Bioprozesstechnik - TCI @ Uni-Hannover.de

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Bioprozesstechnik - TCI @ Uni-Hannover.de

Prof. Th. Scheper Institut für Technische Chemie

Vorlesungsskript (erstellt in Zusammenarebit mit Dr. Lary Kreye, Dr. Chr. Schippers)

Bioprozesstechnik

DECHEMA-Definition: Einsatz biologischer Prozesse im Rahmen technischer

Verfahren und industrieller Produktionen

Biotechnologie kann als anwendungsorientierte Wissenschaft der Mikrobiologie, Biochemie

und Molekularbiologie in enger Verbindung mit anderen Naturwissenschaften (z.B.

Technische Chemie, Ingenieurwissenschaften, Physik, Mathematik) gesehen werden.

Reaktionen mit: lebenden Mikroorganismen

pflanzlichen Zellen

tierischen Zellen

ruhenden Zellen/ Gewebe

Zellteilen

Enzymen

weitere Anwendung: Landwirtschaft, medizinische Technik, Umwelttechnik

Seit wann gibt es die Biotechnologie ?

I) Empirische Biotechnologie:

7000 v.Chr. Bierbrauen (Babylonien)

Biotechnologische Verfahren und Produkte bis zur Zeitwende:

- Sauerteig (Brot)

- alkoholische Gärung (Wein)

- Essigherstellung

- Käse

Erste industrielle Techniken im Mittelalter:

- Ethanolherstellung (Destillation)

- Ledergerberei

- technische Essigproduktion

- ab 19.Jh.: Milchsäureproduktion

II) Übergang zu technischer Mikrobiologie oder klassischer Biotechnologie:

- Darstellung von: - Butanol, Aceton (1915/16)

- Glycerin (1915/16)

- Zitronensäure (1920)

- Abwasserreinigung

- Backhefeherstellung

III) Moderne Biotechnologie, biochemical engineering:

Beginn: Entdeckung der Antibiotika

Entdeckung der Methoden der Gentechnik


Einführung in die Biotechnologie - 2 -

Ein wenig Mikrobiologie

Seitdem der niederländische Naturforscher Antony van Leeuwenhoek um 1700 nachweislich

die ersten Bakterien entdeckte, hat die Wissenschaft von den kleinen Lebewesen, die

Mikrobiologie, eine rasante Entwicklung mitgemacht. Dies war eine wichtige Voraussetzung

für die Biotechnologie.

Im folgenden Kapitel sollen daher verschiedene, grundlegende mikrobiologische

Sachverhalte und Arbeitstechniken vorgestellt werden, um einen kurzen Einblick in dieses

Fachgebiet zu vermitteln. Biotechnologische Aspekte werden dabei ebenfalls berücksichtigt.

1 Von den Kleinsten der Kleinen

In der Natur gibt es eine Vielzahl von Lebensformen, die sich in der Regel einer der drei

folgenden Gruppen zuordnen lassen.

Die normalerweise unbeweglichen Pflanzen zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus,

Sonnenlicht zum Aufbau körpereigener Substanzen nutzen zu können. Hierzu gehören der bis

zu 120 m hoch werdende Mammutbaum (Sequoia) als auch winzig kleine Vertreter, die zum

Teil nicht größer als 0,02 mm sind. Sie alle synthetisieren aus anorganischen Stoffen

organische Substanz, weshalb sie auch Produzenten genannt werden. Die Erforschung dieser

Lebewesen ist Gegenstand der Botanik.

Durch wesentlich komplexere Bewegungs- und Sinnesleistungen zeichnen sich

demgegenüber die Tiere aus. Sie bauen als sogenannte Konsumenten die von den Pflanzen

gebildete organische Substanz wieder unter Energiegewinn um oder ab. Zu dieser Gruppe

gehören Vertreter wie der Blauwal, der mit einer Länge von 30 m das größte derzeit lebende

Säugetier ist. Aber auch winzig kleine Organismen wie die einzelligen Protozoen gehören

dazu, die minimale Ausmaße von etwa 0,01 mm erreichen können. Das Studium der Tiere

bildet das Arbeitsfeld der Zoologie.

Irgendwann muß die organische Substanz, die in Pflanzen und Tieren festgelegt ist, wieder

in die anorganischen Bausteine zerlegt, d. h. mineralisiert werden. Dies wird durch die

Destruenten geleistet. In erster Linie werden hierzu Bakterien und Pilze gezählt, die,

zusammen mit den Viren, im Fachgebiet der Mikrobiologie bearbeitet werden (s. Abb. 1). Die

Mikrobiologie stellt also die Lehre des Lebens mikroskopisch kleiner Objekte dar (logos

(griech.) Vernunft, Begriff / (bios (griech.) Leben-, das Leben betreffend). Je nach

Untersuchungsobjekt wird diese Wissenschaft noch weiter unterteilt in Bakteriologie,

Mykologie („Pilzkunde“) und Virologie. In den Grenzbereich zu anderen biologischen

Richtungen fallen die Algologie und die Protozoologie. Schon sehr früh wurden diese

Organismen unter dem Sammelbegriff Protisten zusammengefaßt. Protisten weisen eine

geringere morphologische Differenzierung als Pflanzen und Tiere auf und sind meistens einzellig.

Viren sind nicht-zelluläre Teilchen, können sich nur mit Hilfe fremder Zellen vermehren

und unterscheiden sich dadurch von den Organismen. Abb. 2 gibt die

Größenverhältnisse zwischen Zellen, Viren und Sporen im Vergleich mit einem menschlichen

Haar wieder.


Einführung in die Biotechnologie - 3 -

Objekte der

Botanik Zoologie Mikrobiologie

Abb. 1: Objekte verschiedener Fachrichtungen

der Biologie

Mikroorganismen sind überall: im Boden, im Wasser und in der Luft, in Gebäuden, an und

in Pflanzen und Tieren. Ein Mensch beherbergt z. B. etwa 10mal so viele Keime, wie er

körpereigene Zellen hat. Bei Vorliegen von „günstigen“ Verhältnissen können

Mikroorganismen in bestimmten Fällen Krankheiten verursachen, viel häufiger sind sie aber

für den Menschen nützlich. So helfen Darmbakterien bei der Verdauung der Nahrung; auf der

Haut angesiedelte Bakterien schützen vor Fremdinfektionen.

1.1 Die zwei Zelltypen

tierische Zelle

Alle Organismen lassen sich differenzieren in Pro- oder Eukaryonten (synonym:

-karyoten). Karyon bedeutet Kern.

Pro- (lat.) bedeutet Vor- ... Prokaryonten sind also die Organismen mit einem „Vorkern“, d.

h. sie haben einen ringförmig geschlossenen DNA-Strang, der frei im Cytoplasma liegt. Das

Cytoplasma stellt dabei eine wäßrige Lösung von Proteinen, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten

und Ionen dar und wird von der Zellmembran umschlossen. Zu den Prokaryonten werden die

Bacteria und Archaea gezählt, auf die im folgenden noch näher eingegangen wird (s. Kap.

1.2).

Demgegenüber stehen die Eukaryonten (eu (griech.) gut); hier liegt die DNA in einem

echten, membranumschlossenen Zellkern vor. Hierzu gehören alle anderen Organismen, also

Pilze, Pflanzen und Tiere.

Die beiden Gruppen unterscheiden sich jedoch nicht nur bezüglich des Zellkerns, sondern

auch noch in anderen Bereichen. Die Tab. 1 gibt einen Überblick der grundlegenden

Unterscheidungsmerkmale wieder.

Tab. 1: Gegenüberstellung der wichtigsten Unterschiede zwischen Pro- und Eukaryonten

5µm

menschliches Haar

Zellkern

Pilze

Hefezelle

Kokken

Hyphe

Spore

Bakterien

Stäbchen

Virus

Abb. 2: Größenverhältnisse in der Mikrobiologie

Die vergleichbaren Virusausmaße entsprechen

in etwa dem eines Punktes des Musters!

.


Einführung in die Biotechnologie - 4 -

Prokaryonten Eukaryonten

DNA als ringförmig geschlossener Strang frei echter Zellkern mit Chromosomen

im Cytoplasma („Bakterien-Chromosom“)

keine Organellen (→ membranumschlossene,

differenzierte Zellbestandteile spezieller Funktion)

kleine Ribosomen (70 S) (→ übersetzen die genetische

Information in Proteine)

morphologisch gering differenziert (Grundform:

Kugel oder gerade bzw. gekrümmte

Zylinder), dafür viele stoffwechselphysiologische

Besonderheiten (s. u. a. Kap. 1.4)

Organellen (u. a. Mitochondrien

(„Kraftwerke der Zelle“) und speziell

bei Pflanzen Chloroplasten (Ort der

Photosynthese))

große Ribosomen (80 S)

zunehmender Differenzierungsgrad von

Einzelzelle zum Organismus

In Abb. 6 sind zwei repräsentative Vertreter der beiden Gruppen dargestellt: die

Bakterienzelle für die Prokaryonten und die embryonale Pflanzenzelle für die Eukaryonten.

Poly-β-hydroxybuttersäure

Glykogeneinschluß

Fetttröpfchen

Polyphosphatgranula

"Zellkern"

Plasmid Ribosom

Geißel

Cytoplasma

Cytoplasmamembran

periplasmatischer Raum

Mureinschicht

äußere Membran

a)

Nucleolus rauhes endoplasmatisches Reticulum

Zellkern Kernhülle Vakuole Dictyosom

Lipidtröpfchen

Plasmodesmos Zellwand

Ribosom

Mittellamelle

Mitochondrium

Cytoplasmamembran

glattes endoplasmatisches Reticulum

Die Darstellung eines auch nur annähernd umfassenden Stammbaums aller Lebewesen würde

den Rahmen einer „Einführung in die Biotechnologie“ sprengen.

Hier soll daher nur eine stark vereinfachte Graphik eines Dendrogramms dargestellt werden,

das auf Basis von 16/18 S rRNA-Untersuchungen aufgestellt werden konnte. Die ribosomale

Ribonucleinsäure eignet sich hervorragend für solche Analysen, da sie gut isoliert und

analysiert werden kann. Zudem finden Veränderungen in bestimmten Bereichen der rRNA

mit der richtigen statistischen Häufigkeit statt. Die gewonnenen Daten lassen sich

anschließend z. B. per Computer vergleichsweise einfach auswerten und vergleichen. Der

dargestellte Stammbaum gibt die Dreiteilung der Lebewesen wieder. Je kleiner der Abstand

zwischen zwei Punkten, desto kleiner sind die Unterschiede in der Nukleinsäuresequenz, um

so größer ist also die Verwandtschaft. Eukaryonten (Eucarya) sind daher enger mit Archaea

verwandt, als mit den Bacteria. Das ganze Stammbaumsystem muß derzeit ständig verändert

und er-weitert werden, da durch intensive Forschungsarbeit und die Weiterentwicklung (bio-

)chemischer und physikalischer Methoden ständig neue Organismen entdeckt und bereits

bekannte besser charakterisiert werden.

b)

Abb. 6: Gegenüberstellung einer pro- und einer eukaryontischen Zelle

a) Prokaryontische Zelle (am Beispiel: Bakterienzelle)

links: Präsentation einiger Zelleinschlüsse, artifiziell

rechts: Darstellung restlicher „normaler“ Zellbestandteile

b) Eukaryontische Zelle (am Beispiel: Pflanzenzelle)


Einführung in die Biotechnologie - 5 -

Bacteria

Eucarya

Archaea

Abb. 7: Stark simplifizierter, auf

Analyse der rRNA basierender

Stammbaum

der Lebewesen,

In den folgenden Kapiteln sollen die verschiedenen

Großgruppen der Mikrobiologie, also Bacteria, Archaea

und Pilze, aber ebenso die Organismengruppen der

Übergangsbereiche zu anderen biologischen Disziplinen,

nämlich Algen und Protozoen, vorgestellt werden.

1.2 Die verschiedenen Gruppen der

Prokaryonten

So wie sich Pro- und Eukaryonten klar voneinander

unterscheiden lassen, so kann innerhalb der Gruppe der

Prokaryonten wieder gut in Bacteria und Archaea differenziert

werden.

1.2.1 Bacteria

Die folgende Übersicht gibt eine Unterteilung nach Morphologie und GRAM-Färbbarkeit

wieder, die sich am Lehrbuch „ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE“ von H. G. Schlegel 1 orientiert.

(Zwei grundlegende Bücher für die Bestimmung von Prokaryonten sind „BERGEY’S MANUAL

OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY“ 2 und „BERGEY’S MANUAL OF SYSTEMATIC

BACTERIOLOGY“ 3 .) Die Unterteilung nach den beiden Aspekten Morphologie und GRAM-

Färbbarkeit heißt aber auch, daß innerhalb einer Gruppe stehende Organismen nicht

unbedingt nah verwandt sein müssen. Um ein Beispiel aus der Zoologie zu nennen: Sowohl

Haie als auch Delphine haben einen stromlinienförmigen Körper und Flossen, jedoch gehören

erstere zu den Knorpelfischen und damit zu einer erdgeschichtlich sehr alten Art, Delphine

dagegen sind Säugetiere, die sich wieder an das Leben im Wasser angepaßt haben. Für die

verschiedenen Gruppen sind in den meisten Fällen repräsentative Beispiele angegeben.

1. Kokken (Cocci), kugelförmige Bakterien

GRAM-positiv: Streptococcus, Staphylococcus

GRAM-negativ: Neisseria

2. Stäbchen, gestreckt zylinderförmige Bakterien

GRAM-positiv: Bacillus

GRAM-negativ: Pseudomonas, Escherichia, Serratia, Vibrio

3. Gekrümmte Stäbchen oder flexible Zellen

GRAM-positiv

GRAM-negativ: Spirillum

4. Große Sondergruppen

- gleitende Bakterien

- Bakterien mit Anhängseln

1 Schlegel, H. G. (1992) Allgemeine Mikrobiologie. 7., überarbeitete Auflage unter Mitarbeit von

Christiane Zaborosch, Thieme, Stuttgart • New York

2 Buchanan, R. E.; Gibbon, N. E. (Herausgeber) (1974) Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.

8. Aufl., Williams & Wilkins, Baltimore

3 Krieg, N. R.; Holt, J. G. (1984-1989) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Bd. 1-4, Williams

& Wilkins, Baltimore


Einführung in die Biotechnologie - 6 -

- obligat parasitische Bakterien

- Mycoplasma-Gruppe (Bakterien ohne Zellwand)

- phototrophe Bakterien (Bakterien, die Photosynthese betreiben),

z. B. Cyanobakterien (Blaualgen)

Die nach dem dänischen Mikrobiologen Gram (1884)

benannte Färbung stellt ein wichtiges Kriterium bei der

Bestimmung von Bakterien dar, die sich in GRAMpositive

und GRAM-negative Keime klassifizieren lassen

(s. Abb. 8). Später wurde herausgefunden, daß diese Anfärbung

in der Hauptsache mit der Dicke der Zellwand

korreliert. Diese besteht bei den Bacteria aus einem

Peptidoglycan, dem sogenannten Murein. Zwei unterschiedliche

Monosaccharide, die sich beide auf Glucose

als Grundkörper zurückführen lassen, bilden über

glykosidische Bindungen lange Ketten, die über

Peptidbrücken miteinander zu einem Makromolekül

quervernetzt sind. Das Mureinnetz, auch als

Mureinsacculus bezeichnet, gleicht der Lederhülle eines

Balls, durch den Turgordruck des inneren, membranumschlossenen

Teils wird die Stabilität

gewährleistet. GRAM-positive und GRAM-negative

Bakterien unterscheiden sich in der Dicke der Zellwand.

Daneben besitzen GRAM-negative Keime noch eine sogenannte

äußere Membran (s. auch Abb. 6 a). Die

1. Lackbildung

Anfärbung mit Kristallviolett

und Behandlung mit

Jodlösung

2. Differenzierung

Entfärbung durch Alkohol

oder Aceton

3. Gegenfärbung

Behandlung der Zellen

mit einem Kontrastfarbstoff

z.B. Fuchsin

chemische Zusammensetzung der unterschiedlichen Zellwände kann deshalb erheblich

differieren. Die Art der vorkommenden Moleküle oder deren chemische Bindung dient daher

häufig auch als Merkmal bei der Bestimmung eines Bakteriums.

Im Prinzip verläuft die GRAM-Färbung über die Herstellung eines wasserunlöslichen blauen

„Lackes“ in allen Zellen. Mit einem Lösemittel werden die Bakterien differenziert, d. h.

GRAM-negative werden dabei entfärbt, während GRAM-positive blau bleiben. Die farblosen

Zellen können dann noch mit einem anderen Farbstoff gegengefärbt werden.

Die Zellwand bzw. äußere Membran kann wieder von einer Kapsel umgeben sein (s.

Tuschekontrastierung, 1. Mikrobiol. Versuch, s. Kap. 1). Dabei handelt es sich um

Polysaccharid- oder Polypeptidschichten, die auf den Bakterien haften. Wenn sich diese

Schichten ablösen, entstehen Schleime. In biotechnologischen Prozessen ist die Produktion

von Kapseln oder Schleimen meist unerwünscht. Zum einen wird der Stoffaustausch

zwischen den Zellen und dem sie umgebenden Medium eingeschränkt und die Viskosität der

Nährlösung unnötig erhöht. Des weiteren können die Bakterien bzw. deren Schleime an

ungünstigen Stellen haften bleiben und Ventile, Pumpen u. a. verstopfen. Außerdem ist die

Kapsel- bzw. Schleimproduktion ein Syntheseweg, der in der Regel zu nutzlosen

Nebenprodukten führt und damit auf Kosten der Produktausbeute geht. Unter natürlichen

Bedingungen verleihen sie ihrem Träger Haftung und Schutz. In bestimmten Fällen können

sich Prokaryonten, z. T. unter Schleimabsonderung, auf festen Oberflächen fortbewegen. Sie

hinterlassen dann Schleimspuren, die, wenngleich auch sehr viel kleiner, vergleichbar denen

von Schnecken sind. Weitaus die meisten beweglichen Bakterien verfügen über Geißeln, die

durch Rotation die Zelle vorantreiben können.

Nur wenige Bakteriengruppen sind in der Lage, Dauerformen auszubilden. Am meisten

verbreitet sind dabei die sogenannten Endosporen, die gegen Strahlung, Trockenheit, hohe

Temperaturen und Chemikalien am widerstandsfähigsten sind. Die oft im Vergleich zur

blau

blau

blau

blau

rot

Abb.8: Die Durchführung der

Gram-Färbung

(links: GRAM-positiv

rechts: GRAM-negativ)


Einführung in die Biotechnologie - 7 -

Ausgangszelle nur ca. 1 /10 so große Spore wird intrazellulär gebildet und anschließend

freigesetzt. Die reifen Sporen zeigen keine erkennbare Stoffwechselaktivität; sie können so

bis zu 1.000 Jahre überleben und bei Verbesserung der Außenbedingungen wieder auskeimen.

Das Autoklavieren (20 min, 121°C) zielt auf die Abtötung der Sporen ab, denn vegetative

Zellen können meist bereits durch einfachere Verfahren (z. B. 10 min Erhitzung auf 60°C)

eliminiert werden.

In der Tabelle 2 sind einige biotechnologische Anwendungen von Bakterien aufgelistet, die

einen groben Überblick über die Vielfalt vermitteln soll.

Tab. 2: Einsatz von Bakterien in der Biotechnologie

Industriezweig

Anwendung/Produkt Beispiele

Nahrung Milch Joghurt, Buttermilch, Kefir, verschiedene

Käsesorten

Soja

Sauerkraut

Essig

Aromastoffe

Tempeh (zusammen mit Pilzen)

Natto (sauermilchartiges Getränk)

Polysaccharide Alginat (für Speiseeis)

Xanthan (in Getränken, Verdickungsmittel)

Pectinolytischen Enyzme zur Fruchtsaftklärung

Amylasen in der Getränkeindustrie zur Stärkeverflüssigung

Chemie Aceton

Butanol

Milchsäure

Aminosäuren L-Lysin, L-Glutaminsäure, L-Arginin u. a.

Pharma Antibiotika Streptomycin, Tetracyclin, Penicillin

Insulin (gentechnisch)

Interferon (gentechnisch) wird ebenfalls durch Zellkultivierung

gewonnen

Vitamine Vit. B12

Steroide (s. Kap. 1.3.1) (neben Pilzen)

Landwirtschaft Bioinsektizide von Bacillus thuringiensis

Futtermittelkonservierung Silage

Umwelt- Gewinnung hochwertiger = Leaching

biotechnologie Metalle aus Erzen

Entschwefelung von Kohle = Leaching (Schadstoffreduzierung bei der

Kohleverfeuerung)

Kompostierung neben Pilzen

Reinigung von Abwässern Klärwerk, neben Pilzen

Abluftreinigung neben Pilzen

Altlastensanierung neben Pilzen

Gentechnologie Standardorganismus E. coli (s. Kap. XX (Gentechnikteil))

Sonstiges Enzyme in Waschmitteln Proteasen, Lipasen oder Cellulasen

Zusatzstoffe in der Kosme- Polysaccharide in Cremes

tikindustrie

Biogasproduktion zur Energiegewinnung

Methangärung

In den folgenden Kapiteln werden verschiedene in der Tabelle aufgelistete Aspekte

ausführlicher dargelegt, daher sollen sie hier nicht näher behandelt werden.


