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LABORWELTNr. 3 / 2012 – 13. JahrgangBiobankingAutomation undProbenvorbereitungFunktionsgenomikGezieltes Ausschalten vonGenen mit TALENs und ZFNsMikroskopieIn vivo-Imaging mitmolekularer AuflösungTäglich aktuell:www.laborwelt.de


GS Junior SystemGS Junior, my new best friend...because now I can sequence on my bench-topWe think you’re going to like the GS Junior System. And not simply because it’s exciting.It’s much more than that.L The GS Junior System allows you to perform next-generation sequencing inyour lab, on your bench, when you’re ready. And because it is based on proven454 Sequencing Systems, it delivers results you can trust time and time again.L The GS Junior System also comes with a desktop PC equipped with userfriendlybioinformatic tools. So you don’t need to be an IT expert to assemble,map or analyze your genome, transcriptome or metagenome.And what’s not to love about that?To learn more about the GS Junior System and how it can help you and your laboratorysucceed, get in touch via our website: www.gsjunior.comIt could be the start of a beautiful friendship.GS Junior System –The power of next-generation sequencing in your handsFor life science research only.Not for use in diagnostic procedures.454, 454 SEQUENCING and GS JUNIORare trademarks of Roche.Roche Diagnostics Deutschland GmbHSandhofer Straße 11668305 Mannheimwww.roche.de© 2012 Roche Diagnostics GmbH.All rights reserved.


Gene Editing Functional GenomicsTALE- und ZF-Nukleasen werden immer paarweise eingesetzt, mit Erkennungssequenzenfür beide DNA-Stränge und mit einem Abstandshaltervon etwa 15 Basenpaaren zwischen den Erkennungssequenzen. DieserZwischenbereich wird dann von der FokI-Endonuklease gespalten.Gene Editing in vitro und in vivoWie auch die bereits bekannten Meganukleasen nutzen TALENs undZFNs aus, dass ein induzierter Doppelstrangbruch zur Aktivierung zellulärerReparaturmechanismen führt. Zur Reparatur der eingeführtenLäsionen stehen zwei gut konservierte Mechanismen zur Auswahl – dienicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder die Reparatur über einehomologe Vorlage (s. Abb. 1B).Genommodifikationen mit Hilfe von Designer-Nukleasen könnenalso zwei Formen annehmen: Ohne Zugabe eines exogenen DNA-Donors findet an der anvisierten Stelle nicht-homologe Endverknüpfungstatt. Aufgrund von Ungenauigkeiten bei der Reparatur kommtes dabei zu kleineren Insertionen und Deletionen. Werden die Erkennungssequenzenalso in einem der vorderen Exons gewählt, kommtes häufig zu einem Knock-out des Gens. Diese Vorgehensweise bietetdie Möglichkeit, Gene auszuschalten, ohne dabei im Genom Spuren inForm von Selektionskassetten zu hinterlassen.Wird dagegen ein Vektor mit homologen Sequenzen gemeinsam mitden Designer-Nukleasen transfiziert, so können über homologe Rekombinationdefinierte Mutationen oder Transgene am gewünschten Locuseingeführt werden, im Vergleich zum herkömmlichen Gene Targetingallerdings mit deutlich erhöhter Effizienz.Für das Einbringen der Designer-Nukleasen in die Zelle stehengrundsätzlich alle bisher bekannten Transfektionsmöglichkeiten zurVerfügung. Besonders interessant ist jedoch die Transfektion als in vitrotranskribierte mRNA, da eine transiente Expression für die Induktiondes Doppelstrangbruches ausreichend erscheint und gleichzeitig einezufällige Integration und die damit einhergehende potentielle Schädigungdurch Off-Target-Aktivtät vermindert werden kann.Die bisherigen Experimente mit Designer-Nukleasen zeigen, dassGene Editing sehr effizient ist und auch ohne Selektion Mutationsratenvon 30% bis 50% auftreten 1,2 . Selbst biallelische Knock-outs treten mitFrequenzen von 1% bis 20% auf 3,4 .Das Potential der Designer-Nukleasen soll hier an zwei Beispielen derin vitro- und in vivo-Genmanipulation verdeutlicht werden. HumaneES-Zellen sind mit Hilfe des normalen Gene Targeting nur schwer zumodifizieren. Durch den Einsatz von Designer-Nukleasen kann sichdies jedoch ändern. So konnten mittels eines neuartigen Assemblierungsprotokollsin kürzester Zeit 96 TALENs für verschiedene Ziele inhumanen ES-Zellen hergestellt werden, die in 87% der Fälle zu einemerfolgreichen Knock-out führten 3 .Noch interessanter für die funktionelle Genanalyse und für dieEntwicklung von Tiermodellen ist die Möglichkeit, dass mit Hilfe vonZNFs oder TALENs ein Knock-out und selbst homologe Rekombinationdirekt im Tier, in der befruchteten Eizelle, durchgeführt werdenkann. Dies wurde für Mäuse gezeigt und in eigenen Experimentenfür das Kaninchen – einer Spezies, für die weder funktionelle ES-Zellenvorhanden sind noch der somatische Kerntransfer etabliert ist (Abb.2) 4 . Designer-Nukleasen eröffnen somit neue Möglichkeiten für diegenetische Manipulation von fast allen Zelltypen und in einer Vielzahlvon Spezies.TALENs oder ZNFs?Im insgesamt noch recht jungen Feld der Designer-Nukleasen stellendie ZFNs die besser charakterisierte Spezies dar. Verschiedene Arbeitsgruppenkonnten ihre Wirksamkeit in einer Vielzahl von Organismenund Zelltypen nachweisen; ebenso wurden mehrere Protokolle erstellt,mit deren Hilfe eigene ZFNs hergestellt werden können. Aber geradeTargeted Metabolite Identification andQuantification:AbsoluteIDQ ®p150 Kit & p180 Kit• Identify and quantify more than 180metabolites• Discovery of metabolomic biomarkers• Routine monitoring of metabolic pathways• Reduced measurement time for U(H)PLC-MS• Integrated MetIDQ TM Software forcalculation of metabolite concentrationsThe Kits are designed to be used with yourWaters ® or AB SCIEX mass spectro meter.Contact:BIOCRATES Life Sciences AGInnrain 66A-6020 Innsbruck, Austriamarketing@biocrates.comwww.biocrates.comLABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 | 7Inserat_Laborwelt_Satzspiegel.indd 1 19.07.2012 09:53:30


Functional Genomics Gene EditingABfür TALENs sehr viel besser und auch deutlichschneller als für ZFNs.FazitAbb. 1: Aufbau und Wirkungsweise von Designer-Nukleasen. A. ZFNs und TALENs unterscheidensich nur durch die Beschaffenheit der DNA-Bindedomänen. B. Gene Editingmittels Designer-Nukleasen resultiert entweder in einem Knock-out oder in derEinführung einer exogenen DNA-Sequenz. DSB: Doppelstrangbruch, HR: HomologeRekombinationdie Assemblierung von funktionalen ZFNsstellt noch ein Hindernis bei der Verbreitungdieser Technologie dar – zwar müssen imVergleich zu TALENs weniger Einzelmotivezusammengefügt werden, um ein funktionstüchtigesMolekül zu erhalten; dafür gestaltetsich der Designvorgang für funktionaleZFNs als deutlich schwieriger. Dies liegt zumeinen daran, dass Zink-Finger Basentriplettserkennen und bisher nicht für alle denkbarenTripletts wirksame Zink-Finger identifiziertwurden – nur etwa alle 500 Basenpaare findetsich im Genom eine geeignete Sequenz. Zumanderen kommt es zwischen den einzelnenZink-Finger-Motiven einer ZFN zu Interaktionen,welche die Bindeeigenschaften erheblichverändern. Eine auf dem Papier ideale ZFNkann also in der Zelle unter Umständen nursehr schlechte DNA-Affinität zeigen, wasein zeitaufwendiges Funktionsscreeningder selbstentworfenen ZFNs unumgänglichmacht. Hinzu kommt der Off-Target-Effekt– die Aktivität außerhalb der eigentlichenZielregion –, der bei ZFNs bei Verwendung derWildtyp-FokI-Domäne nicht unerheblich istund zu erhöhter Zytotoxizität führt.TALENs – obwohl erst seit kurzem bekannt –können dagegen über die verfügbaren Protokollehergestellt werden, ohne dass Problemehinsichtlich der Funktionalität auftreten. Dasliegt daran, dass nach den bisherigen Erkenntnissendie einzelnen Wiederholungseinheiteneiner TALEN in ihrer DNA-Bindung komplettvoneinander unabhängig sind und es nichtzu Positionseffekten kommt. Ebenso könnenTALENs aufgrund des zugrundeliegenden„Eine-Base-eine-Aminosäure“-Codes für jedebeliebige DNA-Sequenz konstruiert werden.Erstaunlich ist zudem, dass alle bisher publiziertenTALENs trotz Wildtyp-FokI-Domänekeine Off-Target-Aktivität zeigen.Beide Arten von Designer-Nukleasen sindgebrauchsfertig erhältlich: TALENs kostenzwischen 3.000 und 5.000 Euro, was auchzu einer Preisreduzierung bei ZFNs führendürfte (bisher kosten diese zwischen 12-000und 25.000 Euro für nicht-kommerzielleAnwendungen). Sowohl für ZFNs als auchfür TALENs gibt es zudem Kits für 650$ bzw.350$, mit denen die Nukleasen im heimischenLabor hergestellt werden können; aus dengenannten Gründen funktioniert dies jedochInsbesondere TALENs haben aufgrund ihrerguten Verfügbarkeit und der Robustheitdes zugrundeliegenden Codes das Potential,Gene Targeting zu revolutionieren.Biallelische Knock-outs, die vorher meist nurdurch Züchtung erreicht werden konnten,können mit Hilfe von Designer-Nukleasen ineinem Schritt realisiert werden. Ebenso istes möglich, durch gleichzeitige Anwendungverschiedener TALENs oder ZNFs zwei Targetsgleichzeitig zu verändern. All dies ist zudemin Spezies möglich, in denen Gene Targetingmit den bisherigen Methoden nicht odernur schwer durchführbar war, einschließlichPflanzen und Reptilien. Designer-Nukleasensind ein effizientes, zeitsparendes Werkzeugfür die funktionelle Genanalyse und bietenMöglichkeiten für die Herstellung komplexerKrankheitsmodelle zur besseren Erforschungvon Humanerkrankungen in physiologischrelevanten Tierspezies. Große Chancen bietensich auch in der personalisierten Medizin: Diegroße Effektivität von TALENs, ihre geringe Off-Target-Aktivität und die Tatsache, dass nachder Genkorrektur keine fremden Sequenzen imGenom zurückbleiben, machen sie zu idealenWerkzeugen für die Gentherapie.Literatur1. Hockemeyer, D. et al. Genetic engineering of human pluripotentcells using TALE nucleases. Nature biotechnology29 (2011), 731-734.2. Li, T. et al. Modularly assembled designer TAL effector nucleasesfor targeted gene knockout and gene replacementin eukaryotes. Nucleic acids research 39 (2011), 6315-25.3. Hauschild, J. et al. Effi cient generation of a biallelic knockoutin pigs using zinc-fi nger nucleases. Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 108, 12013-12018 (2011).4. Santiago, Y. et al. Targeted gene knockout in mammaliancells by using engineered zinc-fi nger nucleases. Proceedingsof the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 105 (2008), 5809-14.5. Reyon, D. et al. FLASH assembly of TALENs for highthroughputgenome editing. Nature biotechnology 30(2012), 460-5.6. Flisikowska, T. et al. Effi cient immunoglobulin genedisruption and targeted replacement in rabbit using zincfi nger nucleases. PloS one 6 (2011), e21045.KorrespondenzadresseDr. Tatiana FlisikowskaTU MünchenLehrstuhl für Biotechnologie der NutztiereLiesel-Beckmann-Str. 185354 FreisingTel.: +49-(0)8161-712030tatiana.adamowicz@wzw.tum.deAbb. 2: Gene Editing mit Hilfe von ZFNs in Kaninchen-Oozytenwww.laborwelt.de8 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


Expertenpanel Functional GenomicsDiagnose und Prognosemit Metabolomics-TestsDr. Therese Koal, Biocrates Life Sciences AG, Innsbruck, Österreich, Dr. Hennicke Kamp,BASF SE, LudwigshafenAnalysen des von einem Zelltyp exprimierten Metabolitspektrums bieten im Gegensatz zuGentests direkte Aussagen über biologische Funktionen. Massenspektrometrische Technikenermöglichen dabei ein Multiplexing, das der Komplexität des Krankheitsgeschehens und derToxizitätsmechanismen wesentlich besser gerecht wird als bisherige Einzelmetabolitbestimmungen.Die Analyse von Metabolitmustern, die relevant für die Diagnose von Krankheitenund die Prognose der Toxizität von Arzneimittelkandidaten sind, bietet über ihren direktenNutzen hinaus auch die Möglichkeit, Erkenntnisse über Krankheits- und Toxizitätspathwayszu gewinnen, indem die Ergebnisse von Metabolom-, Genom- und Transkriptomdaten miteinanderin Beziehung gebracht werden.Hennicke KampMetabolomics oder Metabolite Profilingbeschreiben die Analyse von endogenenStoffwechselprodukten wie Aminosäuren,Kohlenhydraten, Lipiden etc. aus biologischenProben – also allen charakteristischen Stoffwechsel-Eigenschafteneines Organismus. Inden vergangenen Jahren wurde die Technikzunehmend auch in toxikologischen Studieneingesetzt, um Änderungen in biochemischenProzessen zu untersuchen (Lindon et al., 2004;van Ravenzwaay et al., 2007 und 2010). BASFund Metanomics haben basierend auf einer GC/MS- und LC/MS-MS-Plattform die DatenbankMetaMap® Tox aufgebaut, in der die Änderungenim Plasma-Metabolom von mehr als 500verschiedenen Chemikalien hinterlegt sind, diedie meisten toxikologischen Wirkmechanismenrepräsentieren. Durch den Vergleich der Metabolomänderungeiner unbekannten Substanzmit der MetaMap® Tox-Datenbank können nunTherese KoalDiplomchemikerinund Fachchemikerinfür Toxikologie,Director Product &Method Developmentder BIOCRA-TES Life SciencesLABORWELTWo liegen Vorteile von Targeted Metabolomicsgegenüber anderen massenspektrometrischenBestimmungen zu diagnostischen Zwecken?KoalIn der Biomarkerforschung und klinischenDiagnostik werden in jüngster Zeit ehrgeizige„Metabolomics“-Konzepte vorangetrieben, mitdem Ziel möglichst alle relevanten, niedermolekularenendogenen Stoffwechselprodukte(


Advertorial PCRReal-time PCR-ExtraktionskontrollenBioline GmbH, LuckenwaldeDie Verwendung der real-time PCR hat aufgrund ihrer hohen Sensitivität, Genauigkeit undZuverlässigkeit in den letzten Jahren dramatisch zugenommen. Diese Eigenschaften sindstark abhängig von der Qualität des Ausgangsmaterials bzw. dem Vorhandensein von inhibitorischenKomponenten. Diese Faktoren beeinflussen in der Folge den Assay und könnenauch zu falsch negativen Ergebnissen führen.ABEs ist gängige Praxis in der real-time PCR, einebekannte Menge an Kontroll-DNA („spikein“-Kontrolle)nach der DNA/RNA-Extraktionhinzuzugeben. Die Zugabe von Kontroll-DNAnach der Extraktion ermöglicht eine Verfolgungder Inhibition innerhalb des Assays,hat aber keinerlei Bedeutung als Extraktionskontrolleoder als Nachweis der Effizienzder reversen Transkription. Ideal ist es, wennProbe und interne Kontrolle vor der real-timePCR der gleichen Behandlung unterzogenwerden. Bioline verfügt über eine DNA-Extraktionskontrolle (DNA Extraction Control,DEC) und eine RNA-Extraktionskontrolle (RNAExtraction Control, REC), welche die Probe imVergleich zu „spike-in“-Kontrollen genauersimulieren. Das genetische Material der Probesowie der DEC bzw. REC wird gleichzeitig anhandder üblichen Extraktionsmethoden extrahiert,wobei die Extraktionskontrolle eineebenso hohe Sensitivität gegenüber einerInhibition oder fehlgeschlagenen Extraktionaufweist wie die Probe.Die Ergebnisse zeigen einen deutlichen Vorteilunserer Extraktionskontrollen gegenübereiner „spike-in“-Kontroll-DNA. Das Verfahrenermöglicht eine genauere Verfolgung derEffizienz des Extraktionsprozesses bzw. denNachweis einer möglichen Inhibition innerhalbdes real-time PCR-Assays.DNA-ExtraktionskontrolleAbb. 1: Ineffiziente DNA-Extraktion. (A) Ein Fragment des Beta-2-Mikroglobulin (β2MG)-Genswurde aus HEK293-Zellen (grüner Kanal) amplifiziert und (B) die Sequenz der internenKontrolle aus der DEC (roter Kanal) amplifiziert. Dazu wurde das ISOLATE Genomic DNAKit verwendet, wobei der Lysepuffer bzw. Bindepuffer durch PBS ersetzt wurde, umeine ineffiziente Extraktion zu simulieren. Die Reaktionsbedingungen waren 10 min. bei95°C, gefolgt von 50 Zyklen bei 95°C für jeweils 10s, bei 60°C für 30s. Der vollständigeLyse-Schritt (rot) und das Inhibitionsmuster bei keiner Lyse (orange) und ohne Bindepuffer(grün) sind in beiden Fällen gleich, was veranschaulicht, dass die DEC zur Verfolgungder DNA-Extraktion eingesetzt werden kann.Die DNA-Extraktionskontrolle (DEC) bestehtaus Zellen einer bekannten Konzentration,welche die DNA-Sequenz der internenKontrolle enthalten (mit keiner bekanntenHomologie zu anderen Organismen). DieseZellen werden vor der DNA-Extraktion zusammenmit dem Lysepuffer zu der Zielprobegegeben. Im Anschluss an die Extraktionwird der Primermix (Primer und Sonde) vorder Amplifikation zu dem Reaktionsgemischhinzugegeben. Das Signal der internen Kontrolleverursacht dabei nur minimale Interferenzenbei der Detektion der Proben-DNAund bestätigt den erfolgreichen Verlauf desExtraktionsschrittes (Abb. 1)10 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


PCR AdvertorialDie Extraktionskontrollen (REC/DEC) dienennicht nur als Indikator für die Effektivität desExtraktionsprozesses, sondern können ebenfallsgenutzt werden, um Verunreinigungendurch PCR Inhibitoren zu veranschaulichen.Diesen Effekt erhält man dadurch, dass dieExtraktionskontrollen ähnlich auf inhibitorischeFaktoren reagieren, wie das Zielgen.Der Nachweis lässt sich sowohl anhand derct-Werte als auch der Signalstärke erbringen(Abb. 2).ARNA-ExtraktionskontrolleDie RNA-Extraktionskontrolle (REC) funktioniertnach dem gleichen Prinzip, wie die DNA-Extraktionskontrollen. Nach der Extraktionwird der Primermix (Primer und Sonde) vor derreversen Transkription und der Amplifikationzu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben.Wie auch bei den DNA-Extraktionskontrollenlässt sich auch hier eine Aussage über einefehlerhafte Extraktion, bzw. das Auftretenvon Inhibitoren für die PCR treffen.BAbweichungen der internen Kontrollezwischen AnsätzenDie DNA- und RNA-Extraktionskontrollen(DEC und REC) liefern eine exogene interneKontrolle zur universellen Verwendung beiverschiedenen real-time PCR-Assays undbieten eine gebrauchsfertige Anordnungmit neuen Targets ohne die Notwendigkeiteiner Optimierung. Zur Gewährleistung einerkorrekten Interpretation der negativenErgebnisse, ist der Ct-Wert der Kontrollenkonstant.SchlussfolgerungDie DNA- und RNA-Extraktionskontrollen(DEC und REC) dienen nicht nur dem Nachweisvon Inhibitoren der PCR, sondern könnenebenfalls als Indikatoren für die Effektivitätdes Extraktionsprozesses verwendet werden.Bei Nachweis von Inhibitoren in der real-timePCR weisen die Kontrollen ein ähnliches Inhibitionsprofilwie das eines Kontrollgens auf,sowohl hinsichtlich des Ct-Wertes als auchder Signalstärke. Ein weiterer wichtiger Punktist, dass die Kontrollen auch als Indikatorenfür den Probenverlust während des Extraktionsschrittesdienen können. Im Gegensatz zuden REC bzw. DEC hat die Zugabe reiner DNAwährend der Lyse keine Funktion als Indikatorder „Zelllyse“. Der Ct-Wert bei “vollständigerLyse” gegenüber demjenigen “ohne Lyse” ändertsich in diesem Fall nicht wesentlich.Die einzigartige Sequenz, die bei den DNAundRNA-Extraktionskontrollen (DEC und REC)verwendet wird, minimiert die Interferenzenbei der Target-Detektion in einer Multiplex-Abb. 2: PCR-Inhibition (A) Ein Fragment des Beta-2-Mikroglobulin (β2MG)-Gens wurde ausmenschlicher genomischer DNA (grüner Kanal) und (B) die Sequenz der internenKontrolle aus der DEC (roter Kanal) amplifiziert. Steigende EDTA-Konzentrationenwurden in die Reaktion eingetragen (0mM, 1mM, 2mM, 2,5mM, 3mM, 3,5mM und4mM, respektive), um die zunehmenden Konzentrationen eines Inhibitors zu simulieren.Die Ergebnisse veranschaulichen, dass die DEC das gleiche Inhibitionsmusterwie die Ziel-Probe aufweist, was zeigt, dass die PCR-Inhibition anhand der DECidentifiziert werden kann.Reaktion. Eine Optimierung und Validierungder Multiplex-Assays ist jedoch grundsätzlichzu empfehlen.Die DNA- und RNA-Extraktionskontrollen(DEC und REC) eignen sich für eine Verwendungmit kommerziell erhältlichen DNA-Extraktionskits (Silizium-Membran undCHELEX-Filtermatrizen) und wurden für einebreite Palette von real-time PCR-Plattformeneinschließlich der ABI-7500 (ABI), LightCycler480® (Roche), RotorGene-Q (Qiagen) undMX3005P® (Stratagene) getestet.Die Kompatibilität der Kontrollen mitden unterschiedlichen klinischen Proben istlaut den Pathologielabors, die sich mit derValidierung der DEC und REC befasst haben,ein weiterer kritischer Aspekt dieser internenKontrolle. Die Inkorporation der Kontrollenist sehr einfach und kann anhand einer geringenAnzahl von Versuchen bewerkstelligtwerden Abschließend ist festzuhalten, dassangesichts der Vielseitigkeit der DNA- undRNA-Extraktionskontrollen die DEC und RECals universelle Plattform für die qualitativeKontrolle bei den unterschiedlichsten Anwendungenvon real-time PCR-Assays eingesetztwerden können.KontaktBioline GmbHIm Biotechnologiepark TGZ II14943 Luckenwaldehberthel@bioline.comwww.bioline.comLABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 | 11


