Klonierungsvektoren - FH-Wels

Geschichte der Biotechnologie





Geschichte der Biotechnologie 

seit 1982 erste transgene Pflanzen und Tiere (knock-out) 

1985 USA: Kary Mullis entdeckt die PCR Reaktion. 

seit 1990 USA: Das menschliche Genomprojekt wird gestartet 

1995 Transgene Tomaten sind zum ersten Mal im Geschäft 

erhältlich (England und USA) 

seit 1995 Genthereapie Experimente am Menschen 

1996 Hefegenom ist komplett sequenziert 

1998 Das Schaf Dolly wird geboren 

1998 Über 2 Milliarden Basenpaarsequenzen des Menschen 

sind in Computern vorhanden 

1999 Das Drosophila-Genom mit 1,6 Milliarden Basenpaaren 

ist innerhalb von 4 Monaten komplett sequenziert. 

1999 Menschliche Stammzellen können zum ersten Mal in 

Kultur gehalten werden. 

1999 Der Verkauf von biotechnologisch hergestellten 

Pharmaka übersteigt zum ersten Mal $ 10 Milliarden/Jahr.

Definition der Biotechnologie

Definition der Biotechnologie

Biotechnologie

Anzahl gentechnisch hergestellter Produkte in den USA

Die Entwicklung der Blutzellen in Säugetieren

Die Entwicklung der roten Blutkörperchen in Säugetieren 

• Erythropoietin (EPO)—Differenzierungs- und 

Wachstumsfaktor für rote Blutkörperchen 

• EPO führt zum Verlust des Zellkerns und bewirkt 

eine parallele Synthese von Hämoglobin 

• Hämoglobin transportiert Sauerstoff von der Lunge 

in die kleinen Blutgefäße (Sauerstoffversorgung 

der Muskeln) 

• Hämoglobin transportiert ein Teil des CO 2 zurück 

zur Lunge

EPO Synthese 

• Kupfferzellen in der Niere stellen EPO her 

• Kupfferzellen sind meist direkt neben Blutgefäßen 

• Hauptaufgabe der Kupfferzellen ist die Entsorgung von Verunreinigunge im Blut

Struktur von EPO 

• EPO besteht aus 165 Aminosäuren 

• EPO ist ein Glykoprotein 

• 4 große Zuckerketten sind mit 3 Asparaginen und 1 Threonin

EPO ist sauteuer: 

€ 500 Millionen/kg

Restriktionsenzyme 

• Restriktionsenzyme schneiden die Zucker- 

Phosphat Bindungen an beiden DNA Strängen 

• Restriktionsenzyme schneiden fast immer 

palindromische Sequenzen 

5’-GCCAATTGGC-3’ 

3’-CGGTTAACCG-5’ 

• Restriktionsenzyme dienen als Schutz für Bakterien vor Infektionen 

• Restriktionsenzme sind nach dem Organismus, aus dem sie isoliert 

wurden, benannt 

EcoRI – Escherichia coli, Stamm R1

Mechanismus der Restriktionsenzyme

Mechanismus der Restriktionsenzyme 

Restriktionsenzyme können drei verschiedene DNA-Enden generieren: 

•glatt 

• klebrig, auch kohäsiv genannt, mit 3’-Überhang 

• klebrig, mit 5’-Überhang

Wichtiger Punkt: 

DNAse schneidet DNA auch und zwar auch die 

Zucker-Phosphat Bindungen 

ABER 

DNAse schneidet nicht sequenz-spezifisch und ist daher für das 

Herstellen von rekombinanten DNA-Molekülen denkbar 

ungeeignet.

DNA Ligase 

• DNA Ligase verbindet DNA-Moleküle, die entweder 

passende kohäsive Enden haben oder 

irgendwelche glatten Enden 

• DNA Ligase katalysiert die Bindung zwischen dem Zuckerrest und der 

Phosphatgruppe benachbarter Nukleotide 

• DNA Ligase braucht unbedingt ATP damit sie ihre Reaktion ausführen 

kann.