Einführung in die Biotechnologie - 8 -

1.2.2 Archaea

In Faultürmen von Kläranlagen, in Salzseen und Salinen, auf glimmenden Kohleabraumhalden,

in kochenden Wasserquellen: Die Vertreter dieser Gruppe finden sich fast

ausnahmslos an extremen Standorten. Im Englischen heißen sie daher bezeichnenderweise

auch „Extremophiles“ (extrem (lat.) äußerst, radikal / phil- (griech.) Freund). In der

Hauptsache lassen sich die Archaea drei verschiedenen Untergruppen zuordnen:

- Methanogene Bakterien

(Methanbildung durch anaeroben Abbau von organischer Substanz)

- Halobakterien

(optimales Wachstum in einer 3,5 bis 4,5 M NaCl-Lösung, zum Vergleich: Meerwasser:

0,6 M)

- thermo-acidophile Bakterien

(heterogene Gruppe, Wachstumsoptima bei hohen Temperaturen (teilweise über 100°C)

und niedrigen pH-Werten (pH 1-2))

Daneben gibt es aber auch noch Vertreter, die ihr Wachstumsoptimum bei niedrigen

Temperaturen (5-20°C) oder bei pH-Werten > 9 haben. Die folgende Tabelle gibt einige

wichtige unterschiedliche Merkmale zwischen Archaea und Bacteria wieder:

Tab. 3: Gegenüberstellung der wichtigsten Unterschiede zwischen Archaea und Bacteria

Archaea Bacteria

Pseudomurein oder völlig andere Materialien Zellwand aus Murein

in der Zellwand

viele Besonderheiten bezüglich der Membran,

z. B. Glycerindiether bzw. Diglycerintetraether

mit C20 oder C40-Isoprenoideinheiten als Kohlenwasserstoffrest:

HO

O

O

Penicillin, Chloramphenicol u. a. Antibiotika

zeigen keine Wirkung

viele stoffwechselphysiologische Eigenarten:

spezielle Stoffwechselwege, neue oder andere

Enzyme und Coenzyme, Unterschiede bei der

Protein- oder Nucleinsäurebiosynthese

in der Cytoplasmamembran: Glycerinester:

langkettige Fettsäuren sind mit Glycerin über

Esterbindungen verbunden

HO

O

O O

O

mehr oder weniger gute Wirkung der Antibiotika

In der Biotechnologie finden Archaea oder deren Produkte zunehmend Anwendung, doch die

Palette der Nutzungsmöglichkeiten ist noch längst nicht ausgeschöpft.

Zur Zeit werden in erster Linie thermostabile Enzyme bei industriellen oder anderen

Prozessen eingesetzt, beispielsweise beim Abbau von Polymeren zu weiterverwertbaren

Monomeren. Etablierte industrielle Prozesse, wie z. B. die Verzuckerung von Stärke, können

durch Proteine von Archaea vereinfacht und damit effizienter gemacht werden. Im Rahmen

der Biosensorik werden biologische Komponenten mit Transducern gekoppelt, um die

sensitive und reproduzierbare Messung von Analytmolekülen zu ermöglichen. Vielfach sind

die Anwendungsmöglichkeiten dabei aber beschränkt, da die angewendeten Enzyme nicht


Einführung in die Biotechnologie - 9 -

stabil genug sind. Durch den Einsatz von Proteinen aus Archaea kann dieser Nachteil umgangen

werden.

Ebenso können aber auch ganze Zellen zur Anwendung kommen. So werden z. B. Federn,

die in großen Mengen bei der Geflügelhaltung anfallen, durch Kultivierung mit einem

Vertreter der Archaea bei vergleichsweise hohen Temperaturen (50-110°C) abgebaut. Vorteil

dabei ist nicht nur, daß das Entsorgungsproblem gelöst wird, sondern auch, daß aus dem

Keratin, aus dem die Federn bestehen, auch noch die Aminosäuren gewonnen werden können.

Die Anwendungsmöglichkeiten beschränken sich aber nicht nur auf die Nutzung der

thermostabilen Enzyme; auch andere Bestandteile wie z. B. Membrankomponenten oder

Speicherstoffe der Archaea könnten in biotechnologischen Prozessen Anwendungen finden.

Viele Arbeitsgruppen beschäftigen sich derzeit mit der Isolierung, der Charakterisierung und

dem biotechnologischen Einsatz dieser sehr interessanten Mikroorganismenguppe.

1.3 Die verschiedenen Gruppen der Eukaryonten

1.3.1 Pilze

Der Champignon ist wohl der bekannteste

Vertreter dieser Gruppe, die insgesamt weit

mehr als 100.000 Arten umfaßt. Meist führen

die Pilze ein Leben im Verborgenen; nur

wenn sie Fruchtkörper bilden, fallen sie auf.

Der prächtige Hut ist nur ein sehr kleiner

Teil des eigentlichen Pilzes: Viele bilden

Zellfäden, die als Hyphen bezeichnet

werden. Die Gesamtheit der Hyphen bildet

das Myzel. Der Hauptteil des Myzels des

Champignons befindet sich beispielsweise

im Boden, zur Bildung des Fruchtkörpers

wachsen die Hyphen in einem

„Pseudogewebe“; in der großen Masse

werden sie dann für das bloße Auge sichtbar

(s. Abb. 9). Aufgrund ihrer normalerweise

mikroskopisch kleinen Ausmaße fallen die

Pilze ins Fachgebiet der Mikrobiologie (s.

Kap. 1).

Im Unterschied zu den bisher behandelten

Organismengruppen, den Bacteria und den

Archaea, verfügen die Pilze über echte

Kernmembranen und auch alle anderen

Merkmale, durch die sich Eukaryonten

auszeichnen (s. Tab. 1).

Im Gegensatz zu den Pflanzen können sie

jedoch das Sonnenlicht nicht zur

Energiegewinnung nutzen; sie sind also auf

die Zufuhr organischer Verbindungen

angewiesen. Pilze leben daher entweder:

- symbiontisch,

- parasitisch oder

Abb. 9: Fruchtkörper eines Hutpilzes (Basidiomycet)

links: Hyphengeflecht (Myzel) (schematisch)

rechts: makroskopisch häufig erkennbare

überirdische Teile


Einführung in die Biotechnologie - 10 -

- saprobisch

Flechten sind beispielsweise Assoziationen von Pilzen und Algen. In der Gemeinschaft

können sie als Pioniere Lebensräume besiedeln, in denen andere Organismen, aber auch die

Symbiosepartner einzeln nicht überleben könnten. Wegen des exponierten Vorkommens der

Flechten und ihrer Empfindlichkeit gegenüber Luftverunreinigungen läßt eine systematische

Kartierung Rückschlüsse auf die Luftqualität im Untersuchungsgebiet zu. Als Mykorrhiza

(„Pilzwurzel“) wird die Symbiose zwischen Pilzen und vielen höheren Pflanzen bezeichnet,

die über die Wurzeln miteinander in Kontakt stehen.

Neben diesem Zusammenleben artverschiedener Organismen zum gegenseitigen Nutzen ist

der Parasitismus (Schmarotzertum) bei Pilzen ebenfalls verbeitet: Hierbei profitiert nur ein

Partner auf Kosten des anderen. Die Schäden, die jährlich durch Pilze weltweit an

Kulturpflanzen verursacht werden, sind beträchtlich. Demgegenüber ist nur ein sehr geringer

Anteil dieser Eukaryonten humanpathogen; die sogenannten „Fußpilze“ stellen wohl die

bekannteste und auch verbreitetste Gruppe dar.

Saprobisch lebende Pilze wachsen auf toten organischem Material, sind also beispielsweise

auf Komposthaufen, abgesägten Bäumen, eingelagerten Nahrungsmitteln oder verendeten

Tieren zu finden. Die Pilze stellen einen großen Teil der Destruenten und spielen daher eine

wichtige Rolle im Kreislauf der Natur (s. Kap. 1). Diese Mikroorganismen sind aber aufgrund

ihrer ausgeprägten Fähigkeit zum Polymerabbau durchaus in der Lage, Kleidungsstücke oder

verbautes Holz u. ä. zu zerstören. So stellt beispielsweise der Befall eines Wohnhauses mit

dem sogenannten Hausschwamm (Serpula lacrymans = Merulius l.) auch heute noch ein ernst

zu nehmendes Problem dar.

Von den Tieren unterscheidet die Pilze, daß in mindestens einer Phase ihres Lebenszyklus

Zellwände ausgebildet werden. Wie der „Panzer“ bei Insekten ist der Hauptbestandteil dieser

Zellwände vielfach Chitin.

Wie bei den Prokaryonten kann auch hier nur eine sehr einfache Einteilung der Pilze

wiedergegeben werden, da eine ausführlichere Behandlung den Rahmen dieser Einführung

sprengen würde. Als weitergehende Literatur der Mykologie (Pilz: (griech.) mykos, (lat.)

fungus) wird auf das Buch „MYKOLOGIE“ von E. Müller und W. Löffler4 , sowie auf

„KRYPTOGAMEN“ von K. Esser5 verwiesen. Einige biotechnologisch interessante Vertreter

werden jeweils bei den entsprechenden Gruppen aufgeführt.

1. echte Schleimpilze (Myxomyceten)

zelluläre Schleimpilze (Acrasiomyceten)

2. niedere Pilze (Phycomyceten)

3. höhere Pilze (Eumyceten)

a. Schlauchpilze (Ascomyceten)

Saccharomyces (Bier- oder Bäckerhefe), Claviceps (Mutterkornpilz),

Neurospora, Morchella (Morchel), Tuber (Trüffel)

b. Ständerpilze (Basidiomyceten)

Agaricus (Champignon), Serpula (Hausschwamm)

c. Fungi imperfecti (Deuteromyceten)

Aspergillus (Gießkannenschimmel), Penicillium (Pinselschimmel)

4 Müller, E.; Loeffler, W. (1982) Mykologie: Grundriß für Naturwissenschaftler und Mediziner.

4., überarb. u. erw. Aufl., Thieme, Stuttgart • New York

5 Esser, K. (1986) Kryptogamen: Cyanobakterien, Algen, Pilze, Flechten. 2. Aufl., Springer,

Berlin • Heidelberg • New York • Tokyo


Einführung in die Biotechnologie - 11 -

Neben einer großen Reihe von durch Pilze verursachte Schadwirkungen stehen aber auch sehr

viele Nutzanwendungen:

- Nahrungsmittel

- Produktgewinnung durch Kultivierung

- Biotransformationen

- Beseitigung von Abfall- oder Schadstoffen

Im folgenden soll auf die verschiedenen Stichpunkte eingegangen werden. Neben diesen

biotechnologischen Aspekten sollen aber auch weitere mykologische Grundlagen beschrieben

werden.

Seit langem werden Pilze gesammelt oder sogar speziell kultiviert, um sie als

Nahrungsmittel zu nutzen. Dabei sind genaue Kenntnisse vonnöten, um die ungiftigen von

giftigen Vertretern unterscheiden zu können. Des weiteren macht man sich die Bildung von

Aromastoffen z. B. bei der Veredelung von Nahrungsmitteln zunutze. So sind

Penicilliumarten für den intensiven und markanten Geschmack vieler Schimmelkäse

(Camembert, Roquefort, Brie) verantwortlich. Vertreter der gleichen Gruppe sorgen für den

weißen Schimmelüberzug auf

Salami. Die Hefen

(Sproßpilze) sind die

biotechnologisch wohl interessanteste

Gruppe (Abb. 10).

Nicht nur bei der Bier-,

Wein- und Brotherstellung,

sondern auch bei vielen

anderen industriellen Prozessen

wird diese Pilzgruppe

eingesetzt. Neben Ethanol

werden dabei u. a. auch

Glycerin, Fette und

Mutterzelle

sprossende Tochterzelle

Sproßnarbe

1 2 3

4 5 6

Abb. 10: Zellsprossung am Beispiel der Hefe Saccharomyces cerevisiae

(schematisch, sechs aufeinanderfolgende Stadien gezeigt)

(Zellmaße der Mutterzelle: ca. 5 * 8 µm)

Fettsäuren durch Hefekultivierung wirtschaftlich produziert. Saccharomyces cerevisiae ist

der bestuntersuchte Eukaryont und spielt auch eine wichtige Rolle in der Gentechnik (s. Kap.

XX, (Gentechnikteil)). S. cerevisiae, die aufgrund ihrer vielfältigen Einsatzmöglichkeiten

auch allgemein als Bier- oder Bäckerhefe bezeichnet wird, hat einen relativ einfachen

Lebenszyklus.


Einführung in die Biotechnologie - 12 -

In der Mykologie ist die Darstellung von Lebenszyklen gebräuchlich, um alle

morphologischen und physiologischen Formen eines Pilzes zu erfassen und deren Beziehung

deutlich zu machen. Anders als beispielsweise beim Menschen, bei dem sich aus diploiden

vegetativen Zellen durch Meiose haploide Keimzellen bilden, die sich nach Vereinigung

wieder zu diploiden vegetativen Zellen entwickeln, sind die Verhältnisse bei Pilzen sehr viel

vielfältiger und komplexer (s. Kap. 1.4.4). Einerseits gibt es neben der sexuellen Vermehrung,

die immer eine

Neukombination

von Erbmaterial

mit einschließt,

auch eine

vegetative asexuelle

Vermehrung,

wie sie z. B. auch

bei Pflanzen auftritt.

Auf die

Plasmogamie, also

die Verschmelzung

irgendwie gearteter

Vermehrungsstrukturen,

folgt

nicht unmittelbar

zwingend die

Karyogamie, d. h.

die Vereinigung der

Zellkerne. Es gibt

bei den Pilzen

deshalb nicht nur

haploide oder

diploide Zellen,

sondern ebenfalls

Formen mit zwei

oder mehr

Zellkernen.

Letzteres tritt zwar

nicht bei S.

cerevisiae auf

(Abb. 11), doch

können an diesem

Beispiel einige

andere

Sachverhalte

illustriert werden.

Zur näheren

Beschäftigung mit

dem Thema Pilze

sei auf o. g. Lehrbücher verwiesen. Des weiteren wird im 2. Kapitel eine Kultivierung mit

dieser Hefe durchgeführt.

.

Kernverschmelzung

(Karyogamie)

Vermehrung durch

Sprossung

Zygote

Vereinigung zweier

Ascosporen

(Plasmogamie)

aus Ascospore

gekeimte

haploide Zelle

Ascus, (Ort

der Meiose

und Ascosporendifferenzierung)

Ascospore

(haploid)

Vermehrung durch

Sprossung

vegetative,

diploide Zellen

vegetative,

haploide Zellen

weitere

Vermehrung durch

Sprossung

Ascusbildung

Abb. 11: Entwicklungszyklus von Saccharomyces cerevisiae

- Bildung von Asci nur bei Anzucht auf „armen“ Medien

- viele Kulturrassen bilden überhaupt keine Asci mehr

- Haploide Vermehrung nicht natürlich, sondern nur künstlich

erreichbar (s. Esser)

weitere

Vermehrung

durch

Sprossung


Einführung in die Biotechnologie - 13 -

Das Vorhandensein von vegetativen und sexuellen Vermehrungsformen kann für

unterschiedliche Zwecke ausgenutzt werden: zur Herstellung von Biomasse wird die

asexuelle Vermehrung, zum Gewinn von Organismen mit neuartigen oder kombinierten

Eigenschaften die sexuelle Vermehrung forciert. Die Kultivierung myzelbildender Pilze wie

beispielsweise Aspergillus- und Penicilliumarten führt zu Problemen bei der technischen

Handhabung (s. Abb. 12). Da meist nur ein endständiges Wachstum stattfindet, ist von der

gesamten Myzelmasse nur ein geringer Teil stoffwechselaktiv. Das im Vergleich mit

Bakterien oder zellulären Pilzen dichte Wachstum birgt bei der Nährstoffversorgung Probleme,

die zusätzlich durch die meist eintretende Viskositätserhöhung des Mediums noch

verstärkt werden. Für die Sporenbildung wird häufig zusätzlich ein Teil der

Stoffwechselenergie durch den Pilz verbraucht, die dann nicht mehr für die Produktsynthese

zur Verfügung steht. Aus diesen Gründen werden oft nur vergleichsweise geringe Raum-Zeit-

Ausbeuten erreicht. Im Gegensatz zu den zellulären Pilzen,

wo ein Kern pro Zelle vorliegt, ist des weiteren der Einsatz

gentechnischer Methoden bei Hyphenpilzen erschwert. Die

Zellkerne können keinen distinkten Bereichen im Zellschlauch

zugeordnet werden, sondern sind mehr oder

Spore

Abb. 12: Sporenträger von Penicillium

roqueforti

Die Abbildung macht die

die Bezeichnung „Pinselschimmel“

für die

Gruppe allgemein deutlich.

(Ausschnitt)

weniger beweglich. Trotz dieser Nachteile sind es vor

allem Schimmelpilze, die neben den Hefen eine breite

Anwendung in der Biotechnologie gefunden haben.

Neben Ethanol, „CO 2 “, Fetten und Fettsäuren gibt es

noch viele weitere industriell relevante Produkte, die durch

Kultivierung von Pilzen gewonnen werden können:

- Organische Säuren

Herstellung von Citronensäure, Gluconsäure oder

Oxalsäure beispielsweise durch Schimmelpilze (so wird

die Citronensäure

durch Aspergillus

niger produziert,

wenn Anfangs-pH-

Werte von 2,5 -

3,5 und Manganmangelbedingungen

herrschen).

HO

CH2 COOH

C COOH

CH2 COOH

Abb. 13: Citronensäure


Einführung in die Biotechnologie - 14 -

- Mono- bzw. Polysaccharide

z. B. das D-Mannit oder das als Nahrungsmittelzusatz oder Foliengrundstoff gebräuchliche

Pullulan

- Vitamine

z. B. das Riboflavin (Vit. B 2 )

- Enzyme

Auswahl: Pectinasen, Glucamylasen und ß-Galactosidasen, Cellulasen, Labferment

- Antibiotika

Penicillin (Abb. 14), Cephalosporin u. a.

Ersteres wird durch verschiedene Penicilliumarten

gebildet. Das Antibiotikum wirkt hauptsächlich

auf GRAM-positive Bakterien. Es beeinträchtigt

die Quervernetzung des Mureinsacculus

über Peptidbrücken bei wachsenden Zellen

(s. Kap. 1.2.1).

- Alkaloide

Diese werden durch Claviceps spec. gebildet und finden wie die Antibiotika Anwendung in

der Medizin.

Ein weiteres Gebiet, in dem Pilze in der Biotechnologie Anwendung finden, sind die

sogenannten Biotransformationen. Dabei wird ausgenutzt, daß Mikroorganismen sehr selektiv

chemische Reaktionen an hauptsächlich makromolekularen Stoffen durchführen können.

Durch Biotransformationen konnten viele vormals

O

HO

O

Progesteron

11-α-Hydroxyprogesteron

Abb. 15: Die mikrobielle Hydroxylierung

von Progesteron führt

zum 11-α-Hydroxyprogesteron

R

CO

NH

O

chemische nur sehr aufwendig durchführbare

Synthesen vereinfacht und wirtschaftlicher gemacht

werden. Dies gilt vor allem für die Herstellung von

Steroiden, die in der Medizin beispielsweise als

entzündungshemmende Medikamente oder als

Wirkstoff in Antibabypillen Anwendung finden. Die

Abb. 15 stellt eine mikrobiell katalysierte

Einzelschrittreaktion dar, die u. a. für die Synthese

von Cortison wichtig ist. Daneben können durch

Biotransformationen auch mehrere Reaktionen, also

Teilsynthesen, katalysiert werden. Reaktions- und

Stereoselektivität, Regiospezifität und milde

Reaktionsbedingungen sind die Vorteile, die sich

bei diesem biologischen Verfahren gegenüber

chemischen Prozessen ergeben.

N

Abb. 14: Penicillin

S

COOH


Einführung in die Biotechnologie - 15 -

Pilze sind ebenfalls an der Kompostierung beteiligt. Ein großer Anteil des Hausmülls aber

auch anderer Abfälle aus u. a. Agrar- bzw. Forstwirtschaft besteht aus Cellulose,

Hemicellulosen und Lignin. Am Abbau dieser Substanzen sind maßgeblich Pilze beteiligt, da

sie durch die Ausscheidung von Exoenzymen

diese wasserunlöslichen Substanzen zerkleinern,

anschließend aufnehmen und dann

metabolisieren können. Je nachdem, welcher

Anteil des Holzes durch den Pilz verwertet

werden kann, werden Braun- und Weißfäulepilze

unterschieden. Pilze, die die weiße Cellulose

zurücklassen, heißen Weißfäulepilze,

demgegenüber werden als Braunfäulepilze

diejenigen bezeichnet, die das braune Lignin

nicht, nur wenig oder erst später angreifen (wie z.

