Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

64dem Eintauchen in flüssigen Stickstoff ohne weitere Verpackung betrug ca. 25 Sekunden. DasProbenvolumen betrug bis zu 2 µl, und die Abkühlrate dieses Verfahrens betrug 20 000°C/min.Bei beiden Methoden erfolgte das Eintauchen in den Stickstoff zuerst mit dem Bereich, indem sich die Probe befand. Durch die Wärme des straws bildete sich kurzzeitig ein gasförmigesStickstoffpolster, das den Temperaturaustausch verzögert. Nach erfolgtem Wärmeaustauschwurde der gesamte straw senkrecht im flüssigen Stickstoff versenkt und bis zum Erwärmen ineinem Tiefgefriercontainer gelagert.3.2.7.7 ErwärmungZunächst wurden die Proben aus dem Lagerungscontainer genommen und in eine mit flüssigemStickstoff gefüllte Thermoskanne überführt. War der OPS, der die Probe enthielt, nochmals miteinem Verpackungsstraw umhüllt (aseptische Vitrifikation), wurde dieser eröffnet, ohne dieProbe aus dem Stickstoff herauszuheben. Mit einer Pinzette wurde der straw gerade soweit ausdem Flüssigkeitsspiegel des Stickstoffs hervorgezogen, dass die Markierung, die an der dickenSeite des OPS angebracht war, sichtbar wurde. Unmittelbar darüber wurde derVerpackungsstraw mit einer Schere abgeschnitten, und mit einer feinen Pinzette wurde danachder OPS aus dem Verpackungsstraw und aus dem Stickstoff entfernt und direkt in einMikrozentrifugenröhrchen überführt, das 1,5 ml unverdünntes Ausverdünnungsmedium enthielt.Das Ausverdünnungsmedium stieg durch kapillare Wirkung im OPS auf, und dieVitrifikationssäule wurde innerhalb von 1 bis 2 Sekunden flüssig und durchsichtig. Sofort wurdedas Ansatzstück eines Mikropettors auf den OPS aufgesetzt und durch Drehung um 90° fixiert.Danach wurden die Eizellen unter mikroskopischer Kontrolle in eine vorgewärmte und mit 300µl unverdünntes Ausverdünnungsmedium befüllte Petrischale ausgeblasen. Aus dieser Lösungwurden die Eizellen schnellstmöglich in eine weitere, vorgewärmte und mit 300 µlAusverdünnungsmedium befüllte Petrischale überführt, um die Konzentration der bei derErwärmung freigewordenen Kryoprotektoren im Medium gering zu halten und eine toxischeSchädigung der Eizellen zu vermeiden. Diese Arbeitsschritte wurden in einer Zeitdauer von 3Minuten durchgeführt. Pro Durchgang wurden vier Proben bearbeitet. Die Erwärmung des OPSohne weitere Verpackung erfolgte durch schnelles Überführen der Probe vom flüssigenStickstoff in die mit Ausverdünnungsmedium befüllten Eppendorfröhrchen. Die weiterenArbeitsschritte erfolgten analog zum Erwärmen nach aseptischer Vitrifikation.3.2.7.8 TitrationsausverdünnungFür diese Methode wurde Holdingmedium und Ausverdünnungsmedium wie folgt verwendet:300 µl Ausverdünnungsmedium (0,5 mol/l Sukroselösung in D-PBS) wurde in eine Petrischale

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