Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

986 ZusammenfassungEva-Maria SchmölzerUntersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und in-vitro-maturierten RinderoozytenAmbulatorische und Geburtshilfliche Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät derUniversität Leipzig undAbteilung für gynäkologische Endokrinologie und Reproduktionsmedizin der MedizinischenFakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelm-Universität BonnEingereicht im Juni 2006101 Seiten, 15 Abbildungen, 25 Tabellen, 352 Literaturangaben, 1 AnhangSchlüsselworte: Vitrifikation, aseptisches Verfahren, RinderoozytenIn den letzten 10 Jahren hat sich die Vitrifikation als Gefriermethode für kryosensibleSäugetieroozyten etabliert. Sie beruht auf dem physikalischen Prinzip der so genannten Glasbildungvon wässrigen Lösungen. Der Übergang einer Lösung und darin suspendierter Zellen in denamorphen Zustand während des Abkühlens auf -196°C kann durch die Verwendung hoher KühlundErwärmungsraten in Kombination mit hohen, intrazellulären CPA-Konzentrationen erreichtwerden. Ultraschnelle Abkühlverfahren wurden entwickelt, indem die Probe ohne isolierendeKühlbehälter direkt dem Stickstoff ausgesetzt wurde. Die Übertragung von potentiell übertragbarenErregern (BVD/MD,BHV 1 ) via kontaminiertem N 2 stellt in diesem Zusammenhang eine möglicheGefahr dar.Ziel dieser Arbeit war es, eine kontaminationssichere Methode zur Anwendung beiRinderoozyten zu entwickeln. Als Grundlage der aseptischen Methode diente das bereits etablierteOpen pulled straw-Verfahren. Der OPS mit dem Probenmaterial wurde zusätzlich in einen 0,5 mlPlastikstraw verpackt, an beiden Seiten hermetisch verschlossen und im N 2 versenkt. Diese relativgeringe Kühlrate von ~200°C/Min verlangt gemäß dem Prinzip der Vitrifikation nach einer höherenintrazellulären CPA-Konzentration. Das bedeutet ein erhöhtes Potential an Schädigung durchtoxische und osmotische Vorgänge während Äquilibrierung und Dilution der Kryoprotektoren.In dieser Arbeit wurde für das aseptische Verfahren eine dreistufige Äquilibrierungsmethodezur Steuerung der intrazellulären CPA-Konzentration verwendet, zudem wurde die OPS-Vitrifikation mit Kühlraten von 20 000°C/Min mit drei- und einstufiger Äquilibrierung imVergleich durchgeführt. Die Dilution der CPAs erfolgte in stufenweiser Form oder mit einem indieser Arbeit entwickelten titrationsähnlichen Verfahren. Für GV-Oozyten wurden vierVitrifikationsmedien verwendet, die Kryokonservierung maturer Eizellen erfolgte in Medium D+Eeinerseits unter Einschluss des gesamten Kumuluszellverbandes, andererseits partiell denudiert.

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