B. Serpula) So können z. B. auch vorhandene Schadstoffe angegriffen werden. Schon recht

früh wurde nachgewiesen, daß der Weißfäule verursachende Pilz Phanerochaete

chrysosporium schwerabbaubare Schadstoffe wie Benzo(a)pyren oder andere Substanzen

modifizieren kann.

1.3.2 Algen und Protozoen

Sowohl die Algen als auch die Protozoen

fallen in Grenzbereiche zu verschiedenen

anderen biologischen Teilgebieten (s. Kap. 1).

Der Vollständigkeit halber sollen sie hier kurz

behandelt werden.

Die Algen stellen eine sehr heterogene

Gruppe niederer pflanzlicher Organismen dar,

die sich durch den Besitz von Chlorophyll

auszeichnen. Die darauf zurückzuführende

Grünfärbung kann durch braune, rote oder

blaue Farbstoffe überdeckt sein. Die Algen

betreiben in der überwiegenden Mehrzahl

Photosynthese und gewinnen ihren

Zellkohlenstoff durch Fixierung von

Kohlendioxid aus der Luft: Ihre Lebensweise

wird daher als photoautotroph bezeichnet (s.

Kap. 1.4.2). Sie gehören deshalb schwerpunktmäßig

in das Gebiet der Botanik. Die

einzelligen bis vielzelligen Vertreter fallen im

Alltagsleben meist durch ihr Wachstum in

Aquarien, Wasserkühlkreisläufen, Gießkannen

und ähnlichen nassen und hellen Biotopen auf,

wo sie neben Cyanobakterien und anderen

photosynthetisch aktiven Prokaryonten

Abb. 16: Strukturformel des

Benzo(a)pyrens

optimale Lebensbedingungen finden. Als repräsentativer Organismus wurde Chlamydomonas

spec. ausgesucht, der im Süßwasser weit verbreitet ist (s. Abb. 17).

Von der biotechnologischen Bedeutung her treten die Algen hinter die anderen

Mikroorganismen zurück. Sie werden einerseits zur Rohstoffproduktion eingesetzt: Agar, der

als ausgezeichnetes Verfestigungsmittel in der Mikrobiologie breite Anwendung gefunden

Geißel

pulsierende

Vakuolen

Augenfleck

(= Stigma)

becherförmiger

Chloroplast

Nucleus

(Zellkern)

Pyrenoid

(verdichteter Bereich

im Chloroplasten)

Plasmalemma

Zellwand

Abb. 17: Die Grünalge Chlamydomonas spec.

(schematisch) Zellmaße: ca. 14 * 8 µm


Einführung in die Biotechnologie - 16 -

hat, wird beispielsweise aus Rotalgen gewonnen. Seit langem werden Algen andererseits v. a.

in asiatischen Ländern als Nahrungsquelle genutzt. Die photosynthetisch aktiven Organismen

können sich ebenfalls an dem Licht ausgesetzten Orten von Klärwerken ansiedeln und dort an

der Abwasserreinigung beteiligt sein.

Auch die Protozoen stellen eine sehr heterogene Gruppe dar. Im Prinzip können sie als

„einfache Tierchen“ bezeichnet werden, da sie sich in der Regel chemoheterotroph ernähren

(s. Kap. 1.4.2). Das bedeutet, daß sie Energie durch Atmung gewinnen und organische

Verbindungen zum Aufbau zelleigener Substanz verwerten. Sie sind also auf die Zufuhr von

Nahrungsstoffen angewiesen (= Konsumenten, s. Kap. 1). In der Hauptsache sind die

Protozoen Einzeller, es kommen jedoch auch einige Mehrzeller bzw. Übergangsformen zu

Pilzen und Algen vor. Sie leben bevorzugt im humiden Erdreich, Wasser oder vergleichbaren

feuchten - nassen Biotopen. Aber auch an oder in Tieren wie beispielsweise im Pansen von

Wiederkäuern werden sie in großer Zahl gefunden. Dabei verwundert es nicht, daß es viele

pathogene Vertreter gibt, die z. T. auch ernsthafte Krankheiten beim Menschen verursachen

können. So werden z. B. Malaria oder die Schlafkrankheit zu den sogenannten Protozoonosen

gezählt. Die Amöben gehören wohl mit zu den bekanntesten Protozoen; sie haben keine feste

Körperform, was ihnen den deutschen Namen Wechseltierchen eingetragen hat. Ihre

Nahrung, die aus Algen, Bakterien u. a. organischem Material besteht, nehmen sie auf, indem

sie die Partikel umfließen (s. Abb. 18).

Wie die Algen spielen die Protozoen auch eine gewisse Rolle bei der Abwasserbehandlung.

Die „Tierchen“ werden auch in Biotests eingesetzt, um beispielsweise die Toxizität giftiger

Chemikalien oder die Qualität von Abwasser zu erfassen.

Angedeuteter Übergang

zwischen Endo- und

Ektoplasma (inneres

und äußeres Cytoplasma)

Nucleus (Zellkern)

Bewegungsrichtung

kontraktile Vakuole

Nahrungsvakuole

Abb. 18: Amoeba proteus (schematisch)


Einführung in die Biotechnologie - 17 -

1.3.3 Tierische und pflanzliche Zellkulturen

Viele der in der Zellkultivierung gebäuchlichen Techniken stammen aus der Mikrobiologie,

nicht zuletzt deshalb, weil auch die Zellen über mikroskopisch kleine Ausmaße verfügen.

Daher wird dieses Thema ebenfalls in diesem Abschnitt behandelt.

In der Biotechnologie spielen vor allem tierische Zellkulturen eine immer größere Rolle. Sie

werden primär eingesetzt, um Human-Proteine zu gewinnen, die nach ihrer Synthese noch in

einer für Eukaryonten spezifischen Weise modifiziert werden müssen, etwa durch Anhängung

von Zuckerresten. Prokaryonten sind hierzu meist nicht in der Lage. Des weiteren können

Impfstoffe oder Antikörper durch tierische Zellkultivierung gewonnen werden. Zum Teil

werden bereits transgene Tiere als „lebende Bioreaktoren“ eingesetzt.

Im Prinzip können tierische Zellen auf zweierlei Art außerhalb des Organismus kultiviert

werden:

1. als Explantat in Form einer Organ- bzw. Gewebekultur, wobei Aufbau und Funktion des

Explantats erhalten bleiben, sowie

2. als Zellkultur. Diese wird gewonnen, indem das Gewebe durch mechanische oder

chemische Mittel zerstört wird. Aus den so gewonnenen Zellen kann unter geeigneten

Bedingungen eine Primärkultur wachsen, die durch anschließende Subkultivierung zu

einer sekundären Zellinie führt. Wenn dieses Überimpfen (Passagieren) unendlich

weitergeführt werden kann, ohne daß die Zellen absterben, liegt eine Dauerzellinie

(„etablierte“ oder „stabile“ Zellinie) vor. Bekannte Beispiele sind:

HeLa-Zellen: Gebärmutterkrebszellen, ursprünglich 1951 von Henrietta Lacks entnommen

BHK-Zellen: baby hamster kidney-Zellen aus dem Nierengewebe neugeborener syrischer Hamster

CHO-Zellen: chinese hamster ovary-Zellen (Eierstock des chinesischen Hamsters)

MK-Zellen: monkey kidney-Zellen (Affenniere)

Tierische Zellkulturen sind nicht einfach zu handhaben. Zum einen müssen bei der

Kultivierung Verhältnisse geschaffen werden, die denen im Ursprungsorganismus möglichst

genau entsprechen. Dies erfordert neben aufwendiger Apparatur auch spezielle Medien. Zum

anderen sind die Tierzellkulturen extrem anfällig gegenüber Fremdkeimen (Kontaminanten),

was spezielle Sterilisations- und Sterilhaltungstechniken erfordert. Viele tierische Zellen, an

das Leben in Verbänden gewöhnt, benötigen eine feste Oberfläche zum Wachstum (sog.

adhärente Zellen), was jedoch zu Problemen mit dem Stoffaustausch führen kann. Des

weiteren sind die Zellen, ob frei oder adhärent, extrem scherstreßempfindlich, da sie nur über

ihre Plasmamembran von der Außenwelt getrennt sind. Sie könnten sogar durch eine

aufsteigende Luftblase zerrissen werden, so daß neue, feinere Begasungssysteme entwickelt

werden mußten.

Pflanzliche Zellkulturen finden biotechnologische Anwendung in der Grundlagenforschung

und bei der klonalen Massenvermehrung wichtiger Nutzpflanzen oder Züchtung neuer

Kulturpflanzen. Ebenso ist die Gewinnung von pflanzlichen Wirkstoffen, beispielsweise von

Aromastoffen, Opiaten oder Steroiden, durch Pflanzenzellkultur üblich. Vergleichbar der

tierischen Zellkultur lassen sich Explantate auf festen Medien zu Mitosen anregen (s. Kap.

1.4.4). Diese bilden dann aber einen sogenannten Kallus, das ist ein Gewebekomplex mit

entdifferenzierten Zellen. Demgegenüber lassen sich auch Zellen ohne Zellwand gewinnen

und zur Vermehrung bringen. In diesem Fall wird von einer Protoplastenkultur gesprochen.


Einführung in die Biotechnologie - 18 -

1.4 Mikrobielles Wachstum

1.4.1 Welche Faktoren beeinflussen die Biomasseproduktion in einem Bioreaktor?

In vielen biotechnologischen Prozessen ist das mikrobielle Wachstum der Schlüsselparameter:

speziell in ein System eingebrachte Mikroorganismen sollen sich vermehren,

während Kontaminanten ferngehalten werden sollen. Die Systeme, in denen ganze

Mikroorganismen oder aber nur Enzyme Stoffe produzieren oder abbauen, werden als

Bioreaktoren bezeichnet. Ein Bioreaktor ist demzufolge ein Gefäß, in dem unter Beachtung

des jeweiligen Zieles optimale Bedingungen für die Biokomponente hergestellt werden, sowie

das Eindringen unerwünschter Kontaminanten unterbunden wird. Eine Ausnahme bilden viele

in der Umweltbiotechnologie eingesetzte Bioreaktoren, wobei der Eintrag von

Fremdorganismen vielfach sogar erwünscht ist. Die angestrebten optimalen Bedingungen

umfassen sowohl physikalische als auch chemische Komponenten:

physikalische Komponenten:

- Je nach Herkunft der zu kultivierenden Organismen liegt das Wachtumsoptimum bei

unterschiedlichen Temperaturen. So sind z. B. Arten, die den menschlichen Organismus

besiedeln wie beispielsweise Escherichia coli auf 37°C optimiert, während marine

Mikroorganismen bei Temperaturen um 4°C am besten wachsen.

- Wasser als universelles biologisches Lösungsmittel und Reaktionssubstrat spielt eine

eminent wichtige Rolle bei allen Lebensvorgängen. Das verfügbare Wasser wird durch die

Wasseraktivität Aw bestimmt, die der relativen Feuchtigkeit äquivalent ist und definiert ist

als:

A

W

=

P

P

S

W

Ps = Dampfdruck des Wassers über dem Wachstumssubtrat

Pw = Dampfdruck des reines Wassers

Die meisten Bakterien wachsen nur bei A w -Werten nahe 1, während viele Pilze gegenüber

Trockenheit widerstandsfähiger (xerotoleranter) sind und bis hin zu A w -Werten um 0,6 noch

zu wachsen vermögen. Diesen Umstand macht man sich bei der Konservierung von

Lebensmitteln zunutze, indem diese einfach getrocknet (Haferflocken, Zwieback u. a.), oder

durch Zucker- oder Salzzusatz „trocken“ gemacht werden (beispielsweise Marmeladen,

Konfitüren).

- Der pH-Wert, definiert als der negative dekadische Logarithmus der H3O +

-Ionenkonzentration,

ist ebenfalls eine wichtige Größe bei Kultivierungen von Mikroorganismen.

Die Pilze sind meist wesentlich säuretoleranter als die Bakterien; so wird z. B.

Saccharomyces cerevisiae bei pH-Werten um 5, Escherichia coli bei pH-Werten um 7

kultiviert.

- Je nach Mischungstechnik können unterschiedlich starke Scherkräfte auftreten, die sich u.

U. nachteilig auf das mikrobielle Wachstum auswirken können. So kann beispielsweise

Claviceps purpurea nur schlecht in gerührten Reaktoren kultiviert werden, da das Myzel

sehr scherstreßempfindlich ist.

chemische Komponenten:

- Ist die Gewinnung von Biomasse Ziel des biotechnologischen Kultivierungsprozesses, so

sollte das Medium alle Bestandteile in verwertbarer Form enthalten, die für das Wachstum


Einführung in die Biotechnologie - 19 -

der Mikroorganismen notwendig sind. Aufgrund von Elementaranalysen lassen sich

folgende Elemente meist in recht hohen Konzentrationen in den Mikroorganismen

nachweisen: C, O, H, N, S, P, K, Ca, Mg, Fe. Sie werden daher als Makronährelemente

bezeichnet. Eisen wurde verschiedentlich auch schon in so geringen Mengen nachgewiesen,

daß es bei bestimmten Mikroorganismen auch den Charakter eines Mikronährelementes

(Spurenelementes) hat. Letztere werden häufig für Enzyme oder Coenzyme benötigt. Sie

kommen daher in der Regel nicht in allen, sondern nur in den diese Enzyme synthetisierenden

Organismen vor. So benötigen beispielsweise N 2 -fixierende Arten, also solche, die

den molekularen Stickstoff in organische Verbindungen überführen können, Molybdän als

Spurenelement. Weitere Mikronährelemente sind u. a. Mn, Cu, Co, Se, Ni. Diese Auflistung

von Elementen sagt noch nichts darüber aus, in welcher chemischen Verbindung diese

vorliegen müssen, um verwertet werden zu können. Während die anderen Makro- und

Mikroelemente daher häufig in Form ihrer Salze dem Medium zugesetzt werden, muß der

Kohlenstoff in der Regel in Form einer organischen Verbindung zugesetzt werden, sofern es

sich um heterotrophe und nicht um autotrophe Organismen handelt (zu den Begriffen: s.

Kap. 1.4.2). Der zugesetzte Kohlenstoff dient in solchen Fällen häufig nicht allein als C-

Quelle für Zellbausteine wie Proteine, Nukleinsäuren oder Fettsäuren, sondern ebenso als

Energiequelle. Diese Aspekte werden im folgenden Kapitel noch ausführlicher behandelt.

Manche Mikroorganismen vermögen trotz einer verwertbaren C- und Energiequelle und

aller benötigten Mineralstoffe nicht auf dem Medium zu wachsen. Sie können nicht alle

Bausteine selbst synthetisieren, sondern sind darauf angewiesen, daß diese dem Medium

zugesetzt werden. Bei diesen als Suppline bezeichneten Stoffen handelt es sich

hauptsächlich um Aminosäuren (Proteinbausteine), Basen der Nukleinsäuren (Purine und

Pyrimidine) und Vitamine.

- Neben der Zusammensetzung des Mediums ist als weiterer chemischer Parameter die

Sauerstoffkonzentration wichtig. Aus dem Sauerstoff können sich leicht, z. B. durch

Lichteinfluß, noch reaktivere Sauerstoffspezies bilden, so daß die damit konfrontierten

Organismen über Entgiftungsmechanismen verfügen müssen. Mikroorganismen, die diese

nicht besitzen, werden als obligat anaerob bezeichnet. Sie können sich nur unter

Sauerstoffausschluß vermehren. Die Arbeit mit solchen Keimen erfordert einen höheren

apparativen Aufwand. Fakultative Anaerobier wachsen im Gegensatz dazu mit oder ohne

O 2 , einige können ihren Stoffwechsel entsprechend umstellen. Als letzte Gruppe stehen die

obligat aeroben Mikroorganismen: sie benötigen O 2 zum Wachstum.

1.4.2 Wachstumstypen

Um die Vielfalt der möglichen Wachstumstypen bei Mikroorganismen zu benennen, hat sich

eine bestimmte Terminologie eingebürgert, die in diesem Kapitel vorgestellt werden soll.

Prinzipiell werden dabei:

Kohlenstoffquelle

Energiequelle

Quelle der Reduktionsäquivalente unterschieden.

Bereits erwähnt wurden die Fachbegriffe bezüglich der Herkunft des für die Zellbausteine

benötigen Kohlenstoffs. Autotrophe gewinnen diesen durch Fixierung von CO 2 , während

heterotrophe Organismen organische Verbindungen zum Aufbau zelleigener Substanzen

verwerten (s. Kap. 1.3.2).

Bezüglich der Energiegewinnung werden phototrophe, also Photosynthese betreibende

Organismen, und chemotrophe Organismen unterschieden. Letztere führen Redox-

Reaktionen durch, die sich vereinfachend als Atmung oder Gärung charakterisieren lassen.


Einführung in die Biotechnologie - 20 -

Die Atmung ist ein Prozeß, bei dem Reduktionsäquivalente (Elektronen oder H) von einer

Ausgangsverbindung auf eine anorganische Zielverbindung unter Energiegewinn

übertragen werden (s. Kap. 1.4.3). Bei der Gärung werden jedoch die

Reduktionsäquivalente ebenfalls unter Energiegewinn von einer organischen

Ausgangsverbindung auf eine ebenfalls organische Zielverbindung übertragen. Gärung

findet in der Regel unter Ausschluß von O 2 statt, sie wird üblicherweise nach ihren

Hauptprodukten benannt, beispielsweise: Alkohol-, Milchsäure,- Propionsäure-,

Ameisensäure- und Buttersäuregärung.

Als letztes wird noch nach der Herkunft der Reduktionsäquivalente unterschieden. Von

Organotrophie wird gesprochen, wenn organische Verbindungen als Wasserstoffquelle

eingesetzt werden, lithotrophe Organismen verwerten anorganische H-Donatoren wie z. B.

H 2 S, S, NH 3 , H 2 , Fe 2+ .

Pflanzen sind demnach photolithoautotroph, da sie erstens Photosynthese betreiben,

zweitens H 2 O als Quelle für Reduktionsäquivalente nutzen und drittens den Kohlenstoff

für Zellbausteine durch Fixierung von CO 2 gewinnen. Tiere demgegenüber sind

chemoorganoheterotroph, da sie Energie durch Atmung gewinnen und organische

Verbindungen als Wasserstoff- und Zellkohlenstoffquelle nutzen. Üblicherweise werden

nicht immer alle Bezeichnungen genannt. Im folgenden Kapitel werden weitere

grundlegende Aspekte des Stoffwechsels behandelt.

1.4.3 Mikrobieller Stoffwechsel

Was ist der „Stoffwechsel“? Damit werden sämtliche durch Organismen katalysierten

Reaktionen zusammengefaßt, wobei abbauende (katabole) und aufbauende (anabole)

Wege unterschieden werden. Stoffe müssen aus der Umwelt aufgenommen und verarbeitet

werden. Bausteine für beispielsweise die Synthese der Zellwand, DNA oder RNA,

Fettsäuren oder Proteine müssen gebildet (= synthetisiert) werden. Endprodukte müssen

entsorgt werden. Für viele Vorgänge muß Energie bereitgestellt werden, damit die

Reaktionen unter den recht milden Bedingungen in der Zelle überhaupt ablaufen können.

Der Organismus muß zusätzlich in der Lage sein, auf Änderungen des äußeren Milieus zu

reagieren, etwa bei Verschlechterung der Lebensbedingungen. Alle diese Wachstums- und

Lebensprozesse von Organismen gehen auf den Stoffwechsel zurück. Die

hochkoordinativen Prozesse gewährleisten, daß bestimmte Stoffe zu bestimmten Zeiten an

bestimmten Orten in bestimmter Weise zur Verfügung gestellt werden.

Die Werkzeuge des Stoffwechsels sind die Enzyme, die Informationen für den Bauplan

dieser Proteine sind auf der DNA festgelegt. Die Information muß zum richtigen Zeitpunkt

richtig abgelesen und übersetzt werden: eine weitere Leistung des Stoffwechsels.

(Genetische Aspekte werden in Kap. XX (Gentechnikteil) behandelt.)

Beim Vergleich des Stoffwechsels verschiedener Organismen fällt auf, daß sich

bestimmte „Motive“ häufig wiederholen. Die enzymatischen Reaktionen lassen sich auf

wenige Grundtypen zurückführen, bestimmte Stoffwechselwege sind in fast allen

Organismen vorhanden und auch der genetische Code, der den „Übersetzungsschlüssel“

von der DNA zum Protein darstellt, ist nahezu ubiquitär verbreitet.

Am Beispiel des sehr gut untersuchten Stoffwechsels von Saccharomyces cerevisiae

sollen einige weitere Grundlagen vermittelt werden (s. Abb. 19).


