85WOOD (1994) aus ihren

85WOOD (1994) aus ihren Untersuchungen, dass eine Erwärmung der Probe mit ausreichenderGeschwindigkeit größeren Einfluss auf das Überleben nach Vitrifikation hat, als die Anwendunghoher Kühlraten. Die mittels aseptischer Vitrifikation erzielbaren Kühlraten betragen nur~200°C/Min, doch konnten bei Verwendung hoher Erwärmungsraten von 20 000°C/Min gleichgute Ergebnisse nach Vitrifikation humaner Pronuklearoozyten erreicht werden, wie beikonventioneller OPS-Vitrifikation (ISACHENKO et al. 2005). Diese Arbeit sollte die Anwendungdes aseptischen OPS-Verfahrens erstmals an bovinen Eizellen untersuchen.Im Vergleich zu konventionellen Methoden der OPS-Vitrifikation boviner Oozyten inMedium D+E waren die in dieser Arbeit gewählten CPA-Konzentrationen der Kryomedien für dieaseptische OPS-Vitrifikation als gleich hoch konzentriert anzusetzen. Sehr hohe Abkühlraten undgeringes Probenvolumen verringern die Wahrscheinlichkeit der Bildung von Eiskristallen (WOLFEu. BRYANT 1999), ausreichend hohe intrazelluläre CPA-Konzentrationen sind für dieViskositätserhöhung und folglich die Vitrifikation nötig (FAHY et al. 1984). Daher wurden indieser Arbeit zur aseptischen Vitrifikation die Äquilibrierungszeiten länger gewählt, um eineGlasbildung auch mit niedrigeren Kühlraten zu gewährleisten. Eine Steuerung der intrazellulärenCPA-Konzentration ist neben der Inkubationszeit durch stufenweises Zufügen der kryoprotektivenSubstanzen zur Probe möglich (RALL 1987). Ein Äquilibrierungsverfahren mit drei Schrittenwurde gewählt, jeder Schritt umfasste dabei maximal 1 Minute, und der Konzentrationsanstieg inden Äquilibrierungsmedien war langsamer als bei den in der Literatur beschriebenen Verfahren.Auch der Vitrifikationsschritt dauerte maximal 1 Minute. Das ist deutlich länger als beivergleichbaren, angewandten Methoden (VAJTA et al. 1998a, LI et al. 2002, MEN et al. 2002,ALBARRACIN et al. 2005). In der Literatur finden sich jedoch keine Untersuchungen zuunterschiedlichen Zeit- und Konzentrationsschemata in verwendeten Äquilibrierungsverfahren fürdie OPS-Vitrifikation boviner Eizellen in Medium D+E (20% DMSO + 20% EG).Die Darstellung der Teilungs- und Blastozystenrate nach Vitrifikation immaturer Eizellen mitniedrigen Kühlraten und anschließender Fertilisierung und Kultur in-vitro zeigte, dass das in dieserArbeit angewandte aseptische Verfahren zur Kryokonservierung von GV-Oozyten weniger gutgeeignet erschien. Medienunabhängig konnten sich zwar ca. 13-16% der Oozyten über das Zwei-Zellstadium hinaus entwickeln, aber keine einzige Blastozyste ergab sich aus über 300 vitrifiziertenOozyten.Für die Vitrifikation maturer Rindereizellen erwies sich das aseptische Verfahren alsgrundsätzlich geeignet, es konnten Teilungsraten von 52,3% erzielt werden, die vergleichbar zu inder Literatur angegebenen TR aus konventionellen OPS-Vitrifikationsverfahren waren. Die

86Blastozystenrate von 4,3% aus dieser Untersuchung war jedoch geringer als in der Literaturbeschrieben (MEN et al. 2002). Entwicklungsraten nach Vitifikation in allen im Rahmen dieserArbeit durchgeführten Untersuchungen blieben weit unter den Ergebnissen der Kontrollen.5.2 KühlrateEin direkter Vergleich der Auswirkung der Kühlrate auf Überleben und Entwicklung nachVitrifikation durch die Anwendung des aseptischen Verfahrens und der OPS-Vitrifikation miteinem identischen (3-stufigen) Äquilibrierungs- und Dilutionsschema bei immaturen und maturenRinderoozyten zeigte in dieser Untersuchung im Vergleich zu den Kontrollen für beide Verfahrensignifikant schlechtere Entwicklungen nach IVF und Kultur.Grundsätzlich basiert die Entwicklungskompetenz der Rindereizelle auf ihrer intrinsischenQualität und wird durch den Ablauf der in-vitro-Produktion beeinflusst (LONERGAN et al. 2003,MERTON et al. 2003). Da die gewählten äußeren Faktoren (Auswahlkriterien der für Versuche undKontrolle verwendeten Eizellen, Medien und Kulturbedingungen) sowohl für Kontrollen als auchVersuchseizellen konstant blieben, muss die geringere Entwicklung vitrifizierter Eizellen in dieserArbeit alleine dem Konservierungsverfahren zugeschrieben werden. Die Schäden, die durch denKühlvorgang selbst am biologischen Material verursacht werden, setzen sich aus der Bildungintrazellulärer Eiskristalle und der Einwirkung subphysiologischer Temperaturen auf kältesensibleBestandteile der Eizelle zusammen (SHAW u. JONES 2003). Lässt man den Einfluss derKryoprotektoren bei den verwendeten Gefrierverfahren unbeachtet, wurde der Zusammenhangzwischen Überleben von Zellen und der Kühlrate in Form einer ∧-förmigen Kurve dargestellt(MAZUR 1980). Das Sinken der Überlebensrate nach schneller Abkühlung wird durch den hohenintrazellulären Wassergehalt verursacht, dies führt zur Bildung intrazellulärer Eiskristalle und zumZelltod. Weitere Untersuchungen zeigten jedoch, dass bei Verwendung noch höherer Kühlraten(10 7 °C/Min) sogar Wasser ohne Eisbildung vitrifiziert werden konnte (RALL 1987). Die Zeit desAbkühlvorgangs reicht somit bei genügend schneller Kühlung nicht aus, um zu einer ausgeprägtenNukleation und folgender Eiskristallbildung zu führen (WOLFE u. BRYANT 1999). Zudembewirken ultraschnelle Kühlraten, wie sie auch bei der OPS-Vitrifikation verwendet werden, dassder kritische Temperaturbereich zwischen 15°C und -5°C sehr schnell durchlaufen wird(MARTINO et al. 1996b). Beim Erwärmen wiederum reicht die kurze Zeitspanne nicht aus, um zurDevitrifikation zu führen (SHAW u. JONES 2003). Je höher also die Kühlrate gewählt wird, destogeringere Konzentrationen an CPAs sind nötig, um die Zelle ausreichend zu schützen.In dieser Arbeit konnte für unreife Eizellen weder mit hohen (OPS-Vitrifikation) noch mitniedrigen (aseptische Vitrifikation) Kühlraten eine Weiterentwicklung zur Blastozyste beobachtet