Functional Genomics Genome EngineeringSequenzgenaues DNA-Targeting mit TAL-ToolsDr. Frank Notka, Life Technologies Corp. / GeneArt AG, RegensburgTranscription Activator-Like (TAL) Effektorproteine repräsentieren eine Klasse von Transkriptionsaktivatoren,die von verschiedenen Xanthomonas-Arten produziert und in ihre Wirtspflanzeninjiziert werden. Dort wirken sie auf transkriptioneller Ebene auf die Expression bestimmterWirtsgene, um ein für die Vermehrung der Bakterien förderliches zelluläres Milieu zu schaffen.Aus der Sicht des Genome Engineering interessieren dabei besonders die spezifischen Bindesequenzen,welche die TAL-Proteine nutzen, um die Wirtsgene zu manipulieren. Die Spezifitätder Bindesequenzen ist in der Anordnung von Repeat-Domänen innerhalb des zentralen Bereichsvon TAL-Effektoren verschlüsselt. Jede Repeat-Domäne kann ein bestimmtes Nukleotid binden,so dass die Reihenfolge der einzelnen Repeat-Domänen die zu bindende DNA-Sequenz definiert.Der Bindebereich vermittelt – zusammen mit einer Aktivator-Funktion und einem NLS (NuclearLocalization Signal) – den Kernimport und die Aktivierung bestimmter Promotoren. Mit der Entschlüsselungdes Bindecodes und der Möglichkeit, unterschiedliche funktionelle Domänen zufusionieren, wurde jetzt eine ganz neue Klasse von Werkzeugen für die Manipulation genetischerInformation und Funktion hervorgebracht.Die Menge verfügbarer genetischer Informationist bereits heute überwältigend groß undwächst aufgrund der rasanten Technologieentwicklungenim Bereich des Next GenerationSequencing unvermindert weiter. Die Auswertungder Sequenzdaten und die Überführungdieser Resultate in konkrete Anwendungeninnerhalb der Biotechnologie oder Medizinerfolgt hingegen mit einer sehr viel geringerenGeschwindigkeit und Effizienz. Bisher waren dieNRepeat domain NLS AD112 1334L TPEQVV AIASHDGGKQ ALET VQRLLPVLCQAHGCTALRVDMöglichkeiten einer gezielten Manipulation genetischerInformation aufwendig und die Umsetzungvon Erkenntnissen aus Genomanalysenentsprechend limitiert. Bakterielle TAL-Proteine,die wie Transkriptionsfaktoren wirken, habendas Potential, eine ganz neue Dynamik in diegezielte Veränderung von Genomen verschiedensterOrganismen zu bringen.TAL-Proteine lassen sich als molekulareWerkzeuge verwenden, um Genome zu manipulieren.So können beispielsweise Geneirreversibel ausgeschaltet, repariert oderFremdgene eingeschleust werden. Aber auchdie reversible Regulation der Genexpression istmöglich, indem Aktivatoren oder Repressorenmit Promotor-bindenden TALs fusioniert werden.Die Palette möglicher Anwendungen istdurch die einfache Handhabung, beziehungsweiseden unkomplizierten Austausch derfunktionellen Fusionsanteile relativ problemloserweiterbar und neue Anwendungsfelder,beispielsweise im Bereich epigenetischerModifikationen, sind absehbar.Der zentrale, aus Repeat-Domänen bestehendeBereich der TAL-Effektoren ist für dieBindung an die Zielsequenz verantwortlich.Natürlicherweise besteht dieser Bereich aus 12bis 27 dieser Domänen. Jede Repeat-Domäneeines TAL-Proteins besteht aus durchschnittlich34 Aminosäuren. Die spezifische Erkennung einesNukleotids erfolgt über ein polymorphesAminosäurepaar an Position 12 und 13 der sonstäußerst konservierten Repeat-Domäne, das alsRVD (Repeat Variable Diresidue) bezeichnetwird. Die Entschlüsselung des natürlichenCodes, der jeder Repeat-Domäne ein Nukleotidin einer DNA-Sequenz zuweist, führte zur Entwicklungvon Designer-TAL-Effektorproteinen.Diese bestehen aus mehreren Funktionseinheiten.So können unterschiedliche Funktionen,die in der Regel durch die Verknüpfung mitenzymatisch aktiven Domänen vermitteltwerden, gezielt in zugängliche Regionen chromosomalerDNA dirigiert werden.Die Entschlüsselung des TAL-Codes unddie Entwicklung des Konzepts einer TAL-Technologieplattform (Abb. 1) erfolgte inZusammenarbeit mit der Universität Halle 1 .Life Technologies entwickelte den Produktionsprozessfür die Herstellung der Effektorenaus vorgefertigten Bausteinen. Seit März 2012können kundenspezifische GeneArt® PrecisionTAL-Effektoren mit einer Lieferzeit von rundzwei Wochen bezogen werden.Präzises Genome EngineeringT A T A T AAACCT NNCCCT C TZielsequenzNC TAL ProteingerüstA T G CRepeatdomänenNC Precision TAL0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 17.5HD NG NS NG NI NI NI HD HD NG NS NS HD HD HD NG HD NG TAL codeT A T A T A A A C C T N N C C C T C TAbb. 1: Lernen von der Natur: TAL-Code dechiffrieren – spezifisches Bindemolekül designenGezielte Veränderungen von Genomen betreffenbisher in der Regel einfache Gene-Knockouts,Gene Repairs, Genome-Rearrangementsoder das gerichtete Einfügen von Fremd-DNA.In Abhängigkeit der jeweiligen Zielorganismen,wie Bakterien, Hefen, Algen, Pflanzen oder Säugetierzellengibt es eine Reihe von Methoden,die sich in Aufwand und Effizienz erheblichunterscheiden. Während sich einfache Organismen,wie Bakterien, Hefen und mancheAlgen relativ gut manipulieren lassen, indemzelleigene Mechanismen wie die homologeRekombination effizient genutzt werden, sindgezielte genomische Modifikationen geradebei Pflanzen- und Säugetierzellen enormaufwendig. Bisher standen mit Zinkfingernukleasen(ZFNs) und Homing-Endonukleasenzwei Technologien zur Verfügung, die eine12 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


Genome Engineering Functional GenomicsPorvair hairdryer Laborwelt DE 116.5x90_Layout 1 07/03/2012 17:25 Page 1ADNA binding domainFunctionaldomainFok1Fok1BDNA binding domainFunctionaldomainVP16CDNA binding domainFunctionaldomainRepressorAbb. 2: Anwendungskonzepte: A. Genome engineering, B. Aktivierungund C. Hemmung der ExpressionDNA-bindende Einheit mit einer DNA-schneidenden Einheit zur gezieltenSpaltung eines genomischen Locus verknüpfen. Das sequenzgenaueTargeting und das Einführen eines gezielten DNA-Doppelstrangbruchsist die Voraussetzung, um mit Hilfe zelleigener Reparaturmechanismendie Zielsequenz zu verändern. Durch Non-homologous end-joining(NHEJ) kann die Spaltstelle wieder verknüpft werden, wobei es in derRegel zu ungenauen Verbindungen in Form von Nukleotid-Deletionenkommt. Diese Ungenauigkeit wird zum irreversiblen Ausschalten einesGens verwendet, da sie zu einem Frameshift (Leserastermutation) unddamit zu einem inaktiven Gen bzw. Protein führt. Weist ein Ziel-DNA-Fragment zu beiden Seiten der Spaltstelle homologe Sequenzbereicheauf, kann es über homologe Rekombination (HR) in das Genom integriertwerden. Die TALENs (TAL-Endonuklease) sind in ihrem Funktionsmechanismusund ihrer Wirksamkeit vergleichbar mit ZFNs. Allerdings ist dasDesign und die Auswahl der Zielsequenzen bei der Verwendung vonZFNs weniger flexibel. Es hat sich gezeigt, dass die Wirksamkeit von ZFNskontext- und positionsabhängig ist und sich die beiden ZFN-Moleküle inihren Bindungs- und Funktionseigenschaften gegenseitig beeinflussenkönnen. Aus den abgeleiteten Designregeln ergibt sich rechnerisch eineTargetfrequenz von etwa 500 Nukleotiden und damit keine nukleotidgenaueFestlegung der Zielsequenz, sondern nur die Einschränkungauf einen Bereich. TALs haben dagegen kaum Sequenzrestriktionen. Einweiterer Nachteil von ZFNs: Die Effizienz lässt sich nicht gut prognostizieren,und unter Umständen müssen mehrere ZFN-Paare funktionellgetestet werden, was sich auf die Herstellungskosten auswirkt. Auchfür TALENs kann eine Vorselektion aus mehreren Paaren die Effizienzerhöhen. Allerdings hat sich gezeigt, dass die Erfolgsrate von etwa 5%bis 50% genomischer Mutationen ausreicht, um rekombinante Zelllinienkostengünstig herzustellen. Generell ist die Bindungsspezifität der ZFNsnicht hoch genug, um Off-Target-Effekte auszuschließen. Unerwünschteaustria wirtschaftsserviceWir mixen die optimaleFinanzierung.50.000 EuroNebeneffekte, inklusive toxischer Reaktionen, bleiben daher nicht aus.Im Vergleich weisen TAL-Effektoren nachweislich seltener unerwünschteNebeneffekte durch Off-Target-Bindungen auf.Die gezielte Erhöhung oder Reduktion der Expression eines Gensauf chromosomaler Ebene ist in der Regel nur durch VerwendungManagement auf Zeit:Finanzierung vontemporärerexterner Beratungawsg.at/mazDie Vorzüge eines MiniVap Selbstverständlich würden Sie keinen Haartrocknerverwenden, um chromatographische Proben ineiner einzelnen Mikrotestplatte zu verdampfen. Siehaben wahrscheinlich aber auch keine LustSchlange zu stehen, um einen großen Evaporatorin Ihrer Abteilung für denselben Zweck zubenutzen. In diesem Fall brauchen Sie einenPorvair MiniVap. Das Gerät ist klein, schnell,flexibel und beeinträchtigt Ihre Proben nicht. Weitere Informationfinden Sie unter www.microplates.com/downloads.phpTelephone: 0 26 83 / 4 30 94Email: info@dunnlab.dewww.microplates.com1.000.000 EuroSeedfinancing:Finanzierung von Gründungund Aufbau von High-TechUnternehmenseedfinancing.at200.000 EuroLife Sciencesin Österreich 2012LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 | 132980PreSeed:Finanzierung derVorgründungsphasepreseed.atLife Sciences in Österreich 2012Gesucht: Innovative Produkte und Verfahren im Bereich Life Sciences. Gefunden: OptimalerFördermix für maximale Wachstumseffekte. Mit Finanzierungen und gezielter Beratung unterstützt dieFörderbank aws die Gründung und den Aufbau von High-Tech-Unternehmen und stärkt damit denWirtschaftsstandort Österreich. Details und Bedingungen zur Förderung fi nden Sie unter www.awsg.atLife Sciences in ÖsterreichMit Firmen, Adressen & AnsprechpartnerDas neue Standardwerk der Life Sciences-Branche in Österreich enthält nebeneiner aktuellen Branchenstatistik rund 700 Datensätze aller mit Biotechnologieund Medizintechnik befassten Firmen und Organisationen – inklusive Kurzprofilenmit Unternehmensausrichtung und -größe, Arbeitsgebieten undAnsprechpartnern.Life Sciencesin Österreich 2012E 29,80ISBN 978-3-928383-39-4Tel. +49 (0)30/26 49 21-40Fax +49 (0)30/26 49 21-11service@biocom.dewww.biocom.dewww.awsg.at978-3-928383-39-4


Functional Genomics Genome Engineeringnatürlicher Aktivator- oder Repressor-Mechanismen, etwa auf der Ebene der Transkriptionsfaktorenund miRNAs, möglich.Ein Gene-Knockdown kann auf transientemWeg durch posttranskriptionelle Silencing-Mechanismen unter Verwendung entsprechenderMoleküle, wie beispielsweise siRNAoder Antisense-RNA vermittelt werden. DieRegulation der Promotoraktivität durch DNAbindendeAktivatoren ist bisher auf einigewenige definierte Systeme zur Expressionskontrollebeschränkt. In diesen Systemenkommen natürliche Regulationsprozesse zurAnwendung, wie etwa das Lac-Operon oderTet-Repressormoleküle. Die Anwendung solcherinduzierbaren Systeme beschränkt sichin der Regel auf die Expression heterologerProteine für biotechnologische Zwecke. Eineechte Regulation der endogenen Genexpressionist aufwendig. PosttranskriptionelleMethoden, welche die mRNA zum Ziel haben,können zwar die Expression des Zielgensherunterregulieren, aber eine Erhöhung derExpression lässt sich auf diesem Weg nichterreichen. TAL-Effektoren können durch diefrei wählbare Zielsequenz beliebige Regionenim Chromosom anvisieren und in Verbindungmit einer Aktivator- oder Repressoreinheitspezifisch die Genexpression steuern. DieBindung einer TAL-Bindedomäne an Promotorsequenzenführt bereits zu einer Repressionder Promotoraktivität.Neue AnwendungsfelderEin großer Vorteil der TAL-Effektoren ist ihreenorme Flexibilität bezüglich der Wahl derZielsequenz und der Anwendungsvielfalt. TAL-Effektoren können beliebige funktionelle Einheitenspezifisch zu einer genau definierten DNA-Zielsequenz dirigieren. Die DNA-Zielsequenzenunterliegen minimalen Restriktionen, so mussdie Zielsequenz im Moment noch mit einemThymidin beginnen. Die Länge der Zielsequenzist ebenfalls sehr variabel, ein Bereich von 10bis 25 Nukleoiden hat sich aber als praktikabelherauskristallisiert. Die Entschlüsselung desBindungscodes bietet weitere Variationsmöglichkeitenund Spielräume, um die Spezifität undBindungseffizienz zu modulieren. Die kompakteräumliche Struktur der TAL-DNA-Bindedomäne,mit den zentralen variablen Repeat-Einheitenund dem flankierenden konservierten Proteingerüst,erlaubt die Fusion mit anderen Protein-Domänen (oder Nicht-Protein-Anteilen), ohnedie Bindeeigenschaften zu beeinflussen. Dieserlaubt das Bestücken der DNA-Bindeeinheitmit einer beliebigen Funktion. Die Fusionsanteilekodieren in der Regel eine enzymatische Funktion,können aber auch andere Eigenschaften wieetwa signalgebende (Fluoreszenz, FRET) oderstrukturell verbindende Funktionen (Dimerisierunganalog zum Yeast Two-Hybrid System, oderzum Cross-Linking) vermitteln. Entsprechenddieser Möglichkeiten ist die Bandbreite potentiellerAnwendungsgebiete groß. Momentan werdenTAL-Effektoren überwiegend mit Nuklease-,Aktivator- und Repressorfunktion eingesetzt(Abb. 2). Die Nukleasefunktionen bieten bereitsverschiedene Einsatzmöglichkeiten im Bereichdes Genome Editing und -Engineering, undAktivator- und Repressorfunktionen wurdenebenfalls erfolgreich eingesetzt. Anwendungenin der Epigenetik zur Modulation der Chromosomenstruktursind bereits in der Erprobung. Dieenorme Vielfalt der möglichen Anwendungenwird sehr schnell zu neuen Einsatzbereichenführen, die zum Teil jetzt noch nicht absehbarsind. Zu dieser Entwicklung werden die schnelleVerfügbarkeit und die geringen Kosten wesentlichbeitragen.Literatur[1] Jens Boch, Heidi Scholze, Sebastian Schornack , AngelikaLandgraf, Simone Hahn, Sabine Kay, Thomas Lahaye,Anja Nickstadt, Ulla Bonas. “. Science. 2009 Dec11;326(5959):1509-12GeneArt ® Precision TALs sind nur für Forschungszwecke und nichtfür diagnostische oder therapeutische Zwecke in Bezug auf Menschenoder Tiere bestimmt.KorrespondenzadresseFrank Notkafrank.notka@lifetech.comJetzt noch schneller informiert mitwww..deNeu und tagesaktuell| Nachrichten| Börse| Presseschau| Mediathek| und vieles mehr14 transkript_Web_EA_185x120.indd | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 106.03.2012 LABORWELT12:27:50 Uhr


Paperwelt Functional GenomicsEinblick in dashumane SekretomSimpson JC, Joggerst B, Laketa V, Verissimo F, Cetin C, Erfle H, Bexiga MG, Singan VR, HérichéJK, Neumann B, Mateos A, Blake J, Bechtel S, Benes V, Wiemann S, Ellenberg J, Pepperkok R(2012): Genome-wide RNAi screening identifies human proteins with a regulatory functionin the early secretory pathway, Nat. Cell Biol. 2012 Jun 3;14(7):764-74. doi: 10.1038/ncb2510.Erstmals ist es gelungen, einen Großteil der Proteine zu identifizieren, die in humanen Zellen ander Sekretion beteiligt sind, also dem Ausschleusen von Stoffen aus der Zelle. Um das humaneSekretom zu erfassen, schalteten die Forscher um Rainer Pepperkok vom EMBL in Heidelbergund Kollegen vom University College Dublin in HeLa-Zellen jedes der rund 22.000 menschlichenProtein-codierenden Gene mittels RNA-Interferenz (RNAi) aus und beobachteten mit Hochdurchsatzmikroskopiewie stark der Knock-down die Sekretion eines fluoreszenzmarkierten Proteinsbeeinträchtigte. Ergebnis der Analysen von mehr als 8 Millionen Zellen und 700.000 Mikroskopiebildern:mindestens 545 Proteine sind an der Sekretion beteiligt. Davon scheinen 143 wichtigfür frühe Prozesse, die im Endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat stattfinden, 59 sindBestandteil der bereits bekannten Sekretionsmaschinerie. Die Arbeiten ebnen den Weg zu einemVerständnis der Regulation von Sekretionsprozessen und bergen damit das Potential, pathologischeStörungen der Sekretion kausal zu verstehen.LABORWELT:Was war die Motivation für Ihre Arbeiten unddie Wahl Ihres experimentellen Systems?Pepperkok:Wir haben zum ersten Mal weltweit das Sekretomeiner menschlichen Zelle erfasst. Wir habendazu HeLa-Zellen gewählt, weil sie technischeinfach zu untersuchen sind. HeLa-Zellen bewegensich auf den von uns dazu eingesetztensiRNA-Arrays nicht sehr stark; das ist ein Grund,weshalb wir mit ihnen arbeiten. Zweitens, wirhaben 2010 vergleichbare Studien mit HeLa-Zellenveröffentlicht, wo wir einen genomweitensiRNA-Screen der Mitose gemacht haben. DieDaten der damaligen und aktuellen Arbeit lassensich sehr gut miteinander vergleichen. Umgrundlegende Mechanismen des sekretorischenWeges zu analysieren, halten wir HeLa-Zellenzudem für hinreichend informativ. Das ist natürlichanders, wenn es um einen krankheits- odergewebespezifischen Kontext geht. Da mussman entsprechend andere Zellen wählen.LABORWELT:Wie sind Sie methodisch vorgegangen, umdas Sekretom zu analysieren?Pepperkok:Unser Ziel ist es, die an der Regulation der sekretorischenPathways beteiligten Moleküle alsGesamtsystem zu verstehen. Wir mussten dazuverschiedene Methoden etablieren. Vor fast 10Jahren haben wir mit Stefan Wiemann begonnen,Proteine mit GFP zu taggen, zu lokalisieren undzu sehen, ob sie in der Sekretion eine Rolle spielenkönnten. Wir haben diese exprimiert, um dannfunktionell den Einfluss der Überexpression zusehen. Bereits damals haben wir Hochdurchsatz-Mikroskope entwickelt, die es uns erlauben, imHochdurchsatz funktionelle zellbasierte Assaysanzuschauen und zu quantifizieren. DiesenAnsatz haben wir im Laufe der Jahre weiter verfeinert.Wir mussten in diesem großen DurchsatzZellen mit siRNAs transfizieren. Dazu habenwir eine Methode zur reversen Transfektionvon Array-gebundenen Zellen entwickelt. NachErstellen einer siRNA-Bibliothek in Kooperationmit Ambion, deren siRNAs jeweils tatsächlichnur die Expression eines Transkripts hemmen,und Entwicklung verschiedener Methoden derautomatischen Bildanalyse waren wir soweit, dashumane Sekretom erstmals zu analysieren.LABORWELT:Was sind Ihre wichtigsten Ergebnisse?Pepperkok:Es ist ein immenser technischer Fortschritt,dass wir die Stärke morphologischer Veränderungender Zelle im Hochdurchsatz erfassenkönnen. Wissenschaftlich gesehen, gab esgleichermaßen erfreuliche wie auch enttäuschendeErgebnisse. Wir haben gelernt, dassSchlüsselproteine zum Teil nicht mit dieser Methodeidentifiziert werden können. Ein Grundist, dass sie redundant exprimiert werden, dasheißt, ähnliche Proteine übernehmen die Funktiondes stillgelegten Proteins. Das scheint fürSchlüsselproteine im sekretorischen Weg eingenerelles Prinzip zu sein. Was wir aber gesehenhaben und sehen wollten, sind Proteine die dieSekretion regulieren, zum Beispiel signalübertragendeProteine, wie den EGF-Rezeptor; wirhaben 170 Transkriptionsfaktoren identifiziert,deren Rolle beim Membrantransport noch garnicht erforscht ist. Unterdessen haben wirMuster gefunden, die darauf heinweisen, dassRainer PepperkokNach Diplom in Angewandter Physik(1987) und Promotion in Zellbiologie(1992) forschte Dr. Rainer Pepperkok von1987-1993 in der Gruppe von Prof. Dr. WilhelmAnsorge am EMBL in Heidelberg. Bis1996 arbeitete er in der Gruppe von Prof.Dr. Thomas Kreis (Universität Genf). Dannwechselte er als Head of Light Microscopyan den Imperial Cancer Research Fundnach London. Seit August 1998 ist PepperkokTeamleiter an der Cell Biology/CellBiophysics-Einheit sowie Leiter der AdvancedLight Microscopy Facility am EMBLin Heidelberg.eine Housekeeping-Aktivität der Sekretion vonverschiedenen Gruppen von Transkriptionsfaktorenreguliert wird.LABORWELT:Wie lassen sich die funktionell redundantenSchlüsselproteine weiter analysieren?Pepperkok:Wir können die funktionelle Redundanz ausnutzen,indem wir das Schlüsselprotein und dasfunktionell dazu komplementäre Protein gleichzeitigausschalten. Wenn wir das tun, sehen wireinen ganz drastischen Effekt auf die Sekretion.Das ermöglicht die Analyse ganzer Proteinnetzwerke.Im Falle der Sekretion konnten wir soaufklären, wie Cytoskelett elemente mit demvesikulärem Coat-Protein interagieren.LABORWELT:Wo liegt das Anwendungspotential IhrerErgebnisse?Pepperkok:Mit derselben Technologie lassen sich auchkrankheitsrelevante Protein-Protein-Wechselwirkungenuntersuchen. Wir haben mit Kollegenbereits gegonnen, die Wechselwirkungenbeim Proteintrafficking der Zystischen Fibrosezu erfassen.LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 | 15


