Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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42erfolgt in zwei und drei Schritten (HURTT et al. 2000, MATSUMOTO et al. 2001, VIEIRA et al.2002). ABE et al. (2005) verglichen die Ausverdünnung einer auf EG basierendenVitrifikationslösung mit 0,3 molarer Trehalose oder Sukrose und konnten zeigen, dass sich zwarkein signifikanter Unterschied in der TR ableiten ließ, Blastozysten bildeten sich jedoch nur beiVerwendung von Sukrose im Ausverdünnungsmedium.2.4.2 DevitrifikationAls Devitrifikation bezeichnet man die Bildung von Eiskristallen in zuvor erfolgreich vitrifiziertenLösungen während des Erwärmens (BOUTRON u. KAUFMANN 1978). Selbst beim Abkühlenvon Lösungen bis zur Glasbildung kann es zur Formierung von kleinsten Eiskristallkernenkommen. Deren Anzahl und Größe bleibt dabei aber so klein, dass diese weder durchkalorimetrische Methoden noch durch Röntgen festgestellt werden können und dieVitrifikationslösung klar und durchsichtig bleibt (SHAW u. JONES 2003). Durchläuft dasbiologische Material während des Erwärmens mit zu niedrigen Raten kritische Temperaturbereiche(ab -90°C), können Eiskerne wachsen und zur Formierung von Eiskristallen führen (SHAW etal. 1995, SHAW u. JONES 2003). Ultraschnelle Erwärmungsraten können dies verhindern, da biszum Erreichen von physiologischen Temperaturen nur Sekunden vergehen und die Zeit zur Bildungvon Eiskristallen nicht ausreicht (STEPONKUS et al. 1990, MARTINO et al. 1996b).Erwärmungsraten von >400°C/Min, hohe Kühlraten, konzentrierte Gefriermedien und dasVerwenden kleinster Volumina sorgen für, dass sowohl die Bildung von Eiskristallen während desAbkühlens, als auch die Devitrifikation unterbleibt (FAHY et al. 1984, RALL 1987, WOLFE u.BRYANT 1999).2.4.3 Stadien und SpeziesIm Vergleich zu Embryonen ist das Volumen einer Eizelle größer, das Verhältnis Zelloberflächezum Volumen kleiner, was dazu führt, dass Eizellen langsamer dehydrieren als embryonale Stadien(PARKS u. RUFFING 1992). Die Permeabilität der Zellmembran für Wasser und CPAs nimmt mitsteigender Entwicklung von unreifer Eizelle bis Embryo zu, unterschiedliche Stadien haben alsoauch unterschiedliche Permeabilitätsmerkmale (SCHNEIDER u. MAZUR 1986, ODA et al. 1992,PEDRO et al. 1997, AGCA et al. 1998, 2000, PEDRO et al. 2005). Eine Zunahme der embryonalenMembranstärke ist zusätzlich verantwortlich für eine erhöhte Stabilität und dadurch Resistenzgegenüber osmotischen Volumenveränderungen späterer, embryonaler Stadien (CHEN et al. 2003).Embryonen aus der IVP besitzen im Vergleich zu in vivo generierten Stadien eine geringereToleranz gegenüber Kryokonservierungsverfahren (LEIBO u. LOSKUTOFF 1993). Die

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