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Instrumentelle MethodenTeil 2: KapillarelektrophoresePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Gliederung• Prinzip• GerätetechnikKapillarenInjektionsmethodenDetektionsmethoden• Kapillarelektrophoretische Modi• BeispielgerätPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Prinzip der Kapillarelektrophorese• Kapillarelektrophorese:Trägerfrei in einemoffenen Rohr(Kapillare)• CE (capillaryelectrophoresis)• Kapillarlängen:5-100 cm• Innendurchmesser derKapillare:20-200 µm+ -5-100 cm20-200 µmPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Prinzip der Kapillarelektrophorese• Trennmedien: Wäßrige Puffersysteme Stromtransport,konstanter pH-Wert• Beispiele:‣ Phosphat- und Citratpuffer bei saurem pH‣ Borat- und TRIS-Puffer bei basichen pH‣ Auch zwitterionische Puffer• Trennung bei elektrischer Feldstärke von mehrerenhundert V/cm• Resultierender Strom ist gering (im Bereich von 100 µA)• Detektion: on-Column UV-Absorption direkt durch dietransparente KapillarePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

• fused-Silica-Kapillare• Hochspannungsversorgung• 2 Elektroden• Pufferreservoirs• On-Column-Detektor• Moderne Geräte:‣ Probengeber‣ Fraktionssammler‣ HydrodynamischenInjektionssystem‣ KapillarthermostatisierungseinheitGerätetechnikPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

• UV transparente Materialien:‣ fused-Silica amorpher Quarz‣ Borsilikatglas‣ TeflonKapillaren• Geringer Durchmesser: Effiziente Wärmeableitung• Mechanische Stabilität: Außenoberfläche der Kapillaremit Polyimidschicht geschützt Entfernen für Detektionnötig (Skalpell oder Flamme)PD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

• HydrodynamischeInjektion‣ Vakuum auf derDetektionsseite‣ Druck auf derEinlassseite‣ Gravitationskraftdurch Anhebender EinlassseiteInjektionsmethoden• ElektrokinetischeInjektionPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Injektionsmethoden• Trenneffizienz der Kapillarelektrophorese‣ Geringes Injektionsvolumen keine Bandenverbreiterung• Gesamtvolumen der Kapillare wenige µl‣ Probenvolumen einige nl• Reproduzierbare Injektionsvolumina wichtig Routineanalytik• Probenvolumen V i bei der hydrodynamischen InjektionVi=4Δp⋅ Π ⋅r8 ⋅ η⋅L⋅ t‣ Abhängig von: Druckdifferenz Δp, Injektionszeit t, Kapillarlänge L,Viskosität η, Kapillarradius rPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Injektionsmethoden• ElektrokinetischeInjektion‣ AufgebrachtesProbenmenge nimmtmit der Mobilität derProben-Ionen zu‣ Injizierte Probenmengehängt von derProbenmatrix ab• HydrodynamischeInjektionPD Dr. C. Kasper‣ Unhabhängig von derMobilität derProbenmatrixElectrodeElectrodeTCIInstitut fürTechnische Chemie

Detektionsmethoden• Absorptions-Detektor⎛I0 ⎞‣ Lambert-Beersche-Gesetz A = log⎜⎟ = ε ⋅c⋅⎝ I ⎠‣ UV-Detektor‣ Diodenarray-Detektor (DAD)‣ Photodiodenarray-Detektor (PDA)‣ Empfindlichkeit: 10 -15 -10 -13 mol‣ Anwendungen: Proteine, aromatischeVerbindungen• Indirekte UV-Detektion (Probenohne Absorption im UV-Bereich)‣ Puffer + Elektrolyt mit UV-Absorption Negatives Signal‣ Empfindlichkeit: 10 -16 -10 -13 mol‣ Anwendungen: Organische undanorganische Ionen, ZuckerPD Dr. C. KasperdUV-DetektionDetektorzelleTCIKapillareNegatives SignalInstitut fürTechnische Chemie

