Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

563 Material und Methoden3.1 Material3.1.1 Biologisches MaterialIm Zeitraum von November 2003 bis Juni 2005 wurden Eierstöcke von Schlachtrindern aus nahegelegenen Schlachthöfen gesammelt. Daraus wurden KOKs isoliert und für die nachfolgendenUntersuchungen eingesetzt.3.2 Methoden3.2.1 Entnahme der EierstöckeDie benötigten Ovarien stammten aus nahe gelegenen Schlachthöfen, wobei sie direkt amSchlachtband mit einer Schere vom Mesovar getrennt und sofort in eine, mit 39°C temperierterphysiologischer Kochsalzlösung (0,9%) und Streptomycinzusatz (0,5 ml/l) befüllteThermoskanne gegeben wurden. Pro Kanne konnten 50 bis 60 Ovarien transportiert werden. DieProben wurden innerhalb von 3 Stunden ins Labor gebracht und dort verarbeitet.3.2.2 Gewinnung der EizellenIm Labor wurden die Eierstöcke zunächst mit auf 39°C vorgewärmtem, 70%igem Alkohol(Ethanol) gereinigt und danach noch zweimal mit ebenfalls vorgewärmter, physiologischerKochsalzlösung gewaschen. Die Gewinnung der Eizellen erfolgte durch Punktion und Aspirationdes Follikelinhaltes. Dafür wurden nur Follikel verwendet, die einen Durchmesser von 2 bis 8mm hatten. Die Punktion wurde mit einer Einmalspritze und einer Einmalkanüle durchgeführt.Die Punktionsflüssigkeit wurde in einem Falcon-Röhrchen, das auf einem auf 39°C temperiertenWärmeblock stand, gesammelt, und während des Punktionsvorgangs konnte die bereitsgewonnene Flüssigkeit und darin enthaltene KOKs sedimentieren. Unter einem Stereomikroskopwurden die KOKs aus dem Sediment entnommen und in Modifiziertes Parker Medium (MPM)verbracht. Nach der Entnahme des ersten Sediments wurde die Punktionsflüssigkeit in einerZentrifuge bei 250g anzentrifugiert und das dabei gewonnene Sediment ebenfalls auf KOKsuntersucht. Die entnommenen Kumulus-Oozyten-Komplexe wurden dreimal in MPM gewaschenund danach nach Qualitätsmerkmalen sortiert.3.2.3 Qualitätsbeurteilung der EizellenDie Selektion der immaturen Eizellen erfolgte direkt im Anschluss an die Gewinnung undnachdem sie gewaschen wurden, mature Oozyten wurden nach 22stündiger Maturation in MPMunter Zugabe von östrischem Kuhserum (ÖCS) beurteilt. Das Auswahlverfahren wurde immer

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