Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

6zwischen 5°C und -15°C. Die meisten konventionellen Gefrierprotokolle sehen daher ein Seedingbei Temperaturen von -6 bis -7°C vor, um ein zu starkes supercooling des biologischen Materials zuvermeiden (SHAW u. JONES 2003). NIEMANN u. MEINECKE (1993) beschrieben die manuelleAuslösung der Nukleation durch Berühren des extrazellulären Mediums mit einer stark unterkühltenPinzette. Eine Haltezeit von 5 bis 10 Minuten dient der Anpassung von Temperatur undZellvolumen.Das Zytoplasma einer Zelle enthält mehr gelöste Stoffe als das sie umgebende Milieu (SHAWu. JONES 2003). Des weiteren sorgt die Zellmembran dafür, dass im intrazellulären Bereichzunächst auch bei Temperaturen unter dem Gefrierpunkt ( -5° bis -15°C ) keine Eiskristalle gebildetwerden. Dieser Zustand wird als supercooling bezeichnet, das Zytoplasma ist unterkühlt (WOLFEu. BRYANT 1999). Im Verlauf des Kühlprozesses bilden sich üblicherweise zuerst extrazelluläreEiskristalle (SHAW u. JONES 2003). Durch die Bindung des freien Wassers erhöht sich dieKonzentration an gelösten Stoffen außerhalb der Zelle, das chemische Potential von Wasser wirdgeringer, und es bildet sich ein Konzentrationsgefälle zwischen intra- und extrazelluläremKompartiment. Zum Ausgleich dieses osmotischen Gradienten fließt intrazelluläres Wasser in denExtrazellularraum, die Zelle dehydriert und beginnt zu schrumpfen (LEIBO 1989). In Abhängigkeitvon der Abkühlgeschwindigkeit schreitet die Dehydration unterschiedlich schnell voran, so dass eszur Formation von unterschiedlich großen, sowohl extra- als auch intrazellulären Eiskristallenkommen kann (MAZUR 1977, 1980). MAZUR (1980) stellte das Verhältnis zwischenÜberlebensrate und Kühlrate in einer Kurve mit der Form eines ∧ dar. Bei einer niedrigen Kühlratebildet sich vorwiegend extrazelluläres Eis. Der entstehende Konzentrationsunterschied wird vorallem durch Ausströmen von intrazellulärem Wasser ausgeglichen, das Wasser gefriertextrazellulär. Zusätzlich wird der Wassereflux durch die geringere Permeabilität der Zellmembranfür extrazellulär gelöste Stoffe im Vergleich zu Wasser unterstützt (PAYNTER et al. 1999b). Beieiner hohen Kühlrate kann die Dehydration der Zelle nur ungenügend erfolgen, kleine,intrazelluläre Eiskristalle werden gebildet, was zu einer Absenkung der Überlebensrate führt(MAZUR 1980).Die Wahrscheinlichkeit der intrazellulären Eiskristallbildung ist neben der Kühlrate abhängigvon spezies- und stadiumbedingten Eigenschaften der Zellmembran (LEIBO 1989). Diese sinddefiniert durch die hydraulische Konduktivität einer Zelle und einer temperaturabhängigenPermeabilitätskonstante für Wasser. Ein weiterer Faktor, der von Entwicklungsstadium und Speziesdes organischen Materiales abhängt, ist das Verhältnis Oberfläche/Volumen des biologischenMateriales (MAZUR 1963, 1977). Je größer der Zelldurchmesser, desto länger dauert dieDehydrierung, dementsprechend langsame Kühlraten müssen angewandt werden, um intrazelluläres

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