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Wissenschaft Tumorzellnachweis

Hochsensitiver Nachweis

von Tumorzellen mittels

Amplikon-Fusion-Site-PCR

Axel Weber und Holger Christiansen, Abteilung für Kinderhämatologie,

-hämostaseologie und -onkologie der Universitätskinderklinik Leipzig

Hochsensitive Verfahren zum direkten Nachweis von Tumorzellen und tumorzellspezifischen

Veränderungen auf Genom- (DNA) oder Genexpressions(mRNA)-Ebene halten zunehmend

Einzug in die klinische Praxis. Aktuell sind zytologische und molekulargenetische, insbesondere

PCR-basierte Methoden, wichtige diagnostische Bausteine im Rahmen der Untersuchung auf

das Vorliegen einer minimalen Resterkrankung (Minimal residual disease = MRD) hämatologischer

Malignome geworden, vor allem bei der akuten lymphatischen Leukämie (ALL). Mit den

entsprechenden Verfahren lassen sich geringste Mengen von Tumorzellen im Knochenmark,

peripherem Blut oder auch anderen Geweben und Körperkompartimenten (z.B. Lymphknoten,

Metastasen, Liquor, Urin etc.) nachweisen. In zunehmendem Maße wird die MRD-Diagnostik

auch zur Beurteilung des Remissionsstatus verschiedener solider Tumore genutzt. Ein Weg,

Tumorzellen beziehungsweise deren Genom mit absoluter Spezifität und hoher Sensitivität zu

detektieren und zu quantifizieren, bietet die Amplikon-Fusions-Stellen-PCR (AFS-PCR). Dieses

Verfahren, das wir in der aktuellen Ausgabe des Journal of Clinical Investigation (2011;121(2):545-

553. doi:10.1172/JCI44415) 1 vorstellen, detektiert spezifische Fusionsbereiche zwischen Einzelkopien

amplifizierter Genomabschnitte (ampGA).

Der Nachweis und die Quantifizierung geringster

Mengen an Tumorzellen in Knochenmark,

peripherem Blut oder Geweben bzw. Körperkompartimenten

(Lymphknoten, Metastasen,

Liquor, Urin etc.) im Verlauf onkologischer

Erkrankungen kann eine wichtige Aussage

über das Therapieansprechen der Erkrankung

geben, zum Beispiel nach den ersten Therapieelementen

(Operation, Chemotherapie,

Bestrahlung). Die Diagnostik auf das Vorliegen

einer minimalen Resterkrankung (MRD)

entspricht einem in vivo-Assay der jeweiligen

Malignome bezüglich der individuellen Therapiesensibilität

und -effektivität. Derzeit

werden Informationen über eine MRD bereits

routinemäßig zu festgesetzten Zeitpunkten

der Therapie im Rahmen verschiedener

Leukämieformen eingesetzt und dienen hier

teilweise auch als unabhängige Prognose- und

Stratifizierungsparameter 1–5 . Der Einsatz der

MRD-Diagnostik zur Beurteilung des Remissionsstatus

verschiedener solider Tumore ist

aktuell Gegenstand intensiver Forschung. Eine

weitere, potentielle Anwendungsmöglichkeit

hochsensitiver MRD-Verfahren ist der Nachweis

minimaler Mengen von Malignomzellen

in Stammzell- oder Knochenmarkpräparaten,

die für eine eventuelle autologe Transplantation/Retransfusion

des jeweiligen Patienten

genutzt werden könnten. Neben den methodischen

Herausforderungen müssen hier auch

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immer die Auswertbarkeit und die klinische

Relevanz der erhobenen Daten berücksichtigt

werden.

Methoden der MRD-Diagnostik

Die Ansprüche an eine möglichst optimale

MRD-Diagnostik sind:

I eine möglichst absolute Tumorzellspezifität,

I eine möglichst hohe Sensitivität und

I eine möglichst valide Möglichkeit zur absoluten

oder zumindest relativen Quantifizierung

der Tumorzelllast.

Derzeit findet vor allem die Durchflusszytometrie

(FACS-Analyse) als Nachweismethode

residueller maligner Blasten in der Leukämiediagnostik

breite Anwendung 2,3 . Daneben haben

sich verschiedene PCR-basierte Verfahren

zur Detektion von Malignomzellen etabliert:

I Die klonspezifische PCR in Rearrangementbereichen

von Genen, die für Immunglobulinketten

(IgH, TCR, etc.) kodieren (Nachweis

auf DNA-Ebene) 4-6 . Diese Methode ist per

definitionem nur für Leukämieerkrankungen

sinnvoll einsetzbar, denn nur in diesen

können die genomischen Rearrangements

gefunden werden.

I PCRs, die über einen Fusionsbereich spezifischer

Translokations-Fusionstranskripte (z.B.

BCR/ABL, Tel/AML1) gelegt werden 7,8 . Der

Nachweis von Fusionstranskripten ist in den

meisten Fällen Tumorzell-spezifisch. Allerdings

findet der Nachweis auf mRNA-Ebene

Abb. 1: Entwicklung einer Tumorzellspezifischen

und Patientenindividuellen

AFS-PCR

statt. Die verglichen mit genomischer DNA

wesentlich höhere Instabilität der mRNA

kann direkten Einfluss auf eine robuste und

valide quantifizierbare MRD-Diagnostik

haben.

I PCRs für „Tumorzell-spezifische“ Genexpressionsmuster

9,10 . Die Spezifität der Expression

einzelner oder mehrerer Gene für Tumorzellen

kann im Verlauf allerdings nur bedingt

garantiert werden, denn durch die in den Therapieschemata

eingesetzten Medikamente

sind theoretisch alle im Körper befindlichen

Zellen in ihrer Genexpression beeinflussbar.

Eine valide Quantifizierung kann somit auch

hier nicht sichergestellt werden.

I PCRs, die die genomischen Veränderungen

(Amplifikationen, Deletionen, Translokationen,

Punktmutationen) auf DNA-Ebene

nachweisen 11 Bei Translokationen und Punktmutationen

stellt das Auffinden der betroffenen,

spezifisch veränderten Sequenzen ein

Hauptproblem dar. Dieses kann technisch

sehr aufwendig und dadurch für den

6 | 12. Jahrgang | Nr. 1/2011 LABORWELT

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