preis (für eine typische Konfiguration) auf Anfrag e

Zeichenerklärung:

*mit Kühlung • **mit S-Steuerung

Kühlung und S-Steuerung


***

mit

auf

Anfrage

Zeichenerklärung:

**mit S-Steuerung

Steuerung

***

mit

Kühlung

und

S

-

a uf Anfrage

Preis für Zentrifuge mit 6 Liter-Rotor un d

Rundbechern: EUR 122.000

28 | Nr. IV/2001 |transkript LABORWELT


/

/

/

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l

/

:

:

:

/

Z E N T R I F U G A T I O N

1 . Firmenanschrift/Ansprechpartner

Jouan Gmb H

Kapellenstraße 22

82008 Unterhaching

Tel.: 089-611 4038

Fax: 089-611 3087

eMail: info@jouan.de

Internet: www.jouan.com

Jouan GmbH

Kapellenstraße 22

82008 Unterhaching

Tel.: 089-611 4038

Fax: 089-611 3087

eMail: info@jouan.de

Internet: www.jouan.com

Kendro Laboratory Products

Heraeusstr. 12-14

63450 Hanau

Tel.: 01805-536 376,

Fax: 01805-112 114

eMail: info@kendro.de, www.kendro.de

Ansprechpartner: Dr. Arndt Führ

® ®

2 . Gerätebezeichnung/Serie

H igh Speed Stand-Kühlzentrifuge KR 25 i

High

Speed Tisch-Kühlzentrifuge MR 23 i

H eraeu s B iofug e primo/primo R

3.

Abmessungen

(Breite x Tiefe

x

des Systems

Höhe, cm)

Gewicht

(kg)

4 . Einsatzgebiet (Produktion/Forschung)

Forschung und Routin e

Universitäten, Industrie,

5.

Kurzbeschreibung des

seiner Komponenten

Produktes/Systems

und

6 . Kühlung/Bereich ( ° C )

8

7.

8.

Drehzahl

k-Faktor

Rotoren

(rpm)

relative

Zentrifugalkraft

(g)

7 8,7 x 69 x 96 cm (BxTxH) 242 kg

5 8,5 x 63,5 x 36 cm (BxTxH) 85 k g

315 x 380 x 475 mm / 40 kg (Biofuge primo) •

313 x 580 x 493 mm / 69,5 kg (Biofuge primo

Biotechnologie

High Speed-Zentrifuge for große Volumina bis

in Sekunden mit pat. AUTO-LOCK-SYSTEM •

Video-Bildschirm VIDEOset • Wartungsfreier

verschiedene Rotoren

zu 3 L • Rotorwechsel

Bedienung mittels

Induktionsantrieb • 10

- ° C bis +4 0 ° C FCKW-fre i

8

2

1

2.500

min

-

g

Forschung und

Universitäten,

Routine

Industrie,

Biotechnologie

Multifunktions-Zentrifuge für den

Rotorwechsel in Sekunden mit pat.

mittels Video-Bildschirm VIDEOset

• 12 verschiedene Rotoren

- ° bis +4 0

/ 63.400 x

3.000 min

C ° C FCKW-fre i

2

1

-

g

High und Low Speed-Bereich •

AUTO-LOCK-SYSTEM • Bedienung

• Wartungsfreier Induktionsantrieb

Die Biofuge

Zentrifugen

biologische

/ 36.668 x

Max. Drehzahl (rpm): 15.000, verstellbar in 10er-Schritten •

Min. Drehzahl (rpm): 300 • Max. 21.885

R)

8.1

8.2

8.3

Rotortyp(en) und

Einsätze (Zahl/Vol.)

Beladung

(min/max)


8

AKL 16.20 Winkelrotor 32 x 16 ml, 2 Adaptersätze 1,5/2 ml und 5 ml

AKL 50C.17 Winkelrotor 8 x 50 ml konisch/rund, 1 Adaptersatz 10

ml rund • AKL 50.17 Winkelrotor 14 x 50 ml, AKL 50.22 Winkelrotor

x 50 ml, 7 Adaptersätze von 1,5/2 ml bis 38 ml • AKL

100.21 Winkelrotor 8 x 100 ml, 6 Adaptersätze von 1,5/2 ml bis 50

ml • AKL 250.14 Winkelrotor 6 x 250 ml, 3 Adaptersätze von 15 ml

bis 100 ml • AKL 500.11 Winkelrotor 6 x 500 ml, 5 Adaptersätze von

15 ml bis 250 ml • SWK100.13 Ausschwingrotor 4 x 100 ml, 4

Adaptersätze von 1,5/2 ml bis 50 ml

x

6

x

®

H ighconic Rotor – Festwinkelrotor: Max. Kapazität: 6 x 50 ml, Max .

Drehzahl: 8.500 rpm, Max. RZB: 10.015 x g • Ausschwingrotor: Max.

Kapazität: 4 x 100 ml, Max. Drehzahl: 4.000 rpm, Max. RZB: 2.585 x g •

M ikroliterrotor 45 ° Max. Kapazität: 24 x 1,5/2 ml, Max. Drehzahl: 15.00 0

r pm, Max. RZB: 21.885 x g • Mikroliterrotor 40 ° Max. Kapazität: 24 x

1,5/2 ml, Max. Drehzahl: 13.000 rpm, Max. RZB: 16.060 x g •

Mikroliterausschwingrotor (nur für Biofuge primo R): Max. Kapazität: 12

1,5 2 ml, Max Beladung 12 g, Max. Drehzahl: 13.000 rpm, Max RZB:

16.438 x g • Trommelrotor: Max. Kapazität: 80 x 1,5/2 ml, Max. Drehzahl:

12.000 rpm, Max. RZB: 14.005 x g

9 . Programmsteuerung für …

m Prozessorsteuerung über Video-Bildschir m

m Prozessorsteuerung über Video-Bildschir m

Die zuletzt eingegebenen Daten bleiben gespeicher t

1 2. Extras/Besonderheiten

Patentiertes Rotorwechselsystem AUTO-LOCK, erstmals weltweit a n

einer großvolumigen Kühlzentrifuge • Hohe Sicherheit, da Rotoren

nicht mehr auf der Spindel befestigt werden müssen •

Videobildschirm mit VIDEOset-Software

Integralvon

0 bis

Bremsstufen

32 Anwenderprogramme speicherbar mit Paßwortschutz

Zentrifugation für lebenslange Reproduzierbarkeit • Timer

99h 59 min und Dauerbetrieb • 10 Beschleunigungs- und

Patentiertes Rotorwechselsystem AUTO-LOCK

VIDEOset-Software



primo und die gekühlte Variante Biofuge primo R sind ideale

für das medizinische Labor, die biochemisch-molekular-

Forschung oder für Routineanalysen in Industrie-Labors.

