Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

28MARTINO et al. (1996b) verwendeten zum URF boviner Eizellen eine 31%ige Lösung ausEthylenglykol.2.4 VitrifikationDieses Kühlverfahren ist definiert durch das Erreichen eines glasähnlichen Zustandes desVitrifikationsmediums bei tiefen Temperaturen und direktem Eintauchen des organischen Materialsin flüssigen N 2 oder Stickstoffdampf. Durch den Einsatz von hochmolaren Konzentrationenpenetrierender CPAs steigt die Viskosität der Lösung beim Abkühlen an, ohne dass es intra- oderextrazellulär zur Bildung von Eiskristallen kommt (FAHY et al. 1984, RALL u. FAHY 1985c,RALL 1987, FRIEDLER et al. 1988). Dieser glasähnliche Zustand hat dadurch dieselben ionischenund molekularen Eigenschaften der wässrigen Lösung ohne die Gefahr der mechanischen undchemischen Schäden durch Konzentrationsveränderung und Eiskristallbildung (SHAW u.JONES 2003). MACFARLANE (1987) stellte fest, dass eine CPA-Konzentration von über 40% v/vfür eine Glasbildung nötig ist, die Anwendung eines höheren hydrostatischen Druckes verringertedie erforderliche CPA-Konzentration (FAHY et al. 1984). Die Vitrifikation wird zu den Non-Äquilibrium-Gefrierverfahren gezählt, ein Ausgleich zwischen extra- und intrazelluläremKompartiment wird nicht erreicht (LEIBO 1989).2.4.1 Methode2.4.1.1 Grundlagen der MethodeAlle angewandten Gefriermethoden haben grundsätzlich eine Abfolge von Einzelschrittengemeinsam, die es letztendlich erlaubt, biologisches Material auf Temperaturen bis -196°Cabzukühlen, wieder auf physiologische Temperaturen zu erwärmen und eine Weiterentwicklung zugewährleisten (LEIBO 1989). Diese Einzelschritte umfassen auch bei der Vitrifikationsmethodedas:I. Zufügen der CPAs zum biologischen Material ( Äquilibrierung )II. Abkühlen der Probe ( Plunging )III. Erwärmen auf physiologische TemperaturenIV. Entfernen der Kryoprotektiva ( Dilution )Der Vorteil der Vitrifikation liegt in der Verkürzung der Zeit für den Gefriervorgang von mehrerenStunden auf wenige Minuten. Es ist keine spezielle und kostenintensive Ausrüstung(Gefrierautomat) nötig, und der Verbrauch an Stickstoff ist deutlich geringer (NIEMANN u.MEINECKE 1993). Die Vitrifikation und direkte Übertragung von Embryonen ist praktischanwendbar, jedoch ist die genaue und geübte Durchführung der Einzelschritte durch die

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