Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

60anhaftenden Kumuluszellen zu entfernen, wurden die Eizellen in 1 ml Kulturmediumsuspendiert, in ein vorgewärmtes 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben und für 2 Minutengevortext. Aus dieser Lösung wurden die Eizellen unter mehrmaligem Spülen zurückgewonnenund dreimal in Kulturmedium gewaschen. Danach wurden die Eizellen in das Kulturmediumgegeben. Für die weitere Entwicklung verblieben die Zygoten im Inkubator bei 39°C, 5 % CO 2und einer Umgebungsluft von 95 %. 72 Stunden nach der Fertilisierung wurde die Teilungsrateerfasst, jeweils vom 7. bis zum 10. Tag nach der Fertilisierung wurde die morphologischeEntwicklung beurteilt und als Blastozystenrate erfasst.3.2.7 Vitrifikationsversuche3.2.7.1 Vorbereitung des ArbeitsplatzesAlle Arbeitsschritte während der Vitrifikation und Ausverdünnung wurden an einem auf 39°Cgeheizten Arbeitstisch durchgeführt. Die Arbeitstemperatur in den Lösungen derMultidishschalen wurde mit einem Thermometer kontrolliert und betrug konstant 37°C. DieVorbereitung begann mit einer gründlichen Reinigung mit 70 %igem Alkohol, danach wurdenalle Materialien zur Vitrifikation bereitgelegt. Als Verpackungsstraws dienten 0,5 mlKunststoffpailletten (French straw). Diese wurden mit einem Verschweißungsgerät an einer Seiteverschlossen und die Dichte des Verschlusses unter dem Mikroskop bei 50facher Vergrößerungkontrolliert. Zum Verschließen der zweiten Öffnung des 0,5 ml straws wurden Metallkügelchenvorbereitet. Direkt vor Beginn wurde eine Thermoskanne mit flüssigem Stickstoff für das„plunging“, das unmittelbare Eintauchen der Probe in flüssigen Stickstoff vorbereitet. In dieKanne wurde ein 50 ml Zentrifugenröhrchen getaucht, das zu jeder Zeit vollständig mitflüssigem Stickstoff bedeckt war. Dieses Röhrchen wurde beschriftet und im oberen Teil mitLöchern versehen. Durch diese Löcher konnte Stickstoff ins Innere der Röhrchen gelangen, unddamit wurde gewährleistet, dass die Proben auch während des Umsetzens in denLagerungscontainer mit Stickstoff bedeckt blieben.3.2.7.2 Kennzeichnung der OPSFür die OPS-Vitrifikation wurden diese an ihrem dickeren Ende markiert und konnten somiteinfach identifiziert werden. Bei der aseptischen Vitrifikation wird nach der so genannten „strawin straw-Methode“ vorgegangen, d.h. der OPS wird nochmals in einer 0,5 ml Plastikpailletteversenkt. Auch hier wurde der open pulled-straw an seinem dickeren Ende markiert, dieIdentifizierung der Probe erfolgte durch Beschriftung der Plastikpaillette. Die Markierung desOPS diente beim Erwärmen zur Orientierungshilfe zum Erkennen der Stelle, an der der Frenchstraw eröffnet werden konnte, ohne den OPS zu beschädigen.

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