Mechanismus der DNA Ligase 

Ganz wichtig: Die Enden der DNA Moleküle müssen komplementär sein 

damit die DNA Ligase sie verbinden kann 

Es können nur Enden, die mit gleichen Restriktionsenzymen generiert 

worden sind miteinander verbunden werden.

Klonierungsvektoren 

Um DNA-Moleküle in Zellen einzubringen, müssen sie in 

Klonierungsvektoren verpackt werden. 

Viele dieser Klonierungsvektoren können sich unabhängig 

von der DNA des Trägerorganismus duplizieren. 

Daher müssen sie folgende Kriterien besitzen: 

1. einen DNA-Replikationsstart 

2. Sie müssen klein genug sein, damit sie bei der Isolierung nicht 

abgebaut werden. 

3. Sie müssen einmalige Restriktionsschnittstellen besitzen für den 

Einbau von fremden DNA Molekülen. 

4. Sie müssen Selektionsmarker besitzen.

Klonierungsvektoren 

Es gibt Klonierungsvektoren für alle möglichen verschiedene Organismen. 

Häufige bakterielle Klonierungsvektoren: 

• Plasmide 

• Bacteriophagen 

•Cosmide 

Andere Klonierungsvektoren: 

• Yeast Artificial Chromosomes 

• Bacterial Artificial Chromosomes 

• Viruses 

Welchen Typ von Vektor man benutzt hängt von der Anwendung ab

Bakterielle Klonierungsvektoren 

Klonierungsplasmide werden extrachromosomal dupliziert 

Sie integrieren nicht ins bakterielle Genom

Der erste Klonierungsvektor 

• Plasmide üben normalerweise eine 

Vielfalt an biologischen Funktionen 

aus. 

• Es gibt zwei verschiedene Typen von 

Plasmiden: 

1. Low-copy Plasmide: Kommen nur 

1- bis 2-mal pro Zelle vor 

2. High-copy Plasmide: Kommen 

mehrer 100- bis 1000-mal pro Zelle 

vor.

Weiterentwickelte Klonierungsvektoren 

• Das Plasmid ist kleiner. 

• Das Plasmid enthält zwei Antibiotikaresistenzgene für Selektionszwecke 

• Das Plasmid enthält mehrere einzigartige Restriktionsschnittstellen

Antibiotikaselektion 

Mit Hilfe der Antibiotikaresistenzgene kann 

überprüft werden, ob ein Stück DNA vom 

Vektor aufgenommen worden ist. 

• Auf Nährmedium, das sowohl Ampicillin und 

Tetrazyklin enthält, wachsen nur Bakterien, 

die den linken Vektor aufgenommen haben. 

• Bakterien, die den rechten Vektor 

aufgenommen haben, wachsen nur noch 

auf Ampicillin-haltigem Nährmedium.

Moderne Klonierungsvektoren 

• Sind alles high-copy Plasmide 

• Besitzen nur noch ein Antibotikaresistenzgen 

• Das zweite Resistenzgen ist durch das β-galactosidase Gen ersetzt worden 

• Enthalten eine Multiple-Cloning-Site (MCS)

Multiple Cloning Site (MCS) 

• enthält sehr viele Schnittstellen, die einzigartig im Klonierungsvektor sind 

• enthalten Primersequenzen, die als Sequenzierhilfe beim Verifizieren 

des eingebrachten DNA-Stücks dienen

Moderne Klonierungsvektoren 

• Das zweite Resistenzgen ist durch das β-galactosidase Gen ersetzt worden

Blau-Weiß Selektion 

Mit Hilfe des β-galactosidasegens kann 

überprüft werden, ob ein Stück DNA vom 

Vektor aufgenommen worden ist. 

Das Nährmedium für die Selektion enthält: 

• Ampicillin 

• X-Gal (Lactose Analog) 

Bakterien, die einen Vektor aufnehmen, der 

keine DNA aufgenommen hat, wachsen als 

blaue Kolonien. 

Bakterien, die einen Vektor aufnehmen, der 

DNA aufgenommen hat, wachsen als weiße 

Kolonien.

Bakteriophagen als Klonierungsvektoren 

Bakteriophagen sind Viren, die Bakterien infizieren können. 