Affinomics Functional Genomicserfordert andere Moleküle als eine Immunfällungoder der Nachweis von Proteinen inGewebeschnitten.Weltweit wurden vor kurzem erste koordinierteProgramme aufgelegt, um Affinitätsreagenzienin unterschiedlichen Formaten alsglobale Ressource bereitzustellen. Beispieledafür sind ProteomeBinders (www.proteomebinders.org),Affinomics (www.affinomics.org),die Clinical Proteomic Technologies Initiative(proteomics.cancer.gov) oder die Antibody Factory(www.antibody-factory.de). Der HumanProteome Atlas (www.proteinatlas.org) ist imAugenblick am weitesten fortgeschritten unddürfte in einem guten Jahr für jedes der etwa22.000 menschlichen Gene einen polyklonalenAntikörper gegen das vorhergesagte Genproduktbereitgestellt und mittels der Antikörperdie Lokalisation des Proteins in verschiedenenGeweben bestimmt haben. Vom Ansatz hersind alle genannten Initiativen noch relativkleinformatig – trotz einer recht großen Zahlan Bindern, die jeweils hergestellt und charakterisiertwerden. Dies liegt neben finanziellenBeschränkungen auch daran, dass als Teil derProjekte die besten Affinitätsmoleküle fürdie verschiedenen Anwendungen definiertwerden. Gleichzeitig werden experimentelleParameter untersucht, um die Grenzen dereinzelnen Analyseformen auszureizen. Zusätzlichwerden die Grundlagen geschaffen, um dieDatenspeicherung und die Kommunikation derErgebnisse zu standardisieren.Das von der Europäischen Kommissiongeförderte Affinomics-Konsortium, das aufder ProteomeBinders-Initiative aufbaut, kombiniertein ganze Reihe von Gruppen mit derExpertise, um all die oben genannten Aspekteabzudecken. Neben Produzenten der Zielproteineund von Epitopen mit unterschiedlichenModifikationen nehmen eine ganze Reihe vonGruppen teil, die Affinitätsreagenzien produzieren.Einige der oben genannten Aktivitäten,wie der Human Proteome Atlas und die AntibodyFactory, nehmen ebenfalls teil. Das Portfoliovon Bindern reicht von IgG-Antikörpern ausKaninchen und Mäusen, über Antikörpern ausKamelen, die eine andere Struktur besitzen,rekombinanten „single chain fragment“ (scF)Bindern bis zu Darpins, niedermolekularenBindemolekülen, deren Spezifität gezieltkonstruiert werden kann. Dazu kommen Aptamere– Oligonukleotide, die spezifisch an einEpitop binden. Außer der Charakterisierungder gewonnenen Bindemoleküle wird in demAbb. 2: Umkehrung des Formats zu Abb.1: Inkubation eines Proteinextrakts aus Gewebe aufeinem Antikörper-Microarray. In der Falschfarben-Darstellung sind überexprimierteProteine rot, geringer exprimierte Proteine blau dargestellt.Konsortium ihre Eignung für eine Reihe vonAnwendungen untersucht. Ein Schwerpunktdabei sind Microarray-basierte Studien. Diesehaben mittlerweile eine Qualität erreicht, diejene übertrifft, die für eine klinische Zulassungvon DNA-Microarrays Voraussetzung istGleichzeitig ist eine Sensitivität bis zum Nachweisvon Interaktionen einzelner Moleküleselbst ohne Signalamplifikation möglich. Danebenbilden Aspekte der Datenspeicherungund Datenkommunikation einen weiterenSchwerpunkt.AusblickWährend ein erster Satz von 22.000 Antikörperngegen das grundlegende menschliche Proteom inwenigen Monaten existieren wird, wird es einigeJahre dauern, um ein breites Portfolio an Bindernzu produzieren, die gegen die geschätzten einbis zwei Millionen Protein-Isoformen sowie füralle relevanten Anwendungen in unbegrenztenMengen verfügbar sein werden. Aufbauend aufden Erfahrungen von Aktivitäten wie Affinomicswird dieses Ziel jedoch recht schnell erreichbarsein. Bereits auf dem Weg zu diesem Ziel werdenwichtige Ergebnisse gewonnen werden, die eineunmittelbare Anwendbarkeit ermöglichen. Sokann beispielsweise der Zugang zu menschlichenGenomsequenzen für aberzehntausendevon Individuen die Grundlage für eine gezielteaffinitätsbasierte Untersuchung von Proteinenbilden. Krankheitsrelevante Protein-Isoformen,die auf Basenaustauschen, Sequenz-Deletionenoder Splice-Varianten basieren, können mitpassenden Affinitätsreagenzien gezielt auf ihreStruktur und Funktionaltät analysiert und mitden „gesunden“ Isoformen verglichen werden.Dies kann die Grundlage für neue, gezielte undvor allem Individuum-spezifische Therapienbilden.Literatur[1] Taussig et al. (2007). ProteomeBinders: planning aEuropean resource of affinity reagents for analysis ofthe human proteome. Nature Meth. 4, 13-17.[2] Alhamdani, M.S.S., Schröder, C. & Hoheisel, J.D. (2009).Oncoproteomic profiling with antibody microarrays.Genome Medicine 1, 68[3] Gloriam et al. (2010). A community standard for therepresentation of protein affinity reagents. Mol. Cell.Prot. 9, 1-10.[4] Mustafa, S.A., Hoheisel, J.D. & Alhamdani, M.S.S.(2011). Secretome profiling with antibody microarrays.Mol. Biosyst. 7, 1795-1801.[5] Alhamdani et al. (2012). Immunoassay-based proteomeprofiling of 24 pancreatic cancer cell lines. J. Proteomics75, 3747-3759.KorrespondenzandresseJörg D. HoheiselFunktionelle GenomanalyseDeutsches KrebsforschungszentrumIm Neuenheimer Feld 58069120 HeidelbergTel.: +49-(0)6221-42-4680Fax: +49-(0)6221-42-4682j.hoheisel@dkfz.dewww.dkfz.de/funct_genome/Biobanking Services für Ihre Proben· Lagerung kryokonservierter Zellsammlungen· Lagerung von Humanzellen (Herstellungserlaubnis nach AMG)· Lagerung von infektiösen Proben bis BSL 3 (BioStV, IfSG, GenTG)· Back-up bestehender Biobanken· Globale KryologistikBioKryo GmbH, Industriestr. 5, 66280 Sulzbach/Saar · Tel.: +49-(0)6897-952 86 96 · Fax: +49-(0)6897-952 86 98 · www.biokryo.com · E-Mail: kontakt@biokryo.comLABORWELT LW3_12_BioKryo_185x32.indd 113. 16.08.2012 Jahrgang | Nr. 16:07:54 3/2012 Uhr | 17


Functional Genomics Aktivitäts-basiertes ScreeningBiotechnologie ausdem MittelmeerPeter N Golyshin 1 , Christian Leggewie 2 , Karl-Erich Jaeger 3 Hanno Teeling 4 and Frank OliverGlöckner 4,5 , 1 School of Biological Sciences, Bangor University, UK, 2 evocatal GmbH,Düsseldorf, 3 Heinrich-Heine Universität Düsseldorf 4 Max-Planck-Institut für MarineMikrobiologie, Bremen, 5 Jacobs University BremenIm Rahmen des EU-finanzierten MAMBA-Projektes fahndet ein internationales Konsortiumnach neuen Enzymen für die Biokatalyse sowie mikrobiellen Aktivitäten, um bisher unbekannteAntioxidanzien und Krebswirkstoffe zu produzieren. MAMBA steht für „Marine Metagenomicsfor New Biotechnological Applications”. Das Projekt baut auf national und durch die EU-Rahmenprogramme finanzierten Arbeiten auf, die sich bereits mit der Erkundung katalytischerAktivitäten mariner Mikroorganismen und Biozönosen sowie den Mechanismen des Überlebensdieser Organismen unter extremen Umweltbedingungen befassten. Das Konsortium aus Biochemikern,Genetikern, Mikrobiologen, Pharmazeuten und Prozessingenieuren bearbeitet die nochunterschätzte Erschließung der mikrobiellen Diversität durch Metagenomics. Diese versprichtgesellschaftlich hohen Nutzen und kann einen entscheidenden Beitrag zur Weiterentwicklungder Weißen Biotechnologie sowie der pharmazeutischen Industrie leisten.– potentiell fehlerbehaftete – Genom-Annotationverlässt. Dies begrenzt die Vorhersagevon Genfunktionen auf bereits bekannteProtein- bzw. Enzymfamilien – die Entdeckungvon Proteinen mit neuartigen Funktionenist damit nicht möglich. Die gewaltigenMetagenom-Sequenzierdaten werden derzeitzum Großteil nicht zur anschließenden Entdeckungneuer Aktivitäten oder funktionellenCharakterisierung der vorhergesagten Genedes Metagenoms genutzt. Um dies zu leisten,etablieren sich derzeit weltweit Gruppen vonStrukturgenomikern, deren erklärtes Ziel es ist,die Struktur zumindest eines repräsentativenProteins der etwa 10.000 bis 15.000 Proteinfamilienaufzuklären. Gleichwohl geben diemeisten Proteinstrukturen keinen eindeutigenHinweis auf deren Funktion. Eine sinnvolleAntwort auf diese Herausforderung ist es, dieStrukturaufklärung und bioinformatischenAnsätze mit einer en masse-Aktivitätsanalyseder Proteine zu kombinieren und die neuen Aktivitätenin biotechnologische Anwendungeneinzuschleusen.Die Mehrheit der aktuellen biotechnologischenAnwendungen sind mikrobiellen Ursprungs. Esist allgemein anerkannt, dass die mikrobielle Weltden bei weitem größten Teil der Biodiversität derBiosphäre repräsentiert. Mikroorganismen sinddeshalb auch die Hauptressource enzymatischerDiversität und für neue biotechnologische Applikationen.Marine mikrobielle Lebensgemeinschaftenmachen mehr als 80% des Lebens aufder Erde aus und spielen eine unverzichtbareRolle im Primärenergie- und Kohlenstoffkreislauf.Demzufolge wird die marine biochemische undchemische Diversität als Hauptquelle für dieSuche nach neuen Enzymen und Naturstoffenbetrachtet. Der Einsatz traditioneller Strategienzum Auffinden von Enzymen ist allerdingsdadurch limitiert, dass sich die meisten Mikroorganismennicht kultivieren lassen. Die erwarteteenzymatische Diversität in unkultivierbarenMikroorganismen hat zur Entwicklung neuerGenomics-basierter Methoden geführt, densogenannten Metagenomics. Es gibt in denMetagenomics zwei verschiedene Konzepte,entsprechend ihrer primären Zielsetzung:l das großangelegte Sequenzieren der Bulk-DNA oder von DNA-Bibliotheken zielt daraufab, den größtmöglichen Teil genetischer Ressourcenin der Probe oder Bibliothek in einemmeist Homologie-basierten Data mining zuidentifizieren.l die Konstruktion von Expressionsbibliothekenmit kleinen DNA-Fragmenten – speziellsolcher in Phage λ-Vektoren – zielt dagegenauf ein direktes Aktivitätsscreening ab.Ein klarer Nachteil des ersten Ansatzes ist es,dass er sich vollständig auf die existierendeAbb. 1: Pipeline der aktivitätsgerichteten Enzymentdeckung aus Umweltressourcen innerhalbdes MAMBA-Projektes. Die Funktionsanalyse von Metagenomen stellt die Identifikationvon Enzymen sicher, die auf definierte Substrate wirken. In Klammern angegebensind Referenzen, die die erfolgreiche Implementierung des Ansatzes innerhalb vonMAMBA dokumentieren.ProjektzieleMAMBA zielt darauf ab, Enzyme und Stoffwechselwegeextremophiler Mikroorganismenund die Metagenome mikrobieller Lebensgemeinschaftenaußergewöhnlicher marinerLebensräume zu erkunden und neu identifizierteenzymatische Reaktionen in biotechnologischenAnwendungen umzusetzen. DasProjekt baut dabei auf der wissenschaftlichtechnologischenExpertise seiner Partner ausForschung und Industrie auf. Darüber hinaussetzt MAMBA auf die Anwendung hochmodernerTechnologien zur Archivierung, zummolekularen Aktivitätsscreening, zur Proteinstrukturaufklärung,Enzymengineering undgerichteten Evolution, um neue biotechnologischeProzesse und Biokatalysatoren zurSynthese von Feinchemikalien zu etablieren.Um die ganze Breite des marinen mikrobiellenLebens abzubilden, werden Proben anmarinen Hotspots gesammelt und unlängstsequenzierte Genome genutzt. Gleich zweierleiNutzen verspricht dabei die Erforschungan den Grenzen des Lebens, also an hypersalinenStandorten, in sehr kalten oder heißenBiotopen sowie das Leben unter hohem Druckoder niedriger Wasseraktivität: Sie verbesserteinerseits das Verständnis der Mechanismen,die das Überleben der Mikroorganismen unterextremen Bedingungen sichern, ist zugleichaber hochrelevant für das Auffinden industriellnutzbarer neuer Enzyme.Im Rahmen des MAMBA-Projekts stehtdas aktivitätsbasierte Screening im Fokus. Esermöglicht, individuelle, mit ihren Substrateninteragierende Enzyme zu identifizieren. NeueEnzyme werden produziert, kristallisiert undstrukturaufgeklärt. Die vielversprechendstenKandidaten werden auf Aktivität gegenüber18 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


Aktivitäts-basiertes Screening Functional Genomicseiner Vielzahl chiraler und nicht-aktivierterbiokatalytisch relevanter Substrate getestet,und ihre Fähigkeit, in wasserfreien Systemen zuarbeiten, wird geprüft.Methoden der gerichteten und der ungerichtetenEvolution werden angewandt, um beispielsweisedie Aktivität oder die Spezifität derEnzyme zu verbessern (vgl. Abb. 1). Angemerktsei hier, dass innerhalb des Projektes auch modernebioinformatische Methoden zum Einsatzkommen: Eine umfassende bioinformatischeAnalyse entlang des gesamten Stammbaumszellulären Lebens soll Kandidaten in weiterenOrganismen ermitteln, die Homologie zu denneuentdeckten Proteinen aufweisen – diesesollen kloniert und auf Funktionalität getestetwerden (Abb. 2).Die Implemienterung der neuen Enzymein biotechnologische Prozesse erfolgt in Kooperationmit kompententen Partnern ausder Industrie. Wir erwarten nicht nur einenQuantensprung hinsichtlich der Leistungsfähigkeitund Spezifität neuer biotechnologischerProzesse, sondern auch die Etablierungeiner neuen Technologieplattform, um dienoch unentdeckte marine Protein-Diversitätzu erforschen.Projekt-HighlightsSeit dem Projektstart im Jahr 2009, hat dasMAMBA-Konsortium einige hundert Proteineund niedermolekulare Substanzen identifiziertund charakterisiert, die ein hohes Potential inden folgenden Applikationen haben:l Synthese von Feinchemikalien und biochemischeReaktionen mit Relevanz für diePharma-Industrie– Ester zu Amiden (Lipasen, Amidasen)– Redoxreaktionen (Aldolasen und Oxidoreductasen)– Aktivierung von OH-Gruppen (Aldolasen)– Hydroxylierungen (Mono-/Dioxygenasen)– Lipidmodifikationen: Spezifische Umesterungen(Lipasen)l Lebensmittelverarbeitende Enzyme (Brot,Wein etc./Amylasen)l Textilverarbeitung: Enzyme aus aus halophilenOrganismen zur enzymatischen Textilbehandlung(Baumwolle, Polyester usw.,Laccasen/Cellulasen, Hemicellulasen)l Detergenzien: Enzyme mit höherer Stabilität(Proteasen)l Energie– Biomasse-Konversion (β-Glucosidasen)– Enzymatische Brennstoffzellen (Laccasenund Hydrogenasen)l Polymere– Monomer-Epoxidierung (Epoxidasen)– Polyester-Synthese (Lipasen, Esterasen)l Umwelt– Enzyme aus Extremophilen (aktiv beitiefen Temperaturen und hohen Salzkonzentrationenfür Entfärbungen/Laccasen,Peroxidasen)Abb. 2: Die Annotations-Pipeline für Metagenom-Sequenzierungsdaten – bioinformatikgetriebeneVorhersage von Stoffwechselwegen in mikrobiellen Lebensgemeinschaften unddie Entdeckung von biotechnologisch relevanten Enzymen. Kandidatenproteine werdennach ihrer in silico-Identifikation kloniert und funktionell sowie strukturell analysiert.– Dekontamination (Esterasen, Mono- undDioxygenasen, Dehalogenasen)l Medizinisch relevante industrielle Prozesse– Antioxidanzien mit pharmakologischenEigenschaften– Wirkstoffe gegen Darm-, Lungen- undBrustkrebs.Die Beteiligung der Industriepartner PierreFabre SAS (Paris), evocatal GmbH (Düsseldorf)und PharmaMar S.A. (Madrid) gewährleisteteine unmittelbare Übertragung akademischenKnow-hows in Produkte, die relevant für dieHautpflege, Lebens- und Futtermittelproduktionund Feinchemikaliensynthese für medizinischeAnwendungen sind.Literatur[1] Beloqui A, Polaina J, Vieites JM, Reyes-Duarte D, Torres R, GolyshinaOV, Chernikova TN, Waliczek A, Aharoni A, Yakimov MM,Timmis KN, Golyshin PN, Ferrer M. (2010). CHEMBIOCHEM11(14):1975-1978.[2] Ferrer M, Beloqui A, Golyshin PN. (2010) Methods Mol Biol.668:189-202.[3] Fernández-Arrojo L, Guazzaroni ME, López-Cortés N, Beloqui A,and Ferrer M. (2010). Curr Opin Biotechnol. 21:725-733.[4] Ferrer M., Werner J., Chernikova T.N., Bargiela R.,Fernández L., La Cono V., Waldmann J., Teeling H., GolyshinaO.V., Glöckner F.O., Yakimov M.M., Golyshin P.N.;number of hits5040302520151050R-TransaminasesS-TransaminasesKryos F2Kryos F3LOV domainsShort-chain ADHMedium-chain ADHGDSL lipasesCarbohydrate esterasesHormonsensitive lipasesPatatin-like lipasesEstZ3-family lipasesSubfamily 9 lipasesBeta-lactamasesCytochrome P450Lacasses/multicopper oxidasesPHA depolymerasesThiamine disphosphate dep. enzymesMAMBA Scientifi c Consortium. (2012). Environ Microbiol.14:268-281.[5] Golyshina O.V. (2011) Appl Environ Microbiol. 77:5071-5078.[6] La Cono, V., Smedile, F., Bortoluzzi, G., Arcadi, E., Maimone, G.,Messina, E., Borghini, M., Oliveri, E., Mazzola, S., L’Haridon, S.,Toffin, L., Genovese, M., Ferrer, M., Giuliano, L., Golyshin, P.N.,and Yakimov M.M. 2011. Environ Microbiol 13:2250-2268.[6] Lemak S., Tchigvintsev A., Petit P., Flick R., Singer A.U., BrownG., Evdokimova E., Egorova O., Gonzalez C., Chernikova T.N.,Yakimov M.M., Kube M, Reinhardt R, Golyshin P.N., SavchenkoA., Yakunin A.F. 2012. Biochem J. 445:193-203.[7] Röling WF, Ferrer M, Golyshin PN. (2010) Curr Opin Biotechnol.21(4):532-538.[8] Stock A, Breiner HW, Pachiadaki M, Edgcomb V, Filker S,La Cono V, Yakimov MM, Stoeck T. (2012). Extremophiles.16(1):21-34.[9] Troeschel S.C., Thies S., Link O., Real C.I., Knops K., WilhelmS., Rosenau F., Jaeger K.E. (2012). J Biotechnol. (in press,PMID:22440389)[10] Vieites JM, Guazzaroni ME, Beloqui A, Golyshin PN, and FerrerM (2010) Methods Mol Biol. 668:1-37.[11] Yakimov, M.M., La Cono, V., Smedile, F., Ferrer, M., De Luca, T.H.,Juarez, S., Ciordia, S., Albar, J.P., Golyshin, P.N. and Giuliano, L.2011. C ISME Journal 5:945-961.KorrespondenzadresseProf. Dr. Frank Oliver GlöcknerMicrobial Genomics and BioinformaticsMax-Planck-Institut für Marine MikrobiologieJacobs University Bremen GmbHfog@mpi-bremen.deLABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 | 19