Mikroliter-, Highspeed- und Universalzentrifuge. Rotoren für jeden

Anwendungsbereich ermöglichen Applikationen für Mikroliter-, DIN-,

Blutentnahme- und konische Gefäßen; zusätzlich 12-platziger

Mikroliterausschwingrotor für die gekühlte Variante

AM 2.23 Winkelrotor 12 x 1,5/2 ml, AM 2.21 Gedichteter Winkelrotor

12 x 1,5/2 ml, AM 2.18 Winkelrotor 24 x1,5/2ml, AM 2.19 Winkelrotor

2 8 x 1,5/2ml, 3 Adaptersätze 200 – 500 µ • AM 10.17 Winkelroto r

10 x 10 ml, 2 Adaptersätze 1,5/2 und 5 ml • AM 38.15 Winkelrotor 8

38 ml, 4 Adaptersätze von 5 ml bis 16 ml • AM 50C.13 Winkelrotor

x 50 ml konisch/rund, 2 Adaptersätze 15 ml konisch und 10 ml

rund • AM 50.14 Winkelrotor 8 x 50 ml, 8 Adaptersätze von 10 ml bis

38 ml • AM 100.13 Winkelrotor 6 x 100 ml, 9 Adaptersätze von 1,5/2

ml bis 50 ml • SWM 180.5 Ausschwingrotor 4 x 200 ml, 20

Adaptersätze von 1,5/2 ml bis 100 ml • MTM 6.4 Mikrotiterplatten-

Ausschwingrotor, Für 6 Mikrotiterplatten oder 2 Blöcke • DRM 6.14

T rommelrotor für 60 x 1,5/ 2 ml, Einsätze von 250 µ l bis 80 0 µ

1 0. Datendokumentation

D atendokumentation über RS 232- und RS 485-Schnittstelle n n icht vorhande n

nicht verfügba r

1 1. Technische Daten

32 Anwenderprogramme speicherbar mit Paßwortschutz • Integral-

Zentrifugation für lebenslange Reproduzierbarkeit • Timer von 0 bis

99h 59 min und Dauerbetrieb • 10 Beschleunigungs- und

Bremsstufen

Videobildschirm mit

1 3. Preis (für eine typische Konfiguration) P reis für Zentrifuge mit Winkelrotor 8 x 50 ml: EUR 19.65 0 Preis für Low speed-Konfiguration mit Ausschwingrotor: EUR 7.600 •

Preis für High Speed-Konfiguration mit Winkelrotor 24 x 1,5/2 ml:

EUR 7.300

Antrieb: Kohlebürstenfreier Induktionsantrieb • Max. Kapazität

®

( Festwinkelrotor): 6 x 50 ml Highspeed Gefäße, 6 x 15/50 ml Falcon •

Max. Kapazität (Ausschwingrotor): 4 x 100 ml DIN, 4 x 15/50 ml

F alcon ® , 12 x 7/15 ml Blutentnahme • Temperaturbereich: – 9 ° C bis +

4 0 ° C (Biofuge primo R) • Brems-/Beschl.-Kurven: 9 2 • Lautstärke be i

max.: < 60 dB (Biofuge primo) bzw. < 55 dB (Biofuge primo R) •

Laufzeit: 0 – 9 h 59 min, Dauerbetrieb (Hold) • Funktionen: RZB-Vorwahl,

Quick-run • Rotorerkennung: automatisch • Unwuchterkennung:

elektronisch, optimal auf jeden Rotor abgestimmt • Programmspeicher:

Die zuletzt eingegebenen Daten bleiben gespeichert • Aufbau: Verzinktes

Blechchassis mit Panzerkessel und aufge-setztem Kunststoffgehäuse •

Gerätesicherheit: Deckelverriegelung und -zuhaltung •

Leistungsaufnahme: 350 W (Biofuge primo) bzw. 490 W (Biofuge primo

R) • Prüfnormen: Gefertigt und geprüft in Überein-stimmung mit EN 61

010-1, EN 61 010-2-020, EN 50 081-1, EN 50 082-1; nicht prüfpflichtig

nach UVV VBG 7z

Biofuge primo 230 V, 50/60 Hz, ohne Zubehör (Best.-Nr. 75005181):

EUR 1.762,- • Biofuge primo 120 V, 60 Hz, ohne Zubehör (Best.-Nr.

75005182): EUR 1.762,- • Biofuge primo R 230 V, 50/60 Hz, ohne

Zubehör (Best.-Nr. 75005440): EUR 3.727,- • Biofuge primo R 120

Hz, ohne Zubehör (Best.-Nr. 75005441): EUR 3.727,-

V,

60

|transkript LABORWELT Nr. IV/2001 | 29


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l

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M A R K T Ü B E R S I C H T

1 . Firmenanschrift/Ansprechpartner

Kendro Laboratory Product s

Heraeusstr. 12-14

63450 Hanau

Tel.: 01805-536 376

Fax: 01805-112 114

eMail: info@kendro.de

www.kendro.de

Ansprechpartner: Dr. Arndt

Führ

Kendro Laboratory Products

Heraeusstr. 12-14

63450 Hanau

Tel.: 01805-536 376

Fax: 01805-112 114

eMail: info@kendro.de

www.kendro.de

Ansprechpartner: Dr. Arndt

Führ

® ® ® M

2 . Gerätebezeichnung/Serie

H eraeu s M ultifug e 4 K R

S orvall

E volutio n

R

T

C

3. Abmessungen des Systems

(Breite x Tiefe x Höhe, cm)

Gewicht

(kg)

7 00 x 680 x 720 mm, Gewicht: 236 kg

1.295 x 710 x 1.055 mm (Arbeitshöhe: 850 mm, Tiefe bei geöffnetem Deckel: 1.125 mm) 390 k g

4 . Einsatzgebiet (Produktion/Forschung)

U ntertischgerät für die High-Throughput-Zentrifugatio n

Mikrobiologische, molekularbiologische oder protein/biochemische Anwendunge n

5.