Bakteriophagen haben ein 50 kb großes Genom. 

Die erste Bakteriophage, die als Klonierungsvektor benützt wurde, ist 1974 

hergestellt worden—Bakteriophage lambda 

Bakeriophagen können als zirkuläres oder lineares DNA-Stück in der Zelle 

vorhanden sein: 

• linear bei der Infektion 

• zirkulär bei der Replikation 

Lineare Bakteriophagen-DNA haben klebrige DNA-Enden, mit einem 

jeweiligen 12-Basen Überhang—cos Stellen

Lebenszyklus von Bakteriophagen 

Lysogener Lebenszyklus: 

DNA wird im Trägergenom 

integriert und immer wieder 

repliziert 

Lytischer Lebenszyklus: 

DNA wird vom Trägergenom 

herausgenommen und in Phagen 

verpackt. Die Phagen bringen die 

Trägerzelle zum Platzen und die 

neuen Phagen können weitere 

Bakterien infizieren.

Bakteriophage Lambda als Klonierungsvektor 

• nicht-essentielle DNA kann aus den Phagen entfernt werden, so daß sie 

zusätzliche DNA aufnehmen können 

• kann bis zu 20 kb zusätzliche DNA aufnehmen 

• enthält ebenfalls einzigartige Restriktionsstellen 

• enthalten Primersequenzen, die als Sequenzierhilfe beim Verifizieren des 

eingebrachten DNA-Stücks dienen

Cosmide als Klonierungsvektor 

Sind Hybride, die aus Plasmiden und 

Bakteriophagen zusammengesetzt sind. 

Besitzt cos Stellen, die für die Verpackung 

in Phagen-Partikel zuständig sind. 

Nach der Infizierung des Trägers 

duplizieren Cosmide sich wie Plasmide— 

extrachromosomal. 

Cosmide können 35-45 kb DNA 

aufnehmen.

Bacterial Artificial Chromosome (BAC) 

als Klonierungsvektor 

• sind die am meisten verwendeten 

Vektoren für große DNA Fragmente 

• sind aus einem natürlich 

vorkommenden low-copy Plasmid 

entwickelt worden. 

• können DNA Fragmente zwischen 

100 und 300 kb.

Yeast Artificial Chromosome (YAC) als Klonierungsvektor 

Ein YAC hat folgende Komponenten: 

• ein Centromer 

•einTelomer 

• eine autonomously replicating 

sequence (ARS)--ori 

YACs können sich in Hefen unabhängig 

von der Träger-DNA replizieren. 

YACs können zwischen 200 und 1500 

kb DNA aufnehmen.

Klonierungsvektoren für Säugetierzellen 

Um DNA zu manipulieren verwendet man fast immer bakterielle Vektoren mit 

Bakterien als Trägerorganismus. 

Einzige Ausnahme: Verwendung von YACs für sehr große 

DNA Fragmente—Hefe dient als Wirtsorganismus 

Vektoren für Säugetierzellen sind meist Expressionsvektoren, um 

bestimmte manipulierte Gene zu exprimieren. 

Viren: • SV40 Virus 

• Adenovirus 

• Retrovirus 

Können alle alleine in die Zelle eindringen 

Expressionsvektoren müssen künstlich in Zellen eingebracht werden

DNA vectors: 

•plasmids 

•bacteriophage 

•YACs, BACs 

•viruses 

Vector must be checked: 

• Restriction mapping 

•DNA sequencing 

Which cell-type: 

•Bacteria 

• Yeast 

• Mammalian cells 

EPO gene must be isolated 

Gene must be cloned into a vector 

Different vector types 

•promoter 

•poly(A) tail 

•enhancers 

Vector must be transferred into cells 

Is the vector in the cells? 

Is EPO being made? 