IIZellen & Biobanken StammzellkulturZellen & BiobankenAdhärente Zellkulturim „hängenden Tropfen“Dr. Julia C. Schulz und Prof. Dr. Heiko Zimmermann, Fraunhofer-IBMT, St. IngbertDie sich schnell entwickelnden Omics-Methoden machen immer mehr Datenaus Zellen und Geweben zugänglich. Umwirklich valide Informationen aus denBiomaterialien zu gewinnen, sind nichtnur Kultur- und Lagerungsbedingungenwichtig, die die Zelle in ihrem natürlichenZustand erhalten. Damit vergleichbareDaten erhalten werden, muss auch dieProbenvorbereitung und -konservierungmöglichst standardisiert erfolgen. Deshalbwird sowohl bei der Zellkultur als auchallen anderen Schritten ein möglichsthoher Automationsgrad angestrebt. Einautomatisiertes Protokoll zur Differenzierungund Tiefkühllagerung von Stammzellenstellen in diesem Spezial Forscherdes Fraunhofer-IBMT vor (vgl. S. 20). DieKultur der empfindlichen Stammzellen aufCarriern im hängenden Tropfen eröffneteine Langzeitkultur und zugleich eineMöglichkeit, die Zellen beschädigungsfreieinzufrieren und zu lagern.BiobankingEntsprechend automatisierbare Tiefkühltechnologienwerden dringend gebraucht,um medizinischen Nutzen aus den permanentanwachsenden Bio(material)-banken ziehen zu können. Gemeinsammit Unternehmen arbeiten Forscher derBiobank Graz und des BBMRI an Automationsprotokollen,um eine einheitlicheProbenqualität in Europas größter Biobanksicherzustellen. In diesem Spezial stellensie eine Automationslösung für das Einfrierenvon Flüssigproben und die Verfolgung(Probentracking) von Paraffin-konserviertenGeweben vor (vgl. Seite 24). Wietiefgekühlte Proben sicher transportiert,Biobankproben automatisiert gelagert undmittels kryogängiger Memory Chip- undRFID-Technologie zuverlässig identifiziertwerden können, beleuchten Experten abSeite 27. Ein neues Tool, das die Analysevon Daten aus Kohortenuntersuchungenund Biomarkersuche signifikant verbessert,stellen zudem Haring et al. auf S. 22 vor.Die Stammzellforschung ist eines der vielversprechendsten Gebiete der Biomedizin. Allerdingsstehen immer noch nicht ausreichend Protokolle zur Verfügung, die eine hinreichend effizienteExpansion und gezielte Differenzierung erlauben. Insbesondere trifft dies auf die humanenembryonalen Stammzellen zu. Hier ist die Suche nach Differenzierungsmolekülen mit dengebräuchlichen manuellen Zellkulturmethoden zeitaufwendig und nicht zuletzt immer nochein „Glücksspiel“. Auch die möglichen kombinatorischen Effekte auf die Entwicklung einerZellkultur bei zwei oder drei molekularen Kandidatenfaktoren können aufgrund der Vielzahlder Möglichkeiten nur sehr oberflächlich untersucht werden.Eine neue „alte“ Technologie hat nach unsererEinschätzung allerdings großes Potential beider Bewältigung der beschriebenen Aufgabe.Der „Hängende Tropfen“ (Hanging Drop) ist alsKultivierungsmethode mehr als hundert Jahreim Einsatz und wurde schon zu Anfang desletzten Jahrhunderts als Kultivierungsmethodefür Nervenzellen und für Untersuchungen derEmbryonalentwicklung eingesetzt. Nahezuunverändert ist die Methode der Herstellungdes „Hängenden Tropfens“: Er wird auf demDeckel einer Petrischale plaziert, die dann mitgeschickten Händen umgedreht wird und soeinen Mini-Bioreaktor mit einem Volumen vonwenigen 10 Mikrolitern ohne Anhaftungsflächenfür Zellen schafft. Das geringe Volumenist prädestiniert für einen ressourcenschonendenKultivierungsvorgang und trotzdemausreichend, um statistisch abgesicherteVersuche durchzuführen. Zudem ist eine perfekteund nahezu gradientenfreie Versorgungmit Gas gewährleistet, da die Zellen direkt ander Flüssig-Gasgrenzfläche kultiviert werden.Eventuellen Volumenänderungen des Tropfenslässt sich über eine Umgebung mit definierterLuftfeuchtigkeit entgegenwirken (zum Beispieldurch die Verwendung von Flüssigkeitsreservoirsdirekt unter den Tropfen). Viele etablierteDifferenzierungsprotokolle für Stammzellen, sozum Beispiel die Bildung von Kardiomyozyten(Herzmuskelzellen) basieren auf dieser Methode.Es wurden schon vor einiger Zeit von anderenGruppen sehr erfolgreiche Ansätze zur Automatisierungdurchgeführt, da sich die Zellen auchnach der Kultivierung im Tropfen ohne Zugabevon Enzymen (wie etwa Trypsin) weiterverwendenlassen. Eine Adhäsion der Zellen am Kultivierungsgefäßfindet hier nicht statt, sondern dieZellen aggregieren untereinander und bildeneine Art Mikrogewebe oder Sphäroid.Da die Adhäsion an fremden Oberflächenaber für viele Zellen eine physiologische Grundbedingungist, differenzieren sie, sobald dieseverlorengeht, die Zellen verlieren ihre charakteristischenEigenschaften, oder es kommt garzum programmierten Zelltod. Wir entschlossenuns daher als neuen Ansatz das 3D-System„Hanging Drop“ mit dem klassischen 2D-Ansatzder Zellkultur zu kombinieren. Dazu wurdenMicrocarrier – kleine Trägermatrizen mit einemDurchmesser von 150 bis 200µm – in jedeneinzelnen Tropfen gegeben und so den Zelleneine biokompatible (und somit auch funktionalisierbare)Oberfläche angeboten. Die Zellenkönnen auf einem oder mehreren Microcarriernanwachsen, zugleich ist aber die Kultivierunginnerhalb des aufgrund seiner Größe leichtkontrollier- und standardisierbaren Tropfensmöglich. Dabei konnten wir beobachten, dassdie Zellen nach der Adhäsion schnell wiedermit der Zellteilung beginnen. Während derProliferation vereinnahmen sie immer weitereMicrocarrier, so dass ein ständig wachsendesZell-Microcarrier-Aggregat entsteht. Es ist jedochentscheidend, dass zu Beginn der Kultur im„Hanging Drop“ die Zahl an Zellen pro Microcarriernicht zu gering ist, damit ausreichend Zell-Zell-Kontakte ausgebildet werden können. Dieseröffnet zusätzlich die Möglichkeit durch eineschrittweise Zugabe der Microcarrier eine dynamischeExpansion der Zellen zu erreichen, sodass die Proliferationskapazität ständig erhöhtwerden kann. Die Bildung der Zell-Microcarrier-Aggregate führt auch zur Entstehung einerspeziellen Mikroumgebung („Nische“), wodurchdie Effizienz der Differenzierungsprotokollemöglicherweise erhöht werden kann, da diephysiologischen Bedingungen im menschlichenKörper simuliert werden. Für eine reproduzierbareund standardisierte Anwendung dieserMethode stellt hierbei die Anzahl der Microcarrierpro Tropfen den kritischen Parameter dar, damomentan eine gleichmäßige Verteilung nochnicht gewährleistet werden kann.Allerdings ist die „Hanging Drop“-Kulturnoch sehr zeit- und arbeitsaufwendig, da zumBeispiel für eine längere Kultivierung von Zellenein regelmäßiger Mediumwechsel notwendigist. Dazu muss der Deckel mit den Tropfenvorsichtig gedreht und anschließend manuelldas Medium jedes einzelnen Tropfens erneuertwerden, ohne die Zellen zu verlieren. Um also20 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


ABCEuropeanBiotechnologyNetworkDEFAbb. 1: Kultivierung humaner embryonaler Stammzellen auf Microcarriern im Hanging Drop:A. Schemazeichnung einer Automatisierung der „Hanging Drop“-Kultur durch die Verwendungvon Pipettierrobotern; B. „Hanging Drops“ an einer für die Automatisierunggeeigneten Zellkulturplatte; C. Humane embryonale Stammzellen auf Microcarriern imHanging Drop nach sieben Tagen manueller Kultivierung; D-F. ImmunzytochemischerNachweis der Pluripotenz von humanen embryonalen Stammzellen nach 10-tägigermanueller Kultur im Hanging Drop mit anschließender Kultivierung unter Standardbedingungen;D. Durchlicht-Aufnahme; E. HESCA-2 Färbung (Pluripotenzmarker); F.HOECHST33342-Färbung (Zellkern); Maßstab: 500µmdie Vorteile der „Hanging drop“-Kultur für einebreitere und größere Anwendung nutzbar zumachen, ist eine Automatisierung des Prozessesunerlässlich. Es gibt verschiedene Möglichkeitender automatischen Zugabe von Faktorenin einen derartigen „Hanging Drop“-Bioreaktor,eine bereits umgesetzte ist in Abbildung 1 A undB gezeigt. Jede Manipulation des Tropfens, vomMediumwechsel über die Zugabe von Faktorenbis hin zur Ernte, kann durch die Verwendungeiner speziellen Zellkulturplatte über eine Öffnungauf der Oberseite des Tropfens realisiertwerden. Hierfür können die Vorzüge des breitenAngebotes und der unterschiedlichen Spezifikationenan Pipettier-Plattformen genutztwerden, so dass ein Großteil der manuellenArbeit automatisiert und standardisiert werdenkonnte. Wir konnten damit nun im Rahmen desEU-Projektes HYPERLAB zeigen, dass humaneembryonale Stammzellen ohne Verlust ihrerPluripotenz im adhärenten Zustand im modifizierten„Hanging Drop“ für 10 Tage kultiviertwerden konnten (Abb. 1 C-F). Zusätzlich konntenwir durch die Einbindung von Pipettierroboterneine vollständige Automatisierung des Systemsunter der Verwendung von humanen induziertenpluripotenten Stammzellen und humanenadulten Stammzellen demonstrieren.KryokonservierungDurch die Entwicklung neuartiger Methodenim Bereich der Kryokonservierung, wie zumBeispiel der oberflächenbasierten Vitrifikation 3oder vollständig proteinfreier Kryomedien 4 , istanschließend eine sichere und effiziente Lagerungder Zellen direkt im Tropfen möglich. Beider oberflächenbasierten Vitrifikation könntenLABORWELTdie „Hanging Drop“-Bioreaktoren nach Zugabeder nötigen protektiven Stoffe direkt in flüssigenStickstoff versenkt werden, so dass es zueinem sofortigem Erstarren aller Strukturen undder Einstellung aller biochemischen Prozessekommt. Dabei kann enzymatischer Stress auf dieZellen vollständig vermieden werden, da dieseadhärent auf den Microcarriern eingefrorenwerden, so dass die zellulären Eigenschaftenwie Membranintegrität und Fokalkontakte nichtgestört werden. Zusätzlich können die Zellennach dem Auftauen direkt wieder die Zellteilungs-und Stoffwechselvorgänge beginnen,ohne zuerst den komplexen Adhäsionsprozessdurchführen zu müssen. Der modifizierte „HangingDrop“ bietet hervorragende Möglichkeiten,Plattformen zur Optimierung von Protokollen zurKultivierung, Differenzierung und Kryokonservierungzu entwickeln und damit endlich zu einersystematischen Entwicklung von Kulturmedienund Kulturbedingungen zu kommen.Literatur[1] www.hyperlab.eu[2] Schulz, J. C., P. S. Stumpf, A. Katsen-Globa, A. Sachinidis,J. Hescheler and H. Zimmermann (2012). Engineeringin Life Sciences, DOI: 10.1002/elsc.201100213.[3] Beier, A.F., Schulz, J.C., Dörr, D., Katsen-Globa, A.,Sachinidis, A., Hescheler, J. and Zimmermann, H. (2011).Cryobiology 63, 175-85.[4] Zeisberger, S.M., Schulz, J.C., Mairhofer, M., Ponsaerts,P., Wouters, G., Doerr, D., Katsen-Globa, A., Ehrbar, M.,Hescheler, J., Hoerstrup, S.P., Zisch, A.H., Kolbus, A. andZimmermann, H. (2011). Cell Transplantation 20, 1241-57.KorrespondenzadresseDr. Julia C. Schulzjulia.schulz@ibmt.fraunhofer.deJoin the EuropeanBiotechnology Network!The European Biotechnology Networkis dedicated to facilitating co-operationbetween professionals in biotechnologyand the life sciences all overEurope. The network is run by the EuropeanBiotechnology Foundation, anon-profi t organisation based in Brussels.Do you want to know more aboutthe advantages of a (free) membership?Just have a look at our website:www.european-biotechnology.netEuropean Biotechnology FoundationRue d‘Egmont 15B-1000 Bruxelles, BelgiqueTel: +32 2 50 08 531Fax +32 2 64 92 989info@european-biotechnology.orgwww.european-biotechnology.net


Zellen & Biobanken PaperweltBiomarker undSystem-EpidemiologieHaring R, Rosvall M, Völker U, Völzke H, Kroemer H, Nauck M, WallaschofskiH. (2012): A network-based approach to visualize prevalence and progressionof metabolic syndrome components, PLoS One. 2012;7(6):e39461Einen neuen Ansatz, Herr der Flut an Biobank-assoziierten Daten zu werden, haben GreifswalderForscher um Dr. Robin Haring und schwedische Kollegen vorgestellt. Mit einem neuenbioinformatischen Werkzeug zur statistischen Analyse von komplexen Risikofaktoren gelanges den Forschern, die Häufigkeit und das Fortschreiten des metabolischen Syndroms in einerBevölkerungskohorte von 4.000 Personen anhand von fünf Biomarkern zu beschreiben unddie Bedeutung der Biomarker Bluthochdruck, Fettleibigkeit und erhöhte Blutfette einzuordnenund graphisch darzustellen. Ziel der Wissenschaftler ist es indes, Daten aus Genom-, Transkriptom-,Proteom- und Metabolomanalysen zu integrieren und zur Auffindung molekularerBiomarker zu nutzen, die helfen, die Aussagekraft klassischer Biomarker bei der Krankheitsprädiktionund -prognose signifikant zu verbessern. Die Integration der Information ausMulti-Omics-Analysen verspricht Fortschritte im Feld der personalisierten Medizin.LABORWELT:Vor welchem Problem sehen sich Wissenschaftlerbei der Auswertung großer Datenmengenwie zum Beispiel klinischen, serologischenund molekularbiologischen Daten ausBevölkerungsstudien?Methodol. 2011;11:103). Statt „one size fitsall“ zeichnet sich nun auf der Grundlagemolekularer Biomarker ein Trend zur stärkerenIndividualisierung in der Prognose undPrävention verschiedenster Erkrankungenab.LABORWELT:Was ist das neue an Ihrem Ansatz, wie funktionierter und welche Ergebnisse hat ergeliefert?Haring:Die statistische Integration sogenannterMulti-Omics-Datensätze (molekularbiologischeParameter des Genoms, Transkriptoms,Proteoms und Metaboloms) wird der nächsteentscheidende Schritt zur Analyse individuellerKrankheitsverläufe und deren Ursachensein. Dazu haben wir ein Netzwerk-Analysemodellprogrammiert, um beispielhaft diePrävalenz und Progression des MetabolischenSyndroms zu analysieren und graphisch verständlichdarzustellen. Mit Hilfe der Datenvon 4.000 Probanden der BevölkerungsstudieSHIP (Study of Health in Pomerania) konntenwir zeigen, dass die fünf Komponenten desMetabolischen Syndroms (Bluthochdruck,Bauchumfang, erhöhte Blutzuckerwerte, erhöhteBlutfette und erniedrigtes Cholesterin)einen jeweils unterschiedlichen Beitrag zumKrankheitsbild leisten. Wir konnten durchNetzwerk-analytische Methoden auch belegen,dass Bluthochdruck und Fettleibigkeit diewichtigsten Einflussfaktoren sind, währendein gestörter Blutfettstoffwechsel vor allemden weiteren Verlauf des MetabolischenSyndroms dominiert.Haring:Die Risikoabschätzung klinisch relevanterEndpunkte wie Schlaganfall, Herzinfarktoder kardiovaskulärer Tod ist durch klassischeRisikofaktoren wie Alter, Geschlecht,Body Mass Index oder Rauchen bereits sehrverlässlich möglich, so dass neue potentielleBiomarker häufig nur relativ wenig zu einerVerbesserung des Risikos beitragen können.Beispielhaft für dieses Dilemma steht einefrühere Publikation unserer Arbeitsgruppe,die zeigte, dass die simple Frage nach demsubjektiven Wohlbefinden eine ebenso präziseSterblichkeitsvorhersage erlaubt wie dieMessung von 10 Biomarkern (BMC Med ResLABORWELT:Welche Werkzeuge stehen derzeit zur Verfügungund was muss verbessert werden?Haring:Standardwerkzeug zur Identifikation vonRisikofaktoren und Krankheitsvorhersagesind Regressionsmodelle. Doch dieser traditionellemethodische Ansatz ist durch den eindimensionalenBezug auf jeweils nur einzelneRisikofaktoren beziehungsweise Biomarkerstark limitiert in der Auswertung nun verfügbarermultidimensionaler Datensätze und derMöglichkeit, individuelle Krankheitsverläufezu identifizieren.Dr. Robin HaringDr. Robin Haring (30) ist Postdoc am MetabolicCenter des Institut für KlinischeChemie und Laboratoriumsmedizin derUniver sitätsmedizin Greifswald. Nach demDiplom-Studium der Demographie an derUniversität Rostock promovierte er 2010im Fach Epidemiologie mit Auszeichnung.Im Anschluss verbrachte er als Stipendiatder Krupp-Stiftung ein Jahr an der BostonUniversity als Research Fellow in der FraminghamHeart Study. Seine Forschungenbeschäftigen sich schwerpunktmäßig mitkardio vaskulären Risikofaktoren und Biomarkern,allen voran Testosteron.LABORWELT:Was bedeutet dies für das Auffinden undValidieren neuer Biomarker?Haring:Diese neuen Netzwerk-basierten statistischenVerfahren könnten die Fülle an molekularenBiomarkern im Zusammenspiel mitklassischen Risikofaktoren integrieren und soden Zugang zu hochkomplexen Datensätzenvereinfachen. Auch das Bild der Epidemiologiewird sich dadurch hin zu einer System-Epidemiologie wandeln.LABORWELT:Wie geht Ihre spannende Forschungsarbeitnun weiter?Haring:Im Rahmen von GANI_MED (Greifswald Approachto Individualized Medicine) bzw. desDeutschen Zentrums für Herzkreislaufforschung(DZHK) werden wir am ForschungsstandortGreifswald die Identifikation undIntegration molekularer Biomarker als Grundlageeiner „Individualisierten Medizin“ vorantreiben.In unserer Arbeitsgruppe planen wir,die Anwendung integrierter personalisierterOmics-Profile im Rahmen einer klinischenStudie zur Testosterontherapie, um unserebisherigen Beobachtungszusammenhängeaus epidemiologischen Studien zu validierenund Omics-Verfahren „from bench to bedside“zu bringen.22 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


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Zellen & Biobanken AutomationBiobanken – Optimierungdurch AutomatisierungUniv.-Prof. Dr. Berthold Huppertz, Direktor und CEO, Biobank Graz, ÖsterreichBiobanken sind Infrastruktur-Einheiten, die eine immer größer werdende Anzahl von überwiegendhumanen Proben beherbergen und – mit ihren entsprechenden klinischen Daten vernetzt– der Forschung zur Verfügung stellen. Erweitert wird dieses System der humanen Biobankendurch Biobanken, die Proben tierischen oder pflanzlichen Ursprungs beinhalten und auch dortwieder mit funktionellen Daten verknüpfen. In den vergangenen zehn Jahren ist nicht nurdie Zahl der Biobanken deutlich angestiegen – auch die Zahl der in den einzelnen Biobankengelagerten Proben hat enorme Ausmaße angenommen. So lagern heute in der UK Biobankeine Million verschiedene Proben von 500.000 Spendern und Spenderinnen im Alter von 40bis 69 Jahren. In der Biobank Graz lagern fast sechs Millionen Proben von mehr als einer MillionSpendern und Spenderinnen, die während der vergangenen 30 Jahre gesammelt wurden.Die Sammlung und auch die Langzeitlagerungdieser großen Zahl an Proben erfordert einimmer höheres Maß an Automatisierung. Diesist vor allem notwendig, um die Richtlinien derQualitätsmanagementsysteme zu erfüllen, diemit manuellen Sammel- und Lagerstrategienbei diesen Probenzahlen nicht mehr umsetzbarsind. Hinzu kommt, dass immer ausgefeiltereSammel- und Lagerprotokolle entwickeltwerden, um die Proben möglichst hochwertigüber lange Zeit und für jedwede analytischeAnwendung zur Verfügung zu haben.Die Zunahme an Proben ist verbunden mit einemnoch viel größeren Zuwachs an klinischenund wissenschaftlichen Daten zu jeder Probe.Dies hat zur Folge, dass immer komplexer werdendeIT-Strukturen entwickelt werden müssen,um nicht nur die lokale Einordnung der Probenwährend der Lagerung, sondern auch die Vernetzungzwischen Proben und Daten zu jedemZeitpunkt zu gewährleisten. Dabei müssenalle ethischen und legalen Erfordernisse zumSchutz der persönlichen Rechte der Spenderberücksichtigt werden. Somit sind Entwicklungenauf verschiedensten Ebenen in Biobankenim Gange, um den steigenden Anforderungengewachsen zu sein.AutomatisierungsentwicklungenAutomatisierungsentwicklungen für dieSammlung und Lagerung von Proben findensich in fast allen großen Biobanken. Es zeigtsich heute, dass der Weg von manuellenSystemen hin zu automatisierten Systemenzwingend erforderlich ist, um als Biobankinternationale Akzeptanz zu erhalten undzu behalten. Nur eine zertifizierte und miteinem Qualitätsmanagement (QM)-Systemagierende Biobank wird heute als wissenschaftlicherKooperationspartner ernsthaftin Betracht gezogen.Unterstützung bei der Sammlungvon FlüssigprobenBiobanken, die an Universitäten – besondersMedizinische Universitäten oder Fakultäten –angeschlossen sind, können daraus einen großenNutzen für die Probensammlung ziehen.Die Anbindung an die klinischen Zentrallaborsder entsprechenden Universitätsklinikenermöglicht einen direkten Zugang auf Flüssigproben(vor allem Blutproben) und – überdie entsprechenden LIMS-Systeme – auchden direkten Zugriff auf die entsprechendenklinischen Daten. Der Transport dieser Probenvon der Einzelklinik, in der die Blutabnahmeerfolgt, hin zum Zentrallabor ist in den Universitätsklinikendurch die klinische Routineoptimiert. Somit können angeschlosseneBiobanken hier durch eine direkte Anbindungeine optimale Probenqualität erhalten.An dieser Stelle entscheidet das Probenmanagementeiner Biobank über die weitereHandhabung der Proben auf Ebene der Biobankund damit über die Qualität der Probefür die Wissenschaft. Eine manuelle Probenaufteilungkann trotz aller Bemühungen eineseffektiven QM-Systems eine gleichbleibendeQualität nicht auf Dauer garantieren, so dasseine Automatisierung zwingend erforderlichist. Dafür stehen schon seit langem hochautomatisiertePipettierroboter zur Verfügung,die hier zum Einsatz kommen.Neuerungen bei der automatisiertenSammlung von FlüssigprobenAbb. 1: Blick in den neuen Pipettierroboter der Biobank Graz mit den beiden Einheiten zum direktenEinfrieren von Einzelproben rechts im Bild (je mit kleinem, blauumrandeten Display)Trotzdem bleibt meist ein manueller Schrittoffen, nämlich die aliquotierten Proben ausdem Pipettierroboter in ihre entsprechendenLagersysteme zu überführen. Dieser Schritt,der gerne in der Kette des Probenhandlingsübersehen wird, kann sich entscheidendauf die Qualität der Proben auswirken,da unterschiedlich lange Zeiten zwischenAliquotierung und Einfrieren gerade beiFlüssigproben wie Serum und Plasma entscheidendeQualitätsunterschiede nach sichziehen können.Die Biobank Graz ist diesem kritischen Schrittaktiv entgegengetreten und hat zusammen derFirma Hamilton, einem Hersteller von Pipettierroboterneinen neuen Typ von Robotern entwickelnlassen, der so bisher auf dem Markt nichtzur Verfügung steht. Das Novum an diesem24 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


Your DNA lab will movefasterif it can see where it’s going.Fragment Analyzer TM replaces lab-on-a-chip for RNA, NextGen Sequencing, gDNA and SSR Genotyping applications.Fragment Analyzer TM customers since its January, 2012 introduction:20 government institutes and labs in Germany, France, Austria, Switzerland,the United Kingdom, Italy, Japan, China, Brazil, Canada and the U.S.13 medical genetic/genomics testing firms7 U.S. medical schools6 of the 10 biggest seed companies in the world.International universities in Germany, France, Switzerland, Austria, Japan,Brazil, Canada and the United Kingdom“We found speed, quality, resolution andversatility in the Fragment Analyzer.”— Dr. Sunil Chandran, Senior Scientist, Amyris, Inc.Info@aati-us.com www.aati-us.com Call our lab in Heidelberg to learn more: 49-6221-868058-10


