Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

29Verwendung der hohen Konzentrationen an Kryoprotektiva unabdingbar für eine erfolgreicheDurchführung dieser Gefriermethode. Eine Kryokonservierung von Eizellen und Embryonenkryosensibler Spezies (Schwein, Rind) scheint durch diese Methode erreichbar (VAJTA 2000).2.4.1.2 VitrifikationsmedienDie Zytotoxizität einer Lösung ist abhängig von der Konzentration der CPAs. Diehochkonzentrierten Medien, die zur Vitrifikation nötig sind, erhöhen die Wahrscheinlichkeit vonZellschäden des biologischen Materials (RALL 1987, VAJTA 2000). Die Kombination auspenetrierenden und nicht penetrierenden CPAs, wie auch penetrierender CPAs untereinanderbewirkt eine Toxizitätsverminderung durch die geringeren Einzelkonzentrationen der toxischenpenetrierenden Kryoprotektiva (FAHY et al. 1984, RALL 1987, SHAW u. JONES 2003). NebenPVP/PVA erwiesen sich Makromoleküle wie Dextrane und Ficoll durch ihre geringe Toxizität alsbesonders gut zur Kombination geeignet (SHAW et al. 1997). Der Zusatz von Sacchariden inVitrifikationslösungen dient zur Aufrechterhaltung der Osmolarität des Extrazellularraumes undDehydrierung des biologischen Materiales während der Äquilibrierung (KASAI et al. 1990, ALI etal. 1993a, KULESHOVA et al. 1999a). Sie werden meist in nicht-toxischen, niedermolarenKonzentrationen (bis 2 Mol/l) zugefügt. (Siehe Kap.2.2.2.1 Saccharide). Serumkomponenten wieFKS oder BSA stellen einen weiteren Bestandteil vieler Vitrifikationslösungen dar, ihreAnwendung soll zukünftig durch Makromoleküle in definierten Medien vermieden werden, da dieGefahr der Krankheitsübertragung sehr hoch ist (CARROL et al. 1993, VAJTA et al. 1999,DINNYES et al. 2000, ASADA et al. 2002). In hohen Konzentrationen von bis zu 20% schützen siedie Zellmembranen und Zona pellucida während des Abkühlens und verringern dieEiskristallbildung (RALL 1987, CARROLL et al. 1993, VAJTA et al. 1999). RALL u.FAHY (1985a) verwendeten in den ersten erfolgreichen Vitrifikationsversuchen an verschiedenenEmbryonalstadien von Mäusen Medien auf der Basis von Dulbecco´s phosphatgepufferterSalzlösung mit Serumsupplementierung. DMSO, Acetamid, PROH, GLY und Polyethylenglykolbildeten die CPAs (100%VS1, 90%VS1, VS2, VS3). DMSO und PROH haben sehr guteGlasbildungseigenschaften und penetrieren die Zellmembranen schnell, zur Kompensation derzytotoxischen Eigenschaften von DMSO setzten die Autoren Acetamid ein. Für murine embryonaleStadien und Oozyten wurde diese Medienzusammensetzung vielfach verwendet, doch die erzieltenErgebnisse blieben unzuverlässig, die Verfahren gelten als unpraktikabel und die Medien alstoxisch (FRIEDLER et al. 1987, VAN BLERKOM 1989, SHAW et al. 1990, 1991b). EineAdaptierung des Verfahrens zur Anwendung an Mäuseoozyten und maturen Rinderoozyten (DAP213-Medium) führte beim Rind zu einer Trächtigkeit (NAKAGATA 1989, HAMANO et al. 1992).

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