Fluoreszenz-DetektorDetektionsmethoden‣ Molekülanregung Abgabe derAnregungsenergie durch spontane Emission(Fluoreszenz)‣ Signalintensität ist direkt proportional derIntensität der eingestrahlten Anregungsenergie‣ Lampenanregung:‣ Empfindlichkeit: 10 -18 -10 -13 mol‣ Anwendungen: derivatisierte Aminosäuren,DNA, Peptide, Protein‣ Laserinduzierte Fluoreszenz:‣ Hohe Empfindlichkeit:10 -21 -10 -17 mol‣ Anwendungen: DNA-Fragmente, derivatisierteAminosäurenKapillareFluoreszenzPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Detektionsmethoden• Massenspektrometrie-Detektor‣ Empfindlichkeit: 10 -17 -10 -8 mol‣ Anwendungen: Proteine, Peptide, drug-monitoring‣ z.B. ESI-MS (Electrospray Ionization)PD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

DetektionsmethodenEingesetzt werden auch:• Leitfähigkeitsdetektor• Elektrochemischer Detektor• Brechungsindexdetektor• Detektor für RadioisotopePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Elektrophoretische Wanderung• Zunehmende Spannung und damit wachsende FeldstärkeE führt zu Erhöhung der elektrophoretischenWanderungsgeschwindigkeit v EPH der IonenLEFFvEPH= μEPH⋅E=t‣ Elektrophoretische Mobilität µ EPH , effektive Kapillarlänge L EFF ,Migrationszeit t M• Wanderndes Ion im elektrischen Feld unterliegtKräftegleichgewicht+K RE+zMK B-K R = ReibungskraftK B = BeschleunigungskraftPD Dr. C. Kasperv EPHTCIInstitut fürTechnische Chemie

Elektrophoretische WanderungBeschleunigungskraft KBKB=z ⋅F⋅ENAReibungskraft KR (Stokesches GesetzK R=6 ⋅ π ⋅ η⋅r⋅ vPD Dr. C. KasperWanderungsgeschwindigkeit:vEPH=z ⋅F⋅E6 ⋅ π ⋅ η⋅r⋅NAz = effektive Ladung des IonsF = Faraday-KonstanteN A = Avogadrozahlη = dynamische Viskositätr = Stokescher Radius desIonsFür die elektrophoretische Mobilität µEPH ergibt sich damit:μEPH=6 ⋅z ⋅Fπ ⋅ η⋅r⋅NATCIInstitut fürTechnische Chemie

