Oxidation von Cysteinen: mehr als ein Artefakt der ... - Biospektrum

608 WISSENSCHAFT · SPECIAL: PROTEOMFORSCHUNG
A
B
˚ Abb. 2: Quantitative MS(Massenspektrometrie)-basierte Methoden zur Analyse von oxidierten
Cysteinen. A, Mithilfe von isotopenmarkierten ICAT-Reagenzien werden Proteine (und Proteome)
vor und nach Reduktion an freien Thiolgruppen von Cysteinen markiert und nach proteolytischem
Verdau mittels MS analysiert. Die Verhältnisse der Signale für „schwere“ und „leichte“ Peptide
lassen Rückschlüsse auf den Oxidationszustand der Cysteine in verglichenen Proben zu. B, Eine
gezielte Quantifizierung von Peptiden mit Cysteinsulfensäuren ist mithilfe von Dimedon-basierten
isotopenmarkierten Reagenzien möglich. Markiert man in einer Probe Cysteinsulfensäuren mit
einer leichten Form von Dimedon und freie Thiole am Cystein mit einer schweren Form des Derivats
Iododimedon, lassen sich nach proteolytischem Verdau und MS-Analyse die Verhältnisse von
Peptiden mit zu Sulfensäure oxidierten Cysteinen und ihren nicht oxidierten Gegenstücken
bestimmen.
˚ Abb. 3: Zweidimensionales Proteingel aus einer Studie zur Analyse von Peroxiredoxin I vermittelten
Effekten auf das Redoxproteom von Tumorzellen. Cysteine wurden mit Fluoreszenzfarbstoffen
markiert: A, interner Standard; B, zu analysierende Probe; C, Überlagerung beider Kanäle.
Durch den Vergleich von vor der Markierung reduzierten und nicht-reduzierten Proben lassen sich
redoxaktive Cysteine intakter Proteine identifizieren.
Multimerisierung und zu einer Chaperon-
Aktivität des Enzyms führen kann [3]. Je
nach Oxidationszustand der Cysteine ändert
sich also die Aktivität und Funktion des
Enzyms.
Die Tatsache, dass die Oxidation von Cysteinen
in den letzten Jahren immer mehr in den
Vordergrund bei der Aufklärung der biologischen
Funktionszusammenhänge gerückt ist,
liegt an rasanten Entwicklungen im Bereich
der Proteinanalytik. Insbesondere durch die
Einführung spezifischer Probenvorbereitungsmethoden
in Verbindung mit der Steigerung
der Sensitivität, Genauigkeit und
Geschwindigkeit der Analytik mithilfe der
Massenspektrometrie konnten wesentliche
Fortschritte erzielt werden. Ein besonderer
Fortschritt war hier die Einführung von Mar-
kierungsmethoden, die es erlauben den Oxidationszustand
der Cysteine „einzufrieren“
und eine quantitative Analyse von Proteinen
durchzuführen.
Proteinanalytische Methoden zur
Analyse der Oxidation von Cysteinen
Gerade bei der Analyse von komplexen Proteomen
und bei der Charakterisierung von
posttranslationalen Modifikationen hat die
Proteinmassenspektrometrie einen großen
Einfluss. Durch die Verwendung von (Isotopen-)Markierungen,
aber auch mit markierungsfreien
Ansätzen lassen sich mittlerweile
die Mengen von Peptiden und Proteinen aus
komplexen Mischungen heraus mit einem
Variationskoeffizent von unter zehn Prozent
bestimmen [4].
Zusätzlich wurden in den letzten Jahren einige
Reagenzien und Methoden entwickelt, die
die Analyse von oxidierten Cysteinen vereinfachen.
Die meisten dieser Methoden verwenden
Derivate von N-Ethylmaleinimid oder
Jodacetamid, beides sind Alkylanzien, die mit
freien Thiolgruppen reagieren. In Kombination
mit Molekülen wie Biotin, die für eine
Aufreinigung verwendet werden können, lassen
sich freie Thiolgruppen nicht nur markieren,
sondern auch anreichern. Dies ist insbesondere
in Kombination mit Isotopenmarkierung
interessant, wie sie beim OxICAT-
Ansatz (ICAT: isotope-coded affinity tag) eingesetzt
wird. Hierbei werden freie Thiolgruppen
von Cysteinen eines Proteinlysats
mit einer leichten Form des ICAT-Reagens
markiert. Nach Reduktion von reversibel oxidierten
Cysteinen (Disulfide, Sulfensäuren,
Nitrosothiole) zu ihrer Thiolform lassen sich
diese mit einer schweren Form des ICAT-Reagens
markieren. Nach einem tryptischen Verdau
und Anreicherung der markierten Peptide
werden durch massenspektrometrische
Analyse die Verhältnisse von mit schweren
und leichten Isotopen markierten Peptiden
bestimmt (Abb. 2A, [5, 6]). Eine spezifische
Analyse von zu Sulfensäure derivatisierten
Cysteinen lässt sich durch die Verwendung
von Dimedon-basierten Agenzien erreichen,
auch dies ist in Kombination mit einer Isotopencodierung
möglich (Abb. 2B, [7]). Gerade
die frühzeitige Markierung der Cysteine und
quantitative Analyse erlaubt es, ko-analytische
Artefakte auszuschließen bzw. zu unterscheiden.
So sind ebenfalls Ansätze realisiert,
die die Cysteine noch in der Zellkultur oder
am lebenden Tier modifizieren [8, 9].
Eine weitere Möglichkeit, die Analyse der
Oxidation von Cysteinen auf der Ebene von
ganzen Proteinen durchzuführen, bietet die
zweidimensionale Gelelektrophorese. Durch
Verwendung unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe
besteht die Möglichkeit, Proben
unter reduzierenden und nicht-reduzierenden
Bedingungen direkt miteinander zu vergleichen
[10]. Die Proben werden jeweils mit
Fluoreszenzfarbstoff markiert und in zwei
Dimensionen nach dem isoelektrischen Punkt
und der Proteingröße getrennt und beide
Farbstoffkanäle separat ausgelesen. Durch
einen Vergleich der Proteinspots der reduzierten
mit der nicht-reduzierten Variante lassen
sich Proteine mit redoxreaktiven Cysteinen
identifizieren. Mithilfe dieses Verfahrens
haben wir den Einfluss des Proteins Peroxiredoxin
1 auf den Redoxstatus von Proteinen
analysiert (Abb. 3). Uns interessiert diese Fra-
BIOspektrum | 06.12 | 18. Jahrgang