Zellen & Biobanken AutomationAbb. 2: Blick auf das neue Regalsystem der Biobank Graz mit einem AIV (automatischem intelligentenVehikel) und den eigens für die Biobank entwickelten Lagerungsboxen inden Regalenneuen Pipettierroboter ist, dass in das Systemdes Gerätes zwei Bereiche integriert wurden,die Einzelproben auf minus 15 °C einfrieren undlagern können. Damit kann der Pipettierroboternach dem Aliquotieren einer Probe jedes einzelneAliquot direkt auf minus 15 °C einfrieren, ohnedass längere Stehzeiten bei Raumtemperatur zuQualitätseinbußen führen.Durch ein solches Einfriersystem (Abb. 1)im direkten zeitlichen und örtlichen Zusammenhangmit der Probenaliquotierung istnicht nur eine Steigerung des Erhalts derProbenqualität möglich. Diese Kombinationbringt auch eine deutliche Reduktion desArbeitsaufwandes der Mitarbeiter einer Biobankmit sich. Musste bisher gewährleistetsein, dass sich permanent eine Person derBiobank in der Nähe des Pipettierrobotersaufhielt, um anfallende Aliquots direkt einfrierenzu können, so wird dies durch denneuen Roboter übernommen. Da personelleRessourcen in einer Biobank immer ein kritischerFaktor sind, wird sich der zusätzlichefinanzielle Aufwand bei der Anschaffungeines solchen neuen Pipettier roboters schnellwieder amortisieren.Neuer Nutzen von altenParaffinprobenDie Fixierung und Einbettung von Gewebeprobenin Wachs (Paraffin) ist schon seitlangem eine der häufigsten Methoden, umProben einer dauerhaften Lagerung zuzuführen.Paraffinproben, die über Jahrzehntegelagert wurden, können anschließend nochzur Evaluation und Datenanalyse herangezogenwerden. Mit heutigen Methoden ist zumBeispiel eine Extraktion von DNA möglich, ummit molekularbiologischen Untersuchungenweitere Analysen durchzuführen.Die Langzeitlagerung von Paraffinproben eröffnetsomit die Möglichkeit, Vergleichsstudiendurchzuführen. Solche Studien können beispielsweisedie Verwendung unterschiedlicherMedikationen über Jahrzehnte hinweg vergleichenoder aber die Veränderung der Lebensbedingungenan einem Ort mit dem Auftretenvon bestimmten Erkrankungen korrelieren.Damit wird ein weites Feld für epidemiologischeForschungen aufgestoßen, das bisher nur sehrlückenhaft genutzt worden ist.Eine Grundvoraussetzung für solche Studienist allerdings nicht nur die eindeutige Zuordnungder Proben in den – meist ebenfalls sehralten – Lagerungssystemen für Paraffinproben,sondern auch die eindeutige Zuordnungder klinischen Daten zu diesen Proben.Neuerungen bei der automatisiertenLagerung von ParaffinprobenKlassischerweise werden Paraffinproben inden Archiven der Pathologien von (Universitäts-)Kliniken gelagert. Dort befinden sich ingeeigneten Räumen spezielle Archivschränke,in denen die Paraffinblöcke gelagert werden.Anfangs ist noch versucht worden, die Probennach Patient zu sortieren und hinter jedemBlock Platz zu lassen, um bei einer neuenProbe des Patienten eine direkte räumlicheZuordnung zu gewährleisten.Mit zunehmender Zahl an Proben erreichtallerdings jedes Lager irgendwann seineGrenzen. Dann ist eine dichte Lagerungohne räumliche Zuordnung der Proben eineseinzelnen Patienten notwendig. Diese neuechaotische Lagerung erhöht zweifelsohne dieGefahr einer Verschlechterung der Wiederfindungsratevon Proben, wenn nicht ein hohesMaß an Qualitätssicherung in einer solchenBiobank vorliegt.Entsprechende automatisierte oder semiautomatisierteLagerungssysteme für Paraffinblöckesind seit längerem auf dem Markterhältlich. Allerdings sind oft zwei Faktorenentscheidend, sich gegen solche Systeme zuentscheiden. Diese Systeme sind oft sehr kostenintensiv,und/oder sie erfordern sehr vielPlatz. Diese Kombination verhindert oft dieAnschaffung einer solchen automatisiertenInfrastruktur.Inzwischen drängen daher verstärkt Systemein den Biobanken-Bereich, die aus derklassischen Lagersystem-Branche stammen.Mit entsprechenden Anpassungen könnenauch solche Systeme an den Biobanken-Bereich adaptiert werden. Ein solches Beispielfindet sich in der Biobank Graz. Hier wurdeein semi-automatisiertes Lagerungssystemder Firma YLOG mit automatischen intelligentenVehikeln verwendet (Abb. 2), um diechaotische Lagerung von Paraffinprobenzu einem hochdichten Lager zu optimieren.Zentraler Bestandteil dieses Systems ist eineLagerungsbox, die im Rahmen einer Masterarbeitan der Technischen Universität Grazentwickelt worden ist (Abb. 2). Mit dieserBox ist die Verwaltung der Paraffinproben indem hochdichten Lagersystem in der Biobankgerade in die Routine gegangen.AusblickDie Auflistung von Neuerungen im Bereichder Biobanken ist inzwischen sehr langund wird wohl jedes Jahr erneuert werdenkönnen. Das zeigt die Innovationskraft undEntwicklungsfähigkeit dieses Bereiches, vorallem auch für Firmen, die sich in diesem nochimmer stark wachsenden Bereich engagierenwollen. Hinzu kommt, dass viele Biobankeninzwischen beginnen, ihre Betätigungsfelderzu erweitern, um vom reinen Probenlieferantenzu einem Forschungspartner zu werden.Experten-Zentren sollen die Forschung –auch die industrielle Forschung – näher andie Probensammlungen und ihre klinischenDaten heranbringen, um somit die Expertisenaller Seiten (akademisch, klinisch undökonomisch) zu bündeln und synergistischzu nutzen.KorrespondenzadresseUniv.-Prof. Dr. Berthold HuppertzDirektor und CEO der Biobank GrazMedizinische Universität GrazStiftingtalstr. 3.18010 Graz, Österreichberthold.huppertz@medunigraz.atwww.medunigraz.at/biobankwww.laborwelt.de26 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


Expertenpanel Zellen & BiobankenKryotechnik für BiobankenDipl-Phys. Uwe Schön, Fraunhofer-IBMT, Sulzbach; Dr. Ben Spindler, Sysmex BiosienceEurope, Horgen, Schweiz; Prof. Dr. Heiko Zimmermann, Fraunhofer-IBMT, St. IngbertSeitdem Biobanken als Ressource für das Auffinden diagnostischer Signaturen betrachtet werden,sind immense Beträge investiert worden, um medizinische Informationen aus den Probenmaterialienzu gewinnen. Von erheblicher Bedeutung für die Analysenqualität: die standardisierte Probenentnahme,Probenvorbereitung und automatisierte beschädigungsfreie Probenlagerung.Foto B. MüllerDr. Uwe Schönist Physiker amFraunhofer-Institutfür BiomedizinischeTechnik inSulzbach.LABORWELTVor welchen Herausforderungen stehen Logistikerbeim Versenden von tiefgefrorenenProben für Therapie und Forschung?SchönDas Versenden von medizinischen und biologischenProben stellt die modernen Logistikunternehmenwie DHL, UPS auch in Zeiten vonAmazon und anderen Internet-Versendern nochimmer vor unlösbare Aufgaben. Insbesonderedie Notwendigkeit einer lückenlosen Kühlkette– beginnend bei der Probennahme bishin zur Einlagerung oder Anwendung für diehäufig tiefgefrorenen Zellen – bleibt in vielenFällen eine Sonderanforderung abseits der ganzgroßen Stückgutzahlen, die mit den üblichenTransportmitteln nicht zufriedenstellend erfülltwird. Es existiert beispielsweise keine Firma ameuropäischen Markt, die für den vollständigenUmzug von Proben aus Kryolagerbehälterneine sichere Lösung ohne Unterbrechen derKühlkette anbietet. Das impliziert in vielenFällen ein erhöhtes Risiko der Erwärmung derProben, da weder eine lückenlose Temperaturüberwachungder wertvollen Sammlungennach der Entnahme aus dem Lagerbehälterdurchgeführt wird, noch geeignete Schleusensystemezum Umpacken vorhanden sind. DasFraunhofer-Institut für Biomedizinische Technikhat im Umfeld neuer Qualitätsstandards fürdie Behandlung von tiefkalten Kryoprobenbis –196 °C Lagertemperatur auf diesem SektorLösungswege geschaffen und geeigneteGerätschaften entwickelt. Die Erfahrung derWissenschaftler und Techniker im Umgangmit Kryoproben konnte erfolgreich in Projekteneingesetzt werden. Dabei wurden die Probenaus dem Kryolager entnommen und am Zielim Kryolager eingebracht. So wurde etwa daswertvolle Jahrzehnte-alte Archiv mit 300.000Humanproben der Umweltprobenbank desBundes unter anderem aus sechs Behälternder Größe 1.400 Liter bei Temperaturen bis zu–196°C entnommen, über 500 km transportiertund anschließend wieder sicher eingelagert. DieVorgänge wurden im Vorfeld simuliert und dieTemperaturen lückenlos gemessen. Mit online-Überwachung auch während des Transportswäre auch ein etwaiges Überschreiten der zulässigenLagertemperaturen per Alarm gemeldetworden. Mit auf dem Transportweg befandensich die geeigneten Notfalllösungsmittel desFraunhofer-IBMT wie Ersatzbehälter, genügendflüssiger Stickstoff zum Kühlen und hochqualifiziertesPersonal zur Rettung der Proben.Foto B. MüllerProf. Dr. HeikoZimmermannist HauptabteilungsleiterdesFraunhofer-Institutsfür BiomedizinischeTechnik inSt. Ingbert.LABORWELTWelche kryobiotechnologischen Trends zeichnensich derzeit im Biobanking ab?ZimmermannDas Biobanking unterliegt momentan einemrasanten Wandel: weltweit, aber gerade auchin Deutschland. Die explodierenden Probenzahlenund der Start der Beprobung von großenKohorten mit krankheitsorientierten und epidemiologischenFragestellungen haben zu einemAutomatisierungsdruck in der Tieftemperaturlagerunggeführt. Die Folge ist nun die Installationunterschiedlichster Systeme, über die einerseitsnoch keine Langzeiterfahrungen vorliegen unddie andererseits – zumindest physikalisch – innicht optimalen Temperaturbereichen für dieProben arbeiten. Gleichwohl bestimmen dieEinfrier- und Lagertechnologien zweifellos dieQualität der Proben und die Aussagekraft derdavon abgeleiteten Ergebnisse. Im Fokus derkryobiologischen Forschung wird daher nun dieEtablierung retrospektiver Qualitätskontrollenstehen, die sowohl physikalische Messprinzipienanwenden (z. B. die Eisstruktur einer Probe) alsauch biologische Marker, um die Qualität einerProbe im Nachhinein zu bestimmen. Gleichzeitigmüssen die Einfrier- und Auftauverfahrenweniger invasiv und zugänglicher für die medizinischeZulassung werden, zum Beispiel durchdie Verbesserung der Vitrifikations- und auchder Einfrierverfahren mittels Eisnukleation. Paralleldazu muss auch – gerade im Hinblick aufdie Verwendung von konservierten Zellen undGewebe im klinischen Kontext – die Invasivitätder Konservierungsverfahren auf molekularbiologischerund funktioneller Ebene besseruntersucht werden.Dr. Ben Spindlerist Direktor derSysmex BioscienceEurope,dem SchweizerSpezialisten für dieVerarbeitung tiefgekühlterProben.LABORWELTWie lässt sich die beschädigungsfreie Lagerungvon Zellen effizient automatisieren?SpindlerBiobanken befinden sich im Wandel. Harmonisierungsbestrebungen,Kostendruck sowiegesteigerte Anforderungen im Qualitätsmanagementsteigern das Bedürfnis nach automatisiertenLösungen. Die allseits bekanntenMegabiobanken haben diesen Automationsbestrebungenmit Millionenbudgets entsprochen,jedoch ist hier die vollautomatisierte Lagerungim Idealzustand – bei Temperaturen unterhalbvon –170°C – noch nicht Realität. Wegen deroft eingesetzten Mikroplatten-Formate ist dieindividuelle Probenansteuerung unerreicht,ebenso wie die dauerhaft erschütterungsarmeund Wärmeexposition-eliminierendeLagerung. Auch kleinere Sammlungen beabsichtigendie Lagerbedingungen (ablösendeLabels, Suchvorgänge und damit verbundeneProbenerwärmung) und Probendokumentation(Inventarisierung) zur verbessern. Auch fürdieses kleinere Segment ist die für Zelllinien sowichtige Automation der Stickstofflagerungnicht gelöst. 2013 wollen Anbieter, darunterSysmex Bioscience, diese Lücke mit Systemenschließen, die Stickstofflagerung unter –170°Cund Vollautomation vereinen. Passiert diesauf Basis einer „Cherry Picking“-Lösung mitder Möglichkeit einzelne Tubes ein- und auszulagern,bleibt die Qualität der Sammlungdauerhaft gesichert. Besonders spannend wirdder Einzug neuer Identifizierungstechnologien,wie die kryogängige Memory Chip- und RFID-Technologie, die eine Unverwechselbarkeitvon Proben sowie das elegante „Inventar aufKnopfdruck“ ermöglichen.LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 | 27


IIIMikroskopie dSTORMMikroskopieVielfarben-dSTORMmit CarbocyaninenAndré Lampe, Dr. Jan Schmoranzer, Freie Universität BerlinNeue Lichtmikroskopietechniken habendie Beugungsgrenze des Lichts hinter sichgelassen und erreichen Auflösungen vonunter 100 Nanometern. Dieses Forschungsfeldder sogenannten hochauflösendenMikroskopie stellen wir in diesem Spezialgenauer vor. Darunter sind sowohl „echte“als auch „funktionelle“ Techniken der hochauflösendenMikroskopie. Die Mikroskopiemit strukturierter Beleuchtung (SIM) gehörtzu ersteren Techniken, da bei ihr die Bildinformationaus den abgefangenen, abklingendenLichtwellen selbst ermittelt wird.Reto Fiolka stellt einen neuen SIM-Aufbauvor, der schnell genug für Live-Aufnahmenlebender Zellen in 3D ist (Seite 32).Lebende Zellen, lebende MäuseSowohl die STED-Mikroskopie als auchdSTORM sind „funktionelle“ Techniken hochauflösenderMikroskopie, das heißt, dass sieüber verschiedene Umwege zum eigentlichenZiel kommen – dem detaillierten Bild.Die STED-Mikroskopie macht sich das nichtlineareAntwortverhalten von Fluorophorenzunutze. LABORWELT hat mit Stefan Hellüber die erstmalige in vivo-Anwendung derTechnik am Gehirn lebender Mäuse gesprochen(Seite 36). Bei der dSTORM wechselnFluorophore zufällig den Leuchtzustand. Aushintereinander aufgenommenen Einzelaufnahmenwird dann das hochaufgelöste Bilderrechnet. Jan Schmoranzer stellt auf Seite28 die Weiterentwicklung SD-dSTORM vor.Das Prinzip der spektralen Entmischungermöglicht es dabei, im Experiment zweiverschiedene Fluorophore zu unterscheidenund damit zwei distinkte Zellstrukturenabbilden zu können.Dieses Mikroskopie-Spezial wird abgerundetvon einem Expertenpanel zumThema Optogenetik und der Vorstellungeiner neuen Methode für die Elektronenmikroskopie.Auf Seite 30 erläutert JürgenPlitzko, wie sich mit Ionenstrahlen außerstdünne Probenschnitte fräsen lassen, so dassnoch viel mehr Details im EM-Bild erkanntwerden können als bisher.Wir haben eine neue Variante der direkten stochastischen optischen Rekonstruktions-Mikroskopie (dSTORM) mit dem Namen SD-dSTORM entwickelt 1 . SD steht für spektrale Entmischung(engl. spectral demixing). SD-dSTORM kombiniert die photochemischen Vorteilerot strahlender Carbocyanin-Farbstoffe mit dem Prinzip der spektralen Entmischung. Dabeigeht es um die neue Kombination der beiden für hohe Auflösungen geeigneten Carbocyanin-FarbstoffeAlexa Fluor 647 und Alexa Fluor 700, die einwandfreie, Puffer-kompatibleBlink-Charakteristika zeigen. Diese Eigenschaft wird insbesondere bei der Lokalisierung vonEinzelmolekülen benötigt. Für eine wirklichkeitsgetreue, hochauflösende Rekonstruktionlinearer und punktförmiger biologischer Nanostrukturen benötigt SD-dSTORM im Vergleichzu anderen hochauflösenden Mikroskopie-Technologien eine deutlich reduzierte Laser-Leistung und auch weniger Einzelaufnahmen.Unter den momentan für die Einzelmolekül-Lokalisierung verfügbaren organischen Photoschalternsind die Carbocyanin-Farbstoffe Cy5und Alexa 647 die effizientesten, da sie sehrphotostabil sind (bis zu 6.000 Photonen je AN-Zyklus) und vor allem die Fähigkeit besitzen, ineiner reduzierenden Umgebung sehr lang imAUS-Zustand zu verharren. Daher konzentriertenwir uns auf Alexa 647 und suchten einenPartnerfarbstoff, der sowohl den gleichenPuffer benötigt als auch jenen verlängertenAUS-Zustand aufweist. Schließlich wurde Alexa700 ausgewählt. In einer 100 bis 300 millimolarenβ-Mercaptoethylamin (MEA)-Lösungund bei Vorhandensein eines Fängers vonSauerstoffradikalen besitzt dieser Farbstoffbei einer Anregungswellenlänge von 643 nmden gewünschten verlängerten AUS-Zustand.Ein Zweikanal-Emissionsteiler (OptosplitII, Cairn Research) wurde verwendet, um diesich überlappenden Emissionsspektren vonAlexa 647 und 700 voneinander abzugrenzen.Die Emissionswellenlängen wurden mit Hilfeeines dichroitischen Spiegels (710 DCXR) undzwei Emissionsfiltern (HC 687/40 und ET794/160) in Kurz- und Langwellenemissionaufgespalten, wobei sie nebeneinanderauf der EMCCD-Kamera (iXon 897, Andor)registriert wurden. Der dichroitische Spiegelund die Bandpassfilter wurden sowohl andie Einzellaser linie (643 nm) als auch an dieEmissionsspektren angepasst, mit dem Zieldie für die spektrale Entmischung benötigteSignalüberlappung zu optimieren.Um die Qualität der Trennung der Spektrenvon Alexa 647 und 700 einschätzenzu können, wurden die Mikrotubuli vonBS-C-1-Zellen mit im Handel erhältlichenZweitantikörpern getrennt für jeden Farbbereicheingefärbt. Dabei wurden die Probenin dSTORM-Puffer (MEA, Sauerstoffradikalfänger)aufgenommen. Vor der eigentlichenAufnahme der Bilder wurden die Fluorophorezunächst in den AUS-Zustand versetzt. Dazuwurde die Probe mit 3 bis 5 kW/cm 2 starkemLaserlicht (Wellenlänge 643 nm) so langebeleuchtet, bis die Mikrotubuli-Strukturnicht mehr erkennbar war, dafür aber daszufällige Blinken der Farbstoffe einsetzte.Typischerweise wurden für eine Anregungswellenlänge5.000 bis 20.000 Einzelbilderaufgenommen. Die EMCCD-Kamera liefdabei durchgehend.Nach der Akquise der Bilder wurden dieOrte, an denen sich die Einzelmoleküle befandenund deren jeweilige, individuelle Intensität,über die gesamte Zweikanalansichtmit der Open Source-Software rapidSTORMAbb. 1: SD-dSTORM-Rekonstruktion vonMikrotubuli. Mikrotubuli wurdenseparat mit Alexa 647 (rot) oderaber Alexa 700 (grün) angefärbt undmittels SD-dSTORM visualisiert. DieIntensitätswerte für die Lokalisationder beiden Farbstoffe zeigen in einemzweidimensionalen IntensitätshistogrammunterschiedlicheLokalisationen. Lokalisierungen inCross-talk-Regionen sind ausgeblendet(grau).28 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


A B CNext GenerationSequencingAbb. 2: SD-dSTORM-Rekonstruktion getrennter und co-lokalisierender Strukturen.SD-dSTORM von mit Alexa 647 (rot) gefärbten Mikrotubuli und fokale Adhäsionen(A), Clathrin-überzogene Grübchen (C) und Mikrotubuli (B, für Co-Lokalisationstest),die jeweils mit Alexa 700 (grün) gefärbt wurden. Balken: 1µmbestimmt. Dabei verwendeten wir einen vonuns selbst geschriebenen Algorithmus, umein möglichst vollständiges, zweifarbigesSD-dSTORM-Bild der Probe herzustellen. InAbbildung 1 ist die Streuung der Einzelmolekül-Aufenthaltsortedargestellt, was erstdank der experimentellen optischen Auflösungdes zweifarbigen SD-dSTORM-Systemsmöglich wurde. Die Analyse zeigt, dass dieAufenthaltsorte als vollständig eigenständigePunkte erscheinen – ein Beweis für diesaubere Trennung der Farbkanäle.ErgebnisseDie Auflösungen für beide Kanäle bewegensich mit 22 nm für Alexa 647 und 30 nm fürAlexa 700 in einem Bereich, der bereits zuvorfür Alexa 647 bei der Lokalisierungsmikroskopieerreicht wurde. Die Anwendbarkeit vonSD-dSTORM in der Zellbiologie wurde durchdas Abbilden von Objekten des subzellulärenBereichs verdeutlicht. Für jene Objekteist bekannt, dass sie je nach verwendetemZweitantikörper unterschiedlich ausgeprägteFormen und räumliche Verteilungsmusterzeigen. Ausgewählt wurden sogenannte fokaleAdhäsionen (engl. örtliche Anhaftungen, focaladhesions) – große Proteinkomplexe in derPeripherie der Zelle – und Clathrin-überzogeneMembrangrübchen (clathrin-coated pits),150 nm große, vesikuläre Objekte in der Näheder Plasmamembran.Beide befinden sich an jeweils verschiedenenOrten in der Zelle und überlagerndarüber hinaus auch nicht das Mikrotubuli-Netzwerk. Daher sollten beide Strukturenals distinkte subzelluläre Objekte erscheinen.Die Zweifarben-SD-dSTORM stelltMikrotubuli und fokale Adhäsionen (Abb 2A)beziehungsweise Mikrotubuli und ClathrinüberzogeneMembrangrübchen (Abb. 2C)gut getrennt und hochaufgelöst dar. DerKontrollversuch (Abb. 2B) zeigt Mikrotubuli,die sowohl mit Alexa 647 als auch mit Alexa700 angefärbt wurden. Hier zeigt sich deutlicheine Übereinstimmung zwischen beidenKanälen und aufgrund der hohen AuflösungLABORWELTauch die heterogene Verteilung der Probenauf derselben Struktur, die mit normalerMikroskopie nicht sichtbar wäre.AusblickUnser Ansatz ist ein bedeutender Fortschritthin zu einer benutzerfreundlichenvielfarbigen Einzelmolekül-Mikroskopie. Erkombiniert die Vorteile der rot strahlendenCarbocyanin-Farbstoffe mit dem Prinzip derspektralen Entmischung, um dSTORM effizient,verlässlich und schnell durchführen zukönnen. SD-dSTORM bietet die Möglichkeit,auch auf mehr als zwei Farben ausgeweitetzu werden. Dabei kommen andere, verwandterote Farbstoffe wie Alexa 750 in Frage.Außerdem kann die Technologie mit jederkommerziell erhältlichen Lokalisierungs-Software wie QuickPALM and rapidSTORMkombiniert werden. Auch für die Echtzeitverfolgungmit Hilfe von tag-Technologienwird SD-dSTORM in Zukunft häufiger mitErfolg eingesetzt werden.Literatur[1] Multi-color direct STORM with red emitting carbocyanines,Biology of the Cell (2012), DOI: 10.1111/ boc.201100011.KorrespondenzadresseDr. Jan SchmoranzerGroup Leader in Super-Resolution Microscopyand Cell PolarityFreie Universität BerlinInstitut für Chemie und BiochemieTakustraße 614195 BerlinTel.: +49-(0)30-838-56-822Fax: +49-(0)30-838-56-908janschmoranzer@fu-berlin.dewww.sfb958.dewww.laborwelt.deYour Partner ofChoice for DNASequencing Projects454 RocheGS FLXSangerABI 3730SOLiD5500 XL· Small to large projects· Coordination & flexibilitybetween the 3 technologies· Extended customer support· Bioinformatics+41 71 722 83 33genome@microsynth.chwww.microsynth.ch