•Genomiclibrary 

• cDNA library 

• PCR from genomic DNA 

DNA modifying enzymes: 

• Restriction endonucleases 

• DNA ligase 

• DNA phosphatase etc 

Transfection methods: 

• Electroporation 

• Lipofectin 

• Calcium phosphate 

• Nuclear injection 

• Eukaryotic selection 

• Southern blot 

Expression analysis: 

•Northern 

•Western 

• Immunoprecipitation

DNA vectors: 

•plasmids 


•YACs, BACs 

•viruses 





•Bacteria 

• Yeast 





•promoter 


•enhancers 



















•Northern 

•Western 


3 Wege ein Gen zu klonieren: 

Klonierung eines Gens 

1. Klonierung des Gens aus einer Genbank 

2. Klonierung des Gens aus einer cDNA-bank 

3. Klonierung des Gens mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Was ist eine Genbank? 

Eine Genbank ist eine Ansammlung von DNA Fragmenten, die in 

einen Klonierungsvektor einkloniert worden sind und einen 

gemeinsamen Ursprung haben. 

Also: 

geschnittene genomische DNA aus einem Organismus, die in einen 

Klonierungsvektor eingebracht wurde ist eine Genbank

Klonierung eines Gens aus einer Genbank 

1. Genomische DNA wird 

geschnitten. 

2. Fragmente werden isoliert. 

3. Fragmente werde in Phagen- 

DNA einkloniert. 

4. Phagen-DNA wird verpackt.

Warum zwei verschiedene Restriktionsenzyme? 

GATC 

CTAG 

+ Sau3AI 

GATC 

CTAG 

GATCC G 

CTAG 

GGATCC 

CCTAGG 

+ BamHI 

GATCC 

G 

G 

CCTAG

Warum zwei verschiedene Restriktionsenzyme? 

Man benützt zur Herstellung einer Genbank ein 4-cutter 

(Restriktionsenzym, das 4 Nucleotide als Schnittstelle erkennt), damit die 

Chance größer ist, daß das ganze Genom mindestens einmal in der 

Genbank vertreten ist.

Wie viele Phagen müssen untersucht werden? 

Das menschliche Genom hat 3 x 10 9 Basen 

Jede Phage enthält 1,5 x 10 4 Basen 

Also müssen mindestens 2 x 10 5 

Phagen untersucht werden. 

Um eine 98 %ige Chance zu haben, daß ein Gen in der Genbank 

vertreten ist müssen 4-5 mal so viele Phagen untersucht werden, wie 

man braucht, um das komplette Genom einmal abzudecken

Phagenwachstum in Bakterien 

Bei der Freisetzung der Phagen werden die Bakterien lysiert und es entstehen 

klare, freie Flächen auf der Platte.

Bakterienwachstum auf einer Platte 

Bakterien wachsen als einzelne Kolonien auf einer Platte

Fischen nach einem Gen in der Genbank 

1. Die Genbank wird ausplattiert 

2. Die Genbank wird auf eine 

Nitrozellulose- oder Nylonmembran 

transferriert. 

3. Die DNA wird auf der Membran 

immobilisiert. 

4. Die Membran wird mit einer 

genspezifischen Probe hybridisiert.

Hybridisierung einer Nitrozellulosemembran 

mit einer radioaktiv markierten Sonde 

Phagen, die die gesuchte DNA enthalten, sind als schwarze Punkte auf dem 

Röntgenfilm sichtbar.

Herstellung einer cDNA-Bank 

1. Isolierung aller mRNAs einer Zelle 

2. Synthese der cDNA 

3. Chemischer oder enzymatischer 

Abbau der RNA


4. Synthese eines Mononucleotid- 

Überhangs 

5. Synthese des Komplementärstrangs


6. Ligation von DNA-Linkern 

7. Restriktionsverdau der Linker 

8. Einbringung der cDNA in einen 

Klonierungsvektor

Überblick über das Fischen eines Gens aus einer Genbank 

1. Herstellung der Genbank 

2. Plattieren der Genbank 

3. Übertragen der Genbank 

4. Hybridisieren der Genbank 

5. Klonisolierung aus der Genbank

Polymerase Kettenreaktion

Zyklische Widerholung des PCR-Programms

PCR Gerät

DNA vectors: 

•plasmids 


•YACs, BACs 

•viruses 





•Bacteria 

• Yeast 





•promoter 


•enhancers 



















•Northern 

•Western 


DNA vectors: 

•plasmids 


•YACs, BACs 

•viruses 





•Bacteria 

• Yeast 





•promoter 


•enhancers 



















•Northern 

•Western 


Prinzip der DNA Isolierung 

a) Cäsiumchlorid Methode 

b) Phenol/Chloroform Methode 

c) Ionen-Austausch Methode

DNA Isolierung mittels Ionenaustausch 

DNA bindet an die positiv geladene Gruppe des DEAE mittels der 

negativ geladenen Phosphatgruppe.

