Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

58Abb. 3: bovine GV-Oozyte Klasse 3 Abb. 4: bovine mature Oozyte Klasse 3200fache Vergrößerung200fache Vergrößerung3.2.4 In-vitro-Maturation ( IVM ) der OozytenDie selektierten KOKs wurden gruppenweise (Gruppengröße = 50 Eizellen) in eine mitMaturationsmedium (400 µl/well) vorbereitete Schale (4-well Multidish) verbracht. Jedes wellwurde mit Follikelstimulierendem Hormon (FSH-p) in einer Konzentration von 10µg/mlversetzt. Um eine zu große Verdunstung und damit eine Osmolaritätsveränderung zu vermeidenwurde abschließend jedes well mit Mineralöl überschichtet. Medium und Mineralöl wurden dannbei 39°C und 5% CO 2 im Inkubator für mindestens eine Stunde bis zum Einsetzen der Eizellenäquilibriert. Die Dauer der Maturation betrug 22 Stunden.3.2.5 In-vitro-Fertilisation ( IVF )3.2.5.1 Aufbereitung des SpermasFür die Durchführung der IVF wurde für jede Versuchsgruppe Tiefgefriersperma desselbenBullen genutzt. Die Aufbereitung erfolgte nach der Swim-up-Technik modifiziert nachPARRISH et al. (1986).Das Kapazitationsmedium wurde aus 8 ml Kapazitations-Stocklösung hergestellt, die mit1 mM Na-Pyruvat und 6 mg/ml BSA versetzt wurde. Anschließend wurde die Lösung sterilfiltriert und jeweils 1,7 ml in ein 4,5 ml Zentrifugenröhrchen gegeben. Die Äquilibrierungerfolgte im Brutschrank bei 39°C, 5% CO 2 . Die Spermaportionen wurden im Wasserbad für 10Sekunden bei 40°C aufgetaut, abgetrocknet und mit einer Schere an der Stopfenseite geöffnet.Eine 1 ml Spritze wurde verwendet, um den Strawinhalt auszublasen und dasKapazitationsmedium mit der Spermaportion zu unterschichten. Die Röhrchen wurden in einemAnstellwinkel von 45° in den Inkubator verbracht und blieben dort bei 39°C und 5% CO 2 für 50Minuten. Befruchtungsfähige Spermien konnten so in das oben gelegene Kapazitationsmedium

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