Kurzbeschreibung des

seiner Komponenten

Produktes/Systems

und

Die Multifuge 4 KR vereint die hohe Kapazität einer Standzentrifuge mit dem geringen Platzbedarf und

Bequemlichkeit eines Untertischgeräts. Sie bietet maximales Fassungsvermögen für eine breite Palette

gängiger Gefäßtypen • Die Multifuge 4 kann die doppelte Menge an Mikrotestplatten aufnehmen als

vergleichbare Zentrifugen in diesem Segment. Sie bietet mit ihrer umfangreichen Palette an Rotoren

individuelle Möglichkeiten in der Probenverarbeitung für jedes Labor

der

A

M

T

4

6 . Kühlung/Bereich ( ° C )

Temperaturbereich: –9 bis +40ºC, FCKW-freies Kühlmittel • Genauigkeit der Temperaturkontrolle :

± 2 ºC unter normalen Laborbedingunge n

7. Drehzahl (rpm)

k-Faktor

relative Zentrifugalkraft (g)

D rehzahlbereich 300 - 10.000 rpm, einstellbar in Schritten von 10 rpm • max. RZB: 15.320 x g

max. Drehzahl: 26.000 rpm • Max. RZB: 70.450 x g

8.

Rotoren

8 .1 Rotortyp(en)

LH-4000 Ausschwingrotor: ausgelegt auf die Anforderungen von Protokollen mit hohen Drehzahlen un d

niedrigen Temperaturen • LH-4000 W – Windkessel-Ausschwingrotor: 4 x 1 Liter Probenvolumen in

®

R undbechern • BIOshield Windkessel-Ausschwingrotor: 4 x 250 ml Rechteckbecher, getestet e

®

B ioabdichtung, vollständig autoklavierbar • HIGHplate Rotor: zum Zentrifugieren von RNA/DNA -

®

F ilterplatten bei 5.890 x g, Filterplatten bis 85 mm Höhe, 10 Standard-Mikrotestplatten • Highconic

Festwinkelrotor: schnelle Verarbeitung von Zellkulturgefäßen mit bis zu 10.020 x g, zertifizierte

Bioabdichtung, autoklavierbar • LAC-250 Festwinkel-Kohlefaserrotor: Verarbeitung von bis zu 1,5

Probenflüssigkeit, Fassungsvermögen 6 x 250 ml, 15.320 x g, korrosionsbeständiger Kohlefaserwerkstoff

8.2

Einsätze

(Zahl/Vol.)

8.3

Beladung

(min/max)

9 . Programmsteuerung für …

E s können 9 Zentrifugationsprogramme + 1 Vorkühlprogramm (Pretemp) gespeichert werde n

Die letzten fünf Zentrifugationsprofile werden automatisch gespeichert. Eine erweiterte Programmsteuerun g

ist optional erhältlich

Die SORVALL Evolution RC Superspeed-Zentrifuge

universeller Einsatzmöglichkeit. • Reduzierung der

Antriebssystem.

verbindet

jährlichen

hohe Leistung

Wartungskosten

und hohen Durchsatz

durch vakuumfreies

mit

Die Evolution RC zentrifugiert 6 Liter in 9 Minuten. Konkurrenzlos schnelle Beschleunigungs-

und

Bremszeiten bei max. Geschwindigkeit reduzieren die Laufzeiten erheblich (Herstellerangabe). Die neueste

Superspeed-Zentrifuge von Kendro arbeitet vakuumfrei und verfügt über ein robustes, unwuchttolerantes

ntriebssystem, dem DuraFlex Gyro • Zur Auswahl stehen 20 Festwinkelrotoren: 12 Aluminium-,

Kohlefaser- und 4 Titanrotoren decken durch ihre Größen-

und Materialvielfalt alle Anwendungen ab.

T emperatureinstellbereich: – 20 bis 40ºC • Genauigkeit der Temperaturkontrolle: ± 2 ºC unter normale n

Laborbedingungen • Umgebungstemperatur: 10 – 38 ºC, Mittlere Wärmeabgabe: 2,5 kW/h • Temperaturregelung:

FCKW-frei, vakuumfreies DuoTherm Temperaturregelungssystem

Die größte Rotorenauswahl weltweit umfaßt u.a. 4 leistungsfähige SUPER-LITE Kohlefaserrotoren und

z ahlreiche farbige ColorTone -Rotoren. Insgesamt stehen zur Auswahl:

• 20 Festwinkelrotoren mit einem Fassungsvermögen von 48 ml bis 6 Liter. 12 Aluminium-, 4 Kohlefaserund

4 Titanrotoren decken durch ihre Größen-

und Materialvielfalt alle Anwendungen ab.

• 4 Ausschwingrotoren mit einem Fassungsvermögen von 80 ml bis 3 Liter. Diese Rotoren erreichen die

höchsten Zentrifugalbeschleunigungen aller auf dem Markt erhältlichen vergleichbaren Ausschwingrotoren

• 5 Rotoren für Spezialanwendungen wie kontinuierliche Durchfluss-Systeme oder Zonal-

und

Vertikalrotoren

1 0. Datendokumentation

o ptional über serielle Schnittstelle

RunBrowser speichert automatisch die letzten fünf Zentrifugationsprofile mit Temperatur, Geschwindigkeit ,

Rotor, Brems- und Beschleunigungsprofilen und Zeit. Eine serielle Schnittstelle zur Datendokumentation ist

optional erhältlich

1 1. Technische Daten

Max. Fassungsvermögen: 4 x 1000 ml oder 4 x 8 Standard-Mikrotestplatten • Antrieb: Kohlebürstenfreie r

Induktionsantrieb • Beschleunigungs-/Bremsprofile: 9/9 • Programmspeicher 9 + 1 Vorkühlprogramm

