Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

40die Membranpermeabilität temperaturunabhängig für Wasser höher als für CPAs ist (PAYNTER etal. 1999b). Es kommt zu einem Anschwellen des biologischen Materials in Abhängigkeit vonTemperatur und Konzentration der extrazellulären Lösung. Die dabei auftretendenVolumenänderungen können das biologische Material schädigen (MAZUR u. SCHNEIDER 1986,MULLEN et al. 2004). Spezies- und stadiumbedingte Unterschiede in Permeabilitätseigenschaftender Zellmembran bedingen eine unterschiedliche osmotische Toleranz (MAZUR u.SCHNEIDER 1986, ODA et al. 1992, PEDRO et al. 1997, AGCA et al. 2000).Die Ausverdünnung kann direkt im isotonen Medium durchgeführt werden (directrehydration), bedingt aber durch den großen Konzentrationsunterschied zwischenVitrifikationslösung und Kulturmedium hohen osmotischen Stress. Eine Möglichkeit, osmotischenSchäden während der Ausverdünnung vorzubeugen, ist der Zusatz von Sacchariden in dasÄquilibrier- und Ausverdünnungsmedium (LEIBO 1984, RALL 1987, ODA et al. 1992).Mäuseembryonen, die eine größere osmotische Toleranz zeigen als frühere Stadien, tolerierten diedirekte Dilution ohne Einbußen in der Überlebensfähigkeit (KASAI et al. 1992, 1996), dieAnwendung der direkten Rehydrierung für die Vitrifikation von Embryonen von Pferden, Schafen,Rindern und Ratten wurde beschrieben (VAJTA et al. 1996, DONNAY et al. 1998,SOMMERFELD u. NIEMANN 1999, ISACHENKO et al. 2003b, DATTENA et al. 2004,ELDRIDGE-PANUSKA et al. 2005). In Anlehnung an ein one-step Verfahren der konventionellenGefriermethode mit EG beim Rind wurden auch in der Vitrifikation boviner Blastozysten solcheAusverdünnungsverfahren eingesetzt (VOELKEL u. HU 1992). Die vereinfachte Handhabung undschnellere Dilution im straw ermöglichte den praktischen Einsatz im bovinen Embryotransfer mitvergleichbaren oder besseren Trächtigkeitsraten als mit konventionellen Verfahren (SAHA etal. 1996b, VAJTA et al. 1997a, PUGH et al. 2000). Auch für die Vitrifikation ovinerPronuklearstadien und Schafoozyten erwies sich die direkte Rehydrierung als geeignet(ISACHENKO et al. 2001a, 2003a, 2004). PAPIS et al. (2000) verbrachten mature, bovine Oozytennach Vitrifikation direkt in isotones Medium, die Weiterentwicklung in der in vitro-Kultur ergabeine TR von 55%, 13,8% erreichten das Blastozystenstadium.Eine weitere Möglichkeit besteht in der stufenweisen Ausverdünnung, die Kombination derAnwendung hypertoner Lösungen (Saccharide) mit stufenweiser Ausverdünnung vor Überführungin das isotone Kulturmedium ist die am häufigsten angewandte Methode. AGCA et al. (1994)verwendeten vier Schritte mit abnehmender Sukrosekonzentration und erhielten TR von 63%,vergleichbar mit Ergebnissen aus der Übertragung frischer boviner IVP-Embryonen. Ebensobeschrieben wurden Verfahren mit drei, zwei und einem Ausverdünnungsschritt (ISHIMORI etal. 1993, TACHIKAWA et al. 1993, KUWAYAMA et al. 1994, WURTH et al. 1994,

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