Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

67befreit. Die denudierten Eizellen wurden in Gruppen von maximal 50 Stück in das vorbereiteteIonomycin-Aktivierungsmedium verbracht und darin für 4 Minuten suspendiert. Danach wurdensie aus dem Medium genommen, drei Mal in CR1aa Medium gewaschen und in DMAP-Aktivierungsmedium überführt. Dort verblieben sie für 4 Stunden und wurden nach weiteremdreimaligem Waschen in das Kulturmedium gebracht. 48 Stunden später wurden dieentstandenen Teilungsstadien morphologisch beurteilt, die Teilungsrate erfasst und am Tag 7 bis10 die Blastozystenrate gezählt.3.2.8.4 Morphologische UntersuchungDie Beurteilung der Morphologie immaturer und maturer Eizellen erfolgte direkt nach demErwärmen bzw. nach Rekultur für 2 Stunden in MPM und umfasste die Beurteilung derKumuluszellen, Zona pellucida und des Zytoplasmas. Die Kumuluszellen wurden auf ihrestrukturelle Beschaffenheit, Verband zwischen den Kumuluszellen und zwischen Cumulus undOozyte überprüft. Des Weiteren wurde auf Farbveränderungen geachtet. Bei der Zona pellucidawurde die Integrität beurteilt, besonders das Auftreten von Rissen wurde vermerkt. Diemorphologische Beurteilung umfasste besonders Veränderungen des Zytoplasmas im Hinblickauf Struktur, Farbe und Größe im Vergleich zu Kontrolleizellen. Die Beurteilung erfolgte alsProzentangabe bezogen auf die Gesamteizellzahl unter 50 und 100facher Vergrößerung amStereomikroskop.3.2.8.5 DNA-Färbung mit Hoechst 33342Vitrifizierte und erwärmte immature KOKs wurden für 22 Stunden in MPM versetzt mit p-FSH(4,5 µl/well) unter Öl bei 39°C und 5 % CO 2 im Inkubator maturiert. Wurde der Versuch mitbereits maturierten KOKs durchgeführt, erfolgte dies in direktem Anschluss an einezweistündige Rekultur in MPM unter Öl. Danach wurden die KOKs denudiert, indem siegruppenweise (maximal 50 Oozyten pro Gruppe) in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführtwurden, das mit 1 ml vorgewärmter Hyaluronidase befüllt war. Die Eizellen wurden ca. 1Minute gevortext, bis eine vollständige Ablösung der Kumuluszellen unter dem Mikroskop(50fache Vergrößerung) zu sehen war. Die vollständige Ablösung der Kumuluszellen war vongroßer Bedeutung, da anhaftende Kumuluszellen sich sehr gut mit dem Farbstoff anreichertenund so durch ihre starke Fluoreszenz unter dem Mikroskop die Beurteilung derChromatinkonfiguration der Eizellen stören konnten. Gruppenweise wurden die Oozyten wiederin Multidishschalen verbracht, die mit MPM (400 µl/well) versetzt mit Hoechstfarbstoff 33342(20 µl/well) befüllt waren. Durch mehrmaliges Pipettieren der Oozyten im Medium wurden dieEizellen im Farbstoff suspendiert und für 10 Minuten im Inkubator bei 39°C, 5 % CO 2 und 95 %

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