Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

84birgt den Vorteil, dass zwar hohe Kühlraten verwendet werden können, die Durchführung undAnwendung der OPS aber einfach und unkompliziert im Verfahren ist. Bei der OPS-Vitrifikationwird ein kleinstes Probenvolumen (2µl) einfach und schnell durch Kapillarwirkung in einen strawaufgezogen und in Stickstoff versenkt (VAJTA et al. 1998a). Im Vergleich zu herkömmlichenPlastikpailletten bleibt die Thermoinsulation durch die geringere Wandstärke der OPS relativniedrig. Die open pulled straws können beschriftet, technisch unkompliziert selbst hergestellt undohne weitere Arbeitsschritte im N 2 gelagert werden.Ein grundsätzliches Problem stellte sich jedoch bei allen Verfahren: Durch das direkteVersenken der Probe in den flüssigen Stickstoff kommt es bei jeder der angewandten Methoden zueinem direkten Kontakt zwischen dem biologischen Material und dem Stickstoff (ARAV u.ZERON 1997, VAJTA et al. 1998a, DINNYES et al. 2000, ASADA et al. 2002). Dies birgt dieGefahr der Kontamination der Proben mit pathogenen Keimen (FOUNTAIN et al. 1997,BIELANSKY et al. 2000). Um dieses Risiko so gering wie möglich zu halten, wurden die Proben ingefiltertem Stickstoff vitrifiziert, zusätzliche Gefrierbehälter zur Lagerung eingeführt, oder dieProben in einem separaten Lagerungscontainer gehalten (VAJTA et al. 1998b, MATSUMOTO etal. 2001). Zwar stellen diese methodischen Adaptionen einen relativ hohen Schutz gegenFolgekontaminationen dar, der Vitrifikationsschritt selbst erfolgt aber immer direkt im Stickstoff,und so sind diese Verfahren nicht ausreichend sicher. Für einen zukünftigen, unbeschränktenVerkehr von kryokonservierten Oozyten und Embryonen scheint es unabdingbar, einekontaminationssichere Methode zu entwickeln. Gesucht wurde eine Möglichkeit auf der Grundlageder OPS-Vitrifikation völlig steril zu arbeiten, ohne aber aufwendige und komplizierte Schrittedurchzuführen. Die direkte Verpackung der Probe in einem zweiten straw vor dem Versenken inStickstoff erschien dafür geeignet (KULESHOVA u. SHAW 2000, ISACHENKO et al. 2005). Inden Untersuchungen dieser Arbeit ließ sich die Durchführung der Verpackung des OPS in einem0,5 ml Plastikstraw ohne Probleme in den Arbeitsablauf integrieren. Der French straw wurde dabeivor Arbeitsbeginn an einer Seite durch Verschweißen, an der anderen Seite nach Aufnahme desOPS durch eine Metallkugel verschlossen. Der zeitliche Aufwand des Verschließens mit einerKugel war gering und verlängerte den Vitrifikationsschritt nur um wenige Sekunden. Die Probehatte dadurch zu keiner Zeit direkten Kontakt mit Stickstoff. So konnte eine Kontamination sicherausgeschlossen werden (BIELANSKY et al. 2000). Ein weiterer Vorteil der Methode war dieMöglichkeit der direkten Kennzeichnung jeder einzelnen Probe und damit ein Verhindern derVerwechslung des Probeninhalts im Lagerungscontainer.Das Verwenden von geringeren Kühlraten ist die Einschränkung des Verfahrens(KULESHOVA u. SHAW 2000, ISACHENKO et al. 2005). Jedoch schlossen RALL und

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