Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

89Tab. 22) ergab deutlich höhere Teilungsraten mit einstufiger Äquilibrierung (insgesamt kürzereInkubationsdauer) und vergleichbare Blastozystenraten beider Methoden bei anschließender invitro-Fertilisation.Die Überlebensraten nach Vitrifikation hingegen unterschieden sich nicht.Jedoch waren die Entwicklungsraten nach Vitrifikation mit beiden Äquilibrierungsmethoden weitunter den Ergebnissen aus den Kontrollen. Zusätzlich blieben auch bei der Anwendung der vonVAJTA et al. (1998a) beschriebenen konventionellen OPS-Methode die Entwicklungsraten, die indieser Arbeit erzielt wurden, teilweise unter den von den Genannten beschriebenen Resultaten. EinVergleich der beiden Äquilibrierungsmethoden bei OPS-Vitrifikation und anschließenderparthenogenetischer Aktivierung mit Ca-Ionophor und DMAP verdeutlichte den schädigendenEinfluss der Äquilibrierung im dreistufigen Verfahren (siehe 4. Ergebnisse, Tab. 23). Hier ergabensich für das einstufige Verfahren deutlich bessere Teilungs- und Blastozystenraten nachVitrifikation, und auch die Überlebensrate war nach kürzerer Inkubation höher. Jedoch blieben auchin diesem Versuch die Entwicklungsraten im Vergleich zur Kontrolle deutlich geringer.Ein bestimmter Gehalt an intrazellulär vorhandenem Kryoprotektivum ist für eineerfolgreiche Vitrifikation von Zellen nötig (FAHY et al. 1984). Konzentrationen, die über dasoptimale Maß hinausgehen, begünstigen toxische und osmotische Schäden durch CPAs(RALL 1987). Um diese Schäden zu minimieren, existieren zwei anerkannte Maßnahmen: Dasstufenweise Zusetzen der CPAs in Äquilibrierungsmedien mit geringer Konzentration und sehrkurze Inkubationszeiten im Vitrifikationsmedium selbst (RALL 1987). Das KryoprotektivumDMSO penetriert die Zellmembran von Rinderoozyten schneller als EG und ist überdies toxischer(AGCA et al. 1998, SHAW et al. 2000). Daher scheint die kürzere Inkubation während dereinstufigen Äquilibrierung deutlich günstiger für das Überleben und die Entwicklungsfähigkeit vonRindereizellen zu sein. Zwar macht die länger dauernde dreistufige Äquilibrierung die in vitro-Entwicklung bis zur Blastozyste nicht unmöglich, aber bei Verwendung hoher Kühlraten reichengeringere und weniger belastende intrazelluläre CPA-Konzentrationen aus. Allerdings konnte ausden Versuchen dieser Arbeit kein Rückschluss gezogen werden, ob dies auch bei Verwendungniedriger Kühlraten im Rahmen der aseptischen Vitrifikation der Fall wäre.Bei humanen und murinen Eizellen wurde eine kälteinduzierte Aktivierung beschrieben(BERNARD u. FULLER 1996). Ebenso sahen WU et al. (1999) die parthenogenetischeEntwicklung unreifer Rindereizellen durch Kühlung auf 0°C. Das Kryoprotektivum PROH führt beiMäusen zur ungeschlechtlichen Aktivierung (SHAW u. TROUNSON 1994). Eineparthenogenetische Aktivierung von maturen Rindereizellen durch die Vitrifikation bzw. dasVitrifikationsmedium selbst wurde ausgeschlossen (DINNYES et al. 2000). Um dies für dasMedium D+E und das in dieser Arbeit gewählte Äquilibrierungsverfahren zu prüfen, wurde ein

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