Mikroskopie Elektronentomographie‚Minimal invasive‘Methoden in der Kryo-ETJürgen M. Plitzko, Alexander Rigort, Felix J.B. Bäuerlein, Tim Laugks,Miroslava Schaffer, Max-Planck-Institut für Biochemie, MartinsriedEin Bild sagt mehr als tausend Worte – das gilt auch in den Naturwissenschaften. Seit jeher sinddabei mikroskopische Techniken ein wesentliches Hilfsmittel zur Bildgewinnung. Das Ziel ist es,ein möglichst detailgetreues Bild vom lebenden Organismus zu erstellen, um Strukturen undderen Funktionen zu untersuchen. Bis heute bleibt der Traum, die Einzelheiten bis hin zu denmolekularen Bausteinen herauszuvergrößern. Hierbei kommt der Elektronenmikroskopie einebesondere Bedeutung zu, da mit ihr – im Vergleich zu Lichtmikroskopen – Objekte abgebildetwerden können, die mehrere hundert mal kleiner sind. Mit Hilfe der hier von uns vorgestelltenPräparationsmethode, den fokussierten Ionenstrahlen (FIB, engl.: focused ion beam) kann manso dünne Proben erzeugen, dass nun auch elektronenmikroskopische Blicke ins Innere einerZelle möglich sind. So können erstmals die Vorgänge innerhalb der Zelle mit hoher Auflösungdreidimensional dargestellt und analysiert werden.Die Bildgebung mit Elektronen kann entwedermit Hilfe der Raster-Elektronenmikroskopie,(kurz REM oder SEM) oder der Transmissionselektronenmikroskopie(kurz TEM) erfolgen.Die Kehrseite der Medaille dieser hochauflösendenMethoden: Lebende Organismen undZellen können nicht direkt im Hochvakuumbei einem konstanten ‚Bombardement‘ mitElektronen untersucht werden. Spezielle Präparationsmethodensind deshalb notwendig,um die delikaten und vor allem strahlenempfindlichenStrukturen in ihrer wässrigenUmgebung zu erhalten und im Besonderenfür die TEM zugänglich zu machen. Um die nötige‚Transparenz‘ für Elektronen zu erreichen,müssen Dünnschnitte angefertigt werden,da Elektronen nur eine sehr kurze Distanz inMaterie zurücklegen können. Die Ultramikrotomieist dabei die Präparationsmethode derWahl, um mechanisch Schnitte mit Dickenvon ca. 50-500 Nanometern anzufertigen.Jedoch können diese ‚invasiven‘ Prozedurenzu massiven Strukturveränderungen der zuuntersuchenden Objekte führen und somitdie erreichbare Auflösung im TEM einschränken.Um biologische Objekte, wie beispielsweiseMakromoleküle und Molekülkomplexe, innerhalbder Zelle in ihrer natürlichen wässrigenUmgebung sichtbar zu machen und zu charakterisieren,müssen Verfahren angewendetwerden, die jegliche Strukturveränderungenausschließen. Kryo-Präparationsverfahren ermöglichenes heute, den hohen Wasseranteil(> 70 %) von Zellen und Geweben aufrechtzuerhalten.Dies gelingt durch schockartigesEinfrieren der Proben innerhalb von Millisekundenauf -190°C. Die Wassermolekülekristallisieren so nicht, und es bildet sich einglasartiges (amorphes) Eis. Dieser Vorgangder Vitrifizierung erlaubt es, wenige Mikrometerdicke biologische Präparate einzufrieren.Für größere Objekte sind Hochdruckverfahren(‚high-pressure freezing‘) notwendig, die dieEinfriertiefe nahezu verzehnfachen. LetzteresVerfahren erfordert die Anfertigung vonDünnschnitten unter Kryo-Bedingungen(d.h. < -140°C), um den vitrifizierten Zustandder Probe zu erhalten. Beim mechanischenSchneiden hochdruckgefrorener Proben tretenebenfalls irreversible Veränderungen auf,die eine Interpretation der anschließendenStrukturen in den mikroskopischen Aufnahmenerschwert.Für die Mikroskopie mit vitrifizierten biologischenPräparaten bei Temperaturen unterhalbvon -140°C wird üblicherweise der Präfix‚Kryo‘ vorangestellt, wie beispielsweise beider Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie,kurz Kryo-EM. Neben der bestmöglichenBewahrung biologischer Strukturen durch Vitrifizierunglassen sich zudem Strahlenschädenbei tieferen Temperaturen verringern.3D-Bild aus ElektronentomogrammenIn der Elektronenmikroskopie an biologischenProben spielt die Kryo-Elektronentomographie(kurz Kryo-ET) eine herausragende Rolle– denn selbst relativ dünne, durchstrahlbarePräparate haben eine räumliche Dimension,das heißt, die resultierenden TEM-Bilder sindnur zweidimensionale (2D-) Repräsentationen(Projektionen) einer dreidimensionalenProbe. Einzelheiten aus unterschiedlichenEbenen innerhalb eines Objekts werden ineinem Bild überlagert und lassen sich so ineiner einzelnen 2D-Aufnahme nicht trennen.Ähnlich wie in der medizinischen Diagnostikwerden tomographische Verfahren aufschockgefrorene Präparate angewendet,um dieses ‚Durcheinander‘, welches durchdie Überlagerung struktureller Einzelheitenensteht, zu beseitigen. Bei der ET wird dieProbe in kleinen Winkelschritten durch densenkrecht dazu einfallenden Elektronenstrahlgedreht und für jeden Kippwinkel ein 2D-Bildaufgezeichnet. Durch anschließende Rekonstruktiondieser Serie von Projektionen lässtsich ein 3D-Bild des untersuchten Objektserhalten. Nicht-‚invasive’ Untersuchungenlassen sich mit Hilfe der Kryo-ET an kleinerenA B CAbb. 1: Raster-Elektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen einer Kryo-FIB-Präparation (a) Vitrifizierte eukaryotische Zellen auf einem EM-Grid für die Elektronenmikroskopie mit regelmäßigen, löchrigem Kohle-Film (Maßstab 10 µm, Löcher der Kohlefolie 2 µm), (b) Zelle aus(a), Lamelle nach der Präparation mit dem Ionenstrahl-Mikroskop, (c) Schematische Ansicht der präparierten Zell-Lamelle aus (b)30 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


Elektronentomographie Mikroskopie– und vor allem dünneren – Objekten wie prokaryotischenZellen und isolierten Organellendirekt durchführen. Auch flache Randbereicheeukaryotischer Zellen sind direkt zugänglich,wenn diese eine Dicke von ca. 500 nm nichtüberschreiten. Um dickere Präparate, vor allemganze eukaryotische Zellen, Zellverbände odergar Gewebe untersuchen zu können bedarf esgeeigneter minimal-invasiver Präparationsverfahren,die zudem mögliche Strukturveränderungenund Artefakte vermeiden.ADünne Proben dank IonenstrahlenEine alternative Methode zum mechanischenSchneiden von größeren Objekten bietet dasIonenstrahl-Mikroskop (kurz FIB: ‚Focused IonBeam‘). Hauptsächlich wird dieses Instrumentin der Halbleiterherstellung zur Oberflächenanalyseund -bearbeitung eingesetzt.Es vereint die Vorteile eines REM und einesIonenmikroskops. Letzteres kann nicht nurzur Bildgebung, sondern auch für eine gezielteMaterialbearbeitung im Nanometerbereichverwendet werden. Schwere, große Ionen wieGallium besitzen eine höhere Wechselwirkungund schießen förmlich einzelne Probenatomeheraus. So ‚fräsen‘ sie sich (kontrolliertund schonend) Schicht für Schicht in dasProbenmaterial, bis letzlich eine elektronentransparenteLamelle übrigbleibt. Neben derVermeidung jeglicher mechanischer Interaktion,Schneidartefakten und den damitverbundenen Struktur-Veränderungen ergibtsich ein weiterer Vorteil dieser Methode:Zu jedem Zeitpunkt lässt sich dieser ‚Fräs‘-Prozess mit dem REM beobachten und damitgegebenenfalls korrigieren. Um empfindliche,eiseingebettete biologische Proben für diesesVerfahren zugänglich zu machen waren NeuundWeiterentwicklungen methodischer undinstrumenteller Art notwendig. Vor allem dierestriktiven Temperaturbedingungen – dieProbe darf nicht wärmer als -140°C werden –und die immanente Strahlenempfindlichkeitdes biologischen Probenmaterials erfordertenneue Konzepte.Ein spezieller Kühlkörper und ein eigensdafür gebauter dreh- und kippbarer Probenhalter/Tischbildeten die Grundlage, um dieersten ‚Fenster’ in das Innere von Zellen zuöffnen. Der Kühlkörper selbst ist das Produkteiner weiteren neuartigen dreidimensionalenFertigungstechnik, dem schnellen Modellbau,dem sogenannten ‚3D rapid-prototyping’(ein laserbasiertes dreidimensionales Druckverfahren).Mit herkömmlichen feinmechanischenProduktionsverfahren wäre dieserKühlkörper nicht realisierbar gewesen.Da das Ionen-‚fräsen’ oder ‚-dünnen’ direktauf einem TEM-Probenhalter (mit einerhauchdünnen löchrigen Kohlefolie belegtesMetall-Netzchen, welches auch EM-Grid genanntwird) stattfindet, ist es notwendig, denIonenstrahl unter sehr flachen EinfallwinkelnBAbb. 2: Kryo-Transmissions-elektronenmikroskopische (TEM) und -tomographische Aufnahmeneiner FIB-präparierten Zelle: (a) Übersicht über das gesamte ‚Fenster‘ im Innerender Zelle (Maßstab 1 µm) mit Zellkern und dem gesamten Zytoplasma bis hin zurZellmembran, (b) Bereich aus (a), aus dem ein Tomogramm erstellt wurde (Maßstab200 nm), (c) schematische Darstellung des Tomogramms aus (b) mit einem Teil desZellkerns (grau-braun) samt Kernporen (rot) sowie Mitochondrien (braun), Ribosomen(gold-gelb) und Mikrotubuli (orangefarbene Röhrchen)auf das Präparat auftreffen zu lassen – ohneentsprechende Kippung und Drehung desProbentisches eine nicht zu lösende Aufgabe.Zudem gewährleistet der ‚streifende Einfall’des Ionenstrahls eine minimale Strahlenbelastungfür die entstehende Lamelle im Innerender eiseingebetteten Zelle (Abb. 1). Sind dierichtigen Voraussetzungen geschaffen, istdas eigentliche Ionenstrahldünnen fast einKinderspiel. Jedoch müssen die Präparationsparameter,wie etwa die Verweilzeit desIonenstrahls, Stärke des Ionenstroms und dieGeschwindigkeit der Ionen, je nach Dicke undBeschaffenheit des Probenmaterials experimentellbestimmt und angepasst werden.Die Herstellung einer Lamelle dauert wenigerals eine Stunde. Typischerweise werden bis zu5-10 Probenbereiche pro EM-Grid so erschlossen.Die fertigen Präparate können anschließendins Kryo-EM transportiert und mit Hilfeder ET untersucht werden. Dieser ‚Transport‘ist ein weiterer kritischer Schritt, weil er unterKryo-Bedingungen erfolgen muss.FazitMit Hilfe dieser neuen Methode ist es nunmöglich, gezielt und vor allem reproduzierbar‚Fenster‘ ins Innere von Zellen zu öffnen. InKombination mit der Kryo-Elektronentomographielassen sich nun Vorgänge innerhalbder Zelle mit hoher Auflösung dreidimensionaldarstellen und analysieren (Abb. 2). Diesedetaillierten Einblicke in bisher unzugänglichemolekularen Landschaften im Zellinnereneröffnen neue Ansätze für die Forschung underweitern unser Verständnis der fundamentalenProzesse des Lebens.KorrespondenzadresseDr. Jürgen M. Plitzko, Projektleiter TEMAbteilung Molekulare StrukturbiologieMax-PIanck-Institut für BiochemieAm Klopferspitz 18, D-82152 MartinsriedCLABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 | 31


Mikroskopie SIMHochaufgelöste in vivo3D-Zeitserien mittels SIMDr. Reto Fiolka, Howard Hughes Medical Institute,Janelia Farm Research Campus, Ashburn, USADie Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (engl. structured illumination microscopy,SIM) kann die räumliche Auflösung eines Mikroskops verdoppeln. Die Methode ist sehr lichteffizient,aber bisherige Umsetzungen dieser Technik waren zu langsam, um Zellen live in 3Dbeobachten zu können. Dank neuer elektro-optischer Modulatoren und schneller Kamerasist es nun Forschern um Mats Gustafsson gelungen, 3D-Zeitserien von lebendigen Zellen inverschiedenen Farben mit verdoppelter Auflösung aufzunehmen.Die Fluoreszenzmikroskopie ist ein unersetzlichesInstrument in der Biologie undden Lebenswissenschaften, da sie minimalinvasive,dreidimensionale Abbildungenvon lebendigen Zellen in ihrer natürlichenUmgebung ermöglicht. Die Einführung vonFluoreszenz-Markern, allen voran GFP, führtezu molekularer Spezifität und ermöglichtesomit das „Einfärben“ von verschiedenenOrganellen und anderen Zellstrukturen mitextrem hohem Kontrast.Unglücklicherweise ist das räumliche Auflösungsvermögenvon optischen Mikroskopenstark eingeschränkt. Ernst Abbe bewies 1873,dass zwei Punkte, die näher als λ/(2 NA) nebeneinanderliegen, nicht mehr unterscheidbarsind. Lambda ist dabei die Wellenlänge desLichtes und NA die Numerische Apertur desObjektivs.Abbes Diktum umgangenAllerdings hat Abbe nicht die Fluoreszenzmikroskopieberücksichtigt, sondern nur dieTransmissions- oder Reflexionsmikroskopie.Fluoreszenz-Emissionen sind proportionalzur Intensität des Anregungslichts. Regt maneine Probe mit „Flutlicht“ uniform an, dannresultiert in der Tat eine begrenzte Auflösunggemäß Abbe. Allerdings kann man dasAnregungslicht auch formen und ihm eineStruktur geben. Konfokale Mikroskopie ist eingutes Beispiel dafür: Die Anregungsstrukturist ein fokussierter Laserstrahl. Zusammenmit einer Lochblende (engl. pinhole) ergibtsich schließlich eine höhere dreidimensionaleAuflösung. Um die Jahrtausendwende demonstrierteMats Gustafsson auf beeindruckendeWeise, dass eine sinusoidale, stehendeWelle als Anregungsstruktur noch höhereAuflösungen ermöglicht – die strukturierteBeleuchtung (engl. structured illumination)war geboren. Beim Einsatz der Mikroskopiemit strukturierter Beleuchtung (SIM) wirddie Probe mit einem sehr feinen sinusoidalenStreifenmuster angeregt und dabei ein Bildaus der resultierenden Fluoreszenz-Emissionaufgebaut. Die Streifen kodieren dabei räumlicheInformationen der Probenstruktur, diemit normaler Mikroskopie nicht auflösbarsind. Mit geeigneten Streifenmustern lässtsich die Auflösung eines Mikroskopes in allendrei Dimensionen um den Faktor 2 erhöhen 1 .Dies resultiert in einer Auflösung von lateral(in x,y-Richtung) 110 nm, axial (in z-Richtung)360 nm für grüne Emissionen 2 . Der Preis fürdie erhöhte Auflösung ist allerdings, dass fürdie dreidimensionale, strukturierte Beleuchtungpro Fokusebene 15 Bilder mit unterschiedlichenPostionen des Streifenmustersaufgenommen werden müssen.rotierende BlendeObjektebeneSIM – die VorteileSpiegelmultimodaler LeiterdichromatischerSpiegelSpiegelLC-Zellefeste BlendedichromatischerSpiegelSpiegelEmissionsfilterZeiss-MikroskopAbb 1: Experimenteller Aufbau für 3D-live-SIM. Laserlicht wird in einem multimodalen Leiter„gescrambelt“ und mit einer Linse kollimiert. Der Laserstrahl scheint auf das SLM-Display, auf welchem ein Streifenmuster dargestellt wird. Das Licht wird durch Beugungin mehrere Ordnungen reflektiert. Die Beugungsordnungen 0, 1 und -1 werdenaufgefangen. Eine LC-Zelle wird eingesetzt, um die Polarisation der Laserstrahlen zukontrollieren. Die drei Laserstrahlen werden in die Aperturebene eines Objektivs fokussiertund interferieren in der Objektebene. Die Fluoreszenz-Emission wird mit einemdichromatischen Spiegel gefiltert und auf einer Kamera abgebildet. Abkürzungen: AOD– Akustooptischer Deflektor, SLM – räumlicher Licht-Modulator (Spatial Light Modulator),LC-Zelle – Flüssigkristallzelle, QWP – lambda-viertel-Platte (Quarter Wave Plate),HWP – lambda-halbe-Platte (Half Wave Plate), PBS – Polarisationssplitter (PolarizingBeam Splitter), SCOMS – wissenschaftliche (scientific) CMOS-KameraSpiegelDies war auch lange Zeit ein Grund, dass strukturierteBeleuchtung nur für fixierte Zelleneingesetzt wurde, für das „Live imaging“ warendie experimentellen Mikroskope schlicht zulangsam. Allerdings blieb das Interesse groß,strukturierte Beleuchtung auch für lebendigeZellen einzusetzen. Im Vergleich zu anderensuperauflösenden Techniken bietet sie nämlicheinige Vorteile:I Sie ist sehr effizient in der Beleuchtung undbei der Detektion von Fluoreszenz und kanndaher auch bei einer sehr geringen Laserleistungzum Einsatz kommen. Das ist insofernwichtig, als dass die Zellen so in ihrer Funktionnicht beeinträchtigt werden.I Es werden keine speziellen Fluorophorebenötigt. Alle Fluorophore, die in normalerWeitfeld- oder Konfokalmikroskopie funktionieren,sind auch für die strukturierteBeleuchtung geeignet.I Im Gegensatz zur konfokalen Mikroskopie,bei welcher ein Laserpunkt durch die Probegeleitet wird, werden bei der strukturiertenBeleuchtung viele Probenpunkte parallelgescannt. Auch die Detektion erfolgt parallelisiert.Mit den neuen SCMOS-Kameras(komplementärer Metalloxid-Halbleiter,engl. scientific complementary metal oxide32 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


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Mikroskopie SIMsemiconductor) mit 5 Megapixeln könnenmittels strukturierter Beleuchtung extremgroße Bildfelder in hoher Bildfolge aufgenommenwerden.ABAufbau des ExperimentsUm strukturierte Beleuchtung für das liveimaging einsetzen zu können, haben wir einMikroskop mit extrem schnellen, elektrooptischenWandlern und einer schnellenSCMOS-Kamera entwickelt (Abb. 1) 2 . Dabeiwerden auf einem Display, ähnlich denen ineinem Fernseher oder Projektor (nur etwasschneller), die Streifenmuster in schnellerFolge abgespielt und mittels verschiedenerLaserquellen in die Objektebene des Mikroskopesprojiziert. Die Umschaltzeit beträgthierbei weniger als eine Millisekunde. Somitist es nun möglich, ein Volumen von 100 x 100x 1 Mikrometer in weniger als einer Sekundeaufzunehmen. Um einen zweifarbigen Datensatzaufzunehmen, muss dieser Vorgangwiederholt werden, da für unterschiedlicheAnregungswellenlängen unterschiedlicheStreifenmuster auf dem Display abgespieltwerden müssen. Eine Mehrfarben-Aufnahmeist daher immer seriell.In Abbildung 2 ist eine dreidimensionaleProjektion maximaler Intensität (engl. maximumintensity projection) eines Datensatzeseiner HeLa-Zelle abgebildet. Dabei wurde dasAktin-Skelett mit dem Fluoreszenz-MarkertdTomato rot und die Clathrin-überzogenenVesikel (engl. Clathrin-coated vesicles, CCV)mit mEmerald grün eingefärbt. Abbildung3 zeigt eine Zeitserie von einer HeLa-Zelle.Hier wurde abermals das Aktin-Zellskelettmit TdTomato eingefärbt und darüber hinausdie Mitochondrien mit MitoTracker Green. Essind wieder dreidimensionale Projektionender Datensätze dargestellt. Mit der erhöhtenAuflösung von 3D-SIM lassen sich interneA B CAbb 2: Aktin-Zellskelett (rot) und mit Clathrin überzogene Vesikel (CCV, grün) in einer HeLa-Zelle, abgebildet mit klassischer Weitfeldmikroskopie (a) und Mikroskopie mit strukturierterBeleuchtung (b). Farbstoffe: Lifeact-tdTomato zur Visualisierung von F-Aktin,Clathrin-mEmerald zur Visualisierung von CCV. Maßstabsleiste: 5 Mikrometer.Strukturen der Mitochondrien „live“ verfolgen.Diese Strukturen sind zum Beispiel innereMembranen, die sogenannten „Christae“.Normalerweise sind Christae nur unter demElektronenmikroskop zu sehen, allerdings istdies dann alles andere als „live“.Momentan können solche dreidimensionalenAbbildungen von ganzen, lebendigenZellen nur mit strukturierter Beleuchtung inhoher Auflösung live aufgenommen werden.Andere Techniken mögen zwar noch höhereAuflösungen erreichen, sind aber entwederdeutlich langsamer oder nicht in der Lage,solch große Bildfelder abzudecken wie diehier vorgestellte Methode 3,4 . Durch die geringeLaserstrahlung bei strukturierter Beleuchtungwerden die Zellen auch insgesamtweniger in ihrer Funktion beeinträchtigt.Außerdem werden die Farbstoffe langsamerausgeblichen. Dadurch kann die Zelle übersehr lange Zeit beobachtet werden, andereTechniken bleichen die Zellen hingegen bisDEzu zehnmal schneller aus. So konnten beispielsweisebis zu 100 aufeinander folgendeAufnahmen einer lebenden Zelle gemachtwerden, wobei eine Aufnahme aus 360 bis720 Einzelbildern besteht.FazitDie Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtungstellt damit einen guten Kompromisszwischen räumlicher und zeitlicher Auflösungdar. Biokompatibilität, eine hohe Aufnahmerate,ein großes Bildfeld und minimaleLaserbestrahlung – alles Qualitäten, die benötigtwerden, um Zellen live zu beobachten.Wir glauben daher, dass SIM eine wichtigeRolle in der Biologie spielen wird und dabeihelfen kann, wichtige Fragestellungen zubeantworten.Literatur[1] Gustafsson M.G.L., et al, Three-Dimensional ResolutionDoubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy byStructured Illumination, Biophysical Journal, Volume 94,Issue 12, pp 4957-4970, 2008[2] Fiolka R., Time-lapse two-color 3D imaging of live cellswith doubled resolution using structured illuminationPNAS 109 (14) pp 5311-5315, 2012[3] Jones SA, et al, Fast, three-dimensional super-resolutionimaging of live cells. Nat Methods 8:499–508, 2011[4] Westphal V, et al, Video-rate far-fi eld optical nanoscopydissects synaptic vesicle movement. Science 320 pp246–249, 2008KorrespondenzadresseAbb 3: Aktin-Skelett (rot) und Mitochondrien (grün) in einer HeLa-Zelle abgebildet mit strukturierterMikroskopie (a). Zeitserie (b – e) des mit dem weißen Quadrat umrahmtenAuschnittes in (a). Farbstoffe: Lifeact-tdTomato zur Visualisierung von F-Aktin und MitoTrackerGreen zur Visualisierung von Mitochondrien. Maßstabsleiste: 5 Mikrometer.Dr. rer. nat. Reto FiolkaHoward Hughes Medical InstituteJanelia Farm Research Campus19700 Helix Drive20147 Ashburn, Virginia, USATel.: +1-(0)571-209-4000-3027fiolkar@janelia.hhmi.org34 | 13. Jahrgang | Nr. 2/2012 LABORWELT


