Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

262.3 GefrierverfahrenGrundsätzlich können Gefrierverfahren aufgrund ihres kryobiologischen Konzeptes eingeteiltwerden. Erfolgt ein Ausgleich zwischen intrazellulärem und extrazellulärem Kompartiment durchBildung extrazellulärer Eiskristalle und Osmose während der Abkühlung, werden diese Verfahrenals Äquilibriumgefrierverfahren bezeichnet (FRIEDLER et al. 1988, LEIBO 1989). Zu den Non-Äquilibriumverfahren zählen die Vitrifikation und ultraschnelles Gefrieren (LEIBO 1989,FAHNING u. GARCIA 1992). Die erzielten Abkühlraten während des Gefriervorganges lassenzwischen langsamen und schnellen Protokollen unterscheiden (SHAW u. JONES 2003). Alskontrollierte Gefrierverfahren beschreibt man Methoden, die es erlauben, das biologische Materialin definierten Raten auf niedrige Temperaturen zu kühlen. Dies gelingt durch Anwendungprogrammierbarer Kühlautomaten (NIEMANN u. MEINECKE 1993).2.3.1 Langsame ProtokolleLangsame Protokolle sind definiert durch durch das Verwenden geringer Abkühlraten (0,3°C bis1°C/Min für Embryonen bzw. Eizellen) und die Verwendung niedriger molarer Konzentrationenvon CPAs im Gefriermedium (SHAW u. JONES 2003). Während der Abkühlung werden imExtrazellulärraum Eiskristalle gebildet, und die Zellen werden dehydriert. Die Bildungintrazellulärer Eiskristalle wird zusätzlich zum Wasserefflux durch das Seeding verhindert(FRIEDLER et al. 1988, FAHNING u. GARCIA 1992, NIEMANN u. MEINECKE 1993). Erstmalserfolgreich angewandt wurden langsame Gefrierprotokolle an Mäuseembryonen (WHITTINGHAMet al. 1972), das erste Kalb aus einem tiefgefrorenen Embryo erhielten WILMUT undROWSON (1973). Beide kühlten das biologische Material nach Seeding bei -7°C in Raten von0,3°C/Min bis auf -80°C ab und danach erfolgte die Sturzkühlung in Stickstoff. Die langsameAbkühlrate bedingte eine starke Dehydrierung der Embryonen, verhinderte aber die Bildungintrazellulärer Eiskristalle. Langsame Auftauraten (~10°C/Min) mussten verwendet werden, dadurch die vollständige Penetration der CPAs bei diesem Äquilibriumverfahren das schnelleAuftauen zu Lösungseffekten und osmotischen Schäden führen kann (MAZUR 1980, FRIEDLERet al. 1988, LEIBO 1989). Durch Modifizierung des Kryomediums (Einführung von GLY und EGanstatt DMSO), Überführung in N 2 schon bei Temperaturen zwischen -25°C und -35°C undVerwendung höherer Auftaugeschwindigkeiten (~300°C/Min) entwickelte sich das konventionelleTiefgefrierverfahren, das heute zur Kryokonservierung von Embryonen und Eizellen angewandtwird (WILLADSEN et al. 1976, FAHNING u. GARCIA 1992, VOELKEL u. HU 1992,NIEMANN u. MEINECKE 1993, PALASZ u. MAPLETOFT 1996). Die Einführung der 0,25 mlPlastikpaillette als Gefrierbehälter, Zusatz von Sacchariden in Gefriermedien und das one-step

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