Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

62Holdingmedium:Das Holdingmedium basierte ebenfalls auf der Grundlage von D-PBS und hatte einenSerumanteil von gleichfalls 20 % (v/v) FKS. Auch hier erfolgte die Aufbewahrung bis zumVerbrauch im Wärmeschrank ohne Begasung für mindestens 1 Stunde bei 39°C.Ausverdünnungsmedium ( 10 ml ):Es bestand aus D-PBS + 0,5 mol/l Sukrose + 20 % (v/v) FKS und wurde durch Lösen von1,71 g Sukrose in 7 ml D-PBS hergestellt, das mit 2 ml FKS versetzt und steril filtriert wurde.Die Aufbewahrung bis zum Gebrauch erfolgte bei 39°C im Wärmeschrank.3.2.7.4 Aufbereitung der Kumulus-Eizell-Komplexe (KOK)• Vitrifikation von partiell denudierten maturierten OozytenNach Beenden der 22stündigen Maturation wurden die KOKs aus dem Maturationsmediumgenommen und mit Hyaluronidase (1 mg/ml) versetzt. Durch wiederholtes Pipettieren der KOKsmit einer Pipette, deren Lumen etwas enger als der durchschnittliche Durchmesser der Kumulus-Eizell-Komplexe war, erfolgte ein Ablösen der äußeren Kumuluszellschichten. Als partielldenudierte Oozyten fanden nur solche Eizellen Eingang in die Versuche, deren Kumulus 5 bis 2Zellschichten umfasste. Vor Beginn der Vitrifikation wurden die Oozyten in Holdingmediumgewaschen, um aus dem Maturationsmedium übertragenes Mineralöl zu entfernen.• Vitrifikation von maturierten Oozyten mit KumuluszellenNach Beenden der 22stündigen Maturation wurden die KOKs aus dem Maturationsmediumgenommen und nach dreimaligem Waschen in Holdingmedium mit den umliegendenKumuluszellen vitrifiziert.• Vitrifikation von immaturen Oozyten mit KumuluszellenFür die Versuche an Oozyten im Germinalvesikelstadium erfolgte die Bearbeitung der KOKsdirekt nach der Gewinnung aus der Punktionsflüssigkeit, dreimaligem Waschen und derKlassifizierung. Die partielle Ablösung der Kumuluszellen unterblieb bei diesen Versuchen unddie Vitrifikation fand unter Einschluss dieser Zellschichten statt.3.2.7.5 Aseptische VitrifikationDiese Methode erforderte drei Äquilibrierungsschritte und den Vitrifikationsschritt. Unmittelbar,bevor die Eizellen in das Medium eingesetzt wurden, wurden die Lösungen für dieÄquilibrierungsschritte zusammengestellt. Dafür wurden in eine vorgewärmte Multidishschale(5-well-Schale) drei vorbereitete Lösungen verbracht. Well 1 enthielt für die Durchführung des

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