Einführung in die Biotechnologie - 21 -

CH2OH H

OH

O

H

H

HO

OH

H OH

H

Glucose

anaerob aerob

Gärung Atmung

H

- O

Glycolyse

C

C

O

O

H CO2

CH3 H C OH Pyruvat

CH3 Ethanol

CO2

TCC

H

CO2

CO2

Atmungskette

O 2

H

H 2O

Energiegewinn an Mol ATP / Mol Glucose

2 38

Abb. 19: Stoffwechsel der Hefe Saccharomyces cerevisiae

unter anaeroben (links) und aeroben

(rechts) Bedingungen und Energieausbeute

(TCC = Tricarbonsäurezyklus,

H = Reduktionsäquivalente)

Saccharide sind die in der Natur

am weitesten verbreiteten Moleküle.

So bestehen etwa Cellulose, Lignin,

Chitin oder Murein aus Glucosederivaten.

S. cerevisiae oxidiert Glucose,

wie übrigens auch wir Menschen, in

der sogenannten Glycolyse unter

Energiegewinn formal gesehen zu

zwei Molekülen Pyruvat. Die dabei

auftretenden Reduktionsäquivalente

(H oder Elektronen) werden dabei

auf spezielle Transportmoleküle

(NAD + und andere) übertragen, die

aber für die nächste Redoxreaktion

wieder regeneriert werden müssen.

Unter aeroben Bedingungen werden

die Reduktionsäquivalente in die

Atmungskette eingeschleust, wo sie

unter Energiegewinn letztendlich auf

den Sauerstoff in einer kontrollierten

Knallgasreaktion übertragen werden.

Unter anaeroben Bedingungen

steht aber kein Sauerstoff zur

Verfügung, folglich können die Reaktionen

der Atmungskette nicht

ablaufen. Die Reduktionsäquivalent-

Transportmoleküle müssen also auf

andere Art regeneriert werden. Die

Hefe verwendet dann einfach das

Endprodukt der Glycolyse, nämlich

Pyruvat. Dieses wird zur

Vorbereitung erst einmal

enzymatisch decarboxyliert, der

entstehende C 2 -Körper wird dann

unter Regeneration des

Reduktionsäquivalent-

Transportmoleküls zum Ethanol reduziert. Dieser Stoffwechselweg ist die alkoholische

Gärung, die beispielsweise bei der Bier- und Weinproduktion durch S. cerevisiae

ausgenutzt wird. Während das Pyruvat unter anaeroben Bedingungen also zur

Regeneration der Reduktionsäquivalent-Transportmoleküle verbraucht wird, kann es unter

aeroben Bedingungen in einen weiteren Stoffwechselweg eingeschleust werden. Dabei

handelt es sich um den Tricarbonsäurezyklus, der nach seinem Entdecker auch

Krebszyklus oder nach einem charakteristischen Metaboliten auch Citratzyklus genannt

wird. Er ist in fast allen Organismen vorhanden und dient als zentrale

Stoffwechseldrehscheibe, da von ihm zahlreiche andere Stoffwechselwege ausgehen. Das

aus der Glycolyse stammende Pyruvat wird ebenfalls zuerst decarboxyliert und der

entstandene C 2 -Körper mit einem aus dem Zyklus stammenden C 4 -Körper zum Citrat

verbunden (s. Abb. 13). Diese Tricarbonsäure wird im Anschluß daran unter Bildung

zahlreicher Reduktionsäquivalente und unter Energiegewinn in mehreren enzymatischen

Schritten wieder zu dem o. g. C 4 -Körper abgebaut. Die dabei gebildeten


Einführung in die Biotechnologie - 22 -

Reduktionsäquivalente können ebenfalls in die Atmungskette eingeschleust werden.

Dadurch ergibt sich insgesamt ein im Vergleich zur Gärung 19mal höherer Energiegewinn.

Bisher wurde immer abstrakt von Energiegewinn gesprochen. Sowohl bei Pro- als auch

bei Eukaryonten wird diese Energie meist in Form von Adenosintriphosphat (ATP) gespeichert,

welches das zentrale Molekül des Energiestoffwechsels ist (Abb. 20). Bei der

Hydrolyse des ATP zum ADP (Adenosindiphosphat) wird nämlich eine große Menge an

Energie freigesetzt, die für viele Stoffwechselreaktionen genutzt werden kann. Das ADP

kann anschließend einerseits durch Prozesse der Atmungskette, anderseits aber auch durch

Reaktion mit energiereicheren Stoffwechselzwischenprodukten wieder phosphoryliert

werden. Eine Spaltung zum Adenosinmonophosphat unter Energiegewinn ist ebenfalls

möglich.

Nach diesen einführenden Absätzen zum mikrobiellen Stoffwechsel, der in anderen

Kapiteln aufgegriffen und vertieft werden wird, soll noch ein weiterer Aspekt des

Wachstums beschrieben werden, nämlich der der Zellvermehrung.

N

O

O P

O

O

H H

N

H H

HO OH

-

O

P

O -

O

P

O

O

-

-

O O CH2

Triphosphat

Adenosin = Ribose +

NH2

N

Adenin

Abb. 20: Strukturformel des Adenosintriphosphats

N

1.4.4 Zellvermehrung

Prokaryonten vermehren sich

überwiegend durch einfache

Zweiteilung, wobei erst kurz vor dem

Teilungsprozeß die DNA des

„Bakterien-Chromosoms“ dupliziert

wird (s. Kap. 1.1). Es sind also

Haplonten. Demgegenüber gibt es bei

den Eukaryonten zum Großteil

Dikaryonten mit Ausnahme der Pilze,

wo die Verhältnisse vielfältiger sind (s.

Kap. 1.3.1).

Die Zellkerne von Protozoen, Algen bis hin zu den höheren Säugetieren, die des Menschen

eingeschlossen, führen eine Teilung durch, die als Mitose bezeichnet wird und die der

Zellteilung vorausgeht. Normalerweise sind die Chromosomen eines Zellkerns nicht

voneinander zu differenzieren, erst zu Beginn der Mitose kontrahieren sie sich und werden

mikroskopisch sichtbar. Die Chromosomen, die die Form eines X annehmen, bestehen dann

aus zwei identischen Einheiten, den Chromatiden, die an einer speziellen Stelle, den

sogenannten Centromeren (oder Kinetochoren) zusammengehalten werden. Während des

Kontraktionsvorganges verschwindet die Kernmembran und die Kernteilungsspindel entsteht.

Ihren Ursprung hat sie an den sogenannten Centriolen, die sich nun, nachdem sie sich

aus einem einzigen herausgebildet haben, an den verschiedenen Polen des Kerns befinden.

Die Chromosomen ordnen sich sodann in der Äquatorebene an, die Fasern der Kernteilungsspindel

heften sich an die Centromere an und ziehen die Chromatiden an die

entgegengesetzten Enden des Kerns. Dies ist ein hochgeordneter Prozeß, jede Seite erhält

einen identischen Satz an Chromatiden. Anschließend entspiralisieren sich diese, die

Kernmembran bildet sich wieder aus und parallel dazu haben sich auch die Zellorganellen

verdoppelt. Der Zellteilungsprozeß schließt dann mit der Durchschnürung der Mutterzelle ab,

wobei die zwei Tochterzellen gebildet werden (s. Abb. 21). Bis zur nächsten Mitose muß die

DNA wieder verdoppelt werden.


Einführung in die Biotechnologie - 23 -

Etwas komplizierter sind die

Verhältnisse bei der Meiose (Abb.

22). Zu Beginn verfügt die

Ausgangszelle über den doppelten

Chromosomensatz, ist also diploid;

am Ende des Prozesses, der zwei

Teilungen einschließt, sind die vier

entstandenen Zellen haploid. Im

Prinzip paaren sich zuerst die

homologen Chromosomen, wobei

DNA-Stücke ausgetauscht werden

können. Anschließend werden nun die

ganzen Chromosomen, also die zwei

Chromatiden mit dem Centromer, an

unterschiedliche Enden befördert. Da

nun die Chromosomenzahl je

Tochterzelle halbiert wurde, wird

diese erste Teilung auch als Reduktionsteilung

bezeichnet. Erst im

Anschluß findet die zweite Teilung

statt, die mit der der Mitose

vergleichbar ist und zur Trennung der

zwei Chromatiden eines Chromosoms

führt. Neben der Reduktion der

Chromosomenzahl findet bei der

Meiose auch eine Neukombination

Abb. 21: Mitose

des Erbmaterials statt. Die

entstandenen haploiden Zellen

können nun mit ebenfalls haploiden

Zellen eines anderen Organismus der gleichen Art zu einer

diploiden Zelle verschmelzen, wobei eine Zygote entsteht,

aus der ein neuer Organismus mit neukombinierten Genen

hervorgeht.

Abb. 22: Meiose


Einführung in die Biotechnologie - 24 -

Grundtypen:

Satzreaktor

Batch Reactor

Abhängigkeit von der Zeit (t)

Abhängigkeit vom Ort (z)

Prozeßtechnik

Reaktortypen

Durchflußrührkessel

CSTR

Continuous Stirred Tank Reactor

Strömungsrohr

PFR

Plug Flow Reactor

typische Kenngrößen: τ = V

[min] hydrodynamische Verweilzeit

V& D V&

1

= =

V τ Verdünnungsrate

c - c

U =

c o

°

Umsatz (zwischen 0 und 1)

Spezielle Reaktortypen:

1) Kreuzstromreaktor


Einführung in die Biotechnologie - 25 -

Kreuzstromreaktor (z.B.: pH konstant halten; dosierte Substratzugabe bei

Substratinhibierung in Enzymreaktoren)

2) Blasensäulenreaktoren

Vorteil: keine mechanisch bewegten Einbauten (Rührer) oder Flüssigkeitspumpen (Energieeintrag)

Im Mammutsäulenreaktor werden die Dichteunterschiede zwischen begastem und

unbegastem Medium ausgenutzt, um eine Strömung zu erzeugen.

Arbeitsweise

Betriebsart Vorteile Nachteile

Satz - billig

- flexibel

- hohe Umsätze, da definierte Reaktionszeiten

- wenig Infektionen und Mutationen,

da kurze Kultivierungszeiten

wann sinnvoll?

- geringe Produktmenge nötig

- wechselnder Anwendungsbereich

- hohe Infektionsgefahr

- Totzeiten

- häufiges Sterilisieren

- häufiges Animpfen

- hohe Lohnkosten

- Gefahr für Bedienungspersonal,

da häufiges Öffnen und

Schließen des Reaktors

- Mutationsgefahr

- nur diskontinuierliche

Aufarbeitung möglich

kontinuierlich Vor- und Nachteile ergeben sich aus dem Obigen.

Mutationen können zur Stammselektion genutzt werden

halbkontinuierlich

Kombination beider Prozeßweisen:

hier ist Trennung zwischen Wachstum und Produktbildung möglich !!

Betriebsweise von Reaktoren: - diskontinuierlich

- kontinuierlich

- Zufütterungssatzbetrieb (fed batch)

Beschreibung von Reaktoren

Die Konzentration einer Komponente im Volumenelement eines Reaktors wird bestimmt

durch:


Einführung in die Biotechnologie - 26 -

differentielle

Konzentrations -

ä nderung

erzwungene





effektive



= + + Reaktion

Konvektion Diffusion

⎣⎢

⎦⎥

⎡ ⎤ ⎡ ⎤

⎢ ⎥ ⎢ ⎥

⎣ ⎦ ⎣ ⎦

Mathematisch läßt sich diese Beziehung als Bilanzgleichung formulieren:

∂c

∂t

∂c

∂t

r r

= - div (u c ) - div ( j ) + υ r

r i


i i i ij

oder

= - div (u c ) + div (D grad c ) + R

i i

[ ]

Durch mathematische Operationen, die die Kenntnis der Kinetik der interessierenden

Reaktion sowie des dynamischen Verhaltens des betrachteten Reaktors voraussetzen, lassen

sich sogenannte Design-Gleichungen herleiten. Sie ergeben im einfachsten Fall einen

Zusammenhang zwischen der Reakionszeit und dem erzielbaren Umsatz.

Ideale Reaktoren

Idealer Satzreaktor (Rührkesselreaktor, batch reactor)

Die Bilanzgleichung lautet:

dc

= - 0 + 0 + R = R

dt

angewandt auf die einfache Reaktion A → B (Reaktion 1. Ordnung) ergibt sich mit

0

dca

ca − ca

ca

dca

=− kca

und U = = 1 − : dU =− 0 0

0

dt

c c c

0

−cadU = −k ca

0

= −kca dt

dU

( 1− U)

1

ln

( 1−

U )

= k dt

(1- U) dt

= k t � t = 1

k

a

ln 1

1− U

Dabei ist t die Zeit, die nötig ist, um unter gegebenen Bedingungen einen bestimmten

Umsatz zu erreichen.

Ideales Strömungsrohr (plug flow reactor)

(Beispiel: eine Fläche S wird in einer Richtung durchströmt; u ist der Betrag der Strömungsgeschwindigkeit).

Die Bilanzgleichung hat die Form:

d( u c i )

− + R = 0

dx

a

a


Einführung in die Biotechnologie - 27 -

u dci dx

= R

u S dci

S dx

= R

V& dci

= = R

dV

mit dU = − dci 0

dU

dV

R

= − 0

V&

Durch Integration erhält man:

c

0

i

U

c i

V

R

dU &

∫ = dV

− ∫ = V

0

V

0

τ = c

U

0

i ∫

0

R

dU


Idealer Durchflußrührkessel (continuous stirred tank reactor)

Die Bilanzgleichung erhält die Form:

c i

dj

0 = div { u + R = − z +

dz R

(r c)

=j

Diese Betrachtungsweise ist so möglich, da bei der Eintrittsfläche ein Konzentrationssprung

stattfindet (Annahme spontaner und vollständiger Durchmischung).

Die Bilanzgleichung kann dann in der folgenden Weise geschrieben werden:

jaus − jein

0 = −(

) + R

L

u

= − ( caus − cein ) + R

L

F u

V& = − ( caus − cein ) + R = − ( caus − cein ) + R

F L V


Einführung in die Biotechnologie - 28 -

Reale Reaktoren

τ R = ( c − c )

τ R = −U c ein

aus ein

0

c − c ( cein − caus)

mit: U = =

folgt dann:

0

c c

τ R

U = −

Das Verhalten realer Strömungsrohre und Rührkesselreaktoren läßt sich durch Verknüpfung

sich ideal verhaltender Reaktoren modellieren. Gebräuchlich sind:

- Kaskadenmodell

- Dispersionsmodell

Wertvolle Rückschlüsse darauf, welches Modell zur Anwendung kommt, liefert das

Verweilzeitverhalten realer Reaktoren.

Kinetik des Wachstums

c ein

Wachstum im Bioreaktoren

Die Formalkinetik setzt sich zusammen aus den biologischen Reaktionen in den Zellen und

der reaktionstechnischen Kinetik (Stofftransport etc.). Sie beschreibt das komplexes

Zusammenspiel zwischen Reaktor und Zellbiologie.

Formalkinetik des Zellwachstums und der Produktbildung

Man muß kennen: - Reaktortyp

- Stamm

- physiologischer Zustand

- Vorgeschichte/ Vorkultur

- Morphologie

- Umwelt

Modelle, die dieses Wissen umfassen, bezeichnet man als strukturierte Modelle. Bei

undefinierten Bedingungen wird das Geschehen mit unstrukturierten Modellen als Funktion

der Prozeßvariablen (Substrat, Produkt, etc.) beschrieben, die Zellen sind "black boxes".

In realen Systemen wird eine modellmäßige Erfassung immer schwieriger: Phänomäne wie

Mutationen oder Plasmidverlust können nur mit sehr komplexen strukturierten Modellen

erfaßt werden.

Basisgrößen zur Beschreibung der Formalkinetik des Zellwachstums sind

Zellmassenkonzentration: X

Zellzahlkonzentration: n

Unbeschränktes Wachstum heißt: Vermehrung erfolgt durch Zweiteilung:

0 1 2 m m+1

2 ; 2 ; 2 ;...; 2 ; 2 Zellen

Es gilt: bei t = t 0 sind n0 Zellen vorhanden

ein


Einführung in die Biotechnologie - 29 -

bei t = t' haben sich m Teilungen ergeben und n Zellen sind vorhanden mit

n = n 0 2 m

Auflösen nach m durch Logarithmieren ergibt die Anzahl der Teilungen in der Zeit

zwischen t 0 und t':

log n−log n0

m =

log2

Die Zahl der Teilungen m pro Zeiteinheit bezeichnet man als die Generationszeit ⎟ ⎛ m ⎞

⎜ .

⎝ t'−t

0 ⎠

Da die Zellmassenkonzentration von Interesse ist, gilt:

R X = dX

dt = µ X mit: R X = Wachstumsgeschwindigkeit

dX

=

dt

Änderung der Zellmassenkonzentration mit der Zeit

µ = spezifische Wachstumsgeschwindigkeit

Ungehindertes Wachstum

Die Wachstumsgeschwindigkeit ist für eine ungehindert wachsende Kultur konstant, so daß

gilt:

µ = dX 1


dt X

Auch hier kann man X0 als Anfangskonzentration wählen (t = 0: X = X0): Dann folgt:

dX

= µ dt

X

X

dX

∫ = µdt

X ∫

X

0

t

0

X

lnX 0 = µ t

X

ln X

= µ t

0

X

X = X 0 e t µ exponentielles Wachstumsgesetz

Man definiert analog zur Halbwertszeit des radioaktiven Zerfalls eine Verdopplungszeit t D,

nach der sich die Zellkonzentration verdoppelt hat:

0 0

2X e t D = X µ

t D = ln2

µ

Diese Verdopplungszeit wird bei Zweierteilung auch Generationszeit genannt.

(Alles läßt sich auch analog für die Zellzahlkonzentration n als Zellzahl pro Volumen

sagen.)


Einführung in die Biotechnologie - 30 -

Reales Wachstum

(Am Beispiel einer Satzkultur)

Oben Genanntes gilt nur für unlimitiertes Wachstum. In der Realität läßt sich eine

Satzkultur in Einzelschritte unterteilen (Definition 'Satzkultur' kommt später noch einmal):

Trägt man die Zellmassenkonzentration (d.h. Zellmasse

) gegen die Zeit auf, erhält man 7

Volumen

Abschnitte.

Als Randbedingungen sind zu beachten: Einfacher Organismus, ein Substrat (dieses

limitiert, sobald es verbraucht ist).

Wichtig ist, daß sich die Lebensbedingungen der Zellen hier mit der Zeit ändern, d.h. die

Wachstumsgeschwindigkeit ändert sich.

zu �: Lag-Phase

Durch Umsetzen in eine andere Umgebung wird das Zellwachstum zuerst stark

verlangsamt. (Neue Substrate, andere Verdünnung, pH-Wert-Änderung, Scherbeanspruchung,

Zellen kommen evtl. aus der Ruhephase der Vorkultur).

Die Zellen sollten daher nach Möglichkeit so überführt werden, daß diese Effekte

nicht zu gravierend sind. Die Lag-Phase ist je nach Bedingungen unterschiedlich lang.

Die Zellzahlkonzentration n ändert sich kaum, wohl aber die Zellmassenkonzentration

X (RNA- und Proteinproduktion).

zu �: Die ersten Zellen beginnen, sich "normal" zu teilen. Diese Phase dauert solange, bis

alle Zellen in die exponentielle Wachstumsphase � übergegangen sind.

zu �: Exponentielles Wachstum

Hier liegt nicht limitiertes Wachstum vor. Alle Zellen wachsen schnellstmöglich. Die

maximale Wachstumsrate µ max ist erreicht.

In dieser Phase gelten die Gesetze des unlimitierten Wachstums (s.o.) streng!

Es gilt aber allgemein: µ = f(t)


Einführung in die Biotechnologie - 31 -

zu �: hier beginnt sich die Substratkonzentration so zu verringern, daß Limitierung einsetzt.

Evtl. wirken sich auch Stoffwechselprodukte hemmend aus. Zelltod tritt ein. Das

Zellgewicht der einzelnen Zellen nimmt ab, da Speicherstoffe abgebaut werden. Oft ist

die Teilungsrate noch groß, sodaß das Zellgewicht kleiner wird. Die Zellzahlkonzentration

erscheint daher länger in der exponentiellen Phase als die Zellmassenkonzentration.

zu �: stationäre Phase

Geschwindigkeit der Vermehrung und des Absterbens sind gleich. Zellzahl erscheint

nach außen konstant. In dieser Phase sind die maximale Zellmassenkonzentration und

Zellzahlkonzentration erreicht.

zu �: Allmählich überwiegt die Absterberate. Zellmassen- und Zellzahlkonzentration

sinken.

zu �: Hier beginnt die exponentielle Absterberate, bei der eine bestimmte

Absterbegeschwindigkeit erreicht wird.


Einführung in die Biotechnologie - 32 -

Substratverbrauchsraten

Zellwachstum und Produktbildung

Nimmt man bei einer Satzkultivierung die Zellmassen- und die Zellzahlkonzentration auf,

erhält man die einzelnen Phasen. Auch der RNA- und DNA-Gehalt können zur Beurteilung

des Kultivierungsprozesses herangezogen werden. Oft komplizierter, aber interessanter sind

die Substratverbrauchs- und Produktbildungsraten.

