Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

16ausreichende Dehydrierung. Die Zytotoxizität der CPAs ist abhängig von derInkubationstemperatur (RALL 1987). SHAW et al. (2000) beschrieben den Einfluss der Temperatur(Raumtemperatur vs. 39°C) auf die Zytotoxizität von CPAs an bovinen immaturen Oozyten. Alleuntersuchten Kryoprotektiva verringerten die Maturationsfähigkeit nach Inkubation bei 39°Csignifikant stärker im Vergleich zur Inkubation bei Raumtemperatur (RT). Am wenigsten toxischauch bei hohen Temperaturen erwies sich Ethylenglykol (EG). Mehrere Autoren beschrieben denEinfluss von Spezies und Entwicklungsstadium auf die Penetrationsgeschwindigkeit verschiedenerCPAs (ODA et al. 1992, AGCA et al. 1998, 2000, PFAFF et al. 1998, PAYNTER et al. 1999b).Obwohl die Permeabilität der Membranen für alle CPAs mit der Entwicklung von der Eizelle zumEmbryo generell ansteigt, konnten PEDRO et al. (2005) Unterschiede im Grad dieses Anstiegs fürunterschiedliche Kryoprotektiva zeigen: So wiesen murine Achtzeller einen starkenPermeabilitätsanstieg für Glycerol auf, während von allen untersuchten CPAs EG am raschestendurch Morulae diffundierte. Bovine GV-Stadien zeigten sich empfindlicher gegenüberÄquilibrierung und Dilution der CPAs als spätere Stadien derselben Spezies (HAMANO et al.1992, FUKU et al. 1994, OHBOSHI et al. 1998, VAJTA et al. 1998a). Das Senken des toxischenPotentials verschiedener Kryomedien durch Kombination von penetrierenden CPAs untereinanderwurde vielfach beschrieben (RALL u. FAHY 1985a, HALASZ u. COLLINS 1984, MASSIP et al.1986, SZELL u. WINDSOR 1994, PUGH et al. 2000, ELDRIDGE-PANUSKA et al. 2005). Die amhäufigsten eingesetzten penetrierenden CPAs sind Dimethylsulfoxid (DMSO), EG, 1,2-Propandiol(PROH) und Glyzerin.2.2.1.1 Ethylenglykol (EG)Obwohl FAHY et al. (1987) die Glasbildungsfähigkeit von EG im Vergleich mit anderen CPAs alsweniger gut ausgeprägt beschrieben, machten es seine Eigenschaften zum meistangewandten,penetrierenden CPA in der modernen Kryobiologie (MASSIP 2001). Das toxische Potential von EGist sehr gering. In Konzentrationen bis 3 Mol/l überstanden Mäusemorulae eine Inkubation bis zu10 Minuten ohne Verringerung der Entwicklungsrate, während es bei PROH und GLY nach fünfMinuten schon zu massiven Einbußen kam (GUTIERREZ et al. 1993a). Immature bovine Oozytentolerierten das Aussetzen in eine 30%ige EG-Lösung bei Raumtemperatur deutlich besser als eineLösung auf DMSO-Basis (DEPIESSE et al. 1991). Aktinfilamente von Mäuseoozyten wurdendurch Konzentrationen von bis zu 8 Mol/l nicht verändert, wenn die Einwirkzeit 5 Minuten nichtüberschritt, bei Zeiten von 10 Minuten genügte bereits eine Konzentration von 4 Mol/l, um zuVeränderungen in der Aktinformation und -verteilung zu führen (HOTAMISLIGIL et al. 1996).Äquilibrierung maturer boviner Oozyten in 1,5 mol EG-Medium führte zwar zu einer signifikanten

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