( Pretemp) • Laufzeit 0-99 min., plus Bremsen • Temperaturbereich -9 bis +40 ° C • Temperaturgenauigkeit :

± 2° C • Steuerung mikroprozessorgesteuert über EASYcontro l II • Funktionen: RZB-Vorwahl, Quick run ,

automatische Rotorerkennung, Unwuchterkennung und Deckelverriegelung über Folientaste •

Unwuchterkennung: elektronisch, drehzahl-

und rotorabhängig • Steckertyp: Nema 5-15R • Prüfnormen:

Konstruiert und geprüft gemäß EN 61 010-1, EN 61 010-2-020, EN 50 081-1, EN 50 082-1

Maximale Rotorkapazität 6 Liter • Antrieb Bürstenloser Gleichstrommotor mit Gyro-Antriebskopf • Bes

chleunigungs-/Bremsprofile 3 4 • Programme Optional • Genauigkeit der Drehzahlsteuerung ± 20 rpm im

B ereich von 0 – 1.000 rpm; ± 0,2 % im Bereich von 1.000 – 26.000 rpm • Geräuschpegel: 63 dBA (be i

max. Drehzahl im Abstand von 1 m vom Gerät) • Garantie 1 Jahr (Gerät) bzw: 3 J. (Antriebsmotor) und

5 J. (Kühlsystem)

4-Liter-

1 2. Extras/Besonderheiten

Fassungsvermögen eines Standgeräts bei Außenabmessungen eines Untertischgerätes • Nac h

Herstellerangaben: Kürzeste Prozeßzeiten und höchster Durchsatz aller auf dem Markt erhältlichen

Zentrifugen (Herstellerangabe) • Sehr hohe Flexibilität durch breites Rotorspektrum

1 3. Preis (für eine typische Konfiguration) M ultifuge 4 KR, gekühlt, 230 V, 50 Hz, 12,9 A (Best.-Nr. 75004461): EUR 9.30 0

Evolution RC, CE-Version, Drehknopf, Einphasenstrom, 32 A, 187 – 253 V, 50 Hz, Schutzkontaktstecke r

nach IEC 60309 (Best.-Nr. 728311): EUR 21.700,- • Evolution RC, CE-Version, Folientastatur, Einphasenstrom,

32 A, 187 – 253 V, 50 Hz, Schutzkontaktstecker nach IEC 60309 (Best.-Nr. 728411): EUR 21.900,-

• Evolution RC, CE-Version, Drehknopf, Mehrphasenstrom, 32 A, 187 – 253 V, 50/60 Hz, Fünfstift-Stecker

nach IEC 60309 (Best.-Nr. 728511): EUR 21.700,- • Evolution RC, CE-Version, Folientastatur, Mehrphasenstrom,

32 A, 187 – 253 V, 50/60 Hz, Fünfstift-Stecker nach IEC 60309 (Best.-Nr. 728611): EUR 21.900,-

30 | Nr. IV/2001 |transkript LABORWELT


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Z E N T R I F U G A T I O N

1 . Firmenanschrift/Ansprechpartner

MACHEREY-NAGEL GmbH & Co.K G

Product Management Bioanalysis

Neumann-Neander-Street 6-8

D – 52355 Düren

Tel.: ++49-(0)-2421-969 272

Fax: ++49-(0)-2421-969 279

eMail: pm-bio@mn-net.com

Sigma Laborzentrifugen GmbH

Postfach 1713

D - 37507 Osterode am Harz

Tel.: 05522-5007-0

Fax: 05522-5007-12

eMail: info@sigma-zentrifugen.de

www.sigma-zentrifugen.de/

Sigma Laborzentrifugen GmbH

Postfach 1713

D - 37507 Osterode am Harz

Tel.: 05522-5007-0

Fax: 05522-5007-12

eMail: info@sigma-zentrifugen.de

www.sigma-zentrifugen.de/

Sigma Laborzentrifugen GmbH

Postfach 1713

D - 37507 Osterode am Harz

Tel.: 05522-5007-0

Fax: 05522-5007-12

eMail: info@sigma-zentrifugen.de

www.sigma-zentrifugen.de/

2 . Gerätebezeichnung/Serie

NucleoSwing Z513 bench top centrifug e

NucleoSwing Z513 K bench top centrifuge (refrigerated)

SIGMA

2-5

SIgma

3 K 3 0

Sigma 4 K 1 5

3. Abmessungen des Systems

(Breite x Tiefe x Höhe, cm)

Gewicht

(kg)

6 1 x 73 x 46,5 cm 90 kg

3 65 x 460 x 300 mm / 20 k g

580

x 560 x 530 mm / ca. 100 k g

650 x 685 x 405 mm / 124 k g

4 . Einsatzgebiet (Produktion/Forschung)

High-speed bench top centrifuge • In combination with a swing-ou t

rotor and its rotor buckets, NucleoSwing Z513 and NucleoSwing

Z513 K are specifically designed for the demands of DNA/RNA

purification in 8-well and 96-well format • Ideally suited for nearly

all laboratory centrifuging demands • A wide variety of fixed-angle

and swing-out rotors and buckets are provided by HERMLE (see

Hermle manual, Wehingen/Germany)

T ischgerät für Arzt, klin. Labor, Forschung Tischgerät für Biochemie, Biotechnologie, DNA ,

Chemie, Pharmazie

Tisch/Standgerät,

Klinikbereich

universell

für

Forschung

und

5.