DNA Verdau mit Hilfe von Restriktionsenzymen 

Ein DNA Verdau muß enthalten: 

1. DNA, die verdaut werden soll 

2. Restriktionsenzym 

3. Puffer 

Enzymeinheiten: 

1 U Restriktionsenzym verdaut 1 µg DNA in einer 

Stunde bei optimalen Reaktionsbedingungen.

DNA Verdau mit Hilfe von Restriktionsenzymen 

Vorsicht: 

Restriktionsenzyme können Star-Aktivität haben 

Star-Aktivität: 

Enzyme schneiden DNA unter ungünstigen Reaktionsbedingungen 

auch an anderen Sequenzen als ihre gewohnte Erkennungssequenz. 

Bedingungen, die zu Star-Aktivität führen: 

• Hohe Glycerol Konzentrationen (>5% v/v) 

• Hohes Enzym-Einheiten zu µg DNA Verhältnis (normalerweise >100 

Einheiten/µg) 

• Geringe Salzkonzentration (8,0) 

• Organische Lösungsmittel (DMSO, Ethanol, Ethylenglycol…..) 

• Austausch von Mg 2+ mit anderen divalenten Kationen (Mn 2+ , Cu 2+ , 

Co 2+ , Zn 2+ )

Agarose Gel Electrophorese 

Die Methode dient zur Visualisierung 

und Größenbestimmung von DNA 

Molekülen


1. DNA wird mittels 

Restriktionsenzymen geschnitten. 

2. Größen der Fragmente werden in 

einem Agarosegel bestimmt. 

3. Fragmente werden umgekehrt 

proportional zu ihrer Größe 

aufgetrennt: 

• kleine Fragmente wandern weit 

• große Fragmente wandern kurz

Mit Hilfe des Kamms werden Taschen 

ins Gel geformt 


In der Gelkammer kann 

Spannung angelegt werden: 

• DNA wandert zum + Pol


1. Agarose und Puffer werden 

aufgekocht. 

2. Gel wird gegossen 

3. Kamm wird eingfügt damit die 

Taschen sich formen können 

4. Gel wird beladen. 

5. DNA wird der Größe nach 

aufgetrennt.

Färben der DNA im Agarose Gel 

• Ethidium bromid interpoliert zwischen den DNA Doppelstrang. 

• Ethidium bromid wird durch UV-Licht angeregt und leuchtet. 

• Ethidium bromid ist sehr giftig (karzinogen), aber sehr sensitiv. 

• Andere DNA Färbemittel sind auf dem Markt, haben aber alle ihre Nachteile.

verdaute DNA 

DNA Agarose Gel-Bild 

DNA Größenstandard

DNA vectors: 

•plasmids 


•YACs, BACs 

•viruses 





•Bacteria 

• Yeast 





•promoter 


•enhancers 



















•Northern 

•Western 


DNA vectors: 

•plasmids 


•YACs, BACs 

•viruses 





•Bacteria 

• Yeast 





•promoter 


•enhancers 



















•Northern 

•Western 


Prokuktion rekombinanter Proteine— 

Gen Expressionssysteme 

2 Möglichkeiten rekombinante Proteine zu produzieren: 

1. Expression des Gens in fremden Zellen 

2. Expression des Gens in vitro mit Hilfe von Zelllysaten, die die 

Proteinsynthese erlauben.

Zelluläre Genexpressionssysteme 

Rekombinante Proteine können in folgenden Zellsystemen erzeugt werden: 

• Bakterien 

• Hefen 

• Insektenzellen 

• Säugetierzellen

Expression von rekombinanten Proteinen in Bakterien 

1. Verwendete Bakterien: Staphylococcus, Bacillus, Caulobacter 

or Pseudomonas. 

