Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

152.2.1 Penetrierende KryoprotektivaPenetrierende Kryoprotektiva entwickeln ihre Schutzfunktion extra- und intrazellulär. Ihre Aufgabebesteht darin, Wassermoleküle zu ersetzen (MAZUR 1984). Kolligative Effekte schienen vorerstalleine verantwortlich für die gefrierschützende Wirkung zu sein. Damit wird die chemischeEigenschaft gelöster Stoffe in Lösungen beschrieben, die unabhängig von der Art der gelöstenStoffe zur Erniedrigung des Gefrierpunktes führen. Die genauen, molekularen Mechanismen derWirkung von CPAs blieben jedoch unklar (MCGANN u. WALTERSON 1987).ANCHORDOGUY et al. (1991) beschrieben eine temperaturabhängige Bindung des polarenSulfoxidanteils von DMSO an die Phospholipide der Zellmembran als stabilisierend, zusätzlichekolligative Effekte wurden nicht ausgeschlossen. Der Zusatz von CPAs zu wässrigen Lösungenerhöht deren Viskosität, senkt den Gefrierpunkt der Lösung und kann in hohen molarenKonzentrationen (7-8 Mol/l) dazu beitragen, dass eine Kristallisation im Medium völlig unterdrücktwird und die Lösung bei tiefen Temperaturen eine Viskositätsveränderung bis zum Erreichen einesamorphen, glasähnlichen Zustandes (Vitrifikation) vollzieht (FAHY et al. 1984, WOLFE u.BRYANT 1999, SHAW u. JONES 2003). In niedrigeren molaren Konzentrationen (1-2 Mol/l)fördern sie die Dehydrierung des biologischen Materials, sie verhindern eine Zellschädigung durchLösungseffekte und intrazelluläre Eiskristallbildung, und sie wirken membranstabilisierend(FRIEDLER et al. 1988, LEIBO 1989, SHAW et al. 2000, SHAW u. JONES 2003). Dabei ist dieGeschwindigkeit der Penetration durch die Zellwand abhängig von der Art des CPAs, Spezies undStadium des organischen Materials, dem damit zusammenhängenden Permeabilitätskoeffizientenfür das individuelle CPA, dem Konzentrationsgradienten zwischen intra- und extrazellulärem Raumund der Inkubationstemperatur (LEIBO 1989, FAHNING u. GARCIA 1992). Die Permeabilitäteiner Zellmembran für Wasser, CPAs und andere gelöste Stoffe ist unterschiedlich hoch undtemperaturabhängig (FRIEDLER et al. 1988, AGCA et al. 1998, PEDRO et al. 2005). Sinkt dieInkubationstemperatur, tritt dieser Unterschied deutlicher zutage, die Geschwindigkeit der CPA-Penetration nimmt ab, und bei Temperaturen unter 0°C ist die Penetrationsfähigkeit aller CPAsvernachlässigbar gering (JACKOWSKI et al. 1980, FRIEDLER et al. 1988). Eine auf Spezies undStadium abgestimmte Penetrationsgeschwindigkeit der CPAs in die Zelle während desÄquilibrierungsverfahrens bestimmt das Ausmaß der Dehydrierung vor dem Abkühlen und damitdie Wahrscheinlichkeit des Auftretens osmotischer Schäden (PAYNTER et al. 2005). RALL u.FAHY (1985a,c) beschrieben das stufenweise Zufügen der Vitrifikationslösung mitunterschiedlichen Inkubationstemperaturen als Maßnahme, um eine zu hohe intrazelluläre CPA-Konzentration und damit zytotoxische Schäden zu verhindern. Gleichzeitig erreichten sie eine

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