Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

33KUWAYAMA et al. 1994, SOMMERFELD u. NIEMANN 1999, PAPIS et al. 2000). Dasbiologische Material wird in Äquilibrierungslösungen mit niedrigen Konzentrationen anpenetrierenden, kryoprotektiven Substanzen verbracht, die mit geringer Toxizität in dasintrazelluläre Kompartiment diffundieren und ihre Schutzfunktion erfüllen können. Die meistenMethoden arbeiten mit Äquilibrierungslösungen in Konzentrationen von 50% derVitrifikationslösung oder darunter, die Inkubationsdauer variiert in Abhängigkeit der Methode(ISHIMORI et al. 1993, VAJTA et al. 1996, 1997a, 1998a, 1999, DONNAY et al. 1998, LAZAR etal. 2000, PUGH et al. 2000, NEDAMBALE et al. 2004). DINNYES et al. (2000) führten in ihrenUntersuchungen einen zweistufigen Äquilibrierungsprozess durch, dessen erste Stufe aus einerInkubation (15 Min) der maturen Rindereizellen in eine 4%-ige EG-Lösung bestand. NachVitrifikation und IVF erhielten sie Teilungsraten von 60% und eine Blastozystenrate von 20%. EineÄquilibrierungslösung von noch geringerer Konzentration (1%EG) verwendeten PAPIS etal. (2000) und konnten damit vergleichbar gute Ergebnisse erzielen (BR:13,8%). Je höher jedochdie Konzentration der Äquilibrierungslösung ist, desto kürzer muss die Zeitdauer der Inkubation desbiologischen Materials sein, damit es zu keiner Beeinträchtigung in der Weiterentwicklung kommt(LI et al. 2002, CHIAN et al. 2004, ALBARRACIN et al. 2005). VAJTA et al. (1998a) wählten beiKonzentrationen von 10% DMSO+10% EG Äquilibrierungszeiten von max. 45 Sekunden. DasAussetzen in die konzentrierte Vitrifikationslösung erfolgt nur für eine sehr kurze Zeitdauer (bismax. 1 Minute bei 30-37°C für Rindereizellen), dadurch wird einer zu hohen intrazellulärenKonzentration, übermäßigen Dehydration und osmotischen Schäden vorgebeugt (ARAV u.ZERON 1997, VAJTA et al. 1998a, PAPIS et al. 2000, ALBARRACIN et al. 2005). Die Anzahlder Äquilibrierungsschritte ist abhängig von der verwendeten Methode, Art des Kryomediums undSpezies und Stadium des biologischen Materials. KASAI et al. (1992) zeigten, dass sichMäuseembryonen nach Einsetzen in das Vitrfikationsmedium für 0,5 Min erfolgreich konservierenließen. OHBOSHI et al. (1998) untersuchten in-vitro bovine Blastozysten. Die Äquilibrierungumfasste zwei Schritte oder erfolgte durch direktes Einsetzen der Zellen in dasVitrifikationsmedium. Das two-step Verfahren erwies sich als besser, Kryoschäden zeigten sich ineiner Verringerung der Anzahl von Mikrovili, Integritätsverlust der Plasmamembran undAnschwellen des rauen, endoplasmatischen Retikulums. Drei Äquilibrierungsschritte führten zuhöheren Entwicklungsraten als das einstufige Verfahren (SAHA u. SUZUKI 1997). KUWAYAMAet al. (1994) beschrieben eine 16-stufige Äquilibrierung über einen Gesamtzeitraum von 18 Min fürin-vitro bovine Blastozysten bei 15°C und zeigten, dass diese einer zweistufigen Methode überlegenwar (ÜR: >80% vs. 0%). Für beide Verfahren wiesen die Autoren eine vollständige Vitrifikationder Probe nach und konnten so Schäden durch Eiskristalle ausschließen. Bei Verwendung schneller

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