2. Für die Expression von rekombinanten Proteinen verwendet 

man spezielle Expressionsvektoren, die den 

Klonierungsvektoren sehr ähnlich sind. Sie enthalten allerdings 

ein paar zusätzliche Eigenschaften: 

• Kontrollierbare Promoter 

• Ribosomen Bindungsstelle 

• Transkriptions-Terminationsstellen 

• Translations-Terminationsstellen 

• Multiple cloning site 

• Replikationsursprung 

• Selektionsmarker

Bakterielle Promotersequenzen 

Je näher die eigentliche Sequenz der optimalen Sequenz entspricht, 

desto besser wird das einklonierte Gen exprimiert. 

Zu hohe Expressionsraten können aber auch schädlich sein.

Kontrollierbarer bakterieller Promoter 

In der Gegenwart von Glukose ist 

der Promoter nicht aktiv. 

In der Gegenwart von Laktose ist der 

Promoter aktiv.

Kontrollierbarer bakterieller Promoter 

In der Gegenwart von Glukose ist 

der Promoter nicht aktiv. 

In der Gegenwart von Laktose ist der 

Promoter aktiv.

Kontrollierbarer starker bakterieller Promoter 

Die Expression der T7 RNA polymerase wird mit Hilfe des lac Promoters reguliert. 

Die T7 RNA polymerase führt zu einer hohen Expression des einklonierten Gens.

Bakterielle Ribosomenbindungstelle 

Die Ribosomenbindungsstelle muß 7-9 Nukleotide vor dem Start-Codon sein 

Die 16S rRNA des Ribosomes bindet direkt an die vorliegende mRNA

Bakterielle Transkriptions-Terminationssequenz 

Durch die Bildung eines „Hairpin Loops“ wird verhindert, daß die RNA 

Polymerase ein endlos RNA-Transkript produziert.

Multiple-Cloning Site zum Einklonieren des Gens

Die Zahl der Bakterien 

in der Kultur verhält 

sich proportional zu der 

Extinktion bei einer 

Wellenlänge von 600 

nm. 

Bakterielle Wachstumskurve 

Produktion des Proteins während der Wachstumsphase kann unter 

Umständen das Wachstum inhibieren—Toxizität des Proteins für die 

Bakterien. 

Menge an prduziertem Protein

Verwendete Hefen: 

Vorteile: 

Hefe Expressionssysteme 

• Saccharomyces pombe, Pichia pastoris or Schizosaccharomyces pombe 

• Hefen besitzen die gleiche Proteinsynthese-Maschinerie wie Säugetiere 

• Hefen wachsen ähnlich wie Mikroorganismen—Bakterien. 

Nachteile: 

• Die Modifikationen an den Proteinen nach der Translation ist nicht 

immer gleich den Säugetieren.

Hefe-spezifische Promotoren für Genexpression 

Saccharomyces cerevisiae: Galactose induzierbare Gal1 und Gal10 

Promotoren 

Pichia pastoris: Methanol induzierbare Alkoholoxidase Promoter 

(AOX1) 

Schizosaccharomyces pombe: Thiamine induzierbare Promotoren 

nmt1, nmt2 und nmt81

Hefe-spezifische Replikationsursprünge 

• Yeast Integrating Plasmids: YIp 

• Yeast Replicating Plasmids: YRp 

• Yeast Episomal Plasmids: YEp 

Diese beiden Plasmide 

werden nicht ins Hefegenom 

integriert.

Hefe-spezifische Selektionsmarker 

Hefen werden mit Hilfe von auxotrophe Markern selektioniert, z.B. leu2, 

ura3, trp1 oder his4 

• Gene, die für den Metabolismus von bestimmten Stoffen 

verantwortlich sind, sind in der Hefe mutiert. 

• Die Hefe kann nur überleben, wenn das Metabolit im 

Nährmedium ist, oder das Gen auf einem 

Expressionsvektor in nicht mutierter Form wieder in die 

Hefe gebracht wird.

Expression von rekombinanten Proteinen in Hefe 

• Ein Problem der Expression in S.cerevisia ist die Hyperglykosylierung. 

