Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

21verglichen die Autoren die Auswirkungen von unterschiedlichen Konzentrationen einer auf EGbasierenden Vitrifikationslösung auf die Struktur der Zellmembran. Der Zusatz von Sukrose(0,5 Mol/l) zur Vitrifikationslösung verhinderte morphologische Veränderungen in derZellmembran, auch bei Zusatz von EG-Konzentrationen von 8 Mol/l. Eine Klärung derBedeutsamkeit der osmotischen und spezifischen Mechanismen zur gefrierschützenden Wirkungder Kohlenhydrate scheint schwierig (WOLFE u. BRYANT 1999). Obwohl vorwiegendDisaccharide in der Kryokonservierung zum Einsatz kommen, vertraten schon MCWILLIAMS etal. (1995) die Ansicht, dass Monosaccharide geeignetere osmotische Puffer wären. PraktischeAspekte wie die bessere Löslichkeit der Monosaccharide im Vergleich zu Di- und Polysaccharidenmachen sie zudem einfacher in der Anwendung. Der Zusatz von verschiedenen Sacchariden zuGefriermedien erfolgt meist, ungeachtet ihres unterschiedlichen Molekulargewichtes, in ähnlichen,niedermolaren Konzentrationen bis zu 1 Mol/l (KULESHOVA et al. 1999b). KASAI et al. (1992)konnten nachweisen, dass Mäusemorulae die Inkubation bei Raumtemperatur (RT) über 20 Minutenin 1 und 0,5 molarer Sukrose ohne Beeinträchtigung tolerierten. Wurde die Inkubationstemperaturauf 30°C erhöht, sank die Überlebensrate (ÜR) auf 10%. Mature Mäuseoozyten konnten bei RTeine 10-minütige Einwirkung von 0,5 Mol Sukrose oder Mannitol ohne Einbußen in ihrerEntwicklungsfähigkeit tolerieren (KULESHOVA et al. 1999b). GV-Oozyten erwiesen sich alsempfindlich gegenüber einer hohen Disaccharidkonzentration. Zwar tolerierten sie eine 0,5 molareSukroselösung über 20 Minuten bei RT, eine 1 molare Lösung führte jedoch schon nach 5 Minutenzu verringerten Maturationsraten, keine Eizelle überlebte die Inkubation über 20 Minuten. DieEinwirkung einer ebenfalls 1 molaren Mannitollösung über 20 Minuten wurde jedoch toleriert.Hinweise auf das geringe zytotoxische Potential von Monosacchariden erhielt man auch durchZufügen von Sacchariden in der in-vitro-Kultur. Üblicherweise wird als Zusatz für murineMaturationsmedien Glukose in einer Konzentrationen von 5 mMol/l verwendet (SAKKAS et al.1993). Das Halten von Eizellen in Medien mit hohen Konzentrationen an Monosacchariden(50mMol/l) hatte keine negativen Auswirkungen auf die Entwicklungsfähigkeit der Mäuseoozyten,Trehalose hingegen verursachte signifikant geringere Blastozystenraten. Ein parthenogenetischesAktivierungspotential zeigte sich für Sukrose nicht (KULESHOVA et al. 1999b). Der Zusatz vonSukrose in einer 0,7 molaren Lösung zeichnete bei maturen Mäuseoozyten für das Auftreten vonZona hardening verantwortlich. Dabei trat der negative Effekt durch einen abrupten Zusatz desZuckers verstärkt auf (VINCENT et al. 1991). Eine bis zu dreifach höhere Konzentration anSukrose in der Gefrierlösung bei konventionellen Gefrierverfahren erwies sich als positiv für dieEntwicklungsfähigkeit von immaturen und maturen humanen Eizellen (FABBRI et al. 2001, CHENet al. 2004). SCHELLANDER et al. (1994) setzten Disaccharide nur in den Dilutionsmedien zu und

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