Zu deren Bestimmung zieht man das essentielle Substrat oder das typische Produkt heran.

Substratverbrauchsrate:

1) keine Produktbildung:

Wird kein Produkt gebildet, laufen die Änderungen der Substratkonzentration und der

Zellmassen- und Zellzahlkonzentration parallel.

2) Keine größeren Mengen an Produkten werden gebildet:

Dann gilt für die Zellmassenkonzentration X:

1

− RS

= R X

YXS

/


dS 1

− =

dt YXS /

RX: −R S:

Bildungsrate von Biomasse

Substratverbrauchsrate

S: Substratkonzentration

dX

YXS

/ =− ist hier ein Ausbeutekoeffizient in Bezug auf das Substrat. Er gibt

dS

dX

dt

an,wieviel Biomasse aus wieviel Substrat gebildet wird:

großes YXS / heißt kleines (−R S) bei konstantem R X. Wächst YXS / , so sinkt

(−R S) weiter.

Für die Zellzahlkonzentration gilt analog:

1

− RS

=

Y

und Y

nS / =−

Das Zellwachstum kann man auch in seinen verschiedenen Phasen in einem X-D-Diagramm

(D = Verdünnungsrate) bei einer kontinuierlichen Kultur betrachten. (siehe weiter unten)

nS /

dn

dS

R n


Einführung in die Biotechnologie - 33 -

Produktbildung

Einteilung nach GADEN

TypI:

Die Produktbildung hängt vom Substratverbrauch ab und ist diesem weitgehend

proportional. Primärmetabolite werden gebildet, (d.h. Produkte, die durch indirekte

Substratoxidation gebildet werden: z.B. Ethanol (vgl �), Milchsäure (vgl.�), Gluconsäure

aus Glucose (vgl.�))

Aus Glukose können gebildet werden:

� Ethanol:

� Milchsäure:

� Gluconsäure

HO

CHO

Glukose

OH

OH

OH

CH 2 OH

Glukose

Glukose

Oxidation

durch GOD

Glykolyse

⎯⎯ ⎯ → Ethanol

Glykolyse, Milchsäuregärung

⎯ →

⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ Lactat

HO

CH 2 OH

O

OH

OH

O

Gluconolacton

HO

COOH

OH

OH

OH

CH 2 OH

Gluconsäure


Einführung in die Biotechnologie - 34 -

R X, R S und R P sind auch ähnlich:

Typ II

µ = R

δ = R

π = R

X / X

S / X

P / X

Beispiel für Typ I der

Produktbildung nach Gaden:

Alkoholproduktion

a) Zellmassen- und

Produktkonzentration und

verbrauchtes Substrat

b) Wachstums-,

Produktbildungs- und

Substratverbrauchsgeschwin

digkeit

c) spezifische

Geschwindigkeiten als

Funktion der Zeit



⎬ spezifische

Geschwindigkeiten



Produktbildung hängt vom Substratverbrauch indirekt ab:

Das Produkt entsteht indirekt aus dem primären Energiestoffwechsel. Daraus ergibt sich

eine indirekte Abhängigkeit:

Beim Verlauf der spezifischen Raten wird deutlich, daß Wachstum und Substratverbrauch

eng zusammenhängen. In der Wachstumsphase ist die Bildung des Produktes auch noch

gering. In der Produktphase sind der spezifische Substratverbrauchs- und die spezifische

Produktbildungsgeschwindigkeit sehr ähnlich, hier also gekoppelt. Wachstum zeigt "kleines"

Maximum.


Einführung in die Biotechnologie - 35 -

Beispiel für Typ II der

Produktbildung nach Gaden:

Zitronensäureproduktion

a) Zellmassen- und

Produktkonzentration und

verbrauchtes Substrat

b) Wachstums-,

Produktbildungs- und

Substratverbrauchsgeschwin

digkeit

c) spezifische

Geschwindigkeiten als Funktion

der Zeit

TypIII

Produktbildung hängt nicht vom Substratverbrauch ab. Hierzu gehören die komplexen

Produkte Antibiotika, Vitamine etc. Sie werden oft auch Sekundärmetabolite genannt. Hier

kann man klar in die Wachstums- und Produktionsphase unterteilen.

� Wachstumsphase:

X

Substrat

Produkt

Hier gibt es eine enge Kopplung zwischen Substratverbrauch und Biomasse; es wird

kaum Produkt gebildet.

� Produktionsphase:

Produkt wird gebildet. Wachstum und Substratverbrauch sind gering, das spez.

Wachstum kann sogar negativ werden.

X

t


Einführung in die Biotechnologie - 36 -

Modelle

A) Nichtstrukturierte, verteilte Modelle

Beispiel (veraltet *) für Typ III

der Produktbildung nach

Gaden: Penicillinproduktion

a) Zellmassen- und Produktkonzentration

und

verbrauchtes Substrat

b) Wachstums-, Produktbildungs-

und Substratverbrauchsgeschwindigkeit

c) spezifische Geschwindigkeiten

als Funktion der Zeit

Die Berechnung erfolgt aufgrund von durchschnittlichen Eigenschaften der Zellen und der

Annahme einer homogenen, nicht segregierten Verteilung der Biomasse. Die Zellen werden

nur durch die Zellmassenkonzentration X charakterisiert. Also haben zwei Kulturen mit

gleichem X die gleiche biologische Aktivität.

Dies gilt nur für balanciertes Wachstum, d.h. alle extensiven Eigenschaften des wachsenden

Systems ändern sich in Abhängigkeit von der Zeit in gleicher Weise.

extensive Größen: Gewicht, Volumen, Energie

(ändern sich bei Aufspaltung des Systems)

intensive Größen: Temperatur, Dichte, Druck

(ändern sich nicht bei Aufspaltung des Systems)

Ein balanciertes Wachstum wird in der Regel in gut durchmischten CSTR erreicht, nicht

jedoch in Blasensäulen, da diese Segregation zeigen. In Blasensäulen ändern sich die

extensiven Eigenschaften entlang des Reaktors und zusätzlich mit der Zeit (Schwankungen).

Nichtstrukturierte Modelle ergeben für jeden Reaktor mit verteilten Parametern andere

Ergebnisse.

* Erwähnt nur, um das Prinzip zu zeigen. In Wirklichkeit ist Penicillin kein Sekundärmetabolit.


Einführung in die Biotechnologie - 37 -

B) Strukturierte Modelle

Sie enthalten Informationen über den Zellzustand, z.B. über Schlüsselkomponenten (ATP,

DNA). Besser wäre noch eine genaue Beschreibung der Zellregulation.

Das Monod-Modell

Ein einfaches Beispiel der nichtstrukturierten verteilten Modelle ist das Monod-Modell für

das Substrat.

Bedingung: limitiertes Wachstum (sonst gelten die Gesetze für die nichtlimitierte

exponentielle Wachstumsphase)

Für Einzeller gilt:

und damit

µ = µ m

S

S+K

S

entsprechend der Enzymkinetik; S = limitierender Stoff

S

R X = =

dX

X

µ X= µ m .

dt

S+KS

Man unterscheidet zwei Grenzfälle:

1.) S >> KS: ⇒ µ µ

Reaktion nullter Ordnung.

S

2.) S


Einführung in die Biotechnologie - 38 -

1.) kompetitive Inhibierung:

Substratreaktion: X + S (XS) K =

Inhibierung: X + J (XJ) K

Produktbildung: (XS) P + X

Geschwindigkeitsbestimmend ist: RP = k [(XS)] = - RS Die spezifische Substratverbrauchsgeschwindigkeit ist:

−R

X + (XS) + (XJ)

dS

=−

dt

1

X + (XS) + (XJ)

mit:

1

α1 = 1+

K

S =

J

J =

µ

m

X S

(XS)

X J

(XJ)

S

S + α K

1

Y

1 S X/S

Man erkennt: KS wird um α erhöht, µ m wird durch die Inhibierung also nicht beeinflußt.

Andere Inhibierungen gemäß der Enzymkinetik:

Werden mehrere Substrate genututzt werden können, müssen diese in die Kinetik

einbezogen werden.

Beispiel: Für Proteus vulgaris wurden mehrere exponentielle Wachstumsphasen gefunden.

Folglich dienen mehrere Substanzen im Medium (Hefeextrakt) als Substrat.

ln X

Wachstum im gerührten Satzreaktor

S 1

1.) nicht limitiert:

RX =µ X

Anfangsbedingungen: X= X

0

bei t = 0

integriert: X X e t 0 µ ⋅

= ⋅

RX hängt weder von Substrat- noch von der Sauerstoffkonzentration ab ⇒ Reaktion formal

nullter Ordnung in bezug auf Substrat und Sauerstoff.

dS

Der Substrat- und Sauerstoffverbrauch ist: − RS

= − = µ m X

dt Y

1

S 2

XS /

ln X

t


Einführung in die Biotechnologie - 39 -

dO

− RO = − = X

dt

1

µ m

YX/O

(Gilt nur, wenn nicht begast wird !)

2.) limitiert:

Anfangsbedingung:

dX

R =

dt

S X

= µ m

KS

+ S

Substrat- und Sauerstoffverbrauch:

dS S 1

− RS

= − = µ m X

dt S+K S YXS

/

dO S 1

− RO

= − = µ m X

dt S+K S YXO

/

(Gilt nur, wenn nicht begast wird !)

Wachstum im CSTR

1.) nicht limitiert:

mit zellfreiem Medienzulauf folgt aus der Beziehung

dX1

= µ m X1−D(X1−X 0)

dt

Unter der Annahme:

dX

dt

= 0 stationärer Zustand

X0= 0 gilt mit D = 1

τ (Verdünnungsrate):

0 = µ m ⋅ X1−D⋅X1 D =

Die Beziehung für das Substrat lautet dann:

µ m

dS

1

D (S -S ) -

dt Y X

= 0 1 µ m 1

X/S

mit Begasung.

dO

1

= D⋅( O0 −O1) −

dt 1 42443 Y

*

⋅µ m⋅ X1+ kL⋅α ⋅( O −O1)

1442443 Sauerstoffgehalt im

Einlauf

XO /

Begasung

Unter stationären Bedingungen gilt:

dS dO

= = 0

dt dt

Umschalten von Satzbetrieb auf kontinuierlichen Betrieb:


Einführung in die Biotechnologie - 40 -

X 1

X 0

� X geht gegen Null, wenn µ m X1 < D (X1 - X0) � µ m X1 = D (X1 - X0) stationär: Bildungsrate = Austragsrate

� µ m X1 > D (X1 - X0) weiteres Anwachsen, bis Limitierung erreicht wird.

2.) CSTR mit Substratlimitiertung

dX

dt

dS

dt

1

1

dO

dt

1

= µ

m

=−µ

S1

K + S

m

=−µ

m

S 1

S1

K + S

S 1

S1

K + S

S 1

1

X + D(X −X

)

1 0 1

1

X 1

Y

X/S

1

X 1

Y

X/O

3

2

+D(S − S )

0 1

*

+D(O − O ) + k a(O −O

)

0 1 L

Der stationäre Zustand ist stabil, wenn Substratlimitierung vorliegt. Wird X kurzfristig

größer, fällt S und R X und X sinken wieder ab.

Ist: X 0 = 0 gilt im stationären Zustand

0 =

µ m

S1S

K + S

S 1S

X -X D

1S

1S

0 µ 1 1 -X1S D= X1S

µ 1

= X S ( − D)

µ 1 = D stabiler Arbeitspunkt

Für den Substratverbrauch gilt:

µ1 X 1S

1

Y X/S

=D(S0 S 1S)=D

− ⋅X Y

S

Da µ 1 = D ist, ergibt sich:

1

XS /

S1S

aus µ 1 = µ m

KS + S 1S

Mit (I) ergibt sich weiter:

folgt S1S

KS D

= wenn S0 µ m -D

> S1S ⎡ K S D ⎤

X 1S = Y X/S (S0− S 1S) = YX/S⎢S0− ⎥

⎣ (µ

m − D) ⎦

(I)

1


Einführung in die Biotechnologie - 41 -

X

S 0=

A

S = B

0

Produktivität

D c ist die kritische Verdünnungsrate, da hier das µ max der Zellen erreicht ist. Die Zellproduktivität

erreicht ihr Maximum bei D ≈ D c:

Dc

⎡ K S D ⎤

R = D X1S = D YX/S⎢S0− ⎥

⎣ (µ m − D) ⎦

Probleme ergeben sich bei kontinuierlichen Reaktoren, wenn die gewünschte

Verdünnungsrate grösser sein sollte al die maximale spezifische Wachstumsrate. Dieses

Problem kann durch Zellrückführung gelöst werden.

Es gibt prinzipiell 3 Arten der Zellrückhaltung

a) Innerer Filter

b) Sedimentation

c) Trenneinheit (äußerer Filter, Separation)

Zu a) Innerer Filter

V

X, 0 S0

αV, S e, X e

V, X, S

R e e

Anteil entnommen: α mit 0


Einführung in die Biotechnologie - 42 -

dX

dt

e

⋅V

R

= V&

⋅X

0

− α⋅

V&

⋅X

e


( 1−

α)

⋅V&

⋅β⋅

X e + R x ⋅VR

rein Auslauf Filter Reaktion

stationär: R = [ ( α + ( 1−

α)

⋅β)

⋅ X − X ]

x

1

τ

Annahme: α = 0 (alles geht durch das Filter)

A⋅

X e X 0

R x = −

τ τ

mit A = α + (1 - α) · β

wenn β = 0 und X0 = 0 (zellfrei)

dann A = α

R x

= µ = D⋅

A

X

e

D

A

µ

=

wenn α = 1 D kann maximal µ max werden

α < 1 D kann größer werden

Zu b) Sedimentation

e

0

Hier gilt: V& geht rein und V& geht raus, τ über System ist daraus bestimmbar

V& wird recycled

δ =

dX

dt

X

R

allg. > 1

V&

, α =

V&

X Rück

Ablauf

e

V

e

S0

X0

V

Reaktor

Mischer

(V + V R)

= V&

X

0


Rücklauf

V, R δ X,S e e

S e

und

β

Überlauf

Settler

Ablauf

wie vorne

( 1−

α)

V&

βX

e − α V&

δ X e + R x VReaktor

(1- α)V, βX e, Se

zellarmer Abfluß

αV, S,

e δX e

zellreicher Abfluß


Einführung in die Biotechnologie - 43 -

Ein solches System stellt beispielsweise die Reaktion in folgender Abbildung dar.

Lochplatte

(1 - α)V

S, e βXe

Sedimentationssäule

CSTR

V, S , X

0 0 αV, S , X

e e

Zu c) Trenneinheit (äußerer Filter, Separation)

V, X 0

Es gilt:

V + V R

X

β =

X

X aus

n =

X e

V&

R

α =

V&

Bilanz über Trenneinheit:

& + V&

⋅X

= V&

⋅β⋅

X + n⋅

X ⋅ &

( ) V

V R e R e e

Gesamtreaktor:

R

e

X e

Höhe

V, R βX

e = XR

V + V R

Filter

S e

S e

X 0

βX e

Permeat

X e

S 0

X

V, X = nX

aus e


Einführung in die Biotechnologie - 44 -

dX

dt

⋅V

= V&

⋅X

0

+ V&

R

⋅β⋅

X

e

+ R

x

⋅V

− V&

R

⋅β⋅

X

Begasung von Biokomponenten und Sauerstoffübertragung

Der Sauerstoffverbrauch hängt von verschiedenen Faktoren ab:

- Zellen, die sich teilen ("junge Zellen"), benötigen mehr Sauerstoff

Der O2-Verbrauch ist deshalb in der exponentiellen Wachstumsphase am größten.

- Oberfläche des Organismus:

e

unzugängliche

Bereiche

- Ionen-, Substrat- und Additivkonzentrationen verändern die Löslichkeit.

Die Beziehung für den Sauerstoffverbrauch muß nun die äußere Begasung berücksichtigen.

Sie lautet nunmehr:

dO

1

= DO ( 0 −O1) − µ mX1+ kLa( O0 −O1)

dt Y 144244 3

XO /

Begasung

Dabei ist k L der auf die Flüssigphase bezogene Stoffübergangskoeffizient. Er umfaßt die

Transportphänomene, die beim Übergang eines Sauerstoffmoleküls von der Gasphase in die

Zelle wirksam werden. Sie sind in der folgenden Darstellung veranschaulicht:

Gasblase

1

� Diffusion vom Kern zur Phasengrenze

� Durchgang durch Phasengrenze

� Diffusion durch Film/ Grenzschicht

� Transport durch Flüssigkeit

� - � entspricht � bis �

2

3

erlauben mehr O 2-Aufnahme als

4

6

5

7

Zelle


Einführung in die Biotechnologie - 45 -

Für den Phasenübergang gas → flüssig gilt:

Das Henrysche Gesetz beschreibt:

* *

A A H = ⋅

1

g

*

Im Gleichgewicht ohne Sauerstoffverbrauch gilt: H ⋅ A1,

max = A g

Die Triebkraft für einen Sauerstoffeintrag ist:

j = K A

*

− A

gasseitig: gas g ( g g )

*

flüssigseitig: j = K ( A − A )

l

l

Daraus folgt (da jgas = jfl im Gleichgewicht sein muß)



* ⎜

1 1

A

+ ⎟

l, max − Al

= j



⎝ K g ⋅ H Kl


und j = Kl (Al,max * – Al)

Für KL gilt:

und da kg » kl

und da

1

K


L

1

= +

k ⋅ H

g

l

1 1


K kl

A g

Q

j = mit a = spez. Austauschfläche

a =

a

&

l

A*

g

Grenzschicht

Gas

1

k

l

Phasengrenze

A l*

A l

Grenzschicht

flüssig

A

V

Ort


Einführung in die Biotechnologie - 46 -

l

* ( A A )

Q& = k ⋅a


l.max

l

Diese Beziehung gilt streng nur an einem bestimmten Ort.

Der Sauerstoffübergang selbst hängt seinerseits von drei Faktoren ab:

1. Stoffübergangskoeffizient Kl (abhängig von der Grenzfilmdicke, Reynoldszahl)

2. Übergangsfläche

3. Konzentrationsgradient

Die Übergangsrate erreicht ihr Maximum, wenn cl = Null ist. Weit verbreitete Verfahren zur

Bestimmung der Übergangsrate sind:

→ "gassing out" (cl = 0)

→ "steady-state oxygen balance"

Wie kann der Wert des Stoffübergangskoeffizienten (k L a) bestimmt werden?

Optimal ist eine (kL a)-Wertbestimmung direkt während des Bioprozesses. Dies ist jedoch

kompliziert und aufwendig. In der Regel greift man daher auf ein synthetisches Medium

zurück, das dem Medium im Bioprozeß ähnelt. Da sich der O2 -Bedarf in Abhängigkeit vom

Entwicklungsstadium des biologischen Systems ändert, ist es von besonderem Interesse,

einen Zusammenhang zwischen (kL a) und der Hydrodynamik (Reynoldszahl) festzustellen,

um maximalen Sauerstoffeintrag sicherstellen zu können: Der in der Flüssigphase gelöste

Sauerstoff sollte maximal verbraucht werden.

Das synthetische Medium sollte folgenden Ansprüche genügen:

- ähnliche Viskosität

- ähnlicher gasförmig/flüssig Phasenwiderstand

- ähnliches Koaleszenzverhalten

- ähnliche Sauerstofflöslichkeit und -diffusion

Strukturiertes Modell

(Am Beispiel eines einfachen Modells.)

Biomasse wird strukturiert, d.h. kompartimentiert; z.B. nach synthetischen Komponenten

(RNA, Vorstufen) und strukturellen Komponenten (DNA, Proteine).

Alle Reaktionen und Transportvorgänge haben eine bestimmte Geschwindigkeit (Sekunden

bis Stunden). Wichtig ist die Korrelation dieser Geschwindigkeiten mit denen im Bioreaktor,

also der Zellumgebung. Wenn sie im Vergleich zu den äußeren Änderungen sehr schnell sind,

sind diese Vorgänge stets im Gleichgewicht. Langsame Vorgänge (z.B. genetische

Verändrungen) können als "eingefroren" betrachtet werden. Nur wenige interne Vorgänge

haben ähnliche Zeitkonstanten wie die äußeren.

Beispiel: Das 2-Komponenten-Modell


Einführung in die Biotechnologie - 47 -

� Ein synthetischer Anteil (Komponente 1) entsteht durch Substratverbrauch (S) mit dem

Masse Komponente 1

Ausbeutekoeffizienten Y Substratmasse . Die Bildung der Komponente 1 ist in Bezug auf

die Zellmasse X und die Substratkonzentration [S] 1. Ordnung.

� Die Komponente 2 wird als struktureller, genetischer Anteil betrachtet, der mit einer Rate

Masse Komponente n

1 aus Komponente 1 hervorgeht. Die Rate ist proportional ρ1 ρ2 (ρn = Einheitvolumen der Zelle ).