Elektrophoretische Wanderung• Anlegen von Spannung (10 bis 30 kV) Trennung aufgrundverschiedener Wanderungsgeschwindigkeiten der Probe imTrennpuffer• Berechnung der Mobilität µ EPH im elektrischen Feld EμEPH=LtMEFF⋅E=LEFFtM⋅L⋅UGES‣ Elektrisches Feld fällt über gesamte Länge der Kapillare ab (L GES )‣ Moleküle durchwandern aber nur effektive Länge (L EFF ) (bis zumDetektor) in der Migrationszeit (t M )Elektrophoretische Trennungen nur möglich bei unterschiedlicherMobilität der IonenPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Negativ geladeneKapillarwand (fused silica)• Hydratisierte Kationenakkumulieren nahe derKapillarwand• Elektroosmotischen Fluß(EOF) in Richtung derKathode bei Anlegen eineselektrischen FeldesPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Trennungsprinzip‣ Interaktionen der Analyten mit dem EOF• Kationen wandern zur Kathode (negativer Pol)• Anionen wandern zu Anode (positiver Pol)PD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Unbehandelte Kapillaren (uncoated)‣ Elektrophoretische Geschwindigkeit‣ Zusätzlich: Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Gesamtgeschwindigkeit:‣ Vektorielle Summe aus elektrophoretischer (v EPH ) undelektroosmotischer (v EOF )GeschwindigkeitDiffuse Doppelschicht Zeta-PotenitalPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Ladungsunterschiede an derInnenseite der Kapillare (diffuseDoppelschicht) resultieren in Zeta-Potential (ζ)• Zeta-Potential und damit der EOF istabhängig von der Dissoziation derSilanolgruppen und dadurch vom pH-Wert der Elektrolytlösung• Basischer pH EOF höher alsWanderungsgeschwindigkeit derIonen‣ Auch Anionen werden durch denEOF zur Kathode transportiert• Saurer pH EOF geringer alsWanderungsgeschwindigkeit derIonenPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Flussprofil des EOF ist stempelförmigen‣ Bei konstantem Fluss trägt der EOF nicht zu Peakverbreiterungbei• Wanderungsgeschwindigkeit (v EOF ) des EOF:ε ⋅E⋅ ζv EOF= 4 ⋅ π ⋅ η‣ Dielektrizitätskonstante ε, Zeta-Potential ζ, Viskosität ηPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Elektrischer StromflußElektrischer Stromfluss führt zu JoulescherWärmeentwicklung‣ Wärmeabfuhr nur über Kapillarwand resultierenderTemperaturgradient‣ Maximale Trenneffizienz kleiner TemperaturgradientVerringerung KapillarinnendurchmesserFlüssigkühlung der Kapillare‣ Temperaturgradient verursacht Viskositätsgradienten Auswirkung aufs Flussprofil‣ Langsamere Wanderung im Bereich hoher Viskosität(Kapillarwand)‣ Schnellere Wanderung im Bereich geringer Viskosität(Kapillarmitte)PD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Kapillarzonenelektrophorese (CZE)• Trennung nach Unterschied inGröße und Ladung• Zunächst wird die Probe (AB) indie Kapillare injiziert• Unter Einfluss des elektrischenFeldes wird die Probe indiskrete Zonen (A und B)unterteilt, die ihrerseitsAnalyten mit der gleichenelektrophoretische Mobilitätenthalten• Puffer, pH-Wert, elektrischeFeldstärke bleiben konstantPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Kapillarzonenelektrophorese (CZE)PD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Peakverbreiterung• Peakverbreiterung Verursachung durch longitudinale Diffusion• Eingangsprofil sei unendlich schmal örtliche Varianzder Konzentrationsverteilung durch die Einstein-Gleichung bestimmt2σ = 2 ⋅D⋅ tz2σ zDiffusionskoeffizient D; Zeit t‣ Varianz und damit mit Peakverbreiterung nimmt mit der Zeit t zuPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

PeakshapeElektrodispersion zusätzlicher Peakverbreiterung‣ Elektrische Feldstärke nicht in gesamter Trennkapillare konstant gestört durch lokale Leitfähigkeitsunterschiede Mobilität von Analyt-Ion und Puffer-Ion nicht ähnlich Konzentration Puffer-Ion ist nicht sehr viel größer als Analyt-Ion (> Faktor 100)Mobilität des Proben-Ion uA < Puffer-Ion uCE Peak-TailinguA > uCE Peak-Leading (Fronting)PD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

• Auflösung R zweier PeaksR=t24‣ Migrationszeiten t 1 und t 2 zweier aufeinanderfolgender Peaks;gemittelte Standardabweichungσ tAuflösung• Einsetzen der entsprechenden Beziehungen liefert:‣ Theoretische Trennstufen N, Mobilität u−t⋅ σN ⎛ u2− u1R = ⋅⎜4 ⎝ ut1⎞⎟⎠PD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Puffersystem• Anforderungen an den Puffer‣ Selektivität für die zu trennenden Ionen‣ pH-Wertstabilität, Pufferkapazität (Reproduzierbarkeit)‣ Geringe UV-Absorption bei der Detektionswellenlänge‣ Anpassung der Mobilität zwischen Probe- und Pufferion‣ Das Gegenion sollte eine geringe Mobilität besitzen (kleineStröme)‣ Reproduzierbare Herstellung des Puffers‣ Stabilität des PuffersPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Optimierung• Trennungsoptimierung Variation folgender Parameter:‣ pH-Wert‣ Ionenstärke‣ Temperatur‣ Kapillarbelegung‣ PufferzusätzePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

ElektropherogrammPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE)• Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen einemRezeptor und Liganden• Bestimmung von Bindungskonstanten und -stöchiometrie• Unterschied in der Mobilität zwischen Protein und demgebildeten Komplex‣ Ligand trägt eine Ladung‣ Molekulargewicht des Komplexes unterscheidet sich wesentlichvon der des ProteinsPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Micellarelektrokinetische ChromatographieMEKC• Hybridtechnik aus Elektrophorese und Chromatographie• Zusatz von Micellenbildnern (Detergenzien) zumPuffersystem pseudostationäre Phase aus geladenenMicellen• Trennung basierend auf Verteilung der Analyte zwischenLösung und MicelleninnerenPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Elektropherogramm• Neutralmoleküle erhalten elektrophoretische Mobilität u iui'⎛ ki⎜⎝1+k= uMC'i⎞⎟⎠‣ Abhängig von Mobilität der Micelle u MC und dem Kapazitätsfaktork‘ i• Kapazitätsfaktor k‘ i ist Verhältnis der Analytaufenthaltszeitin der mobilen zur pseudostationären Phasek'i=toti−⎛ ⋅⎜1−⎝t0ttiMC⎞⎟⎠PD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

• Auflösung R zweier KomponentenR=N{ 4Effizienz⋅Elektropherogrammα −1213 αSelektivitätt01−'k2tMC⋅ ⋅'1+k t2 0 '1+⋅k1tMC14 44 24443Re tention• Verbesserung der Auflösung durch:‣ Steigende Micellbildnerkonzentration‣ Vergrößerung des Zeitfensters des Migrationsbereichs‣ Wahl unterschiedlicher Micellbildner‣ Änderung in der Zusammensetzung der wässrigen PhasePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Kapillargelelektrophorese (CGE)• Trennung nach unterschiedlichen Masse/Ladungsverhältnissen• DNA-Moleküe und SDS-denaturierte Proteine besitzenbei unterschiedlichen Massen sehr ähnliche Masse/Ladungsverhältnissen• Gelmedium bewirkt einen Siebeffekt und behindert dieelektrophoretische Wanderung der größeren Molekülestärker als die der kleineren• Vergleich mit klassischen GelelektrophoreseVorteileSchnellere TrennzeitenOnline-DetektionGeringer Arbeits- und GeräteaufwandNachteileKeine präparative ProbensammlungKeine parallele Trennung mehrerer ProbenNicht zweidimensional durchführbarPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Isoelektrische Fokussierung (CIEF)• Trennung der Analyten nach ihrem isoelektrischen Punkt• Injektion der Probe in einem Ampholytgemisch in dieKapillare• Eine starke Säure wird an der Anode platziert (Anolyt),eine starke Base dient als Kathodenpuffer (Katholyt).• Anlegen der Spannung pH-Gradient Ampholyt-Ionen wandern entsprechend ihrem pI.• Bei pI = pH endet die elektrophoretische Wanderung.Anode+DiffusionE-Feld+ Ladung des--AnalytmolekülsKathodePD Dr. C. KasperVerd.H 3 PO 4pH = pIVerd.NaOHTCIInstitut fürTechnische Chemie

Isotachophorese (ITP)• Trennung nach Größe und Ladung• Zwei Elektrolyte: Leitelektrolyt (LE) und Endelektrolyt(TE)‣ Mobilität Leitelektrolyt > Mobilität aller Analyt-Ionen‣ Mobilität Endelektrolyt < Mobilität aller Analyt-Ionen‣ Anlegen konstanten Stroms Bildung eines Feldstärkengradients‣ Probenaufgabe der Proben-Ionen (A, B)an der Grenzfläche der beiden Elektrolyte‣ Feldstärkengradient verhindert Diffusionscharfer ZonengrenzenPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Gerät schematischPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Beckmann PACEPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

Quellen• F. Lottspeich/H. Zorbas, Bioanalytik• H.Engelhardt, W.Beck, T. Schmitt, Kapillarelektrophorese• Altria, Kevin; http://www.ceandcec.com• Oliver J. Schmitz; www.kapillarelektrophorese.de• P.W. Atkins, Physikalische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

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