Expertenpanel MikroskopieZellvorgänge steuernmittels OptogenetikProf. Dr. Thomas G. Oertner, Dr. Rolf T. BorlinghausDie Optogenetik ermöglicht das schnelle und gezielte Steuern von biologischen Vorgängen.Dabei kann es sich bei dem Untersuchungsgegenstand um Zellen in Kultur oder gar um sichfrei bewegende Tiere handeln. Das An- und Ausschalten dieser Vorgänge mit Hilfe von durchLicht steuerbaren Proteinen hat das Feld der nicht-invasiven Funktionsanalyse revolutioniert.Besonders große Fortschritte wurden bei der Kontrolle von Neuronen erzielt, so zum Beispielmit Channelrhodopsin (ChR), Bakteriorhodopsin oder Halorhodopsin. Aber auch über die Neurowissenschaftenhinaus gewinnt die Optogenetik an Bedeutung. Mittlerweile gibt es optogenetischeWerkzeuge unter anderem für Gliazellen, Muskelzellen oder embryonale Stammzellen. Inunserem Expertenpanel wird diskutiert, welche Möglichkeiten die immer größer werdende Zahlverschiedener optogenetischer Werkzeuge für die Planung von Experimenten bietet. Außerdemwerden die aktuellen Entwicklungen im Bereich der Optogenetik-Mikroskopie vorgestellt.Thomas OertnerDirektor desInstituts für SynaptischePhysiologie(ISP) am Zentrumfür MolekulareNeurobiologieHamburg (ZMNH)LABORWELTWelche Möglichkeiten und Vorteile bietenzwei oder gar mehrere gekoppelte lichtaktivierbareMembranproteine?OertnerUm den Einfluss einer bestimmten Populationvon Nervenzellen auf das neuronale Netzwerkzu verstehen, ist es oft notwendig, die Aktivitätdieser Neurone in positiver (d.h. Aktivierung) alsauch in negativer Richtung (d.h. Hemmung) zubeeinflussen. Man möchte in ein- und derselbenPopulation Aktionspotentiale künstlich auslösenund spontane Aktionspotentiale unterbindenkönnen. Da uns mittlerweile sowohl de- als auchhyperpolarisierende optogenetische Wandlerzur Verfügung stehen, kommt es nun daraufan, mehrere lichtgesteuerte Ionenkanäle oderPumpen gemeinsam zu exprimieren.Eine deutliche Verbesserung gegenüberder bekannten IRES-Strategie (interne ribosomaleEintrittsstelle, engl. internal ribosomalentry site) brachte die Entdeckung viraler selfcleavingSequenzen, die es erlauben, von einermRNA zwei getrennte Proteine zu produzieren.Die vielleicht sicherste Methode ist die direkteKopplung zweier optogenetischer Wandlerüber einen flexiblen Linker, der eine Transmembrandomäneenthält. In der Praxis muss esmöglich sein, den de- und hyperpolarisiendenWandler eines solchen Tandemkonstruktsselektiv zu aktivieren, d.h. die Aktivierungs-spektren sollten möglichst wenig überlappen.Außerdem müssen die Photoströme ausreichendgroß sein, um endogene (synaptische)Ströme komplett dominieren zu können.Neben der Netzwerkanalyse haben Tandemkonstruktenoch ein zweites Anwendungsgebiet:Bei der Entwicklung verbesserter optogenetischerWerkzeuge ist es oft erforderlich, dieneuen Konstrukte mit gut charakterisierten„Standards“ zu vergleichen. Tandemkonstrukteermöglichen stöchiometrische Expression underlauben dadurch einen direkten Vergleich derPerformance, der nicht durch Unterschiede imExpressionsniveau verfälscht werden kann.Eine interessante Entwicklungsrichtung für dieZukunft wäre die Kombination von Wandlernund Sensoren, wie zum Beispiel einem GFPbasiertenKalziumreporter. Die rasante Entwicklungmultispektraler, LED-basierter Lichtquellenwird komplexe optogenetische Experimente fürviele Labore noch attraktiver machen.Rolf BorlinghausScientific Advisorbei Leica Microsystems,MannheimLABORWELTWelche Beleuchtungs- und Aufnahmetechnologienwerden die Optogenetik in dennächsten Jahren voranbringen?BorlinghausUm lichtgesteuerte Proteine zu aktivieren,bedarf es Licht von passender Farbe. Wie invielen anderen Bereichen, ist eine deutlicheOptogenetik: Blaues Licht regt den IonenkanalChR2 an und aktiviert Nervenzellen.Verbreiterung der Farbpalette bei den in derOptogenetik eingesetzten Proteinen zu erwarten.Darum wird das gesamte sichtbareSpektrum zwischen 400nm und 800 nm zubedienen sein. Für Weitfeld-Geräte, also „gewöhnliche“Mikroskope und Stereomikroskopesind zur Zeit Lichtemissionsdioden (LEDs) imTrend. Diese Quellen sind kompakt und intensiv.LEDs haben gegenüber klassischen Lichtquellenviele Vorteile, z.B. einfache Kollimation,schnelle Schaltzeiten, vergleichsweise geringeAbwärme und eine lange Lebenszeit. Hier wirdin den nächsten Jahren sicher noch einiges anEntwicklungspotential ausgeschöpft werden.Die Alternative zum Weitfeld sind Raster-Geräte. Insbesondere bekannt durch die konfokaleMikroskopie, wo zu einer Zeit immernur ein Punkt beleuchtet wird, der möglichstklein (beugungsbegrenzt) sein soll. Für solcheAnwendungen sind Laser nach wie vor die bestenQuellen, da sie die höchste Leuchtdichtebieten und perfekt fokussierbar sind. Die Verbindunghochenergetischer Infrarot-Pulslasermit einem Substrat zur Erzeugung eines sehrbreiten Spektrums, etwa einer Faser mit einemMatrix-Kern (photonic crystal fiber), haben inder jüngsten Zeit den Traum einer weißenQuelle mit Lasereigenschaften Wirklichkeitwerden lassen (WLL: white light laser). SolcheSysteme können in Zusammenarbeit mitakustooptisch abstimmbaren Filtern (AOTF)jede beliebige Farbe des sichtbaren Spektrumserzeugen, wobei gleichzeitig mehrere Spektralfarbenausgewählt werden können – unddie Auswahl in ein paar Mikrosekunden umgeschaltetwerden kann. Das kann insbesonderefür schnell synchronisierte Belichtungsmustervon unterschiedlichen lichtgesteuerten Proteinensehr interessant werden.Für Experimente mit lebenden Säugetierenwerden Mikroskope eingesetzt, die über einenstabilen Tisch verfügen, auf dem die Tiere gutmontiert werden können. Die Fokussierungmuß dann über das Objektiv erfolgen, da dasUntersuchungsobjekt oft mit allerlei Mikroelektrodenverdrahtet ist, und dann nicht mehrbewegt werden kann. Hier sind vielfältigeNeuerungen, sowohl in der optischen Fokussierungals auch bei Halterung und Versorgungdes Objektes zu erwarten. Hinzu kommt dervermehrte Einsatz von Lichtleitern in Hirn- undGewebesonden, die üblicherweise mit Lasernoder LEDs gespeist werden.© MIT McGovern InstituteLABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 | 35


Mikroskopie PaperweltScharfer Blick ins Gehirnlebender MäuseBerning S, Willig KI, Steffens H, Dibaj P, Hell SW. (2012): Nanoscopy in a LivingMouse Brain. Science, Vol. 335 no. 6068 p. 551, doi: 10.1126/science.1215369Zum ersten Mal kann man Prozesse am lebenden Gehirn mit einer Auflösung von weniger als 70Nanometern beobachten. Dabei war der Sprung von den Hirnschnitten zum Cortex laut StefanHell technisch gesehen gar nicht einmal so dramatisch. Der Wert der hier vorgestellten Publikationsei viel mehr, dass eine psychologische Barriere durchbrochen worden ist. LABORWELT sprachmit Hell aber auch über die Grenzen der STED (stimulated emission depletion)-Mikroskopie.LABORWELT:Was zeichnet die STED-Mikroskopie aus?Hell:Mit dem STED-Mikroskop kommt man über dieBeugungsgrenze des Lichts hinaus und kann sodetaillierterer mikroskopieren. Über mehr als1.000 Jahre war die Auflösungsgrenze bei einemLichtmikroskop und dadurch inhärent auch beieinem Fluoreszenzmikroskop fundamentalbegrenzt auf etwa 200 nm. Zwar gab es vieleIdeen, diese Grenze zu durchbrechen, aber beieinem fokussierenden Mikroskop ist man in derPraxis letztendlich nicht über 200 bis 150 nmhinausgekommen. Die STED-Mikroskopie wardas erste Verfahren, das – in Konzept und Praxis– gezeigt hat, dass man deutlich über die Beugungsgrenzehinauskommt und Auflösungenauf Molekülgröße erreicht. Sie hat im Gegensatzzu anderen Konzepten das Fluoreszenzmolekülins Zentrum der Aufmerksamkeit gerückt. Anfangder 90er Jahre herrschte die Vorstellung,dass man die Beugungsgrenze erhöhen könne,wenn man das Licht selbst in seiner Ausbreitungeinschränkt, indem man es durch einewinzige Spitze einer gezogenen Faser zwängt.Diese Nahfeldmikroskope funktionieren in denMaterialwissenschaften an Probenoberflächenziemlich gut. Innerhalb eines transparenten Materialswie der Zelle ist sie hingegen kaum realisierbar– schon gar nicht in einer lebenden Zelleoder in 3D. Bei der STED-Mikroskopie bleiben dieLichtwellen, was sie sind. Die Unterscheidungeng benachbarter Strukturen erfolgt über dieFluorophore. Im Falle zweier Mikrotubuli sorgtman beispielsweise dafür, dass die eine Strukturnicht leuchtet, wenn die andere leuchtet – undumgekehrt. So können die beiden Strukturenvoneinander unterschieden werden.LABORWELT:Was war Stand der Technik vor der Entwicklungder in vivo-STED-Mikroskopie?Hell:Auch am lebenden Gehirn betrug die höchsteerreichte Auflösung 300 nm. Dieser Wert wurdemit der 2-Photonen-Mikroskopie erreicht.LABORWELT:Wie schwierig war der Schritt vom Gehirnschnittzur lebenden Maus?Hell:Das wohl Schwierigste war, den Mut zu haben,das zu machen. Technisch gesehen istder Schritt gar nicht so groß. Die Maus mussgut anästhetisiert sein. Wir haben Herzschlag,Atmung und Blutfluss kontrolliert und ganzallgemein für ein stabiles System gesorgt. Allesin allem wurden dafür ganze vier Wocheninvestiert. Allerdings war die Methode beiuns schon an lebenden Gehirnschnitten etabliert.Bei Kollegen ohne das entsprechendeVorwissen war hingegen eine gewisse Skepsisverbreitet.LABORWELT:Was haben Sie im Maus-Cortex beobachtet?Hell:Es finden kleine morphologische Veränderungenim Gehirn der erwachsenen Mausstatt. Die kleinen Fortsätze der Dendriten,die sogenannten Dornen, bewegen sich. Umauszuschließen, dass diese Bewegung nichtaufgrund eines sich ändernden Fokus zustandekommt, haben wir die Bilder in verschiedenenEbenen aufgenommen und miteinanderabgeglichen. Über die Art der Bewegung, dieFrequenz und den Grund wissen wir allerdingsnoch gar nichts.LABORWELT:Wie könnte man die Technik noch verbessern?Hell:Der Einfachheit halber haben wir uns zunächstfür ein sich frei im Zellplasma bewegendesFluoro phor entschieden. Das Proteinist abundant und man kann so die Zellplasmagrenzengut erkennen. Momentan arbeitenwir mit angehefteten Fluorophoren, um auchnur an bestimmten Stellen vorhandene Proteinedarzustellen. Das Potential ist immens.Stefan HellStefan W. Hell studierte ab 1981 Physik ander Universität Heidelberg und promoviertedort 1990. Danach ging er an dasHeidelberger European Molecular BiologyLaboratory. Von 1993 bis 1996 forschte erin Turku und Oxford. Seit der Habilitationin Physik 1996 in Heidelberg leitet er eineselbständige Nachwuchsgruppe am GöttingerMPI für biophysikalische Chemie,seit 2003 ist er Direktor am Institut. Hellerhielt etliche Preise, so etwa den Carl-Zeiss-Forschungspreis, den Berthold-Leibinger-Innovationspreis,den Helmholtzundden Karl-Heinz-Beckurts-Preis.Demnächst wird so die Proteinverteilung inden Dornen auf der Nanometerebene beobachtetwerden können.Die STED-Mikroskopie hat aber auchGrenzen, die von den Eigenschaften desFluorophors abhängig sind. Dabei ist entscheidend,wie gut sich der Farbstoff an- undausschalten lässt. Für STED gilt: Wenn ich dasSTED-Licht anmache, geht das Fluorophorautomatisch sofort aus. Die sogenannte abregungsstimulierteEmission ist ein Prozess,der unter einer Femtosekunde abläuft. Etwasanders läuft das bei einer Weiterentwicklungunseres Labors, der RESOLFT-Mikroskopie(engl. reversible saturable optical (flurorescence)transitions), ab. Ein durch zwei, dreiMutationen schaltbar gemachtes Fluorophorkann durch photoinduzierte Isomerisierungständig reversibel in einen leuchtenden undwieder zurück in einen nicht leuchtendenZustand geschalten werden. Diese Prozesseverlaufen langsamer und benötigen dahereine geringere Lichtleistung. Für die Beobachtungder Dornen ist das zwar nicht nötig,wenn man aber eine noch höhere Auflösungmöchte, dann wird die RESOLFT-Mikroskopieinteressant.36 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


Seite bitte abtrennen – per Fax an 030-264921-11Verbände ServiceKontakt zu VerbändenDie Mitglieder der nachfolgenden Fachgesellschaften erhalten LABORWELT regelmäßig mitfreundlicher Empfehlung ihrer Organisationen. Wer sich darüber hinaus für eine Mitarbeit odereinen Beitritt interessiert, erreicht die Fachgesellschaften unter den folgenden Kontakt daten:Ich interessiere mich fürden BeitrittUnterstützung für JungwissenschaftlerInteressenvertretungeine SpendeFachgruppen im BereichNameTel.Bitte kontaktieren Sie michFirmaFaxVerband (siehe unten, bitte ankreuzen)E-MailDt. Ver. Gesell. f. Klinische Chemieund Laboratoriumsmedizin e.V. (DGKL)Geschäftsstelle der DGKLFriesdorfer Str. 15353175 BonnTel.: +49-(0)-228-92-68-9522Fax: +49-(0)-228-92-68-9527geschaeftsstelle@dgkl.dewww.dgkl.deGesellschaft für GenetikGESELLSCHAFT FÜR GENETIKc/o HZM – DeutschesForschungszentrum fürGesundheit/Inst. of DevelopmentalGeneticsTel.: +49-(0)-89-3187-2610Fax: +49-(0)-89-4620www.gfgenetik.deNetzwerk NutrigenomikNetzwerk NutrigenomikArthur-Scheunert-Allee 11414558 NuthetalTel.: +49-(0)-33200-88-301Fax: +49-(0)-33200-88-541mail@nutrigenomik.dewww.nutrigenomik.deDeutsche Gesellschaft fürProteomforschungBIO Deutschlandc/o MPI für BiochemieAm Klopferspitz 18a82152 MartinsriedTel.: +49-(0)-89-1897-9007Fax: +49-(0)-89-1897-9009c.kleinhammer@dgpf.orgwww.dgpf.orgTegeler Weg 33/berlinbiotechpark10589 BerlinTel.: +49-(0)-30-3450593-30Fax: +49-(0)-30-3450593-59info@biodeutschland.orgwww.biodeutschland.orgDeutsche Gesellschaft für Hygieneund Mikrobiologie (DGHM)c/o Institut für Hygiene undMed. MikrobiologieCarl-Neuberg-Straße 130625 HannoverTel.: +49-(0)-511-532-4655Fax: +49-(0)-511-532-4355www.dghm.orgGesellschaft für Signaltransduktionc/o Prof. Dr. Ralf HassMed. Hochschule HannoverAG Biochemie u. Tumorbiol.30625 HannoverTel.: +49-(0)-511-532-6070Fax: +49-(0)-511-532-6071www.sigtrans.deGesellschaft für Pharmakologieund ToxikologieGeschäftsstelle der DGPTAchenbachstraße 4340237 DüsseldorfTel.: +49-(0)-211-600-692-77Fax: +49-(0)-211-600-692-78mitglieder@dgpt-online.dewww.dgpt-online.deNationales Genomforschungsnetzc/o DKFZIm Neuenheimer Feld 58069120 HeidelbergTel.: +49-(0)-6221-424-743Fax: +49-(0)-6221-423-454S.Argo@dkfz-heidelberg.dewww.ngfn.deDiagnostikNet-BBNetzwerk DiagnostikBerlin-Brandenburg e.V.Neundorfstraße 1716761 HenningsdorfTel.: +49-(0)-3302-55-199-14Fax: +49-(0)-3302-55-199-10f.adams@diagnostiknet-bb.dewww.diagnostiknet-bb.deVerband der Diagnostica-Industrie e.V.Verband derDiagnostica-Industrie e.V.Neustädtische Kirchstr. 810117 BerlinTel.: +49-(0)-30-200-599-40Fax: +49-(0)-30-200-599-49vdgh@vdgh.dewww.vdgh.deÖsterreichischeReinraumgesellschaft (ÖRRG)ÖRRGNeudorf 41A-8262 IlzTel.: +43-(0)-3385-8117Fax: +43-(0)-3385-8117offi ce@oerrg.atwww.oerrg.atbts (Biotechnologische Studenteninitiativee.V.)c/o BIOCOMLützowstraße 33–3610785 BerlinTel.: +49-(0)-30-2649-21-21Fax: +49-(0)-30-2649-21-11www.bts-ev.deDeutsche Gesellschaft fürNeurogenetikInstitut für HumangenetikCalwer Straße 772076 TübingenTel.: +49-(0)-7071-2977692Fax: +49-(0)-7071-295171peter.bauer@med.uni-tuebingen.dewww.hih-tuebingen.de/dgng/Österreichische Ges. f. Laboratoriumsmedizin& Klinische ChemieÖGLMKC GeschäftsstelleInfomedica-KEG, Xenius BehalTullnertalgasse 72A-1230 WienTel./Fax: +43-(0)-1889-6238offi ce@oeglmkc.atwww.oeglmkc.atLABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 | 37


Branche Labormarkt im UmbruchDanaher, der unbekannteRiese aus dem MarkenzooDr. Patrick Dieckhoff, BIOCOM AGMilliardenschwere Übernahmen sind gang und gäbe im Labormarkt. Grund genug, in dieserLABORWELT-Serie einen Blick auf die Player, ihre Strategien und Deals zu werfen. Klar ist:Elefantenhochzeiten bleiben an der Tagesordnung. Die Preise bleiben hoch, genauso wie dieWahrscheinlichkeit, dass sich der Labormarkt in zehn Jahren völlig anders darstellen wirdals heute. Der US-amerikanische Technologie-Spezialist Danaher hat bereits mehr als 400Übernahmen abgewickelt. Vor fünf Jahren kaufte sich der Konzern in die Life Sciences ein.Bisheriger Höhepunkt: die Übernahme von Beckman Coulter. Wenn es nach CEO Larry Culpgeht, war das jedoch nicht der letzte Streich.Danaher in Zahlen:Umsatz: 16 Mrd. US-$Gewinn (EBITDA): 1,9 Mrd. US-$Operative Marge: 16,6%Börsenwert (gesamt): 37 Mrd. US-$Mitarbeiter: 59.000CEO:Larry CulpUmsätze Life Sciences nach Regionenl Europa: 37%l Asien/Australien: 27%l USA: 31%l andere: 5%Sparten nach Umsatz:l Test & Measurement: 21%l Environment: 18%l Life Sciences & Diagnostics: 29%l Dental: 13%l Industrial Technologies: 19%Was haben Leica, AB Sciex und BeckmanCoulter gemeinsam? Sie alle gehören zumDanaher-Konzern, der hierzulande kaum bekanntist. Dabei machen die US-Amerikanerpro Jahr einen Umsatz von mehr als 16 Mrd.US-$ und sind mit rund 35 Mrd. US-$ an derBörse bewertet – ein Riese also, der Branchengrößenwie Thermo (Umsatz: 12 Mrd.US-$, Marktkapitalisierung 20 Mrd. US-$) oderLife Technologies (3,7 Mrd. US-$/8 Mrd. US-$) locker übertrumpft. In Internetforen wirdDanaher schon als nächste General Electricgehandelt.Life Sciences für den MischkonzernGenauso wie der US-Technologiekonzern istDanaher ein echter Gemischtwarenladen.Zum Konzern gehören mehr als 400 Markenund Unternehmen. Darunter befinden sichvor allem in den USA bekannte Werkzeugherstellerwie Armstrong oder Craftsmen oderauch Fluke, ein Marktführer im Bereich derKalibrierungssysteme in der Elektronik.Der Einstieg in die Life Sciences glücktedem Unternehmen in Washington mit demKauf der deutschen Leica Microsystems. ImJahr 2005 ließen sich die Amerikaner denOptik-Spezialisten in Wetzlar 440 Mio. Eurokosten. Es folgte der Einstieg in die Massenspektrometriemit der Übernahme von ABSciex für 1,1 Mrd. US-$ im Jahr 2009 sowie derKauf des Instrumentations- und ReagenzienspezialistenMolecular Devices.Im vergangenen Jahr krönte Danaher seineLife Sciences-Aktivitäten und ging mit einemGebot über 5,8 Mrd. US-$ als Sieger aus derÜbernahmeschlacht um Beckman Coulterhervor. Seitdem stehen Life Sciences undDiagnostik vor Messtechnik, Umwelt, Industrietechnologieund Dentalapplikationen miteinem Spartenumsatz von 6,4 Mrd. US-$ ganzoben im Konzern. Danaher setzt auf direktenVertrieb. Nur zu einem geringen Teil erfolgtder Verkauf über Distributoren. Auch dieHerstellung wird global auf vier Kontinentenunternommen – Europa, Asien, USA und Australien.Allein in Deutschland sind rund 8.000Angestellte beschäftigt. Immer lässt der Konzernstatt seinem eigenen den Markennamenden Vortritt. So sind Leica Microsystems, ABSciex, Molecular Devices und Beckman Coulterauch heute noch ein Begriff in vielen Laboren.Mit einem Umsatz von etwa 950 Mio.US-$ ist die akademische Forschung noch vorPharmakunden (500 Mio. US-$) und Kliniken(180 Mio. Euro) der wichtigste Absatzmarktfür Danahers Forschungsprodukte. Diesebestehen hauptsächlich aus Instrumenten(80%) und weniger Verbrauchsmaterialienund Services (20%). In der Diagnostik ist dasBild genau andersherum: zu 75% werdenVerbauchsmaterialien und nur zu 25% Instrumenteverkauft.Restrukturierung steht anSeit 22 Jahren bei Danaher und heute laut Washington Post mit 21,6 Mio. US-$ im Jahr einerder bestbezahlten CEOs der börsennotierten US-Unternehmen: Larry Culp (49) Doch auch ein Riese bleibt nicht von schlechtenNachrichten verschont. So musste CEOLarry Culp bei der Präsentation der Quartalszahlenim Juli die Jahresprognose kassierenund Restrukturierungsmaßnahmen ankündigen.Zwar verdoppelten sich die Umsätzeim Life Sciences-Bereich dank des Kaufs vonBeckman. Konzernweit sank der Gewinn jedochim zweiten Quartal um knapp 50 Mio.Euro. Ein Alarmzeichen für das Management.So sei der US-Markt zwar stark. Mit einemViertel der Umsätze ist Danaher aber auchvon der wirtschaftlichen Situation in Europaabhängig. „Essentially flat“ beschreibt derKonzern die Nachfrage in diesen Märkten.Und so kommt es wie es kommen muss: DasManagement setzt das Wörtchen Sparenganz oben auf die Agenda. Gleichzeitig,auch das ist nicht überraschend, werdenÜbernahmen angepeilt. Budget dafür in denkommenden zwei Jahren: 5 Mrd. US-$.38 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


