Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

91Verbesserungsmöglichkeiten für zukünftige Versuche zur aseptischen Vitrifikation wäreneine Optimierung des Zeitschemas der Äquilibrierung, zumal bei der Vitrifikation immaturerOozyten weder mit OPS-Vitrifikation noch mit der aseptischen Vitrifikation bei Äquilibrierung indrei Stufen Entwicklungen bis zur Blastozyste erreicht werden konnten, obwohl in der Literaturbeschrieben nach einstufiger Äquilibrierung mit Medium D+E und OPS-Vitrifikation Blastozystenproduziert und Kälber geboren wurden (VIEIRA et al. 2002). Hier scheint vor allem derVitrifikationsschritt von max. 60 Sekunden als zu lang. In der Literatur angegeben werden Zeitenvon 25-30 Sekunden (VAJTA et al. 1998a, MEN et al. 2002, VIEIRA et al. 2002). Durch dieeinfache Ausführung der Verpackung des OPS in einem 0,5ml straw erscheint eine Verkürzung desVitrifikationsschrittes auf 30 Sekunden auch praktisch durchführbar. Toxische Schädigungen durchdreistufige Äquilibrierung in Medium EG scheinen nicht plausibel. Die bisher höchstenEntwicklungsraten nach Vitrifikation mit hohen Kühlraten wurden nach dreistufiger Äquilibrierungin 7,5%, 10% und 20% EG über eine Gesamtdauer von 10 Minuten erzielt (ABE et al. 2005). DieseErgebnisse weisen darauf hin, dass durch das in der eigenen Arbeit verwendeteÄquilibrierungsschema eine zur Kryoprotektion nicht ausreichende intrazelluläre CPA-Konzentration erreicht wurde.5.4 DilutionsmethodeBeim Einbringen der Probe in die Ausverdünnungslösung mit niedrigerer Osmolarität kommt es zueinem intrazellulären Wassereinstrom, dessen Geschwindigkeit vom Konzentrationsgefälle und derMembranpermeabilität des biologischen Materials abhängig ist (PAYNTER et al. 1999b). Dadurchbedingt erfährt die Zelle während der Dilution Volumenveränderungen, die zu mechanischenSchäden führen können (MAZUR u. SCHNEIDER 1986). Zur Vermeidung solcher osmotischbedingten Schäden erwiesen sich die Zugabe von Sacchariden ins Ausverdünnungsmedium und dieAufteilung der Gesamtkonzentration in einzelne Konzentrationsstufen geeignet (RALL 1987). DieDilution boviner Eizellen wird daher üblicherweise in einem Ausverdünnungsmedium mitSaccharidzusatz von 0,5-1 Mol/l durchgeführt (MATSUMOTO et al. 2001, MEN et al. 2002,VIEIRA et al. 2002, ABE et al. 2005, ALBARRACIN et al. 2005). Der Einsatz von Trehaloseführte zu keiner Verbesserung der Teilungsraten nach Vitrifikation von Rindereizellen, im selbenVerfahren war unter Sukrosezusatz die Bildung von Blastozysten zu beobachten, während diese beiZusatz von Trehalose unterblieb (ABE et al. 2005). Daher wurde in der vorliegenden Arbeit0,5 molare Sukrose im Ausverdünnungsmedium verwendet.Die Untersuchungen zur optimalen Anzahl der Stufen des Konzentrationsgradienten fürRindereizellen in der Literatur variieren. Reife Eizellen werden üblicherweise in mehreren Schritten

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