Kurzbeschreibung des

seiner Komponenten

Produktes/Systems

und

Max. speed: 15,000 rpm, max. RCF-value: 25,900 x g • Low noise

levels are achieved by the integrated rotor wind shield [72 dB(A)]

for operation of the centrifuge in any laboratory • A wide variety of

fixed-angle as well as swing-out rotors and buckets make

NucleoSwing suitable for nearly all laboratory centrifuging demands

kompaktes Gerät ohne Kühlung mit

kollektorlosem Antrieb mit stufenloser Regelung

der Drehzahl ab 100 rpm mit einer

R egelgenauigkeit von ± 50 rpm bei eine r

maximalen Beschleunigungszeit von 28s und

einer min. Bremsrate von 280 s • Timer • LCD-

Display • Softstopp

kompakte kühlbare Tischzentrifuge mit

kollektorlosem direktem Antrieb •

Unwuchtkontrolle • Bremssystem mit

Kurven, davon 10 frei wählbar

20

kompaktes kühlbares Gerät mit kollektorlosem

direktem Antrieb • Unwuchtkontrolle mit

Anzeige – GS-, UVV-, CE-zertigfiziert •

Bremssystem mit 20 Kurven, davon optional <

10 frei wählbar

6 . Kühlung/Bereich ( ° C )

N ucleoSwing Z513 K : m ax. – 1 0 ° C (routinuous use at 4 ° C), (tota l

t emperature range: – 10 ° C to 4 0 ° C )

N ucleoSwing Z513: without coolin g

- 20 bis +40 ° C bei einer Regelgenauigkeit vo n

± 1 ° C • tiefste Temperatur bei nmax: 0 °C

- 20 bis +40 ° C bei einer Regelgenauigkeit vo n

± 1 ° C • tiefste Temperatur bei nmax: 0 °C

7. Drehzahl (rpm/min)

k-Faktor

relative Zentrifugalkraft (g)

1 5,000 rpm / 25,900 x g -

stufenlos

bis 3.900 rpm / 2.360 x g

bis

30.000 rpm / 64.396 x g

bis 15.000 rpm / 25.155 x g

8.

Rotoren

8 .1 Rotortyp(en)

Specification of swing-out rotor 221.06 V01 (including wind shield) :

Max speed: 6,000 rpm • Max. load: 0.8 kg • Max. RCF: 6,000 x g •

Radius: 147 mm • Rotor weight: 7.65 kg • Rotor height: 147 mm •

Bucket weight 793 g • Bucket dimension 126 x 102 x 56 mm

(Width x Depth x Height)

Ausschwing/Winkel

Winkel/Ausschwin

g

Ausschwing/Winke l

8 .2 Einsätze (Zahl/Vol.)

8 x 15 ml, 16 x 15 ml, 8 x 2,2 ml, 2 x 100 ml, 4

x 100 ml, Adapter für 50, 25 7 ml, 20 und 30 x

15 ml, Falconröhrchen 15 ml und Monovetten

6 x 85 ml, 8 x 50 ml, 30 x 2,2 ml, Falcon 15

und 50 ml, Adaptoren

4 x 500ml, 72 x 15 ml, 6 x 250 ml,

Mikrotiter,Ölrotor, Qiagensystem

8.3

Beladung

(min/max)

9 . Programmsteuerung für …

time • speed • temperature • force of braking •

pre-cooling • Storage of customized program protocols

freie Programmierung aller

einschl.Nutzerlaufkurven

Parameter

freie Programmierung

Nutzerlaufkurven

der

Parameter

einschl.

1 0. Datendokumentation

t ime • speed • temperature • force of brakin g

b is zu 50 Laufprogramme speicherba r bis zu 50 Laufprogramme speicherba r

1 1. Technische Daten

Dimensions 610 x 465 x 730 mm (Width x Height x Depth) •

Weight 90 kg • Noise level 72 dB(A) • Max. speed 15,000 rpm •

Max. volume 4,000 ml • Max. RCF 25,900x g • Admiss. Density 1.2

3

k g/dm • Admiss. kinetic energy 39,500 Nm • Electrical connectio n

230 V/50 Hz 1 Ph - 120 V/60 Hz 1 Ph • Current 11 A - 15 A •

Connected load 1,150 W - 840 W

kompaktes Tischgerät mit kollektorlosem Antrieb

und stufenloser Regelung der Drehzahl ab 100

r pm bei einer Regelgenauigkeit von ± 50 rp m

bei einer maximalen Beschleunigungszeit von

28s und einer min. Bremsrate von 280 s • Timer

• LCD-Display • Softstopp

L eistungsaufnahme/Wärmeabgabe: 1320 W Leistungsaufnahme/Wärmeabgabe: 2000 W

1 2. Extras/Besonderheiten

preisgünstig, kompakt, kollektorloser Antrieb ,

Hermetikbecher, UVV-, CE-zertifiziert

Kollektorloser Antrieb, kompakte

Tischzentrifuge, hochtourig, 1-Knopfbedienung,

UVV-, CE-, GS-zertifiziert

Kollektorloser Antrieb, kompakte

Tischzentrifuge, hochtourig, 1-Knopfbedienung,

Option für Laborroboter

1 3. Preis (für eine typische Konfiguration) on

reques t

EUR 1.48 0

EUR 7.80 0

EUR 7.900,0 0

|transkript LABORWELT Nr. IV/2001 | 31


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T

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M A R K T Ü B E R S I C H T

1 . Firmenanschrift/Ansprechpartner

Thermo Life Sciences Gmb H

Boschring 12

63329 Egelsbach

Tel: +49 (0)6103-408-165 oder –125

Fax: +49 (0)6103-408-122

eMail: info@lifesciences.de

www.thermo-lifesciences.de

Ansprechpartner: Dr. Hans-Peter Schuster

Thermo Life Sciences GmbH

Boschring 12

63329 Egelsbach

Tel: +49 (0)6103-408-165 oder –125

Fax: +49 (0)6103-408-122

eMail: info@lifesciences.de

www.thermo-lifesciences.de

Ansprechpartner: Dr. Hans-Peter Schuster

Thermo Life Sciences GmbH

Boschring 12

63329 Egelsbach

Tel: +49 (0)6103-408-165 oder –125

Fax: +49 (0)6103-408-122

eMail: info@lifesciences.de

www.thermo-lifesciences.de

Ansprechpartner: Dr. Hans-Peter Schuster

M

2 . Gerätebezeichnung/Serie

C entr a

G

M

P8R /

Centr

T T

a

F

M

Thermo

Forma Multi R

M icroma x

F

M

R /

Microma

T

x

3. Abmessungen des Systems

(Breite x Tiefe x Höhe, cm)

Gewicht

(kg)

7 7 x 61 x 44 122 kg

5 2 x 65 x 40 112 k g

31 x 59 x 25 (BxTxH )

4 . Einsatzgebiet (Produktion/Forschung)

Ü berwiegend Forschun g

Forschun

g

Forschun g

5.

