Kapillarelektrophorese - TCI @ Uni-Hannover.de

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Instrumentelle MethodenTeil 2: KapillarelektrophoreseGliederung•Prinzip• GerätetechnikKapillarenInjektionsmethodenDetektionsmethoden• Kapillarelektrophoretische Modi• BeispielgerätPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePrinzip der KapillarelektrophoreseKapillarelektrophorese:Trägerfrei in einemoffenen Rohr(Kapillare)• CE (capillaryelectrophoresis)• Kapillarlängen:5-100 cm• Innendurchmesser derKapillare:20-200 µm+ -5-100 cm20-200 µmPrinzip der Kapillarelektrophorese• Trennmedien: Wäßrige Puffersysteme Stromtransport,konstanter pH-Wert• Beispiele:‣ Phosphat- und Citratpuffer bei saurem pH‣ Borat- und TRIS-Puffer bei basichen pH‣ Auch zwitterionische Puffer• Trennung bei elektrischer Feldstärke von mehrerenhundert V/cm• Resultierender Strom ist gering (im Bereich von 100 µA)• Detektion: on-Column UV-Absorption direkt durch dietransparente KapillarePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie• fused-Silica-Kapillare• Hochspannungsversorgung• 2 Elektroden• Pufferreservoirs• On-Column-Detektor• Moderne Geräte:‣ Probengeber‣ Fraktionssammler‣ HydrodynamischenInjektionssystem‣ KapillarthermostatisierungseinheitPD Dr. C. KasperGerätetechnikTCIInstitut fürTechnische Chemie• UV transparente Materialien:‣ fused-Silica amorpher Quarz‣ BorsilikatglasKapillaren‣ Teflon• Geringer Durchmesser: Effiziente Wärmeableitung• Mechanische Stabilität: Außenoberfläche der Kapillaremit Polyimidschicht geschützt Entfernen für Detektionnötig (Skalpell oder Flamme)PD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie


• HydrodynamischeInjektion‣ Vakuum auf derDetektionsseite‣ Druck auf derEinlassseite‣ Gravitationskraftdurch Anhebender Einlassseite• ElektrokinetischeInjektionInjektionsmethodenInjektionsmethoden• Trenneffizienz der Kapillarelektrophorese‣ Geringes Injektionsvolumen keine Bandenverbreiterung• Gesamtvolumen der Kapillare wenige µl‣ Probenvolumen einige nl• Reproduzierbare Injektionsvolumina wichtig Routineanalytik• Probenvolumen V i bei der hydrodynamischen Injektion4Δp⋅ Π ⋅r⋅ tVi=8 ⋅ η⋅L‣ Abhängig von: Druckdifferenz Δp, Injektionszeit t, Kapillarlänge L,Viskosität η, Kapillarradius rPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie• ElektrokinetischeInjektion‣ AufgebrachtesProbenmenge nimmtmit der Mobilität derProben-Ionen zu‣ Injizierte Probenmengehängt von derProbenmatrix ab• HydrodynamischeInjektion‣ Unhabhängig von derMobilität derProbenmatrixPD Dr. C. KasperInjektionsmethodenElectrodeElectrodeTCIInstitut fürTechnische ChemieDetektionsmethoden• Absorptions-Detektor⎛I0 ⎞‣ Lambert-Beersche-Gesetz A = log⎜⎟ = ε ⋅c⋅⎝ I ⎠‣ UV-Detektor‣ Diodenarray-Detektor (DAD)‣ Photodiodenarray-Detektor (PDA)‣ Empfindlichkeit: 10 -15 -10 -13 mol‣ Anwendungen: Proteine, aromatischeVerbindungen• Indirekte UV-Detektion (Probenohne Absorption im UV-Bereich)‣ Puffer + Elektrolyt mit UV-Absorption Negatives Signal‣ Empfindlichkeit: 10 -16 -10 -13 molPD Dr. C. Kasper‣ Anwendungen: Organische undanorganische Ionen, ZuckerdUV-DetektionDetektorzelleTCIKapillareNegatives SignalInstitut fürTechnische ChemieFluoreszenz-DetektorDetektionsmethoden‣ Molekülanregung Abgabe derAnregungsenergie durch spontane Emission(Fluoreszenz)‣ Signalintensität ist direkt proportional derIntensität der eingestrahlten Anregungsenergie‣ Lampenanregung:‣ Empfindlichkeit: 10 -18 -10 -13 mol‣ Anwendungen: derivatisierte Aminosäuren,DNA, Peptide, Protein‣ Laserinduzierte Fluoreszenz:‣ Hohe Empfindlichkeit:10 -21 -10 -17 mol‣ Anwendungen: DNA-Fragmente, derivatisierteAminosäurenPD Dr. C. KasperTCIKapillareFluoreszenzInstitut fürTechnische ChemieDetektionsmethoden• Massenspektrometrie-DetektorPD Dr. C. Kasper‣ Empfindlichkeit: 10 -17 -10 -8 mol‣ Anwendungen: Proteine, Peptide, drug-monitoring‣ z.B. ESI-MS (Electrospray Ionization)TCIInstitut fürTechnische Chemie


Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Unbehandelte Kapillaren (uncoated)‣ Elektrophoretische Geschwindigkeit‣ Zusätzlich: Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Gesamtgeschwindigkeit:PD Dr. C. Kasper‣ Vektorielle Summe aus elektrophoretischer (v EPH ) undelektroosmotischer (v EOF )GeschwindigkeitDiffuse Doppelschicht Zeta-PotenitalTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperElektroosmotischer Fluss (EOF)• Ladungsunterschiede an derInnenseite der Kapillare (diffuseDoppelschicht) resultieren in Zeta-Potential (ζ)• Zeta-Potential und damit der EOF istabhängig von der Dissoziation derSilanolgruppen und dadurch vom pH-Wert der Elektrolytlösungtlös • Basischer pH EOF höher alsWanderungsgeschwindigkeit derIonen‣ Auch Anionen werden durch denEOF zur Kathode transportiert• Saurer pH EOF geringer alsWanderungsgeschwindigkeit derIonenTCIInstitut fürTechnische ChemieElektroosmotischer Fluss (EOF)• Flussprofil des EOF ist stempelförmigen‣ Bei konstantem Fluss trägt der EOF nicht zu Peakverbreiterungbei• Wanderungsgeschwindigkeit (v EOF ) des EOF:ε ⋅E⋅ ζv EOF= 4 ⋅ π ⋅ ηElektrischer StromflußElektrischer Stromfluss führt zu JoulescherWärmeentwicklung‣ Wärmeabfuhr nur über Kapillarwand resultierenderTemperaturgradient‣ Maximale Trenneffizienz kleiner TemperaturgradientVerringerung KapillarinnendurchmesserFlüssigkühlung der Kapillare‣ Temperaturgradient rgradient verursacht rsacht Viskositätsgradienten Auswirkung aufs Flussprofil‣ Langsamere Wanderung im Bereich hoher Viskosität(Kapillarwand)‣ Schnellere Wanderung im Bereich geringer Viskosität(Kapillarmitte)PD Dr. C. Kasper‣ Dielektrizitätskonstante ε, Zeta-Potential ζ, Viskosität ηTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemieKapillarzonenelektrophorese (CZE)• Trennung nach Unterschied inGröße und Ladung• Zunächst wird die Probe (AB) indie Kapillare injiziert• Unter Einfluss des elektrischenFeldes wird die Probe indiskrete Zonen (A und B)unterteilt, die ihrerseitsAnalyten mit der gleichenelektrophoretische Mobilitätenthalten• Puffer, pH-Wert, elektrischeFeldstärke bleiben konstantPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperKapillarzonenelektrophorese (CZE)TCIInstitut fürTechnische Chemie


