Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

37maximale Werte von 86% und nahm mit weiterer Erhöhung beider Raten signifikant ab. Die Wahleiner höheren Kühlrate in Kombination mit der zuvor als optimal festgestellten Erwärmungsrateführte zu Einbrüchen in der Überlebensfähigkeit der Eizellen (49%), bei Verwendung höhererErwärmungsraten bei optimaler Kühlrate blieben die Überlebensraten unbeeinflusst.KULESHOVA u. SHAW (2000) kühlten Mäusezweizeller mit ~2500°C/Min und mit~400°C/Min. Weder langsames Kühlen, schnelles Auftauen (>300°C) noch Kombinationen derbeiden Verfahren zeigten sich den verwendeten Methoden mit ultrahohen Kühl- undErwärmungsraten unterlegen, allerdings wiesen die Autoren darauf hin, dass es während desAuftauens zu Devitrifikation in den Lösungen kam. Bei völliger Vitrifikation während des Kühlenswurde dies jedoch als tolerabel angesehen (SHAW et al. 1991a). Langsame Kühlraten von ~200°Cbei hohen Erwärmungsraten reichten aus, um humane Vorkernstadien erfolgreich zu vitrifizieren(ISACHENKO et al. 2005). Für ovine GV- Oozyten erwies sich diese Vorgehensweise jedoch alsnicht geeignet, eine Kombination aus ultraschnellem Abkühlen und schnellem Erwärmen hieltenISACHENKO et al. (2001a) für notwendig.2.4.1.5 Vitrifikationsverfahren und BehälterDie technisch erreichbaren Kühlraten bei der Vitrifikation von biologischem Material sind abhängigvon der Art des verwendeten Behälters zur Kühlung und Lagerung der Probe in flüssigem N 2(VAJTA 2000). Ausgehend von den meist mit Vitrifikationsvolumina von 20µl gefülltenPlastikpailletten führte die Technik der Verringerung des Probenvolumens (Minimum drop size,MDS) zu verbesserten Vitrifikationsergebnissen durch das Erreichen höherer Kühl- undErwärmungsraten vor allem in der Anwendung an Oozyten (STEPONKUS et al. 1990, MARTINOet al. 1996b, ARAV u. ZERON 1997, VAJTA et al. 1998a). Der Rückgang an Zonafrakturen trotzhoher Abkühl- und Erwärmungsraten und das geringere Auftreten von Devitrifikation wurdeebenfalls als Folge des geringen Volumens (max. 4 µl) gesehen (VAJTA 2000, SHAW u.JONES 2003). Als moderne Verfahren zur Vitrifikation von immaturen und maturen Oozytenwerden vorwiegend MDS-Techniken wie open pulled straw (OPS), das Abkühlen auf in N 2gekühlten Oberflächen (solid surface vitrification, SSV), die Abkühlung auf Metallgittern (electronmicroscop grids) und Nylonnetzen oder Nylonschlingen (cryoloop, nylon mesh) verwendet(STEPONKUS et al. 1990, MARTINO et al. 1996b, VAJTA et al. 1997a,b, 1998a,b, 1999,DINNYES et al. 2000, MAVRIDES u. MORROLL 2002). Alle diese Verfahren beruhen auf einemmöglichst direkten Kontakt zwischen dem flüssigen Stickstoff und dem biologischen Material.

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