Kurzbeschreibung des

seiner Komponenten

Produktes/Systems

und

Tischgerät • Hochgeschwindigkeitszentrifuge bis 30.300 rzb •

Geräuschpegel bei voller Geschwindigkeit weniger als 62 dB(A) •

Wartungsfreier Induktionsmotor • Schnelle Ankühlung des

Innenraums • Diagnosefunktionen für Ungleichgewicht, kein Rotor,

eckel offen, Geschwindigkeit, Kühlung, Stromausfall • At-Speed

Timer • Integrationsmodus (akkumulierte Zentrifugationswirkung)

optimalen Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit einzelner Läufe

Direkte Eingabe der relativen Zentrifugalbeschleunigung

D

M

zur


Besonders hohe Trennleistung durch hohe Drehzahl und

Beschleunigung • Autoklavierbare Rotoren • Aerosoldichte Rotoren

Geringer Platzbedarf • Bürstenloser Induktionsmotor • Geräuscharm

(weniger als 55 dB (A) bei Maximalgeschwindigkeit von 15.000

rpm/min


6 . Kühlung/Bereich ( ° C )

- 5 bis +4 0 °C - 9 bis +4 0° C in 1 ° C Schritte n

- 9 bis +4 0°C

7.

Drehzahl

k-Faktor

(rpm)

relative

Zentrifugalkraft

(g)

5 00 bis 6.000 rpm/min 50 bis 4.650 rzb

500 bis 16.800 rpm/min 50 bis 30.300 rzb Maximale

Beschleunigung 130.300 rpm/min

1000 bis

rpm/min

15.000

rpm/min

90

bis

21.000

rzb

Beschleunigung

75.000

8 . Rotoren

Rotoren mit 24, 40 und 48 Positionen für Mikroröhrchen von 0,25 bis

1,5 ml • Rotoren autoklavierbar und aerosoldicht

8 .2 Einsätze (Zahl/Vol.)

Einsätze für Mikroröhrchen (0,25ml, 296 Positionen, 9 bis 750 m l Einsätze von 250 ml bis 0,25 ml • Probenzahl von 4 bis 48 Proben

Gefäße (4 Positionen)

8 .3 Beladung (min/max)

M aximales Volumen 3 Lite r

Maximales Volumen 1 Lite r

Wahl zwischen

Betriebsarten:

Tischgerät (auch als Untertisch-

und Standmodel erhältlich) • 3

Liter Maximalvolumen • Für Bedienung mit Einmalhandschuhen

geeignetes Bedienfeld mit Digitalanzeige • Direkte Eingabe der

relativen Zentrifugalbeschleunigung • Wahl zwischen 5

Beschleunigungs- und 6 Abbremsprogrammen

8 .1 Rotortyp(en)

Verschiedene Festwinkel- und Ausschwingrotoren für Röhrche n Verschiedene Festwinkel- und Ausschwingrotoren

(auch Sputum Proben), Mikroplatten, Blutbeutel und Objektträger

9 . Programmsteuerung für …

Wahl zwischen 5 Beschleunigungs- und 6 Abbremsprogrammen •

Wahl zwischen Umdrehungsgeschwindigkeit und relativer

Zentrifugalbeschleunigung • 3 Zeitmodi • Bis 35 Programmspeicher

98 frei definierbare Programme mit Zugangsschutz • 1 Programm für

schnelle Abkühlen/Auswärmen • Arbeitsmodi: Zeit, AT-Speed,

Integrationsmodus • Beschleunigungs- und Bremsstufen

anwenderdefinierbar

2 Beschleunigungs- und

Kurzzeitlauf, Dauerbetrieb,

3

Abbremsprogrammen

manuell


10.

Datendokumentation

11.

Technische

Daten

1 2. Extras/Besonderheiten

Sonderanfertigung von Spezialrotoren möglich! • Auch als 1 Lite r

Tischmodel und als belüftetes Model erhältlich

Hohe

Model

Leistung

erhältlich

bei

geringer

Lärmbelästigung


Auch

als

ungekühltes

Nur

55

dB(A)

bei

21.000

x

g


Auch

als

ungekühltes

Model

erhältlich

1 3. Preis (für eine typische Konfiguration) 3 Liter-Model ab DM 17.000 Euro 899 0

• 1 Liter-Model ab DM 10.000 Euro 5560,

jeweils gekühlte Zentrifuge plus Ausschwingrotor

Preise ab DM 18.000

Ausschwingrotor)

Euro 9240 (gekühlte Zentrifuge plus

Preise ab DM 7500

Ausschwingrotor)

Euro 3834 (gekühlte Zentrifuge plus

32 | Nr. IV/2001 |transkript LABORWELT


P R O D U K T W E L T

Kennziffer 24 LW04

Software für die 2D-Gelauswertung

Seit mehr als 25 Jahren ist die

zweidimensionale Gelelektrophorese

(Klose et al., 1975; O

Farrell et al., 1975) Basistechnologie

für den experimentellen

Zugang zur Protein-Ausstattung

von Zellen. Im Zeitalter der

Functional Genomics, also der

globalen Sicht auf die verschiedenen

Ebenen des zellulären Genexpressions-Programmes,

ist

diese Technologie neben einer

Vielzahl von inzwischen arraybasierten,

chromatographischen

und massenspektrometrischen

Techniken immer noch die Methode,

um das zelluläre Proteinmuster

nahezu in seiner Gesamtheit

und in seinem momentanen

Status zu erfassen.

Trotz bahnbrechender Entwicklungen

ist es aber bis heute

schwierig, den gesamten Arbeitsprozeß

von der Proteinprobe

bis zum fertigen 2D-Gel zu

automatisieren. Folgt man der

Prognose von Ruth van Bogelen,

einer der Pioniere bei der Nutzung

der 2D-Gelelektrophorese

bei der Analyse dynamischer

Prozesse in Escherichia coli, ist

trotz dieser Schwäche ein ebenbürtiger

Ersatz bezüglich Auflösungskraft

und dynamischen Bereichs

höchstwahrscheinlich

nicht in fünf vielleicht sogar

noch nicht einmal in zehn Jahren

verfügbar.