•In P.pastoris ist die Hyperglykosilierung ein geringeres Problem. 

Es können Proteine exprimiert werden, die sowohl in der 

Zelle bleiben als auch aus der Zelle sezerniert werden. 

• In S.pombe kommt die Prozessierung der erzeugten Proteine den 

Säugetieren am nächsten.

Klonierungsstrategie für EPO 





Is EPO being made?

DNA vectors: 

•plasmids 


•YACs, BACs 

•viruses 













• DNA phosphatase etc

DNA vectors: 

•plasmids 


•YACs, BACs 

•viruses 


•Bacteria 

• Yeast 






•promoter 


•enhancers 










• DNA phosphatase etc

DNA vectors: 

•plasmids 


•YACs, BACs 

•viruses 





•Bacteria 

• Yeast 





•promoter 


•enhancers 



















•Northern 

•Western 


Expression von rekombinanten Proteinen in 

Insektenzellen 

2 verschiedene Systeme: 

1. Das zu exprimierende Gen wird mit Hilfe von Baculoviren in 

die Zellen eingebracht. 

2. Das zu exprimierende Gen wird direkt in die Zellen 

eingebracht. 

Dieser Prozeß nennt sich Transfektion


Insektenzellen mit Hilfe von Bakuloviren

Baculovirus Genexpressionssystem


Insektenzellen mit Hilfe von Bakuloviren

Homologe Rekombination



Diese Rekombination findet 

in den Bakterien statt um den 

Shuttle-Vektor mit dem 

viralen Genom zu verbinden. 


Proteinexpression in Säugetierzellen 

2 Möglichkeiten rekombinante DNA in die Zellen zu bringen: 

1. Virale Infektion der Zellen mit genetisch-modifizierten Viren 

2. Direkte Einbringung der DNA mit Hilfe der Transfektion 

Egal welches der beiden Systeme verwendet wird, der 

Expressionsvektor muss wieder bestimmte Eigenschaften haben.

Virale Promoter: 

Säugetierspezifische Promotoren 

• SV40 Promoter 

• Cytomegalovirus Promoter 

Promotoren von Housekeeping-Genen, die konstante Aktivität aufweisen 

• Promoter des Transkriptionsfaktorgens E2A 

• Promoter des β-Aktin Gens 

Induzierbare Expressionssysteme 

• Tetracyclin-induzierbare Expressionssystem

Tetracyclin-induzierbare Expressionssystem 

In der Gegenwart von Tetrazyklin (Doxyzyklin) findet keine Transkription des 

rekombinanten Gens statt.

Weitere Eigenschaften von Säugetierexpressionsvektoren 

Terminationssequenzen: 

• Polyadenylierungssignal AAUAAA 

• Haarnadelsequenzen die das Abfallen der RNA Polymerase begünstigen 

• Gut charakerisierte virale Terminationssequenzen 

Replikationsursprung: 

• Expressionsvektoren werden in Säugetierzellen normalerweise nicht 

episomal repliziert. Sie integrieren ins Genom. 

• Ausnahme: Vektoren, die den Replikaitonsstartpunkt des SV40 Virus 

haben können sich in COS-Zellen extrachromosomal replizieren.

Virale Expressionssysteme in Säugetierzellen 

1. Einbringung der DNA mit Hilfe des Adenovirus 

• sehr große DNA Stücke können in den Vektor kloniert werden 

• Expression läßt sich gut regulieren 

• Virus liegt episomal vor, daher Verlust nach mehreren Zellteilungen 

2. Einbringung der DNA mit Hilfe eines Retrovirus 

• haben ein begrenztes Wirtsspektrum 

• relativ arbeitsaufwendig 

• hohe Infektionsraten 

3. Einbringung der DNA mit Hilfe eines Semliki-Forest-Virus 

• kann fast alle Zelltypen von verschiedenen Spezies 

infizieren 

• als kontrollierbarer Promoter wird meist der bakterielle SP6- 

Promoter gewählt

Retrovirale Genexpressionssysteme 

Struktur eines Retrovirus:

Retrovirale Genexpressionssysteme

Zellfreie Proteinexpressionssysteme 

Es gibt drei verschiedene Systeme: 

1. Reticulocytenlysate vom Kaninchen 

• Da Reticulocyten keinen Zellkern haben, kann dieses System nur 

Proteine von einer vorher synthetisierten mRNA herstellen. 