� Die Verdopplungszeit der Komponente 2 ist notwendig und hinreichend für die

Zellteilung. Folglich ist die Zellzahldichte proportional zur Dichte der Komponente 2 im

Medium.

� Biomasse besteht aus den beiden Komponenten.

Es gilt:



1

2

Komponente 1

dS

dt Y K =−1

= K1( ρ1 + ρ2) − K2

ρ1ρ 2 − µρ

142443 142 34 { 1

Zellbildung

Umsatz zu ρ

c

1

1

S

Komponente 2

S X aus �

dX

dt K = 1 S X aus �

Wachstum

ρ 1 entsteht nur aus [S] bei

Zellmassenbildung

dρ1

= K2

ρ1 ρ 2 −µρ2

mit µ = K1 S ρ2 entsteht nur aus [ρ1] dt

Da µ = K1 S und ρ1 +ρ2 = ρc = const. gilt:

2 f2

= ρ

, alsoAnteile der Komponente 2 an der Zelle.

ρ

→ Medienbereitstellung

→ Vorkultur

→ Luftfiltration (bei Begasung)

→ Prozeßkontrolle

df2

=− K1 S f 2 + ( K2 ρ 2) f 2 ( 1−f2)

dt

Grundoperationen für den Bioprozeß


Einführung in die Biotechnologie - 48 -

→ Zellrückgewinnung

→ Sterilisation/ Sterilfiltration:

- Autoklav (Satzbetrieb)

- Dampf-Reaktor (Satzbetrieb)

- Wärmeaustauscher (kontinuierlicher Betrieb)

- Filtration (kontinuierlicher Betrieb)

- Pasteurisieren

Physikalische Größen (Meßgerät):

- Energieeintrag

- Temperatur (Pt 100 Platinwiderstand)

- Viskosität

- Durchflußgeschwindigkeit (Flowmeter)

- Schaumerkennung

Chemische Größen:

- pH-Wert

- Sauerstoffkonzentration

Sauerstoffmessung

Bioprozeßanalytik

Das wichtigste System zur Messung der Sauerstoffkonzentration in Fermentationsmedien ist

die amperometrische Sauerstoffbestimmung (z.B. Clark-Elektrode).

Wichtig ist, daß diese Sensoren den Partialdruck messen, da eine sauerstoffpermeable

Membran verwendet wird. (vgl. Abb.)

Auf molekularerer Ebene laufen an den Elektroden folgende Vorgänge ab.

1

− Pt


Kathode: 2 O2 + H2O+ 2e ⎯ ⎯→

2OH

− −

Anode: Ag + Cl ⎯ →AgCl

+ e

Bei der amperometrischen Elektrode ist eine konstante Spannung an den Elektroden angelegt.

Der resultierende Strom, der von der Sauerstoffkonzentration abhängt, wird an der Kathode

gemessen


Einführung in die Biotechnologie - 49 -

Enzymkinetik

In diesem Kapitel wird gezeigt, wie biotechnologische Prozesse mit Hilfe von Enzymen

durchgeführt werden können. Dazu werden diese Biokatalysatoren zuerst allgemein

beschrieben, um darauf aufbauend reaktionstechnische Aspekte näher zu erörtern. Es folgen

Experimente, die Möglichkeiten und Eigenarten der Enzymprozeßtechnik aufgezeigen.

Allgemeines

Enzyme sind die katalytisch aktiven Einheiten in lebenden Organismen. Sie haben die

Aufgabe, Stoffwechselreaktionen effektiv und unter optimalen energetischen Bedingungen

durchzuführen. Sie zeichnen sich durch eine hohe Reaktions- und Substratspezifität aus und

erlauben es, die katalysierten Stoffwechselreaktionen unter milden physiologischen

Bedingungen in etwa 10 6 - bis 10 12 mal schneller durchzuführen als die nichtkatalysierten

Reaktionen. Die katalytische Aktivität kann durch verschiedene Mechanismen reguliert

werden.

Enzyme sind Proteine. Seit einigen Jahren sind aber auch katalytisch aktive RNA-

Einheiten bekannt. Sie werden in diesem Buch nicht näher behandelt. Neben dem

eigentlichen Proteinanteil können auch noch Cofaktoren für das funktionsfähige Enzym nötig

sein. Hierzu zählen Metallionen (z.B. Zn 2+ in der Carboanhydrase oder Fe 2+ /Fe 3+ in der

Katalase) oder kleinere organische Moleküle wie das NAD(P)H (reduziertes Nicotinamidadenin-dinucleotid-(phosphat)).

Letztere heißen Coenzyme. Sind sie (z.B. das Flavin-adenindinucleotid,

FAD + ) kovalent an das Enzym gebunden, werden sie als prosthetische Gruppen

bezeichnet. Coenzyme gehen verändert aus der enzymatischen Reaktion hervor. Sie sind als

Cosubstrat anzusehen und müssen vor einem erneuten Einsatz regeneriert werden.

Man kann grob sechs Gruppen von Enzymen unterscheiden, die wiederum in

verschiedenen Untergruppen aufgeteilt sind:

1. Oxidoreduktasen (katalysieren Redoxreaktionen)

2. Transferasen (katalysieren die Übertragung verschiedener

Gruppen)

3. Hydrolasen (katalysieren hydrolytische Reaktionen)

4. Lyasen (katalysieren nicht-hydrolytische Abspaltungsreak-

tionen)

5. Isomerasen (katalysieren Isomerisierungsreaktionen)

6. Ligasen (katalysieren Verknüpfungsreaktionen)

Die meist vierstellige E.C.-(Enzyme commission) Nummer eines Enzyms gibt an, zu

welcher Haupt- und Untergruppe ein Enzym gehört. Aus der E.C.-Nummer des Enzyms läßt

sich also der Reaktionstyp herleiten, der es katalysiert. Als Beispiel sei die Glucoseoxidase


Einführung in die Biotechnologie - 50 -

(E.C. 1.1.3.4) angeführt, die die Oxidation von β-Glucose zum Gluconolacton katalysiert. Die

erste Ziffer (1) besagt, daß es sich um eine Oxidoreduktase handelt, die zweite Ziffer (1), daß

das Enzym auf eine Hydroxygruppe wirkt, die dritte Ziffer (3), daß Sauerstoff der

Elektronenakzeptor ist und die vierte Ziffer (4) ist eine laufende Nummerierung in dieser

Unter-Unter-Klasse.

Eine der Voraussetzungen für die katalytische Aktivität ist die korrekte Konformation

der Proteine. Nur mit ihr ist es möglich, daß das sogenannte aktive Zentrum des Enzyms mit

dem umzusetzenden Substrat so wechselwirkt, daß ein Enzym-Substrat-Komplex gebildet

wird. Hier kann man entweder annehmen, daß Enzym und Substrat wie Schlüssel und Schloß

von vornherein zueinander passen oder daß dieser Komplex über einen „induced fit“ gebildet

wird. Dabei paßt sich das Enzym (speziell das aktive Zentrum) der Substratstruktur an. Ein

Enzym-Substrat-Komplex bildet sich, der einen erleichterten Zugang zu dem

Übergangszustand zwischen Substrat und Produkt ermöglicht. Der Komplex reagiert dann zu

den Produkten ab. Die gesamte Reaktion wird beschleunigt, da die freie Aktivierungsenergie

zur Bildung dieses Übergangszustands zwischen Substrat und Produkt im Enzym-Substrat-

Komplex deutlich geringer ist als bei der nichtkatalysierten Reaktion. Die maßgeblichen

nichtkovalenten Kräfte zur Ausbildung der Konformation eines Proteins sind die gleichen, die

zur Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes führen: van-der-Waals-Kräfte, hydrophobe und

elektrostatische Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen.

Enzyme sind in den von ihnen katalysierten Reaktionen fast ausschließlich

stereospezifisch. Im allgemeinen wird also nur ein Enantiomer umgesetzt oder gebildet. Dies

gilt auch für prochirale Verbindungen. Gegenüber der Substratstruktur sind Enzyme

unterschiedlich selektiv. Diese auch als geometrische Spezifität bezeichnete Eigenschaft, läßt

sich gut an den unterschiedlichen Proteasen zeigen. Die Protease Subtilisin spaltet beliebige

Peptidbindungen, während Trypsin hochspezifisch nur Arginin-Glycinbindungen spaltet.

Auch die Spezifität für die Art der katalysierten Reaktion (Wirkungsspezifität) kann

unterschiedlich sein. Während Trypsin nur Peptidbindungen spaltet, können Chymotrypsine

Peptid- und Esterbindungen hydrolysieren.

Herstellung

Enzyme werden aus den Zellen isoliert, die sie in ausreichender Menge produzieren. Das

können natürliche, u.a. auch Hefe, Bakterien oder durch Mutation bzw. Gentechnik optimierte

Produzenten (Hefe, Bakterien) sein. Zur Aufarbeitung extra- und intrazellulärer Enzyme

werden die zur Proteinreinigung bekannten Methoden verwendet (z.B. Zentrifugation,

Ultrafiltration, Chromatographie). Generell kann man sagen, daß der Preis eines Enzyms

direkt proportional mit der Reinheit und umgekehrt proportional zur Konzentration im

Produzenten steigt.

Einsatz


Einführung in die Biotechnologie - 51 -

Für Enzyme gibt es die viele Einsatzmöglichkeiten: Als Therapeutikum können sie in der

Medizin beispielsweise bei der Behandlung von Thrombosen (Urokinase) oder von

Verdauungsstörungen (Lipasen, Proteasen) eingesetzt werden. Vielfältig ist der Einsatz in der

Analytik. Hier sind besonders die Medizin, die Lebensmitteltechnik und die biochemische

Analytik zu erwähnen (siehe auch Kapitel Biosensoren). Für all diese Einsatzzwecke werden

Enzyme mit hoher Reinheit verwendet. Der Mengenbedarf ist relativ klein.

Bei den industriell in großen Mengen genutzten Enzymen werden nicht so hohe

Reinheitsansprüche gestellt. Zu diesen Enzymen, die meist als technische Produkte verwendet

werden, gehören Proteasen (Waschmittelzusätze, Ledergerberei), Amylasen und Glucose-

Isomerase (Stärkeverzuckerung, Lebensmittelverarbeitung), Pektinasen (Fruchtsaftzuberei-

tung), Lipasen (Waschmittelzusätze, Fettverarbeitung), Glucoseoxidase/Katalase (Lebensmit-

telzusätze zur Sauerstoffentfernung).

Bei den teureren Enzymen bietet sich bei der technischen Verwendung eine

Immobilisierung an (siehe unten). Immobilisierte Enzyme werden bei der Herstellung von 6-

Aminopenicillansäure aus Penicillin, bei der Gewinnung von L-Aminosäuren aus N-Acetyl-

D,L-Aminosäuregemischen oder der Produktion von Fructose aus Glucose eingesetzt.

Enzymkinetik

Für den industriellen Einsatz ist die Kinetik der freien (nativen) und immobilisierten Enzyme

von Interesse. Jedes Enzym hat eine andere spezifische Aktivität, mit der es bestimmte

Substrate umsetzt. Diese Aktivität kann auf verschiedene Art und Weise beeinflußt werden.

Am einfachsten kann die Gesamtaktivität in einem Reaktionsprozeß über die Menge an

Enyzm geregelt werden. Technisch interessant ist auch die Regelung der Aktivität über die

Temperatur und den pH-Wert. Mit steigender Temperatur durchläuft die Enzymaktivität ein

Maximum, wobei oftmals die Enantioselektivität abnimmt. Dieses Maximum entsteht, da

zuerst die Aktivität mit der Temperatur zunimmt, die Proteindenaturierung ab einer kritischen

Temperatur aber so stark ist, daß die Aktivität ingesamt drastisch abnimmt. Ein ähnliches

Optimum existiert auch bei der pH-Abhängigkeit. Auch dies ist verständlich, wenn man den

Einfluß des pH-Werts auf die Proteinkonformation bedenkt (Protonierung/Deprotonierung

verschiedenster Gruppen). Aus der Biochemie ist bekannt, daß Enzyme auch durch

allosterische Effekte (Hemmung bzw. Aktivierung durch Anlagerung an ein regulatorisches

Zentrum), durch proteolytische Aktivierung (Spaltung einer inaktiven Vorstufe zum aktiven

Enzym) und durch reversible kovalente Modifikation (z.B. Phosphorylierung von

Seringruppen) in ihrer Aktivität gesteuert werden können.

Bei enzymatischen Reaktionen spricht man bei der Reaktionsgeschwindigkeit von

Enzymaktivität. Dies ist eine extensive Größe, da eine größere Enzymmenge auch eine

höhere Reaktionsgeschwindigkeit bedeutet. Die häufigste Einheit der Enzymaktivität ist die

internationale Einheit U (international unit). Das ist die Enzymmenge, mit der bei 25 o C unter

optimalen Bedingungen 1,0 µmol des Substrats pro Minute umgesetzt wird. Man

unterscheidet Aktivität (U), Volumenaktivität (U/ml), molare Aktivität (U/mol) und


Einführung in die Biotechnologie - 52 -

spezifische Aktivität (U/mg). Die spezifische Aktivität, bei der sich die Aktivität auf die

Menge Enzym bezieht, gibt die Reinheit des Enzyms an. Die neuere internationale Einheit ist

das Katal (kat). Es ist die Aktivität, die bei optimalen Bedingungen ein Mol des Substrats pro

Sekunde umsetzt. Damit gilt 1 U = 16,67 nkat oder 1 µkat = 60 U.

Im folgenden soll die Kinetik enzymatischer Reaktionen näher behandelt werden. Das

Michaelis-Menten-Modell beschreibt die kinetischen Eigenschaften von Enzymen am

einfachsten. Voraussetzung ist, daß das Enzym mit dem Substrat einen Enzym-Substrat-

Komplex bildet, der dann in das Produkt und das Enzym abreagiert. Dabei dissoziert das

Produkt sofort ab. Dieser Zerfallsschritt ist geschwindigkeitsbestimmend. Eine Rückreaktion

des Enzyms mit dem Substrat ist nicht möglich. Das gilt dann, wenn die Reaktion irreversibel

ist oder am Beginn einer Reaktion, wenn noch kein oder sehr wenig Produkt vorliegt.

Die Reaktionsgleichung hierfür lautet:

E + S

k 1

k -1

ES

k 2

E + P

Es kommt zur Ausbildung eines stationären Zustandes, in welchem nach einer

Anlaufphase die Konzentration an Enzym-Substrat-Komplex konstant bleibt

(Fließgleichgewicht, steady state). Für die Reaktion läßt sich das Geschwindigkeitsgesetz wie

folgt aufstellen:

d[ES]

dt

= k1 ( [ E] [ ES] )[ ] ( ES) [ ES]

0 − S −k−1 −k

2 , (x.1)

wobei [ E] = [ E] −[

ES]

0 die Konzentration an freiem Enzym ist.

übergeht in:

Für den „Steady state“ gilt:

[ ] dES ⎛ ⎞

⎜ ⎟ = 0, so daß das Geschwindigkeitsgesetz

⎝ t ⎠

d st

k ( [ E] − [ ES] )[ S] = k [ ES] + k [ ES]

1 0 st − 1 st 2 st . (x.2)

Durch Umformen erhält man die Michaelis-Menten-Beziehung:

( )

[ S] ⋅ [ E] −[

ES]

[ ES]

0 st −1

2

st

=

k + k

k

1

= K . (x3)

K M ist die Michaelis-Menten-Konstante. Führt man in diese Beziehung noch das

Geschwindigkeitsgesetz der Produktbildung

M


Einführung in die Biotechnologie - 53 -

dP [ ]

v = = k ⋅[

]

dt

2 ES st

(x.4)

so erhält man einen Zusammenhang zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit v und der

Substratkonzentration [S]:

Es lassen sich zwei Grenzfälle betrachten:

[ S] ⋅ [ E]

0

v = k2 K + [ S]

M

(x.5)

(1) [S] > K M: Bei sehr großen Substratkonzentrationen kann K M gegenüber [S] ver-

nachlässigt werden (Sättigung, alle aktiven Zentren besetzt). Das Ge-

schwindigkeitsgesetz geht über in

v= v max = k 2 [E] 0 (Reaktion nullter Ordnung) (x.6)

Im zweiten Grenzfall ist die Geschwindigkeit ist nur noch von der

Ausgangskonzentration des Enzyms und der Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation

abhängig.

Die Beziehung (x.6) kann in die Gleichung (x.5) eingebracht werden:

[ S]

v = vmax


[ ] + K

S M

M

(x.7)

Hierbei ist v die aktuelle Reaktionsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion, v max die

maximale Reaktionsgeschwindigkeit und [S] die Substratkonzentration. Entspricht die

aktuelle Substratkonzentration der Michaelis-Menten-Konstante K M, läuft die enzymatische

Reaktion mit halber maximaler Reaktionsgeschwindigkeit ab. Die maximale

Reaktionsgeschwindigkeit v max wird erreicht, wenn alle aktiven Zentren ständig mit Substrat

abgesättigt sind. Da der Zerfall des Enzym-Substrat-Komplexes geschwindigkeitsbestimmend

ist, wird dann die maximal mögliche Geschwindigkeit erreicht, wenn die die maximale

Konzentration dieses Komplexes erreicht ist.

Die kinetischen Daten v max und K M sind für jeden enzymatischen Prozeß typische

Reaktionsgrößen und damit für die reaktionstechnische Beschreibung der Reaktionen wichtig.

Um sie für eine Reaktion zu erhalten, mißt man den Umsatz bei konstanter Enzymmenge in

Abhängigkeit der Substratkonzentration. Dabei werden meist die Anfangsgeschwindigkeiten


Einführung in die Biotechnologie - 54 -

bestimmt, um Produktinhibierungen zu vermeiden. Aus diesen Daten erhält man eine

Michaelis-Menten- Auftragung aus der man prinzipiell v max und K M ableiten kann. Die

Bestimmung des

v

vmax

1

2 v max

KM

[S]

Abbildung x.1 Verlauf der Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit der Substratkonzentration

gemäß der Michaelis-Menten-Kinetik (1. Ordnung, nullter Ordnung)

wahren v max - und damit auch des K M-Werts ist aber problematisch. Deshalb wird die

linearisierte Lineweaver-Burk-Auftragung vorgezogen, bei der die reziproken

Substratkonzentrationen gegen die reziproken Geschwindigkeiten augetragen werden. Aus

der Steigung und den Achsenabschnitten lassen sich dann v max und K M herleiten. Außerdem

kann auch die Berechnung der kinetischen Parameter durch eine Anpassung der Meßdaten

über Computerprogramme erfolgen. Das ist besonders in Hinblick auf mögliche

Inhibitormodelle nützlich.

1

v

1

v max

- 1

KM Abbildung x.2 Auftragung nach Lineweaver and Burk

Für die Reaktionstechnik lassen sich solche Berechnungen aus einfachen

Überlegungen herleiten. Zuerst wird die Michaelis-Menten-Gleichung in die Bilanzgleichung

für einen Satzreaktor eingefügt:

1

[S]


Einführung in die Biotechnologie - 55 -

dc

vmax ⋅ c

− =

dt

K + c

M

(x.8)

Daraus kann man zunächst die Zeit t, nach der ein Umsatz U erreicht ist, besser

berechnen. Die Anfangskonzentration des Substrats c 0 bei der Anfangszeit t = 0 und

die aktuelle Konzentration c bei t:


KM+ c

⋅ dc = dt.

(x.9)

v ⋅ c

c t

∫ ∫

0

c max

0

Das Integral auf der linken Seite wird aufgespalten:

c

c t

KM

1

−∫ ⋅dlnc −∫ ⋅ dc = ∫dt

= t

0v0v c

max c max

um zu der folgenden Lösung zu gelangen:

K

v

M

0

(x.10),

0 0

c c − c

⋅ ln + = t . (x.11)

c v

max max

Die Einführung des Umsatzes mit U

Umformung zu:

0

c − c

0

= 0 und c = c ( 1 −U)

führt nach

c

0

KM

⎡ 1 1 ⎤ c t

⋅ ln + = (x.12)

v ⎣⎢ U 1−

U ⎦⎥ v U

max max

Aus der Auftragung von t

U gegen

⎡ 1 1 ⎤

⋅ ln lassen sich aus der Steigung

⎣⎢ U 1 −U⎦⎥

K

v

und aus dem Achsenabschnitt c

0

herleiten. Diese Berechnung der kinetischen

vmax

Parameter ähnelt der Lineweaver-Burk-Auftragung, ist aber den für technische

Enzymprozesse eher gebräuchlichen Meßgrößen angepaßt. Rechnerprogramme

können so direkt aus dem Verlauf des Umsatz gegen die Zeit eines Enzymprozesses

die kinetischen Daten berechnen.

Abweichungen vom Michaelis-Menten-Modell

Bei den meisten enzymatischen Reaktionen kommt es jedoch zu Abweichungen. So können

beispielsweise Inhibitoren die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sogenannte kompetitive

Inhibitoren konkurrieren mit dem eigentlichen Substrat um das aktive Zentrum des Enzyms.