Genauso, wie 1995 mit der Veröffentlichung

des H. influenzae-

Genoms (Fleischmann et al.,

1995) die Genomforschung noch

fast ausschließlich deskriptiven

Charakter hatte, befindet sich

die Proteomforschung noch heute

in diesem Stadium. Noch immer

ist der größte Teil der verfügbaren

„Manpower“ damit

beschäftigt, Gele zu produzieren,

Proteinspots zu identifizieren

und die Proteinmuster zu archivieren.

Von einer vollständigen

Analyse kann kaum die

Rede sein. Dies liegt zum einen

an Problemen bei der experimentellen

Reproduzierbarkeit

zweidimensionaler Gele, zum

anderen an der heute weitverbreiteten

Software alter Generationen,

die nicht in der Lage ist,

die experimentellen Varianzen

beim Gel-Lauf zu kompensieren.

Am Institut für Mikrobiologie

der Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald wird seit Mitte

der achtziger Jahre unter Leitung

von Michael Hecker am

Proteom von Bacillus subtilis, seit

den neunziger Jahren zusätzlich

an den Proteomen von Staphylococcus

aureus, Corynebacterium

glutamicum und anderen Grampositiven

Modellorganismen gearbeitet.

Besonders wichtig ist:

der Fokus der Arbeitsgruppe

liegt nicht in der beschreibenden

Proteomforschung, also der Erstellung

von Proteinkarten, sondern

in der Nutzung derselben

für die Charakterisierung dynamischer

Prozesse und der Physiologie

bakterieller Systeme,

was durch eine Reihe von Veröffentlichungen

belegt ist.

Beispielsweise wird gegenwärtig

gemeinsam mit der Bayer

AG an der Aufklärung von

Wirkmechanismen verschiedener

Antibiotikaklassen mit einer

Vielzahl von Einzelsubstanzen

auf Proteomebene – also der

letzten Stufe der Genexpression

– gearbeitet. Ferner wird aktuell

ein Projekt beendet, welches

sich mit der Aufklärung von

Änderungen im Proteinmengenund

Proteinsynthesemuster glukosehungernder

Bacillus subtilis-

Zellen beschäftigt. Wie in einem

Film laufen die Gelbilder eines

engen Probenregimes entlang

der Wachstumskurve ab, und

die Änderungen des intrazellulären

Proteoms werden visualisiert

und quantitativ erfaßt. Einzigartig

ist hier die gleichzeitige

Analyse von Synthese und Menge

von Proteinen, was zum Beispiel

Rückschlüsse auf Syntheseintensität

und Proteinstabilitat

zuläßt und somit für Fermentationsprozesse

bedeutungsvoll

werden kann.

Bei Staphylococcus aureus konzentriert

sich die Forschung auf

Regulatoren, die möglicherweise

für die Pathogenität bestimmter

Stämme verantwortlich sind.

Dafür werden Gelbilder von

Wildtypen und Mutanten im

entsprechenden Regulatorgen

unter Umweltbedingungen, die

zur Aktivierung dieser Gene

führen, verglichen.

Kennziffer 25 LW04

Um die aufwendigen Gelvergleiche

zu bewältigen, wird

Delta2D eingesetzt. Delta2D

konnte als eines der ersten Produkte

endlich die experimentellen

Verzerrungen der 2D-Muster

kompensieren und durch

konsequente Nutzung des sogenannten

Dual Channel Imaging

(Bernhardt et al., 1999) eine

Analyse der Gelbilder erheblich

beschleunigen. Neben der Erfassung

quantitativer Daten und

komfortablen Funktionen des

„Data Filtering“ bietet die Software

eine ständige Kontrolle

des Auswertungsprozesses

durch ausgeklügelte Visualisierungstechniken.

Superspeed-

Zentrifuge

Eine wartungsarme Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge

hat

das Hanauer Unternehmen

Kendro mit der Sorvall ®

Evolution TM RC vorgestellt.

Erreicht wird dies bei dem

Gerät, das sich durch Drehzahlen

bis 26.000 U/min und sehr

kurze Brems- und Beschleunigungszeiten

auszeichnet,

dadurch, daß das komplette

wartungsintensive Vakuumsystem

weggelassen wurde. Die

letzten fünf Laufprotokolle

speichert die Superspeed-

Zentrifuge, für die eine große

Auswahl verschiedener

Rotoren zur Verfügung steht,

automatisch.

Kennziffer 26 LW04

DNA vollautomatisch

Kennziffer 27 LW04

Bis zu 30 µg Gesamt-DNA magnetisch

aus unterschiedlichstem

Probenmaterial in hoher

Qualität extrahieren: Vollautomatisch

geht es mit dem Magnetseparator

AGOWA ® Maxisep

7200. Dieser bearbeitet 72

Proben aus Ausgangsvolumen

von bis zu 2ml gleichzeitig. Das

kompakte Gerät ist mit einer

Heiz- und Kühlfunktion ausgestattet

und auf Pipettierautomaten

verschiedener Hersteller appliziert.

Mikroplatten-

Lesegerät

Ein neues Mikrotiterplattenlesegerät,

das in Hochdurchsatz-

Testreihen eingesetzt werden

kann, hat Perkin Elmer Life Sciences

im September vorgestellt.

Wallac View Lux TM detektiert

mit einer Peltier-gekühlten

CCD-Kamera sowohl zeitaufgelöst

Fluoreszenz- als auch Fluoreszenzpolarisations-Assays.

Daneben lassen sich etwa auch

Lumineszenz, Absorption und

radiometrische Assays messen.

