Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

59aufschwimmen. Der Medienüberstand wurde vorsichtig abgenommen und in ein vorgewärmtes,steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Dieses wurde bei 250g über 10 Minutenzentrifugiert und der dabei entstandene Überstand abpipettiert und verworfen. Das erhalteneSpermapellet wurde in 100 µl Kapazitationsmedium resuspendiert. Die Motilität wurde anhandder Massenbewegung subjektiv beurteilt, in Prozent angegeben, und mittels einer Neubauerimproved- Zählkammer konnte die Anzahl der Spermien pro Milliliter festgestellt werden. Dazuwurden 198 µl destilliertes Wasser aus einer Milli-Q-Anlage und 2 µl des Pellets miteinandergemischt und mit der entstandenen Suspension die Zählkammer gefüllt. Nach Auszählen derSpermien auf den vier Quadraten in den Ecken der Zählkammer bei 200-facher Vergrößerungunter dem Mikroskop wurde der Mittelwert pro Quadrat ermittelt. Mit Hilfe dieses Wertes undder unten stehenden Formel konnte berechnet werden, wie viel µl der Spermiensuspension denEizellen eines wells zugegeben werden musste, um eine Endkonzentration von 1 Mio.Spermien/ml zu gewährleisten.800 / Mittelwert der Spermienzahl pro Quadrat = µl Spermiensuspension pro well3.2.5.2 Aufbereitung der Eizellen und KoinkubationWährend der Aufbereitung des Kryospermas wurden die maturierten Oozyten in das vorbereiteteund äquilibrierte Fertilisationsmedium verbracht. 5 ml Fertilisations-Stockmedium wurden mit30 mg BSA, 50 µl Natriumpyruvat und 10 µl Heparin versetzt, steril filtriert und jeweils 400 µlder Lösung in eine Multischale gegeben und mit Mineralöl überschichtet. Die Äquilibrierungerfolgte im Brutschrank bei 39°C, 5 % CO 2 und 95 % Umgebungsluft. Die maturierten Oozytenwurden drei Mal in Fertilisationsmedium gewaschen und in Gruppen zu je 50 Eizellen pro wellumgesetzt. Die Spermienzugabe erfolgte in einer Konzentration von 1 Million Spermien proMilliliter. Die Kokultivierung der Oozyten und Spermien wurde im Inkubator über 18 Stundendurchgeführt.3.2.6 In-vitro-KultivierungNach Beendigung der 18-stündigen Inkubation von Eizellen und Sperma wurden die Zygotenaus dem Fertilisationsmedium entnommen und gruppenweise in Kulturmedium verbracht. Fürdie Zubereitung des Kulturmediums wurden 9 ml des CR1-Stockmediums mit 1 ml ÖCSgemischt und mit 200 µl Basal Medium Eagle (BME) und 100 µl Minimum Essential Medium(MEM) versetzt. Die Lösung wurde steril filtriert, je 400 µl pro well in eine Multidishschaleverbracht und mit Mineralöl überschichtet. Um die restlichen Spermien und möglichst alle noch

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