Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

32RALL 1987, FRIEDLER et al. 1988, LEIBO 1989). Dadurch kann das biologische Materialwährend des Kühlvorganges vitrifizieren und ist vor Gefrierschäden durch Eiskristallbildunggeschützt (VAJTA 2000). Die Konzentration, die intrazellulär nötig ist, um zu einer Glasbildung zuführen, ist geringer als die dafür nötige Konzentration im Extrazellularraum. Auch ist eine totalePenetration der Zelle nicht nötig, da sich durch die Dehydrierung die Konzentration anintrazellulären Proteinen erhöht und diese den Vitrifikationsvorgang positiv beeinflussen (FAHY etal. 1984, RALL 1987). Eine zu hohe Konzentration an CPAs in der Zelle führt wiederum zutoxischen Schäden, Lösungseffekten und osmotischen Schäden (RALL 1987, FRIEDLER etal. 1988, FAHNING u. GARCIA 1992, PAYNTER et al. 2005). Die Geschwindigkeit derPenetration ist durch die Art des CPAs, Spezies und Stadium des Materials gegeben und drückt sichdurch einen temperaturabhängigen Permeabilitätskoeffizienten aus (SZELL et al. 1989, AGCA etal. 1998, PFAFF et al. 1998, PEDRO et al. 2005). Je höher die Inkubationstemperatur ist, destoschneller penetrieren CPAs in die Zelle. Bei höheren Temperaturen steigt jedoch auch diebiochemische Toxizität der Kryoptotektiva an (KASAI et al. 1992, SHAW et al. 2000).Das Absenken der Inkubationstemperatur auf bis zu 4°C wurde von mehreren Autorenerfolgreich zur Vitrifikation von Embryonen und Oozyten kryotoleranter Spezies verwendet. DieseStadien können das kurzzeitige Verbleiben in diesem Temperaturbereich tolerieren und man konnteso Schäden durch Osmose und toxische Kryomedien verhindern (RALL u. FAHY 1985c, VANBLERKOM 1989, VANDERZWALMEN et al. 1989, SHAW et al. 1991b, KUWAYAMA etal. 1994, LANE et al. 1998, OHBOSHI et al. 1998). VAJTA et al. (1996) hielten die Inkubation beiniedrigen Temperaturen für die erfolgreiche Vitrifikation von IVP-expandierten Blastozysten in0,25 ml straws für unerlässlich und sahen die längere Verweildauer des biologischen Materials alsweiteren Vorteil, da genug Zeit für die Arbeitsschritte blieb. Die Verwendung verträglichererGefriermedien auf der Basis von EG machte die Äquilibrierung bei hohen Temperaturen möglich,und kryosensible Oozyten und Embryonen kryosensibler Spezies konnten konserviert werden(KASAI et al. 1990, 1992, 1996, ALI et al. 1993b, GUTIERREZ et al. 1993b, TACHIKAWA etal. 1993, AGCA et al. 1994, MAHMOUDZADEH et al. 1995, MARTINO et al. 1996b,NAGASHIMA et al. 1996, VAJTA et al. 1998a, DINNYES et al. 2000). VAJTA et al. (1999)zeigten, dass die Äquilibrierung von IVP-Blastozysten bei 35°C eine deutliche Verbesserung in derEntwicklungsfähigkeit zur Folge hatte, die Anwendung niedrigerer Temperaturen (20°C) musstedurch eine Verlängerung der Äquilibrierungszeit ausgeglichen werden.Das stufenweise Zufügen der CPAs beschrieb RALL (1987) als Mittel, um die intrazelluläreKonzentration der Kryoprotektiva zu steuern, kurze Inkubationszeiten verringern das toxischePotential der CPAs (KASAI et al. 1992, ALI et al. 1993b,c, GUTIERREZ et al. 1993b,

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