Produktwelt ServiceReichelt ChemietechnikHalbzeuge aus Elastomeroder KunststoffMit dem Handbuch THOMAPLAST®-II stelltReichelt Chemietechnik ein innovativesHalbzeug-Programm vor. Entscheidendhierbei ist, dass alle Produkte auch in kleinenMengen, das heißt in kleinen Abschnittenbeziehungsweise Zuschnitten, abgegebenwerden, so dass der Anwender im Betrieb,im Technikum oder in der Forschung genaudie für ihn interessante, bedarfsbezogeneMenge bestellen kann.Das Handbuch umfasst Elastomere ausFPM, PI, PUR, EPDM, CSM, CR, NBR, IIR, SBRsowie Rundschnüre aus Silikon, EPDM/PPund TPE, speziell für Pharmaanwendungen.Abgerundet wird das Elastomer-Programmdurch Moosgummi-Abschnitte sowie Zellkautschukplattenaus FPM, CR, NBR, PURoder EPDM.Das Kunststoff-Sortiment ist ebenfalls sehrumfangreich. Auch hier werden Abschnitte undTeilmengen in unterschiedlichen Größen angeboten,wie Folien aus den Materialien ECTFE,PTFE, FEP, PVDF, PEEK, PI, PA sowie PE. Danebenumfasst das Halbzeug-Programm Platten, Rohreund Stäbe aus PTFE, PVDF, PCTFE, PEEK, PI,PA, PE, POM, PVC, PS, PC sowie PMMA. Darüberhinaus beinhaltet das Handbuch Platten undVollstäbe aus Glas-Keramik.Alle Produkte werden im Detail beschrieben,bezogen auf die Produktspezifikation, diechemische Charakteristik sowie die technischeSpezifikation. Das Handbuch stelltsomit gleichzeitig ein kleines „Nachschlagewerk“dar, eine Sammlung für technische Parameterder unterschiedlichsten Werkstoffe.Es kann kostenlos angefordert werden.Reichelt Chemietechnik GmbH + Co.Silvia KrönEnglerstr. 1869126 HeidelbergTel.: +49-(0)-6221-3125-0Fax: +49-(0)-6221-3125-10rct@rct-online.dewww.rct-online.dePorvairArbeitsplatzverdampfer zur HPLC-ProbenpräparationDer Abblaseverdampfer MiniVap von PorvairSciences benötigt nur wenige Minuten, umdie flüchtigen organischen Lösungsmittelvon den HPLC-Fraktionen zu entfernen, die in24er oder 96er Mikrowellplatten aufgefangenwurden.Durch seine kompakte Bauart lässt sich derMiniVap aus dem erschwinglichen Preissegmentganz einfach aufstellen, betreiben undwarten. Zur Inbetriebnahme ist lediglich eineGasversorgung und eine herkömmliche Netzstromversorgungerforderlich. Der sichereBetrieb des Gerätes ist gewährleistet, da dasmit dem CE-Logo gekennzeichnete, kompakteGerät unter jeden Dunstabzug passt.Durch den MiniVap – ausgestattet miteinem hochmodernen Verdunster, der denerhitzten Stickstoff zeitgleich direkt in dieeinzelnen Schalen einer Mikroplatte injiziert– gehört der übliche Engpass im Labor beider Lösungsmittelverdampfung von HPLC-Fraktionen der Vergangenheit an.SensirionDynamische Flüssigkeitsdosierungsicher überwachenDer Schweizer Sensorhersteller SensirionAG hat die SLI Durchflusssensor-Familie fürFlüssigkeiten im Mikroliter- und Milliliter-Bereich vorgestellt. Keine bewegten Teile, einpatentiertes mediengetrenntes Mikrosensor-Messverfahren und ein gerader, völlig hindernisfreierStrömungskanal gewährleistenhohe Zuverlässigkeit. Gleichzeitig stellen diechemisch inerten, biokompatiblen Materialien(Glas, PEEK, Teflon®) eine hervorragendeMedienkompatibilität der medienberührtenTeile sicher, was für eine Vielzahl von kritischenAnwendungen von entscheidenderBedeutung ist. Die RS485-Schnittstelledieser Flüssigkeitsmesser bietet zusätzlicheFeatures zur Prozessdatenverarbeitung.Detaillierte Messungen hochdynamischerDosierprozesse können damit im Hintergrundaufgezeichnet und später weiterverarbeitetwerden. Der Nutzer kann sich so je nachBedarf zum Beispiel darauf beschränken, nurdas automatisch bestimmte Gesamtvolumenjedes Dosiervorgangs auszuwerten. Die hoheGeschwindigkeit der Durchflussmesser (Reaktionszeitvon nur 30 ms) kann mit dieserInterfacelösung voll ausgeschöpft werden.Hochdynamische Prozesse werden so problemlosund effizient überwacht.Die neuen Mikrosensoren sind für hochpräziseProzessüberwachung in Anwendungenmit geringen Dosiermengen entworfenworden. Die Zuverlässigkeit solcher flu-Porvair Sciences Ltd.Dr. Bill BradburyTel.: +44-(0)-208-546-0869info@primetek-solutions.comwww.porvair-sciences.comidischer Systeme wird dadurch deutlichverbessert. Durch die geringe Größe und dieLeichtigkeit der Geräte sind sie für den Einsatzin verfahrenstechnischen Anlagen undin Anwendungen der Pharma- und Medizinindustrieperfekt geeignet. Die Sensoren sindfür maximale Flussraten von 0,0008 ml/sbis 0,08 ml/s (0,05 bis 5 ml/min) bei wässrigenFlüssigkeiten oder von 0,008 ml/s bis1,3 ml/s (0,5 bis 80 ml/min) beim Einsatzmit Ölen, Kraftstoffen und Lösungsmittelnerhältlich.Sensirion AGJennifer WagnerTel.: +41-(0)-44-306-4022Fax: +41-(0)-44-306-4030jennifer.wagner@sensirion.comwww.sensirion.comLABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 | 39


Service ProduktweltBiolineZuverlässig: SensiFASTreal-time PCR-KitsSensiFAST TM beinhaltet das komplette Segmentder real-time PCR-Kits von Biolinefür Anwendungen mit RNA bzw. DNA alsAusgangsmaterial. In den Kits werden dieneuesten Erkenntnisse der Pufferchemie undEnhancer-Technologien genutzt. Zusammenmit der Antikörper-inhibierten hot-start DNA-Polymerase lassen sich hohe Sensitivität undsehr kurze Reaktionszeiten kombinieren, ohnedabei auf Leistung, Reproduzierbarkeit undGenauigkeit verzichten zu müssen.GE HealthcareWestern Blotting-HandbuchDas Handbuch „Western Blotting Principlesand Methods“ von GE Healthcare stellt einenLeitfaden dar, der Anfängern den Einstieg erleichtertund Fortgeschrittenen Hilfestellungund Inspiration gibt, um mehr aus ihren WesternBlot-Experimenten herauszuholen.Das Buch führt durch den gesamten Prozess,von der Probenvorbereitung bis zur Detektionund Auswertung. Kapitel 2 bis 8 erklären denWestern Blot Schritt für Schritt und gehenneben der praktischen Durchführung auch aufdie theoretischen Hintergründe ein. Beispielefür typische Anwendungen und neue Ansätzewerden in Kapitel 9 gegeben.Im vergangenen Jahrzehnt haben Weiterentwicklungenvon Nachweismethoden undSoftware die quantitative Auswertung vonWestern Blots ermöglicht. Auch dazu bringtdas Handbuch Beispiele und Anleitungen. ZumAbschluss gibt es einen Troubleshooting Guideund eine Rezeptesammlung, einschließlich einesempfohlenen Standardprotokolls, auf demaufbauend, eigene Experimente entwickeltwerden können.GE Healthcare Europe GmbHDr. Michael WaltherTel.: +49-(0)-89-962-810Michael.Walther@ge.comwww.gelifesciences.comPromoCellMaßgeschneiderte Angiogenese-AssaysSensiFAST SYBR ist auf Grund der kurzen Reaktionszeitenbei gleichbleibender Qualitätperfekt für den Einsatz in Hochdurchsatz-Anwendungen geeignet. SensiFAST Probe istideal für die Nutzung in Multiplex-Anwendungenauf Sondenbasis und reduziert dabeigleichzeitig die Optimierung, die häufig beidiesen Assays notwendig ist. Dieser Kit bieteteine deutlich höhere Effektivität bei sondenbasiertenTechnologien, wie beispielsweiseTaqMan®, Scorpions® und Molecular BeaconProbes, als andere Kits führender Anbieter indiesem Segment. SensiFAST one-step Kits sindäußerst sensitiv und enthalten alle Reagenzien,um eine reproduzierbare qRT-PCR in einemTube zu gewährleisten.SensiFAST HRM nutzt interkalierende Farbstoffe,extrem genaue Schmelzkurven und dieVerwendung spezifischer statistischer Anwendungen,um SNPs innerhalb der DNA-Sequenzerkennen zu können. SensiFAST-Kits könnenauf allen real-time PCR-Geräten genutzt werdenund sind ebenfalls perfekt für die neueGeneration Fast-Cycler geeignet.Bioline GmbHHolger BerthelTel.: +41-(0)-160-90144-316hberthel@bioline.comwww.bioline.com/sensifastPromoCell bietet vier verschiedene gebrauchsfertigeAngiogenese-Modelle an, mit denenin vitro der gesamte Prozess der Angiogeneseoder einzelne Abschnitte des Prozesses simuliertwerden können. Die Angiogenese-Modelleermöglichen eine schnelle und effiziente prooderanti-angiogenetische Testung.Das PromoCell 3D-Angiogenese-Assay simuliertin vitro dreidimensional den gesamtenProzess der Angiogenese. Der Assay bestehtaus Endothelzellsphäroiden, die in eine Kollagenmatrixeingebettet sind. Nach erfolgreicherStimulation sprießen innerhalb von zwei Tagenneue Blutgefäße aus den Sphäroiden in dieumgebende Kollagenmatrix. Die Anzahl unddie Länge der neuen Blutgefäße korrespondiertzur pro- oder anti-angiogenetischen Wirkungeiner Testsubstanz. Die einfache Auswertungdes Assays erfolgt ohne Färbung der neuenBlutgefäße. Das PromoCell 3D-AngiogeneseAssay wird gebrauchsfertig versandt. ZumStarten müssen nur die Testsubstanzen hinzugegebenwerden.Einzelne Stadien der Angiogenese könnenmit dem PromoCell Transmigration-Kit, demPromoCell Invasion-Kit und dem PromoCellPlanar Migration-Assay untersucht werden.Der Transmigration-Kit nutzt die Migrationvon Endothelzellen entlang eines Zytokingradienten,um die chemotaktische Fähigkeit einerSubstanz zu messen.Beim PromoCell Invasion-Kit wird die proteolytischeAktivität von Endothelzellen undderen gerichtete Migration in vitro simuliert.Dies ermöglicht, den Einfluss von Substanzenauf die proteolytische Aktivität und die Migrationvon Endothelzellen in einem Assay zubeobachten.Der PromoCell Planar Migration-Assay erlaubtes, schnell und einfach den Einfluss vonSubstanzen auf die Migration von Endothelzellenzu untersuchen.PromoCell GmbHSickingenstraße 63/6569126 HeidelbergTel.: +49-(0)-6221-649-340Fax: +49-(0)-6221-649-3440info@promokine.infowww.promokine.info40 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


Kalender ServiceSeptember – November 2012Veranstaltungskalender2.-6.9.12biocat 2012, HamburgInfo: Gerlinde Loebkens, TuTech Innovation GmbHWeb: www.biocat2012.de5.-8.9.123 rd European Congress of Immunology –ECI 2012, Glasgow (UK)Info: EFIS/BSI, Web: http://eci-glasgow2012.com6.-7.9.123. Kongress Industrielle Zelltechnik, LübeckInfo: Norgenta GmbH,Web: www.zelltechnik-kongress.de10.-13.9.1230. Jahrestagung der Biotechnologenund ProcessNet-Jahrestagung 2012, KarlsruheInfo: Barbara Feißt, Dechema e. V.,Web: https://ssl.dechema.de/jt2012.html16.-19.9.1246. Jahrestagung der DGBMT, JenaInfo: DGBMT/VDE Konferenz-Service,Web: www.bmt2012.de18.9.12jobvector career day, DüsseldorfInfo: Dr. Martina Sribar, jobvector,Web: www.jobvector.de/careerday18.-19.9.126 th European Pharma LicensingSymposium, Budapest (HU)Web: www.plgeurope.com/Budapest_201220.-21. September 2012, BerlinDiagnostics 2.0Der von der Scienion AG veranstalteteWorkshop „Diagnostics 2.0 – Turning Contentinto Multiplex Assays“ stellt innovativeTechnologien für diagnostische Testsund Screeningversuche in den Fokus.Info: www.scienion.de18.-19.9.125. NRW Nano-Konferenz, DortmundInfo: NMW.NRW – Cluster NanoMikro+WerkstoffeWeb: www.nmw.nrw.de/nanokonferenz18.-19.9.12Labor-Impuls-Forum 2012, Frankfurt/MainInfo: Akademie für Fort- und Weiterbildung, Web:www.labor-impuls-forum.de19.-21.9.12BioSpain 2012, Bilbao (ES)Info: ASEBIO, Web: www.biospain2012.org24.-26.9.1216. Heiligenstädter Kolloquium –Technische Systeme für dieLebenswissenschaften, HeiligenstadtInfo: Inst. für Bioprozess- und Analysenmesstechnike.V., Web: www.iba-heiligenstadt.de25.-26.9.12Biobasierte Polymere –Kunststoffe der Zukunft, BerlinInfo: Dr. Gabriele Peterek, FNR e.V./BMELV,Web: www.fnr.de/biokunststoffe-201226.-29.9.129. Jahrestagung der DGKL, MannheimInfo: PD Dr. Uta Ceglarek, UniversitätsklinikumLeipzig Institut für Laboratoriumsmedizin, KlinischeChemie und Molekulare Diagnostik,Web: www.dgkl2012.de30.9.-3.10.1264. Jahrestagung der DGHM, HamburgInfo: Conventus GmbH, Web: www.dghm-kongress.de30.9.-2.10.1228. Ernst-Klenk-Symposium inMolecular Medicine The Genomic Futureof Medicine, KölnInfo: Dr. Debora Grosskopf-Kroiher, Zentrum fürMolekulare Medizin, Uni Köln,Web: www.zmmk.uni-koeln.de30.9.-4.10.12Animal Cell Technology Course, Costa Brava (E)Info: António Roldão , ESACT, Web: www.esact.org18.-20. September 2012, Bad TölzECA – ProteinanalytikIm Workshop „ECA – Protein Analysis Technologies!werden in Fallbeispielen verfügbareTechnologien, deren Vor- und Nachteilesowie Optimierungsmöglichkeitenvorgestellt. Weitere Informationen:www.bio-conference.org19.-22.9.12GCB 2012 – German Conference onBioinformatics, JenaInfo: Dr. Margit Leitner, Jena Center forBioinformatics, Web: www.gcb2012-jena.de20.9.125. CIB Partnering Konferenz, Frankfurt/MainInfo: Cluster Integrierte Biotechnologie,Web: www.cib-frankfurt.de21.9.12Moderne Anwendungen der Biotechnologie,DresdenInfo: Dr. Maik Stiehler, TU Dresden,Web: http://biosaxony.com23.-26.9.12Jahrestagung der Deutschen Gesellschaftfür Biophysik 2012, GöttingenInfo: Susanne Enigk, Deutsche Gesellschaft fürBiophysik, Web: www.biophysical-congress.de20. November 2012, StraubingBiopolymereThemenschwerpunkte des KooperationsforumsBiopolymere sind Technologien fürzellulosebasierte Materialien und Verbundwerkstoffesowie industrielle Anwendungenvon Biopolymeren.Info: bayern-innovativ.de/biopolymere2012LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 | 41


AusblickEnde der unreguliertenGenom-Ära?Thomas Gabrielczyk, BIOCOM AGDie Interpretation der funktionellen Bedeutung genomischer Daten ist selbst für Experten ein hartesBrot. Umso schwieriger scheint die Aussage über Krankheitsrisiken und -prognosen auf Basis derFlut an genetischen Daten für den einfachen Bürger. Was manche Firmen zu ihrem Geschäftsmodellerkoren haben, wollen Experten aus 27 europäischen Wissenschafts- und 14 EU-Medizinakademienjetzt unter strengere Marktaufsicht stellen: Gentests, die direkt an die Konsumenten gerichtet sind,ihnen verraten, ob sie auf bestimmte Therapien ansprechen, oder die präsymptomatische Diagnosenmonogenetischer Krankheiten gestatten. Mitte Juli forderten 20 Experten des European AcademiesScience Advisory Council (EASAC) und der Federation of European Academies of Medicine (FEAM)in einem gemeinsamen Bericht ein Verbot des Direktmarketings für vier Arten von Gentests anKonsumenten sowie eine Begutachtung entsprechender genomischer Tests vor Vermarktung.Entsprechende Regelungen sollen in die EU-IVD-Richtlinie aufgenommen werden. AkademischeForscher sollen zudem aufgefordert werden, Standards zu entwickeln, die eine bessere Einschätzungder Vorhersage von Krankheitsrisiken auf Basis genomischer Daten gestatten.InserentenverzeichnisBioKryo GmbH ............................17BIOCRATES Life Science AG .................7BIOCOM AG .........................13, 14,33Bioline GmbH .......................... 10.11Advanced Analytical Technologies ....... 25GeneArt AG ..............................U3Microsynth AG ...........................29New England Biolabs GmbH .............U4Porvair Sciences Ltd. .......................13Roche Diagnostics GmbH ................U2Vorschau Heft 4/2012„Derzeit möchten wir Konsumenten nicht ermutigen,Direct-to-Consumer-Gentests zu nutzen“,heißt es in dem Bericht, den 20 Experten derAkademien Mitte Juli vorgestellt haben. Sie empfehlenstattdessen einen vorsichtigen Umgangmit Genomanalysen, die von Unternehmen wieSequenom oder 23&me angeboten werden, undwollen bestimmte Firmenangebote sogar verbieten.Dazu zählen etwa die Direktvermarktung vonTests auf ernste monogenetische Erkrankungenmit hoher Penetranz oder das pränatale Screeninginkl. Tests fetaler Zellen im Blutstrom der Mutter.Auch von Nutrigenom-Tests raten die Wissenschaftlerab, da sie mit einer Kaufempfehlung fürProdukte verbunden seien, deren Gesundheitsnutzenoft nicht nachweisbar sei. Zudem sollenMinderheiten und Behinderte grundsätzlich nichtdie DCT-Angebote wahrnehmen.Standards und RegularienDie Vermarktung der Gentests sowie das sichrasch entwickelnde Feld der Whole Genome-Sequencing-Studien wollen die Wissenschaftlerkünftig stärker reguliert sehen. Dazu sollenRegelungen in die zur Revision anstehendenIVD-Richtlinie aufgenommen werden, die dieHersteller verpflichten:l die Assoziation zwischen DNA-Markern unddem Krankheitsrisiko nachzuweisen,l neben der Testqualität auch die Qualität desbegleitenden Beratungsangebotes nachzuweisen,l die Produktinformation nach noch zu etablierendenStandards auszurichten,l entsprechende Einwilligungserklärungen derKunden einzuholen.Die EASAC- und FEAM-Experten schlagen zudemvor, ein Register aller angebotenen Gentestseinzurichten, in dem die Validität, der Nutzenund die Verfügbarkeit vormarktlich überprüfterTests dokumentiert ist.Da immer mehr Großforschungsprojekte aufdie Entdeckung molekularer Biomarker abzielen,empfehlen die Experten den FördermittelgebernStandards zu etablieren, mit denen die klinischeValidität entsprechender Marker und Tests beurteiltwerden kann und die die Risikoprädiktionin diversen Populationen erlauben.ThemenBioanalytikDer Nachweis von DNA, Kontaminationenin Lebensmitteln und von endokrinwirksamen Substanzen im Trinkwassersind nur einige Anwendungen derBioanalytik, dem nächsten Thema vonLABORWELT. Daneben wirft LABORWELTeinen Blick auf zwei weitere, hochaktuelleForschungsfelder: die Stammzellforschungund die digitale PCR. Aktuelle Beiträge,Expertenpanels und Top-Publikationenfinden Sie auf der Online-PlattformLABORWELT.de. Bei Interesse, einen Beitragbeizusteuern, hilft die Redaktion (E-Mail:t.gabrielczyk@biocom.de) gerne weiter.ImpressumLABORWELT (ISSN 1611-0854)erscheint vierteljährlich im Verlag derBIOCOM AGLützowstraße 33–3610785 Berlin, GermanyTel.: 030/264921-0Fax: 030/264921-11laborwelt@biocom.dewww.biocom.deRedaktionDipl.-Biol. Thomas GabrielczykTel.: 030/264921-50Dr. Martin LaquaTel.: 030/264921-68AnzeigenleitungOliver SchnellTel. 030/264921-45,o.schnell@biocom.deLeserserviceAngelika WernerTel. 030/264921-40Graphik-DesignMichaela ReblinDruck:Druckhaus Humburg GmbH28325 BremenFür einen regelmäßigen Bezug von LABORWELTist eine kostenlose Registrierung unterwww.biocom.de oder per Fax erforderlich.Namentlich gekennzeichnete Beiträge stehenin der inhaltlichen Verantwortung der Autoren.Alle Beiträge sind urheberrechtlich geschützt.Ohne schriftliche Genehmigung des BIOCOMVerlages darf kein Teil in irgendeiner Formreproduziert oder mit elektronischen Systemenverarbeitet, vervielfältigt oder verbreitet werden.Titelbild: 123rf.com© BIOCOM AG, BerlinBIOCOM AGExpertenpanel ImagingWerbekunden bietet diese Ausgabe eineopti male Plattform für ihre Produkt-undImage anzeigen. Reservieren Sie IhrenWerbeplatz in LABORWELT bis spätestenszum 2. November 2012. Ergänzend zumThema „Bioanalytik“ kommen Automations-und Diagnostikexperten zu aktuellenEntwicklungen im Anwendungsfeld„Imaging“ zu Wort. Informationen zurmöglichen Teilnahme einer Ihrer Expertensowie über die aktuellen Themen gibtOliver Schnell (Tel.: +49-30-264921-45,E-Mail: o.schnell@biocom.de).42 | 13. Jahrgang | Nr. 3/2012 LABORWELT


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