M

max


Einführung in die Biotechnologie - 56 -

Dabei wird die Reaktionsgeschwindigkeit herabgesetzt, da die Wahrscheinlichkeit, daß ein

Enzym-Substratkomplex gebildet wird, kleiner ist. Diese Inhibierung läßt sich aber durch eine

hohe Substratkonzentration zurückgedrängen, da die Wahrscheinlichkeit der Bildung des

Komplexes zunimmt, und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit v max kann wieder erreicht

werden. Kompetitive Inhibitoren können auch die Substrate oder Produkte sein.

Bindet ein Inhibitor nicht an dem aktiven Zentrum, sondern an einer regulatorischen

Einheit eines Enzyms, kann durch eine Konformationsänderung auch die Enzymaktivität

herabgesetzt werden. Diese nicht-kompetitive Inhibierung läßt sich nicht durch eine

Erhöhung der Substratkonzentration zurückdrängen. Beide Hemmtypen lassen sich leicht im

Lineweaver-Burk-Plot erkennen. Weitere kinetische Betrachtungen und Hemmtypen

(unkompetitive Hemmung, Substrat- oder Produkthemmung) sind in den Lehrbüchern

ausführlich beschrieben.

Enzymimmobilisierung

Für die technische Nutzung von Enzymen muß die Stabilität, die Abtrennbarkeit und die

Wiederverwendbarkeit der Biokatalysatoren geklärt werden. Beispielsweise sind die

technischen Enzyme zur Stärkeverzuckerung billig und unterliegen im Prozeß einer

Desaktivierung. Eine Wiederverwertbarkeit ist nicht nötig. Sobald aber die Enzymkosten ein

entscheidener Faktor bei den Produktionskosten sind, muß eine Wiederverwertbarkeit der

Enzyme in Betracht gezogen werden. Eine Wiedergewinnung der Enzyme mit den bei der

Herstellung verwendeten Methoden (Chromatographie, Ultrafiltration) ist im allgemeinen zu

teuer. Besser sind Methoden zur Enzymimmobilisierung, also Techniken, die das

„Molekulargewicht“ der Enzyme drastisch erhöhen und sie so vom Prozeßbeginn an

zurückhalten. Grob kann man zwei Klassen von Immobilisierungsmethoden unterscheiden:

Die Immobilisierung durch Kupplung und die Immobilisierung durch Einschluß. Beide

Gruppen können wieder in Untergruppen eingeteilt werden.

1. Immobilisierung durch Kupplung:

- Adsorptive Bindung: Die Enzyme adsorbieren an Trägermaterialien mit großen

Oberflächen (z.B. Tone, Silicagele, modifizierte Dextrane). Vorteilhaft ist, daß

diese Immobilisierungstechnik einfach durchzuführen ist und die Proteinkon-

formation kaum durch die geringen Wechselwirkungskräfte beeinträchtigt

wird. Andererseits werden die Enzyme leicht abgespült, und das Aufbringen

definierter Enzymmengen ist schwierig.

- Ionische Bindung: Die Bindung an feste Träger erfolgt hier über ionische Kräfte zwischen

der Oberfläche und geladenen Gruppen der Proteine. Basische und saure

Ionenaustauscherharze (z.B. DEAE-Sepharose) sind geeignete Träger. Die Vor- und

Nachteile entsprechen denen der adsorptiven Bindung. Die Beeinflussung der Bindung

durch äußere Faktoren ist erheblich. So können Änderungen im pH-Wert zur Abtrennung

der Proteine führen, da die Ladung der funktionellen Gruppen geändert wird.


Einführung in die Biotechnologie - 57 -

- kovalente Bindung: Diese Immobilisierung, bei der eine echte Bindung zwischen der

Trägeroberfläche und dem Enzym etabliert wird, gilt als stabilste Immobilisierungstechnik.

Die Abtrennung des Enzyms kann nur durch Auftrennung der chemischen Bindung

erfolgen. Meist wird ein aktivierter Träger-eingesetzt, der mit den in Aminosäuren

vorkommenden Sulfhydryl-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Imidazol- oder Phenolgruppen des

Enzyms reagiert. Hydroxylgruppen an Gläsern oder Polymeren lassen sich dazu aktivieren

(z.B. Bromcyanaktivierung,Epichlorhydrinaktivierung) oder Carboxylgruppen (z.B.

Chloridaktivierung). Eine Immobilisierung der Enzyme ist oft mit einer

Aktivitätsverminderung verbunden. Die Kopplung der Enzyme erfolgt meist nicht direkt

an der Oberfläche desTrägers. Beide können durch Kohlenwasserstoffketten mit

verschiedener Kettenlänge (Spacer) getrennt werden. Bei der Epoxidaktivierung durch

Epichlorhydrin ist nur ein kleiner Spacer (3-C) zwischen Träger und Enzym vorhanden,

während bei der Aktivierung mit 1,4 Butandioldiglycidether eine Spacerlänge von10 C-

Atomen erreicht wird. Proteine werden so flexibler angebunden. Das Quellen der

Polymerträger führt zu einer geringeren Beanspruchung der Enzymkonformation.

Bei der Immobilisierung wird die Konformation des Enzyms mehr oder weniger stark

beeinträchtigt. Die kovalenten Bindungen können die Konformation so verändern, daß die

Aktivität beeinträchtigt wird. Das Enzym kann auch so fixiert sein, daß das aktive Zentrum

nicht mehr zugänglich ist. Andererseits kann gebundenes, aktives Protein durch die

kovalenten Bindungen in seiner Konformation stabilisiert werden. Insgesamt kann man

sagen, daß ein Teil des fixierten Enzyms seine Aktivität verloren hat, daß aber das

gebundene aktive Enzym eine höhere Langzeitstabilität aufweist als ungebundenes Enzym.

Außerdem sind gebundene Enzyme meist stabiler gegenüber einem Angriff von Proteasen.

- Cross linking: Hier werden bifunktionelle Vernetzermoleküle verwendet, die mit

funktionellen Gruppen der Enzyme reagieren. Die einzelnen Proteine werden so in

einem Netzwerk miteinander verbunden. Oftmals müssen inerte Substanzen mit

coimmobilisiert werden (co-cross-linking), um ein festes Netzwerk zu erhalten. Die

Kontrolle der Immobilisierung ist schwierig und die Restaktivitäten sind oftmals ge-

ring, da u. U. die Enzymkonformation stark verändert wurde oder die Enzyme nicht

mehr frei zugänglich sind.

2. Immobilisierung durch Einschluß

- Matrixeinhüllung: Durch gezielte Polymerisation werden die Enzyme in einer homo-

genen Phase in eine kugel- oder schlauchförmigen Matrix eingeschlossen. Dies Mem-


Einführung in die Biotechnologie - 58 -

bran muß für die Produkte und Edukte durchlässig sein, nicht aber für die Enzyme.

Schwierigkeiten ergeben sich bei der Polymerisationsführung, da häufig auch die

Monomere auch mit den Enzymen reagieren.

- Membranabtrennung: Über eine Membran werden die Enzyme zurückgehalten.

Hierzu können feste (z.B. Ultrafiltrationsmembranen) oder flüssige Membranen ver-

wendet werden. Sie halten die Enzyme zurück, und die niedermolekularen Produkte

und Substrate können die Membran passieren. Hierbei ist es besonders vorteilhaft, daß

die Enzyme in homogener Phase vorliegen, so daß auch coenzymabhängige Reaktio-

nen in diesen Systemen (siehe Kapitel Enzymreaktoren) durchführbar sind.

Bei der Membranabtrennung mit flüssigen Membranen sollen die Phaseneinhüllung und

die „reversen Micellen“ erwähnt werden. Bei der Phaseneinhüllung erfolgt die

Immobilisierung in einer Wasser-in-Öl Emulsion oder in Phospholipiddoppelschichten

(Liposomen). Für die Herstellung von Flüssigmembranemulsionen wird die Enzymphase

in einer geeigneten Ölphase emulgiert. Die Enzymemulsion kann dann in einer wäßrigen

Substratphase dispergiert werden. Außerdem lassen sich Enzyme in sogenannten „reversen

Micellen“ in organischen Phasen fixieren. Mit geeigneten Tensiden werden dazu in der

organischen Phase Wassermicellen etabliert, in denen die Enzyme löslich sind.

Schwierigkeiten ergeben sich, wenn die organischen Phasen die Enzyme denaturieren.

Zu diesen Grundtypen der Enzymimmobilisierung gibt es in der Forschung eine Fülle von

Varianten. Diese sind jedoch relativ neu und noch kaum für den technischen Einsatz

verwendbar. Auch die Reaktionsführung in organischen Lösungsmitteln, in denen die

Enzyme meist dispergiert werden oder in überkritischen Reaktionsphasen (z.B.

Kohlendioxid) werden von verschiedenen Autoren als Immobilisierungstechniken

bezeichnet, da sich die Biokatalysatoren nach der Reaktion erleichter abtrennen lassen.

Kinetik immobilisierter Enzyme

Bei der Immobilisierung von Enzymen auf festen Trägern möchte man auf wenig

Trägermaterial viel frei zugängliches Enzym immobilisieren. Das heißt, daß man einen Träger

mit großer Oberfläche benötigt, also einen porösen Träger. Bei der Immobilisierung kann ein

Teil der Enzymaktivität durch Denaturierung (extreme Konformationsänderung) oder durch

ungünstiges Fixieren am Träger (katalytisches Zentrum ist nicht mehr frei zugänglich)

verloren gehen. Dies kann man durch eine Bilanzierung der Proteinkonzentration und der

Enzymaktivität feststellen. Bekannt ist die eingesetzte Enzymmenge in Aktivitätseinheiten

und deren Konzentration. Anschließend wird im Überstand und im ersten Waschpuffer die

Restaktivität und Proteinkonzentration bestimmt. So läßt sich einfach bestimmen, wieviel

Protein auf dem Träger gebunden wurde. Ist die Menge des aktiven Enzyms auf dem Träger

auch einer Aktivitätsmessung mit dem Immobilisat zugänglich, kann man berechnen, wieviel

des gebundenen Proteins aktives bzw. inaktives Enzym ist.


Einführung in die Biotechnologie - 59 -

Wichtig ist aber auch, daß durch die porösen Träger zwar eine große Oberfläche vorhanden,

diese jedoch unterschiedlich gut zugänglich ist. Diese Tatsache ist aus der allgemeinen

heterogenen Katalyse bekannt. Die Substrate müssen aus der Kernströmung über eine

laminare Grenzschicht um den Katalysator (Film) durch die Poren zu dem Enzym gelangen.

1

2

vmax

v

vmax

ohne Hemmung

Diffusionshemmung

Abbildung x.3 Vergleich der Michaelis-Menten-Kinetik einer enzymatischen Reaktion mit und ohne

Diffusionshemmung

Der Stofftransport durch den Film und die Poren erfolgt durch reine Diffusion. Jeder

einzelne Schritt kann die gesamte Reaktion limitieren (Film- bzw. Porendiffusionshemmung).

Um herauszufinden, ob eine Diffusionshemmung vorliegt, können die Michaelis-Menten- und

die Lineweaver-Burk-Auftragungen der enzymatischen Reaktion des freien und des

immobilisierten Enzyms helfen. Diese sind in den Abbildungen x.3 und x.4 gezeigt.

Bei der Michaelis-Menten-Auftragung macht sich die Diffusionshemmung durch

einen veränderten K M-Wert bemerkbar. Durch die Hemmung ist die aktuelle

Kernkonzentration nicht am Enzym zugänglich. Der Stofftransport ist erst bei hohen

Substratkonzentrationen ausreichend groß (großer Gradient), daß das Enzym optimal mit dem

Substrat wechselwirken kann. Ab einer hohen Substratkonzentration wird die übliche

maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht.

Auch in der Lineweaver-Burk-Auftragung wird dieser Effekt deutlich. Hier weicht die

reziproke Reaktionsgeschwindigkeit bei kleinen Substratkonzentrationen (hohe reziproke

Werte) extrem von der „ungehemmten“ Kinetik ab.

[S]


Einführung in die Biotechnologie - 60 -

1

KM

1

v max

Abbildung x.4

Diffusionshemmung in der Lineweaver-Burk-Auftragung

1

v

Diffusionshemmung

ohne Hemmung

Die Kinetik der Gesamtreaktion kann auch durch pH-Gradienten in den Poren

beeinflußt werden. Entstehen bei der enzymatischen Reaktion Produkte, die den pH-Wert

beeinflussen, kann sich innerhalb der Poren ein pH-Gefälle aufbauen (siehe Abbildung x.5).

Der pH-Wert in der Kernströmung entspricht dann nicht mehr den in den Poren. Hier kann

das Enzym ineffektiv arbeiten. Wird die enzymatische Aktivität eines Trägers gemessen,

ergeben sich Aktivitätswerte, die denen der tatsächlich immobilisierten Enzymmenge nicht

entsprechen. Die Effektivität des immobilisierten Biokatalysators sinkt.

Substrat

Produkt

pH-Gradient

Enzym

Abbildung x.5 Aufbau eines pH-Gradienten innerhalb einer Pore bei der Bildung von

Reaktionsprodukten, die den pH-Wert beeinflussen.

1

[S]


Einführung in die Biotechnologie - 61 -

Beipiele für Enzymreaktoren

Typ Satzreaktor: Die Gewinnung von 6-Aminopencilliansäure (6-APS) aus fermentativ

hergestellten Penicillin G ist ein industriell wichtiger Prozeß, da das 6-APS als

Ausgangssubstanz für verschiedene halbsynthetische Penicilline eingesetzt wird. Die

enzymatische Umsetzung kann mit Pencillin-G-amidase erfolgen, wie das Reaktionsschema

zeigt:

O

Penicillin G

H

N S CH3 N

CH3 O COOH

Pen-G-Amidase

H 2 O

Phenylessigsäure

H2N N

S CH3 CH3 O COOH

6-Aminopenicillansäure

(6-APA)

Abbildung x.6

Reaktionsschema für die enzymatische Spaltung von Penicillin G zur 6-APS Produktion

+

CH 2 COOH

Für diesen Prozeß müssen β-Lactamase-freie Enzyme verwendet werden, da sonst der

β-Lactamring gespalten wird. Weiterhin ist es wichtig, daß die Produktinhibierung bei der

Reaktionsführung beachtet wird, da die Ausbeuten möglichst an 100 % heranreichen sollen.

Das Enzym wird im allgemeinen auf porösen Trägern kovalent gebunden und in einem

Satzreaktor in der Substratlösung suspendiert. Der pH-Wert wird durch Laugezugabe im

Bereich von pH 7 bis 8 bei physiologischen Werten gehalten (Abbildung x.7).

pH-Messung

und Kontrolle

Lauge

Träger mit immobilisierter

Penicillin-G-Amidase


Einführung in die Biotechnologie - 62 -

Abbildung x.7

6-APS Gewinnung in einem Rührkesselreaktor mit immobilisierten Enzymen

Festbettreaktor: Der erste kommerzielle Prozeß mit immobilisierten Enzymen wurde von

Tanabe Seiyaku in einem Festbettreaktor durchgeführt. Es geht dabei um die

L-Aminosäureherstellung aus DL-Acetyl-Aminosäure in einer durch Aminoacylasen

katalysierten enantioselektiven Hydrolyse (Abbildung x.8).

H 2 O+(D, L)-R COOH

NHCOR'

Aminoacyl-Aminosäure

(racemisch)

Enzym

L-Aminosäur e + D-Aminoacyl-AS + CH 3 COOH

Abbildung x.8

Reaktionsschema der enzymatischen Esterhydrolyse zur L-Aminosäuregewinnung

Um möglichst hohe Umsätze zu erreichen, muß die zurückbleibende D-Acetylverbindung

abgetrennt und durch Wärmebehandlung reracemisiert werden. Bei der Aufarbeitung

werden die Löslichkeitsunterschiede von Edukt und Produkt ausgenutzt. Die Abbildung x.9

zeigt ein Fließschema des industriell eingesetzten Prozesses zur L-Aminosäureherstellung:

D,L-Acetylaminosäure

D,L-Acetylaminosäure

Tank

erwärmen

Aminoacylase

Festbett

Kristallisation

Separator

kristalline

L-Aminosäure

Reracemisieren

der

D-Acetylaminosäure

Abbildung x.9

Ablaufschema des Tanabe-Prozesses zur enzymatischen Darstellung von L-Aminosäuren

In diesem Beispielprozeß wird DEAE-Sephadex (ionische Bindung) als

Immobilisierungsmatrix gewählt, um L-Methionin, L-Phenylalanin und L-Valin herzustellen.

Der Träger ist zwar teuer, doch rechtfertigen lange Standzeiten seinen Einsatz: in fünf


Einführung in die Biotechnologie - 63 -

Wochen sinkt die Aktivität auf ca. 60%. Außerdem kann der Träger regeneriert werden. Der

Prozeß wird in einem 1-m 3 -Reaktor bei 50-70 o C und einem pH-Wert von 7 ausgeführt.

Durch den Einsatz dieses Systems konnten die Preise für L-Aminosäuren halbiert werden.

Es existieren für Festbettreaktoren in der Enzymtechnik folgende Nachteile:

- hoher Druckabfall

- Katalysatorinaktivierung

- Diffusionshemmung

- komplizierte Reaktionsführung

- pH-Wert-Regulierung

Auch die 6-APS-Herstellung wäre prinzipiell in einem Festbettreaktor möglich

(Abbildung x.10). Da aber saure Reaktionsprodukte entstehen, würde der pH-Wert als

Funktion des Orts im Reaktor absinken (siehe Pfeil), was sich proportional auf die

Enzymaktivität auswirken würde. Das Festbett wäre, bezogen auf die enzymatische Reaktion,

ineffektiver als ein Satzreaktor. Über den Reaktor müßte der pH-Wert konstant gehalten

werden. Prinzipiell ginge das über eine drastische Erhöhung der Pufferkapazität der

Substratlösung oder durch Laugezugabe nach dem Prinzip eines Kreuzstromreaktors.

pH

9

7

5

3

Aktivität der

Amidase

in Richtung

Ausgang

des Reaktors

0

0

Festbett mit Penicillin-G-Amidase

9

pH-Wert am

Reaktoreingang

Abbildung x.10

Ausbildung eines pH-Gradienten in einem Festbett und die Auswirkung auf die Enzymaktivität

Ort

pH


Einführung in die Biotechnologie - 64 -

Festmembranreaktoren

Eine interessante Variante eines Enzymreaktors stellt der Festmembranreaktor dar. In ihm

können die Biokatalysatoren in homogener Phase reagieren. Die Enzyme müssen also nicht

vor dem Einsatz auf festen Trägern immobilisiert werden. Aktivitätsverluste durch den

Fixierungsschritt, Konformationsänderungen und damit verbundene Änderungen der

kinetischen Parameter und Probleme wie die Diffusionslimitierung treten nicht auf.. Die

Funktionsweise ist in Abbildung x.11 dargestellt. In den Reaktionsraum, in dem die Enzyme

in gelöster Form vorliegen, werden die Edukte gepumpt. Die enzymatische Reaktion findet

hier statt. Über eine Ultrafiltrationsmembran mit einem bestimmten Ausschlußverhalten

können niedermolekulare Verbindungen der Reaktor verlassen, während die hochmolekularen

Enzyme zurückgehalten werden. Der Umsatz hängt dann von der Enzymaktivität und der

Verweilzeit im Reaktionsraum ab. Bei Bedarf können frische Enzyme neu zugegeben werden.

Die Filtrationsfläche kann limitierend sein. Ultrafiltrationsmodule (siehe Abbildung x.12)

werden dann eingesetzt, um eine große Austauschfläche zu garantieren. Die wäßrige Phase

wird durch das Reaktorsystem gepumpt. Die Prozeßführung (Pumpen, Zufütterung) und -

beobachtung (Analyse) verläuft automatisch. Die Produkte werden über das Filtrationsmodul

abgezogen.

Edukte

Edukt

Reaktionsraum

mit Enzymen

Produkte

Prozeßführung

und -regelung

Ultrafiltrationsmembran

Fritte

Abbildung x.11 Prinzip des Festmembranreaktors

Produkt

Abbildung x.12 Einsatz von Ultrafiltrationsmodulen für den Festmembranreaktor

Edukt Ultrafiltrationsmembran

Produkt


Einführung in die Biotechnologie - 65 -

Dieses Reaktorsystem wurde für die industrielle Herstellung von L-Aminosäure von

Wandrey und Kula optimiert. So können L-Aminosäuren ähnlich zum Tanabe-Prozeß durch

Hydrolyse von N-Acetyl-D,L-Aminosäure oder durch reduktive Aminierung aus den

korrespondierenden α-Ketosäuren hergestellt werden. Während bei der Hydrolysereaktion

nur Um-

Industrieller Prozeß

Von der Degussa AG wurde vor ungefähr 20 Jahren ein industrieller Prozeß zur

Darstellung von L-Methionin in einem Membranreaktor etabliert. Diese Anlage wird heute

von der Great Lake Chemicals in Konstanz betrieben und produziert ca. 300 t L-Methionin

pro Jahr. Dazu wird - wie aus der Prozeßskizze hervorgeht - Aminoacylase aus Aspergillus

oricae in Hohlfasermodulreaktoren immobilisiert. Dieses Enzym spaltet mit hoher

Umsatzgeschwindigkeit N-Acetyl D,L-Methionin. L-Methionin entsteht, und das

zurückbleibende ND-Methionin wird reracemisiert und in den Prozeß neu eingespeist. Die

Acylase aus Aspergillus oricae hat eine breite Spezifität, kann also verschiedene Acetyl-

Aminosäureester umsetzen, jedoch ist die Wirtschaftlichkeit bei der Darstellung von L-

Methionin aus dem chemisch hergestellten

D,L-Methionin am größten. L-Methionin ist als Tierfutterzusatz von großem Interesse.