• sehr effizientes System 

2. Weizenkeimextrakte 

• wird häufig für die Translation von mRNAs benutzt, wo man 

weiss, dass sich doppelsträngige Strukturen bilden können. 

3. E.coli Extrakte 

• kann gekoppelte Transkription/Translation Reaktionen ausführen 

• das am weitesten entwickelte System 

• hat die größten Ausbeuten


Ungekoppelte Systeme enthalten alle Makromoleküle, die nur für die 

Translation notwendig sind: 

• Ribosomen 

• Aminosäuren 

• tRNAs 

• Initiationsfaktoren 

• Elongationsfaktoren 

• Terminationsfaktoren 

• Energiequellen wie ATP und GTP 

Gekoppelte Systeme enthalten alle Makromoleküle, die für die Transkription 

UND die Translation notwendig sind: 

• alle Zutaten von oben 

• RNA polymerase 

• Nukleotide 

• Transkriptionsfaktoren


Vorteile: 

• sehr schnell 

• bietet die Möglichkeit viele verschiedene 

Proteine herzustellen, z.B. Mutanten 

• braucht wenig Vorarbeit 

Nachteile 

• sehr teuer 

• keine post-translationellen 

Porteinmodifikationen 

• geringe Ausbeute

DNA vectors: 

•plasmids 


•YACs, BACs 

•viruses 





•Bacteria 

• Yeast 





•promoter 


•enhancers 



















•Northern 

•Western 


DNA vectors: 

•plasmids 


•YACs, BACs 

•viruses 





•Bacteria 

• Yeast 





•promoter 


•enhancers 



















•Northern 

•Western 


DNA vectors: 

•plasmids 


•YACs, BACs 

•viruses 





•Bacteria 

• Yeast 





•promoter 


•enhancers 



















•Northern 

•Western 


DNA Sequenzierung

DNA Sequenzierung

DNA Sequenzierung

DNA Sequenzierung

DNA Sequenzierung

DNA Sequenzierung

DNA vectors: 

•plasmids 


•YACs, BACs 

•viruses 





•Bacteria 

• Yeast 





•promoter 


•enhancers 



















•Northern 

•Western 


Elektroporation

Elektroporation

Liposomale Transfection

Kalziumphosphat Methode

Injektion in den Zellkern

Virale Infektion der Zellen

DNA vectors: 

•plasmids 


•YACs, BACs 

•viruses 





•Bacteria 

• Yeast 





•promoter 


•enhancers 



















•Northern 

•Western 


Table: Comparison of radioactive and non-radioactive nucleic acid 

labelling and detection systems 

Labelling and 

detection 

system 

32 P 

AlkPhos Direct 

ECL Direct 

Gene Images 

Random-Prime 

with CDP-Star 

Detection 

Gene Images 3'- 

Oligolabelling 

with CDP-Star 

Gene Images 

Random-Prime 

with ECF 

Gene Images 3'- 

Oligolabelling 

with ECF 

ECL Random- 

Prime 

ECL 3'-End 

Labeling 

Sensitivit 

y 

Down to 

10 fg 

60 fg 

0.5 pg 

50 fg 

0.1 pg 

0.25 pg 

120 pg 

0.5 pg 

0.2 pg 

Application 

All high-sensitivity 

applications 

All high-sensitivity 

applications 

High-target 

applications 

High-sensitivity 

Northern blots 

Oligonucleotide 

screening with 

stringency control 

Quantification 

Quantification 

Medium-target 

Southern blots with 

DNA probes 

Medium-to hightarget 

Southern blots 

with oligonucleotide 

probes 

Probe 

labelling 

time 

5 min 

to 3 h 

30 min 

20 min 

30 min 

30 min 

30 min 

30 min 

30 min 

30 min 

Time from 

hybridizati 

on 

to 

detection 

On film, 1 h 

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Klonierungsvektoren - FH-Wels

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