Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

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Untersuchungen zur Vitrifikation von immaturen und In-vitro ...

92ausverdünnt. VAJTA et al. (1998a) verwendeten zwei Schritte, hohe Entwicklungsraten (TR: bis zu60% und BR: bis zu 20%) konnten jedoch auch mit drei Schritten und nur mit einem Schritt erreichtwerden, wobei die Umsetzung der Proben immer in 50%-Schritten relativ zur Ausgangslösungdurchgeführt wurde (DINNYES et al. 2000, ARAV et al. 2002). Auch liegen Untersuchungen übererfolgreiche, direkte Ausverdünnungen boviner maturer Oozyten vor mit erzielten TR von 55% undBR von ~14% (PAPIS et al. 2000). Die Membranpermeabilität unreifer Oozyten ist geringer als beimaturen Oozyten (AGCA et al. 2000). Für immature Eizellen wurden die besten Ergebnisse nachdreistufiger Dilution erhalten (ABE et al. 2005). Darauf basierend wurde für die Ausverdünnung indieser Arbeit angenommen, dass eine schonendere Dilution einerseits durch Erhöhung der Anzahlder Konzentrationsschritte auf vier Stufen, andererseits durch eine Verminderung derKonzentrationsunterschiede per se erreicht werden könnte. Dazu wurde im Rahmen dieserUntersuchungen eine titrationsähnliche Ausverdünnungmethode verwendet. Nach dem Einbringender Probe in das Ausverdünnungsmedium erfolgte kein Umsetzen in die nächsteKonzentrationsstufe, sondern die Gesamtkonzentration wurde über tropfenweises Zufügen vonHolding Medium über ein Schlauchsystem kontinuierlich gesenkt. Durch die gleichmäßigeDurchmischung auf einem geheizten Rüttler sollte überdies der lokale Anstieg der Konzentrationder ausgeschleusten CPAs im Bereich der Zellen so gering wie möglich gehalten werden. Abb. 15skizziert schematisch den intrazellulären Konzentrationsverlauf während einer stufenweisenDilution und der Titrationsausverdünnung.

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