Abb. x.13 L-Methionindarstellung im industriellen Festmembranreaktor in homogener Phase


Einführung in die Biotechnologie - 66 -

Der Gesamtprozeß setzt sich aus folgenden Einzelschritten zusammen:

1. Die Acetylierung von D,L-Methionin erfolgt mit Essigsäureanhydrid im alkalischen

Milieu. Das N-Acetyl-D,L-Methionin wird dann in einer wäßrigen Phase

(ca. 0,6 mol/l) im neutralen pH-Bereich in den Enzymmembranreaktor eingespeist.

2. Die enzymatische Reaktion wird in einem neutralen bis leicht alkalischen pH-Bereich

bei Temperaturen um 30 °C durchgeführt. Die eingesetzte Acylase hat eine Aktivität

von ca. 30.000 units/g Enzym. Sie wird im Konzentratstrom des Hohlfasermembran-

reaktors zurückgehalten. Aktivitätsverluste können durch Einspeisung frischer

Enzymlösungen ausgeglichen werden. Ein Enzymmembranreaktormodul besteht aus

ca. 100 m 2 Membranfläche. Die Ausschlußgrenze der Membran liegt bei 10.000

Dalton. Die Substrate und Produkte haben ein Molekulargewicht von unter 200 Dalton

und können die Membran problemlos passieren. Im Membranreaktor werden

Umsatzgrade von ca. 80% erzielt. In der Produktlösung befinden sich L-Methionin

und N-Acetyl-D-Methionin.

3. Die Produktlösung wird, wie anschließend im Schema angezeigt, eingedampft und

nach Behandlung mit Aktivkohle bei verschiedenen Temperaturen zwischen 55 °C

und 30 °C auskristallisiert. Die Kristalle werden gewaschen, getrocknet und der

Endreinigung zugeführt. Die Mutterlauge aus der Kristallisation wird

chromatographisch gereinigt und das darin enthaltene N-Acetyl-D,L-Methionin (der

Anteil des

D-Enantiomeren ist sehr viel höher als der des L-Enantiomeren) auskristallisiert und

geschmolzen. Nach Zugabe von Essigsäureanhydrid racemisiert dieses Gemisch zu N-

Acetyl-D,L-Methionin (Verhältnis der Enantiomere ca. 50 : 50). Das Racemat wird

erneut in den Kreislauf eingespeist.

Die Prozeßregelung ist relativ einfach. Wird die kritische Umsatzrate im Enzymmembran-

reaktor unterschritten, kann der Durchsatz erniedrigt oder frisches Enzym zugegeben werden.

Die Reaktion wird über den optischen Drehwert der Produktlösung verfolgt.

___________________________________________________________________________

sätze von 50% (ohne anschließende Reracemisierung) zu erreichen sind, können bei der

reduktiven Aminierung Umsätze von 100% erreicht werden. Für diese Reaktion ist NADH als

Cosubstrat nötig. Es wird im gleichen Reaktionsraum durch eine zweite enzymatische

Reaktion kontinuierlich zur Verfügung gestellt. Da das Molekulargewicht von NADH aber

sehr klein ist (MW= 665,4), würde es die Ultrafiltrationmembran leicht passieren. Deshalb


Einführung in die Biotechnologie - 67 -

wurde für die Versuche molekulargewichtsvergrößertes NADH verwendet, beispielsweise

NADH, das an Polyethylengly

O

HCOOH

COOH

NH2

E2

COOH

E1

+ H2O + CO2

Ultrafiltrationsmembran

Ausschlußgrenze

5000 Dalton

PEG 20 000

NADH

Abbildung x.14 Prinzip der coenzymabhängigen enzymatischen Synthese im Festmembranreaktor zur

Herstellung von L-Aminosäuren

gebunden ist (Abbildung x.13). Mit diesem Trick konnte das Molekulargewicht so vergrößert

werden, daß das Coenzym relativ einfach im Reaktionsraum zurückgehalten werden konnte.

Die Abbildung x.14 zeigt das Reaktionsschema für die Darstellung einer L-

Aminosäure (z.B. L-Leucin) aus der entsprechenden α-Ketosäure (z.B. α-Ketoisocaproat).

Unter Verbrauch von NADH wird die Ketogruppe in eine L-Aminogruppe überführt. Ein

Umsatz von 100 % ist prinzipiell möglich (anders als bei enantioselektiven

Racematspaltungen). Das enstehende NAD + wird in einer zweiten Reaktion, bei der Formiat

oxidiert wird, selbst reduziert. Bei der Reaktion entsteht Kohlendioxid (in Form von

Hydrogencarbonat) als Nebenprodukt. Das teure Coenzym kann nun je nach enzymatischem

System einige zehntausendmal reagieren, bis es zerstört ist. Über diese Reaktionsführung

kann der Gesamtprozeß wirtschaftlich eingesetzt werden.

NH 4 OH

O

NH 2

Enzym 1

+ 2 H

+

2

O

R COOH

R COOH

CO 2 + H 2 O

NADH NAD +

Enzym 2

Enzym 1 z.B.: Leucindehydrogenase (LeuDH)

Enzym 2 z.B.: Formiatdehydrogenase (FDH)

HCOOH


Einführung in die Biotechnologie - 68 -

Abbildung x.15

Reaktionsschema zur kontinuierlichen enzymatischen Darstellung von L-Aminosäuren aus den

korrespondierenden α-Ketosäuren

Technische Anwendungen

Aufarbeitung und Isolierung von Produkten

Das generelle Problem bei der biotechnologischen Herstellung chemischer Verbindungen ist

die Trennung von Biomasse und gewünschtem Produkt. Je nach Art der Anreicherung (extra-

oder intrazellulär) und Aggregatzustand ergeben sich zur Aufarbeitung die folgenden

Möglichkeiten.

� Abtrennung der Feststoffe:

Filtration

Zentrifugation

Sedimentation

Flotation (bei extrazellulärer Anreicherung)

� Isolierung (1. Schritt: Aufkonzentrierung)

Extraktion (wäßrig-wäßrig; wäßrig-organisch)

Sorption

Präzipitation

Ultrafiltration

� Isolierung (2. Schritt) Reinigung:

fraktionierte Präzipitation

Chromatographieschritte

Adsorption

� Produktisolierung:


Einführung in die Biotechnologie - 69 -

Überführung in Handelsform (gebräuchlich sind: Marumerizer (überzogene Enzyme),

Prils (eingebettete Enzyme); als Matrix dienen Fettalkoholetylenoxidprodukte

oder PEG (Smp. bei 50- 70°C))

Zentrifugationstrocknung von Kristallen

Sprühtrocknung

Lyophilisierung

Aufarbeitung

Frage: Wieviele Aufreinigungsschritte sind notwendig und ökonomisch vertretbar

(Aufwand-Kosten-Effekt). Diese Abschätzung ist bei jedem Schritt notwendig.

Reinigungseffekt

gering

mäßig

hoch

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Aufreinigungsschritt


Einführung in die Biotechnologie - 70 -

Stärkeverzuckerung

Stärke ist aus linearer Amylose (α-1,4-verknüpft) und verzweigtem Amylopektin (α-1,6verknüpft)

aufgebaut:

CH2OH CH2OH H O H H O H

O OH O OH O

OH

OH

O

H

HO

CH 2

O H

OH

OH

H

HO

CH 2

OH

α-1,4-Verknüpfung α-1,6-Verknüpfung

So entstehen verzweigte Polysaccharidketten, die je nach verwendetem Enzym an

verschiedenen Positionen gespalten werden können, z.B.:

α-Amylase: endo α-1,4-Spaltung (lineare Spaltung; es entstehen Dextrine,

Maltose und Maltotiose)

α-Amyloglucosidase: exo α-1,4- und α-1,6-Spaltung (ergibt Glucoseeinheiten)

Der Vorgang ist eine Zweischrittreaktion, bei der lösliche Enzyme eingesetzt werden. Man

kann bei der Stufe der Glucoseentstehung aufhören und die Glucose aufreinigen. Sie hat eine

Süßkraft von 70% gegenüber Saccharose, die Süßkraft der Fructose liegt demgegenüber bei

150%. Man schließt daher noch einen Isomerisierungsschritt an:

α - Amylase

(nativ)

Glucoamylase

(nativ)

Glucoisomerase

(immobilisiert)

Stärke

Dextrine

Glucose

Fructose

O

O

pH 6,0 - 6,5; T > 80°C

pH 4 - 5; T um 60°C

H

OH

pH 7 - 8,5; T um 60°C

In den USA werden auf diese Weise 5,65 Millionen jato. Zuckersirup gewonnen, in Europa

hingegen nur 20.000 jato (≅ 2% des Industriezuckerbedarfs). Durch Einspeisung von 50

%iger Glucoselösung entsteht ein Zuckersirup mit einem Gehalt von 52% Glucose, 42%

Fructose und 6% Oligosacchariden. Die Süßkraft dieses Sirups entspricht derjenigen des

Haushaltszuckers.

Eckdaten: - Halbwertszeit der Enzyme: 1.000 h

- Reaktionsführung: Umsatz wird konstant gehalten, Durchsatz variiert

O


Einführung in die Biotechnologie - 71 -

Penicillin

- Pro kg immobilisierter Glucoseisomerase können 1- 3 to Fructosesirup

hergestellt werden.

Der eingesetzte Biokatalysator ist die Penicillin-G-Amidase (PGA).

O

HN

N

S CH3 CH3 + H2O Pen-G-Amidase

CH2COOH +

H2 N

O

N

S CH3 CH3 COOH

O COOH

Penicillin G

Phenylessigsäure 6-Aminopenicillansäure

(6-APA)

PGA wird in Polyacrylamid eingeschlossen oder in ganzen Zellen verwendet. Aus der auf

diese Weise gewonnen 6-Aminopenicillansäure (6-APA) lassen sich durch einen

anschließenden Schritt weitere Derivate des Penicillin G herstellen. Beispiel:

Ampicillinherstellung:

6-APA +

NH 2

OCH 3

Pen-G-Amidase

O CH 3 OH

NH 2

N S CH3 N

CH3 O COOH

D-Phenylglycinmethylester Ampicillin

Ein Problem bei der technischen Herstellung stellt die Produktinhibierung durch 6-APA und

besonders durch die Phenylessigsäure dar. Ferner kommt es durch die Entstehung freier Säure

zu einem starken Abfall des pH-Wertes, der im Festbett nur schwer kontrolliert werden kann.

Die Reaktion wird daher zumeist im Satzbetreib ausgeführt.

Aceton-Butanol-Gärung

Vorgeschichte:

Industrielle Nutzung ganzer Zellen

Vor dem ersten Weltkrieg konnte Aceton petrochemisch nur schwer hergestellt werden, war

jedoch wichtig zur Darstellung von rauchfreiem Schießpulver. Daher ging man zur anaeroben

Gärung mit Clostridium acetobutylicum über. Bei der Gärung entstehen Aceton, Butanol und

Ethanol im Verhältnis 3 : 6 : 1. Butanol fand jedoch erst nach dem ersten Weltkrieg als

O


Einführung in die Biotechnologie - 72 -

Lösungsmittel für die Autolackherstellung (Nitroalluloselacke) in größerem Rahmen

Verwendung.

Aceton findet Verwendung: � als Lösungsmittel

� als Acetylallulose Lösungsmittel

� bei der Herstellung von Schießbaumwolle

� bei der Herstellung von Tränengas

� bei der Herstellung von Pharmaka

� zur Herstellung von Acetoncyanhydrin

(Synthesegrundstoff).

Probleme der biotechnologischen Herstellung:

Mit einem Lösungsmittelgehalt von maximal 20 g/l konnten nur schlechte Ausbeuten

erreicht werden. Bei sinkenden Erdölpreisen und gleichzeitig wachsenden Preisen für

Melasse wurde die biotechnologische Herstellung daher bald vollständig durch

petrochemische Verfahren verdrängt (Hydrierung von Acetylenen, die durch Pyrolyse von

Kohlenwasserstoffen erhalten werden.). Eine großtechnische Anlage mit 10 000 jato

Lösungsmittelproduktion ist heute nur noch in China in Betrieb.

Probleme der großindustriellen Nutzung der Aceton-Butanol-Gärung waren:

- geringe Butanoltoleranz des Mikroorganismus (in der statischen Kultur beträgt

die maximal tolerable Konzentration 200 mmol/l)

- hohe Kosten bei Produktisolierung

- schlechte Raum-Zeit-Ausbeute

- Produkte gehen teilweise über die Gasphase verloren. Es bilden sich explosive

Luft-Gasgemische

- hohe Rohstoffkosten

Heute wären biotechnologische Verfahren als Alternative zur petrochemischen Darstellung

interessant, wenn man mehr als 60 g/l Lösungsmittel fermentativ herstellen könnte. Ein

solches Verfahren ist heute noch nicht in Betrieb, doch werden weiterhin Möglichkeiten

untersucht, den biotechnologischen Prozeß konkurrenzfähig zu machen.

Neue Ansätze sind die Züchtung von Stämmen mit höherer Toleranz gegenüber Butanol.

Außerdem ist der Transfer der die für die Aceton-Butonol-Gärung relevanten Enzyme

codierenden Gene in resistentere Organismen denkbar.

Eine verfahrenstechnische Verbesserung des Prozesses ist die Entwicklung eines

kontinuierlichen Zweistufenprozesses mit kontinuierlicher Produktaufreinigung:

1. Stufe: Zellwachstum und Limitierung der Lösungsmittelproduktion

2. Stufe kein Wachstum und Lösungsmittelproduktion

Durch diese Prozeßführung ist eine bessere Anpassung an die Erfordernisse des

biologischen Systems gegeben. So konnten Standzeiten von einem Jahr gegenüber 200 h bei

Einstufenprozessen erreicht werden. Auf diese Weise werden zwar keine höheren Umsetze

erzielt, man erreicht aber einen stabilen Prozeß. Problematisch ist bisher noch die Abtrennung

des Lösungsmittels und Rückführung der Zellen ohne Beeinträchtigung der Aktivität.

Bedingungen für eine Gärung mit hohen Erträgen sind:

- pH < 5

- niedrige Durchflußraten (0,125 h -1 im ersten Kessel, 0,03 im 2. Kessel)

- Überschuß an vergärbarem Zucker

- Schwellenkonzentration an Butyrat

- Einsatz geeigneter wachstumslimitierender Faktoren (Phosphat, Sulfat)

- Temperatur: 37°C (1.Kessel), 33 °C (2.Kessel)


Einführung in die Biotechnologie - 73 -

Backhefe aus Saccharomyces cerevisiae

Bei diesem Prozeß ist die Bildung von Ethanol unerwünscht, da nur Biomasse produziert

werden soll. Deshalb ist für gute Durchlüftung und hohen Stickstoffgehalt zu sorgen. Die

Atmungsaktivität wird bei Glucosekonzentrationen oberhalb von 20 mg/l reprimiert und

Ethanolbildung setzt ein. Als Substrat für die Fermentation wird Melasse, speziell

Rübenmelasse verwendet, die bei der Zuckerherstellung als Abfallprodukt anfällt. Daneben

werden wachstumsfördernde Additive zugesetzt. Das zu Beginn der Hauptgärung unter

geringer Belüftung gebildete Ethanol wird unter den nachfolgenden strikt anaeroben

Bedingungen als C-Quelle benutzt. Die Hefeerzeugung erfolgt heute ausschließlich in

Zulaufverfahren, bei denen die Nährsubstanz während der Hefeentwicklung kontinuierlich

oder diskontinuierlich zugesetzt wird.

Zum Animpfen des Fermenters kann Hefe aus vorhergehenden Fermentationen

(Versandhefe) wegen ihres hohen Anteils an Fremdorganismen und der Optimierung

hinsichtlich der Teilungsrate nicht eingesetzt werden. Geeignete Impfkulturen (Stellhefe) sind

neue Reinkulturen oder gereinigte und auf Gärung umgezüchtete Versandhefe. Die Qualität

der Stellhefe beeinflußt maßgeblich die Qualität der Versandhefe.

Herstellung von Backhefe

Reinigung/ Anzucht: Soweit keine neuen Reinkulturen eingesetzt werden, wird

zunächst der Stoffwechsel der Versandhefe in hochkonzentrierter

Zuckerlösung unter fast anaeroben Bedingungen und unter Abwesenheit

von Nährsalzen auf Gärung umgestellt. Gleichzeitig werden durch

Säurezusatz Fremdorganismen getötet oder schwer geschädigt. In einem

zweiten Schritt wird der Zuckergehalt des Nährmediums ("Würze")

vermindert und der Nährsalzgehalt erhöht. Unter schwacher Belüftung setzt

nun Vermehrung ein. Man erhält die Stellhefe.

Reinkulturen werden nach Durchlaufen einer Anzuchtprozedur in die

Reinzuchtanlage überführt.

Reinzucht: Die Reinzuchtanlage besteht aus drei Stufen, die sich hinsichtlich der Quelle

(organisch, anorganisch) und der Menge an Stickstoff unterscheiden. Mit

der Hefe aus der dritten Stufe wird die erste Vermehrung im Betrieb

durchgeführt (I. Generation).

Hauptzucht: Die Hefe der I. Generation wird im Füllverfahren (Satzbetrieb) angesetzt.

Nach 6 - 8 h beginnt die Entwicklung der II. Generation im

Zulaufverfahren. Sie wird nach weiteren 6 - 8 h unterbrochen, bevor die

Hefezellen voll entwickelt sind. Der Extrakt kann gekühlt aufbewahrt

werden. (Aus der Reinzucht und der I. und II. Generation der Hauptzucht

lassen sich Ausbeuten von 20% Ethanol und 22% (bei guter Belüftung auch

bis zu 30%) Hefezellen erhalten.)

Aus der III. Generation wird die Versandhefe erzeugt. Dazu wird mit der

20 - 25% der zu erwartenden Hefe angeimpft. Zunächst werden bei pH 2 -

2,5 (1-2 h) erneut keimarme Bedingungen geschaffen. Als Reaktor werden

geschlossene 50-400 m³ Tanks aus V2A-Stahl oder Aluminium verwendet.

Nach 1 - 2 h setzt die Vermehrung ein und ist nach weiteren 9 - 12 h abgeschlossen.

Die Temperatur steigt währenddessen von 25°C auf 30°C an, das

Medium wird durch NH 3/NH 4 +-Puffer auf pH 4,2 - 4,8 gehalten. Zur

Schaumunterdrückung werden dem Medium Antischaummittel (Wollfett,

langkettige Paraffinsulfonate, Silicone) zugesetzt.


Einführung in die Biotechnologie - 74 -

Aufarbeitung: Nach Beendigung des Zulaufs schließt sich eine Reifephase unter

verminderter Belüftung an. Anschließend wird die Hefe mit Separatoren

abgetrennt, gewaschen, erneut abgetrennt und unter Kühlung durch

Rahmenfilterpressen abgepreßt. Die Hefe wird mit einem Wassergehalt von

67 - 71% gelagert und gelangt mit 72 - 77%igem Wassergehalt in den

Verkauf.

Betriebskontrolle des Zulaufverfahrens:

zu kontrollierende Parameter: - pH-Wert

- Stickstoffgehalt der Lösung

- Zuckergehalt der Würze

- Hefezuwachsrate

- Nährstoffgehalt der Würze, bestimmt aus dem

spezifischen Gewicht

- Alkoholgehalt


Einführung in die Biotechnologie - 75 -

Weiterführende Literatur

Karl Schügerl Bioreaktionstechnik Band I und II

Salle und Sauerländer

ISBN: 3-7935-5539-9

ISBN: 3-7935-5538-0

Octave Levenspiel The Chemical Reactor Omnibook

OSU Book Stores, Inc.

ISBN: 0-88246-160-5

Harvey Land/ Biochemical Enineering,

Douglas Clark Marcel Dekker, Inc.

ISBN: 0-8247-0099-6

James Bailey/ Biochemical Engineering Fundamentals

David Ollis McGraw-Hill

ISBN: 0-07-003212-2

Pauline M. Doran Bioprocess Engineering Principles

Academic Press

ISBN: 0-12-220856-

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