Peakverbreiterung• Peakverbreiterung Verursachung durch longitudinale Diffusion• Eingangsprofil sei unendlich schmal örtliche Varianzder Konzentrationsverteilung durch die Einstein-Gleichung bestimmt2σ = 2 ⋅D⋅ tDiffusionskoeffizient D; Zeit t‣ Varianz und damit mit Peakverbreiterung nimmt mit der Zeit t zuz2σ zPeakshapeElektrodispersion zusätzlicher Peakverbreiterung‣ Elektrische Feldstärke nicht in gesamter Trennkapillare konstant gestört durch lokale Leitfähigkeitsunterschiede Mobilität von Analyt-Ion und Puffer-Ion nicht ähnlich Konzentration Puffer-Ion ist nicht sehr viel größer als Analyt-Ion (> Faktor 100)Mobilität des Proben-Ion uA < Puffer-Ion uCE Peak-TailinguA > uCE Peak-Leading (Fronting)PD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie• Auflösung R zweier Peakst2− tR =4 ⋅ σAuflösungt1‣ Migrationszeiten t 1 und t 2 zweier aufeinanderfolgender Peaks;σgemittelte Standardabweichungt• Einsetzen der entsprechenden Beziehungen liefert:N ⎛ u2− u ⎞= ⋅ ⎜ ⎟4 ⎝ u ⎠R1Puffersystem• Anforderungen an den Puffer‣ Selektivität für die zu trennenden Ionen‣ pH-Wertstabilität, Pufferkapazität (Reproduzierbarkeit)‣ Geringe UV-Absorption bei der Detektionswellenlänge‣ Anpassung der Mobilität zwischen Probe- und Pufferion‣ Das Gegenion sollte eine geringe Mobilität besitzen (kleineStröme)‣ Reproduzierbare Herstellung des Puffers‣ Stabilität des Puffers‣ Theoretische Trennstufen N, Mobilität uPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemieOptimierungElektropherogramm• Trennungsoptimierung Variation folgender Parameter:‣ pH-Wert‣ Ionenstärke‣ Temperatur‣ Kapillarbelegung‣ PufferzusätzePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie


Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE)• Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen einemRezeptor und Liganden• Bestimmung von Bindungskonstanten und -stöchiometrie• Unterschied in der Mobilität zwischen Protein und demgebildeten Komplex‣ Ligand trägt eine Ladung‣ Molekulargewicht des Komplexes unterscheidet sich wesentlichvon der des ProteinsMicellarelektrokinetische ChromatographieMEKC• Hybridtechnik aus Elektrophorese und Chromatographie• Zusatz von Micellenbildnern (Detergenzien) zumPuffersystem pseudostationäre Phase aus geladenenMicellen• Trennung basierend auf Verteilung der Analyte zwischenLösung und MicelleninnerenPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemieElektropherogramm• Neutralmoleküle erhalten elektrophoretische Mobilität u i'⎛ k⎟ ⎞iu⎜i= uMC'⎝1+ki⎠‣ Abhängig von Mobilität der Micelle u MC und dem Kapazitätsfaktork‘ i• Kapazitätsfaktor k‘ i ist Verhältnis der Analytaufenthaltszeitin der mobilen zur pseudostationären Phase'k =iti− t0⎛ t ⋅⎜ −ito1⎝ tMC⎞⎟⎠• Auflösung R zweier KomponentenR =t01−'N α −1k2tMC⋅ ⋅ ⋅'{ 4 21 α31+k t2 0 '1+⋅k1SelektivitättMC14 44 24443EffizienzElektropherogrammRe tention• Verbesserung der Auflösung durch:‣ Steigende Micellbildnerkonzentration‣ Vergrößerung des Zeitfensters des Migrationsbereichs‣ Wahl unterschiedlicher Micellbildner‣ Änderung in der Zusammensetzung der wässrigen PhasePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemieKapillargelelektrophorese (CGE)VorteileNachteileSchnellere TrennzeitenKeine präparative ProbensammlungOnline-DetektionKeine parallele Trennung mehrerer ProbenGeringer Arbeits- und Geräteaufwand Nicht zweidimensional durchführbarPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemieIsoelektrische Fokussierung (CIEF)• Trennung nach unterschiedlichen Masse/Ladungs-verhältnissen• DNA-Moleküe und SDS-denaturierte Proteine besitzenbei unterschiedlichen Massen sehr ähnliche Masse/Ladungsverhältnissen• Gelmedium bewirkt einen Siebeffekt und behindert dieelektrophoretische Wanderung der größeren Molekülestärker als die der kleineren• Vergleich mit klassischen Gelelektrophorese• Trennung der Analyten nach ihrem isoelektrischen Punkt• Injektion der Probe in einem Ampholytgemisch in dieKapillare• Eine starke Säure wird an der Anode platziert (Anolyt),eine starke Base dient als Kathodenpuffer (Katholyt).• Anlegen der Spannung pH-Gradient Ampholyt-Ionen wandern entsprechend ihrem pI.• Bei pI = pH endet die elektrophoretische Wanderung.PD Dr. C. KasperAnode+DiffusionE-FeldKathode+ --Ladung desVerd.H 3PO4AnalytmolekülspH = pIVerd.NaOHTCIInstitut fürTechnische Chemie


Isotachophorese (ITP)• Trennung nach Größe und Ladung• