Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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94Kontrollen signifikant niedrigeren Entwicklungsraten scheinen auch in diesen Versuchen nichtdurch die Methode der Ausverdünnung verbesserbar, sondern es ist anzunehmen, dass dieSchädigung bereits während des Äquilibrierungs- und Kühlvorganges eingetreten ist.5.5 Reifestadium der EizelleEin deutlicher Einfluss des Reifestadiums der vitrifizierten Rindereizellen auf dieEntwicklungsfähigkeit nach Vitrifikation wurde festgestellt. Die Darstellung des nukleärenZustandes der GV-Oozyten nach aseptischer Vitrifikation und Färbung mit Hoechstfarbstoff zeigtemedienunabhängig eine signifikant schlechtere Maturationsentwicklung im Vergleich zuKontrolleizellen, während die Maturationsrate nach aseptischer Vitrifikation reifer Eizellen nichtverändert zu den Kontrolloozyten war. Mehr als die Hälfte der GV-Oozyten konnten sichmedienunabhängig bis zum Kernstadium MI entwickeln, danach stoppte die Entwicklung. DerAnteil völlig degenerierter Eizellen unterschied sich jedoch zwischen GV und MII-Oozyten nicht.Weder mit aseptischer noch mit konventioneller OPS-Vitrifikation unreifer Rindereizellen konntenin dieser Arbeit Entwicklungen bis zum Blastozystenstadium erreicht werden. GV-Oozyten zeigtensich auch in der Literatur als am wenigsten kryotolerant (MEN et al. 2002). Unreife Eizellen warenkältesensibler als reife Stadien. Zwar verfügen sie nicht über einen empfindlichen Spindelapparatwie die mature Oozyte, doch beeinträchtigen subphysiologische Temperaturen Regulatorproteineder Meiose, Mikrotubulinorganisation, das Phasenverhalten von Zellmembranen, intrazelluläreLipide und zytoplasmatische Organellen in größerem Ausmaß als bei maturen Stadien (ARAV etal. 1996, WU et al. 1999, HYTTEL et al. 2000, LIEBERMANN et al. 2002a). DieMembranpermeabilität für Wasser und CPAs immaturer Oozyten ist geringer als bei späterenStadien, was eine größere osmotische Sensibilität bedingt. Ebenso ist die Empfindlichkeitgegenüber zytotoxischen Schäden durch CPAs höher (FUKU et al. 1994, AGCA et al. 1998, 2000).Der Versuchsaufbau selbst (Äquilibrierung, Dilution) im Rahmen dieser Arbeit schien daherimmature Eizellen stärker zu beeinflussen als dies bei maturen Eizellen der Fall war, da diese mitverschiedenen Äquilibrierungsmethoden und Dilutionsmethoden vitrifiziert werden konnten undsich in vitro weiterentwickelten. Bei GV-Oozyten schienen jedoch die Schäden durch toxischeund/oder osmotische Einwirkung der CPAs während der Äquilibrierung so gravierend, dassunabhängig von verwendetem Medium und Kühlrate bei allen Versuchen die Weiterentwicklungmassiv eingeschränkt war.

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