Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

2immaturen Oozyten und der Auto- oder Xenotransplantation zu einem späteren Zeitpunkt wäre einzukünftiges Anwendungsfeld (NAWROTH et al. 2004).Säugetiereizellen haben einzigartige Eigenschaften und Strukturen, die eine Konservierung inflüssigem Stickstoff erschweren (LEDDA et al. 2001, MULLEN et al. 2004). Oozyten sind sehrgroße Zellen mit einem für die Kryokonservierung ungünstigen Oberflächen-Volumen-Verhältnis.Zahlreiche Studien belegten die Kältesensibilität der meiotischen Spindel maturer Oozyten(PICKERING u. JOHNSON 1987, PICKERING et al. 1990, AMAN u. PARKS 1994). WeitereAngriffspunkte für Kryoschäden bilden Membranen, Mikrotubuli, das Zytoskelett und die Zonapellucida (JOHNSON et al. 1988, ARAV et al. 1996, SAUNDERS u. PARKS 1999, SHAW etal. 2000). Auch zytotoxische Schädigungen durch kryoprotektive Substanzen wurden beschrieben(SATHANANTHAN et al. 1988, VINCENT u. JOHNSON 1992, SAUNDERS u. PARKS 1999).Unterschiede in Formation und Gehalt an intrazellulären Lipiden von Oozyten und Embryonenbedingen eine speziesabhängige Kryosensibilität (LIEBERMANN et al. 2002a). Der Versuch, diesestadienbedingten Schwierigkeiten zu umgehen, indem man GV-Oozyten, deren Chromosomendurch die Kernmembran geschützt sind und die keine Metaphasespindel aufweisen,kryokonserviert, erwies sich als nicht erfolgreich. Immature Oozyten zeigten sich kryosensibler alsmature Stadien (MARTINO et al. 1996a, WU et al. 1999).Einige Autoren berichteten von Erfolgen durch konventionelles Tiefgefrieren von maturenund immaturen Rinderoozyten (FUKU et al. 1992, LIM et al. 1992, SUZUKI et al. 1996). NeuereVerfahren (ultra rapid freezing) verwendeten höhere Kühlraten, die damit erzielten Ergebnissewaren vielversprechend, blieben aber oft schlecht reproduzierbar (STEPONKUS et al. 1990,MARTINO et al. 1996b). Das Verwenden von ultraschnellen Kühlraten mittels Vitrifikation scheintdie für Oozyten geeignetste Methode darzustellen (VAJTA et al. 1998a,b, LE GAL und MASSIP1999, DINNYES et al. 2000, HURTT et al. 2000, LI et al. 2002, MAVRIDES u. MORROLL 2002,HOCHI 2003, CHIAN et al. 2004, ABE et al. 2005). Das dabei verwendete Verfahren derVitrifikation beruht auf dem Verbringen von minimalen Volumina direkt in flüssigen N 2 oderStickstoffdampf bei -196°C bis -210°C, die erzielten Kühlraten und Auftauraten betragen~20 000°C/Minute. Als einen Schwachpunkt dieser Methode sehen einige Autoren den direktenKontakt zwischen flüssigem N 2 und organischem Material an (VAJTA et al. 1998b, KULESHOVAu. SHAW 2000, ISACHENKO et al. 2005). BIELANSKI et al. (2000) berichteten darüber, dasseine Kontamination von in N 2 gelagerten Embryonen durch pathogene Viren erfolgte, und auch dieKonservierung in N 2 -Dampf verringert das Kontaminationsrisiko nicht (FOUNTAIN et al. 1997).Verfahren, bei denen eine Kontamination durch Kühlung und Lagerung ausgeschlossen wird, indemdas biologisch-organische Material derart verpackt wird, dass keinerlei Kontakt mit dem N 2

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