Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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63ersten Äquilibrierungsschrittes eine 20 %ige Lösung aus Holdingmedium undVitrifikationsmedium, well 2 und 3 jeweils eine 33 %ige bzw. eine 50 %ige Lösung. In well 4wurden jeweils 120 µl unverdünntes Vitrifikationsmedium verbracht, und ein separater Tropfenvon maximal 4 µl Vitrifikationsmedium wurde in das noch verbleibende mittlere well gegeben.Sehr wichtig bei dieser Vorbereitung war das mehrfache Durchmischen der Medien durchdauerhaftes Pipettieren, da die beiden Ausgangsmedien sehr starke Tendenzen zeigten, sich zuentmischen. Dies konnte an der Bildung von Schlieren, die unter dem Mikroskop sichtbarwurden, erkannt werden. Nach dreimaligem Waschen der Oozyten in Holdingmedium, um einVerschleppen von Mineralöl aus dem Maturationsmedium zu verhindern, wurden in zufälligerFolge jeweils maximal fünf Eizellen pro Durchgang verwendet. Dies ließ genügend Zeit, um denPipettiervorgang so genau und schonend wie möglich durchzuführen. Zum Überführen derEizellen wurde eine Glaskapillare mit gut abgestimmtem Durchmesser verwendet, um so wenigMedium wie möglich zu verschleppen. Durch die Dichteunterschiede in den einzelnen Lösungenhatten die Eizellen die Tendenz, nach oben aufzuschwimmen, und es war von Vorteil, sie sovielwie möglich zu bewegen. Die Verweildauer in den wells 1 bis 3 umfasste jeweils 1 Minute, dieOozyten wurden im well 4 in 100 %iger Vitrifikationslösung nur kurz gehalten und sofort in den4 µl Tropfen gebracht. Von dort wurden die Eizellen mittels Kapillarkraft in den OPSaufgenommen. Der OPS wiederum wurde mit seinem engen Ende nach unten in den an einerSeite zugeschweißten 0,5 ml Kunststoffstraw gepackt. Die zweite Seite wurde nun durch einMetallkügelchen hermetisch verschlossen und die Probe in flüssigen Stickstoff getaucht. DieZeitdauer von der Vitrifikation bis zum Eintauchen in Stickstoff betrug maximal 50 Sekunden,das Volumen der Probe umfasste bis 2 µl. Die Abkühlrate bei dieser Methode betrug200°C/min (ISACHENKO et al. 2005).Abb. 5: Verpackung und Verschluss des OPS in 0,5ml straw bei aseptischer Vitrifikation3.2.7.6 OPS-VitrifikationBei dieser Methode wurde nur das Vitrifikationsmedium D+E verwendet. Die Äquilibrierungerfolgte in der Lösung D-PBS + 10 % EG + 10 % DMSO + 20% FKS und dauerte maximal 30bis 45 Sekunden. Der Vitrifikationsschritt wurde im unverdünnten Vitrifikationsmedium D+Edurchgeführt, die Oozyten wurden nur kurz darin gehalten und in einen 4 µl großen Tropfen desMediums gebracht. Jeweils fünf Eizellen wurden über Kapillarwirkung in den OPSaufgenommen, die Zeit zwischen Kontaktbeginn der Eizellen mit dem Vitrifikationsmedium und

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