Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

18negativen Einfluss auf die Morphologie von murinen Kumuluszellen, in Kombination mit einemGefrierverfahren konnte jedoch ein Zusammenhang zwischen morphologischem Integritätsverlustder Granulosazellen und einem Absinken in der Fertilisations- und Entwicklungsrate dargestelltwerden (RUPPERT-LINGHAM et al. 2003). Schädigende Auswirkungen durch dieses CPA aufUltrastruktur, Zona pellucida, Mikrotubuli, Zytoskelett und Spindelapparat wurden für verschiedenSpezies beschrieben (JOHNSON et al. 1988, SATHANANTHAN et al. 1988, VINCENT et al.1990a,b, WOOD et al. 1992, FUKU et al. 1995, SAUNDERS u. PARKS 1999, HYTTEL etal. 2000). DMSO zeigt eine bessere Penetrationsfähigkeit gegenüber Embryonen als Glyzerin undwurde daher verbreitet beim konventionellen Tiefgefrieren verwendet (FAHNING u.GARCIA 1992). Die Penetrationsfähigkeit von PROH und DMSO für murine und humane Oozytenbei 24°C ist gleich groß (PAYNTER et. al. 1999b). Das Achtzellstadium von Mäusen ist für DMSOsignifikant schlechter permeabel als für alle anderen embryonalen Stadien, PFAFF et al. (1998)sahen den Grund dafür in der Vorbereitung der Zelle auf die Kompaktierung.2.2.1.3 1,2-Propandiol (PROH)Die Glasbildungsfähigkeit von PROH ist den anderen, hier beschriebenen Gefrierschutzmitteln weitüberlegen, die Stabilität der gebildeten Glasphase während des Erwärmens übertrifft die von DMSO(BAUDOT et al. 2000). Eine Nutzung dieser Eigenschaften in hohen Konzentrationen als alleinigesCPA zur Vitrifikation ist jedoch nicht möglich, da seine Toxizität zu hoch ist. Zur Vitrifikation inKombination mit einem anderen CPA oder in niedermolaren Lösungen, wie sie in konventionellenMethoden angewandt werden, ist PROH durch seine sehr gute Glasbildungsfähigkeit undausgezeichnete Stabilität im amorphen Zustand gut einsetzbar (FRIEDLER et al. 1988, FAHNINGu. GARCIA 1992, SHAW u. JONES 2003). SHAW et al. (2000) beschrieben für Rindereizellen,dass PROH bei 39°C weniger toxisch als DMSO und Glyzerin ist, aber deutlich toxischer als EG.Desorganisation des Spindelapparates bei Kanincheneizellen, Membranschäden an Mäuseoozytenund die parthenogenetische Aktivierung von Mäuseoozyten wurden verzeichnet (VINCENT etal. 1989, SHAW u. TROUNSON 1994, JOLY et al. 1992). Eine weitere Gefahrenquelle für dieArbeit mit biologischem Material ist der Metabolit Formaldehyd, der Gameten schädigen kann(MAHADEVAN et al. 1998). Die Permeabilitätseigenschaften von PROH sind hervorragend,Eizellen und frühe Embryonalstadien werden durch dieses CPA am schnellsten penetriert(PAYNTER et al. 1999b, PEDRO et al. 2005). Für die konventionelle Kryokonservierung humanerOozyten wird PROH in einer Konzentration von 1,5 Mol/l als Standard eingesetzt (FABBRI etal. 2001, BOISO et al. 2002, JONES et al. 2004, BIANCHI et al. 2005, PAYNTER et al. 2005).

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