Nach Herstellerangaben erreicht

das Gerät einen stündlichen

Durchsatz von 200.000

Proben und akzeptiert Mikrotiterplattenformate

mit mehr als

1.526 Kammern. Es können in

einem Meßgang bis zu 64 Platten

geladen werden.

|transkript LABORWELT Nr. IV/2001 | 33


P R O D U K T W E L T

Kennziffer 28 LW04

Einstieg in die professionelle Ultrafiltration

Impressum

Die Themenhefte |transkript

LABORWELT erscheinen vierteljährlich

als Supplement des Nachrichtenmagazins

BioTechnologie

|transkript im Verlag der

BIOCOM AG

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Redaktion:

Dipl. Biol. Thomas Gabrielczyk

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Leserservice:

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Graphik & Bildredaktion:

Heiko Fritz

Alle Beiträge sind urheberrechtlich

geschützt. Ohne schriftliche Genehmigung

der BIOCOM AG darf kein

Teil in irgendeiner Form reproduziert

oder mit elektronischen Systemen

verarbeitet, vervielfältigt oder

verbreitet werden.

© BIOCOM AG, Berlin

Beilagenhinweis: Dieser Ausgabe

liegt eine Beilage (Teilbeilage) des

Neues Unternehmertum e.V. bei

Die Ultrafiltration gewinnt in

der Aufarbeitung pharmazeutischer

und biotechnologischer

Wertstoffe immer mehr an Bedeutung.

Bestand das Hauptmolekülen,

wird sie nun auch

für die Zellernte, die Virustiterreduktion

und die Depyrogenisierung

eingesetzt.

Für den Laborbereich stellt Pall

Life Sciences mit dem neuen

Minimsystem ein Gerät vor, das

sich an individuelle Bedürfnisse

anpassen läßt. Kernstück des

Systems ist ein kompaktes Basisgerät

mit Pumpe und Magnetrührer.

Es läßt sich mit folgenden

Komponenten ergänzen:

Vorlagegefäße von 100ml bis

2L Volumen

Manometer oder digitale

Druckanzeige

CentramateLV-Membranhalter

mit extrem niedrigem Totvolumen

für Membranen mit

90cm 2 oder 180cm 2 .

Da die CentramateLV-Membranen

die gleiche Kanallänge so-

Kennziffer 29 LW04

High throughput preparation of

nucleic acids

NucleoSwing Z513 high-speed

bench top centrifuge was developed

by the cooperation of

MACHEREY-NAGEL and

HERMLE. The centrifuge is suitable

for simultaneous 8-well

and 96-well format extraction

of nucleic acids from biological

samples. Thereby, 2 96-well

plates or 2 column holders with

8-well strips of the NucleoSpin ®

Multi 96 or Multi-8 kits can be

used in combination with deepwell

blocks or MTP´s. This

makes a fast high-throughput

preparation possible, such as

the isolation of ultrapure genomic

DNA (NucleoSpin ® Multi

96/Multi 8 Blood kit for whole

blood, serum, plasma, biological

fluids ; NucleoSpin ® Multi 96/

Multi 8 Plant kit for plants,

food, funghi ; NucleoSpin ® Multi

96/Multi 8 Tissue kit for e.g.

cells, tissue, bacteria, mouse

tails).

NucleoSwing Z513 in combination

with a swing-out rotor has

a maximum speed of 6.000 rpm

and maximum RCF value of

6.000 x g. The low noise level of

72 dB(A) is achieved by the integrated

rotor wind shield, maanwendungsfeld

dieser Technik

bislang in der Konzentrierung

und Diafiltration von Biowie

die gleiche Kanalgeometrie

wie größere Produktionssysteme

aufweisen, eignen sie sich

besonders für das Scale-Up auf

Centramate- und Centrasettesysteme.

Mit entsprechenden

Ausbausätzen lassen sich aber

auch andere Membranhalter

verwenden, die den Einsatz

von Membranflächen bis zu

1000 cm 2 ermöglichen.

Das Minimsystem ist somit ideal

für die

Optimierung und Validierung

von Ultrafiltrationsprozessen

im Scale-Up

Produktion kleiner Chargen

Scale Down-Untersuchungen

Das Minimsystem empfiehlt

sich allen Anwendern, die ein

kompaktes und ausbaufähiges

System suchen, das sich immer

wieder an neue Aufgabenstellungen

anpassen läßt.

king it possible to operate the

centrifuge in any laboratory.

NucleoSwing Z513 K allows the

cooling of maximum – 10 o C

(total temperature range: – 10

o

C to 40 o C).

Kennziffer 30 LW04

Multicolor

Beads

Einen neuen Flyer mit einer

großen Produktpalette farbiger

Partikel für die Entwicklung

sogenannter „Lateral Flow

Assays“ hat die Firma Prolabo/

estapor ® jetzt herausgegeben.

Diese können zum Nachweis

von Zielsubstanzen in der

medizinischen und veterinärmedizinischen

Diagnostik

sowie in der Umweltanalytik

eingesetzt werden. estapor ®

bietet eine Vielzahl verschiedenfarbiger,

fluoreszenter,

bioaktivierter superparamagnetischer

Partikel an. Die farbigen

Partikel haben nach Unternehmensangaben

wesentliche

Vorteile gegenüber den

normalerweise für dieses

Testformat genutzten

Goldpartikeln. Angeführt

werden etwa eine bessere

Reproduzierbarkeit der

Versuche durch geringe

sogenannte Lotvarianzen,

Lotgrößen im 1 kg-Format

sowie eine Partikelgrößenverteilung

mit sehr geringer

Standardabweichung. Dadurch,

daß die Prolabo/estapor ® -

Partikel in mehr als einhundert

verschiedenen Farben erhältlich

sind, bietet sich die Möglichkeit

zur zeit- und kostensparenden

Identifizierung verschiedener

Analyte in einem Ansatz. Die

Kopplung mit zur Detektion

wichtigen Molekülen kann

vermittels Adsorption oder

kovalent erfolgen. Des weiteren

bietet estapor ® eine Produktion

aller Partikeltypen nach

Kundenwunsch sowie ihre

individuelle Aktivierung oder

Beschichtung. Einen Flyer, der

neben technischen Informationen

applikationsspezifische

Empfehlungen zur Nutzung

farbiger Partikel in „Lateral

Flow Assays“ enthält, kann

angefordert werden. Vertrieben

werden die Beads in Deutschland

durch die kmf Laborchemie,

die auf der MEDICA

(Stand C24 Halle 2) in

Düsseldorf vertreten sein

wird.

Kennziffer 22 LW 04 oder www.biocom.de Information ordern

34 | Nr. IV/2001 |transkript LABORWELT


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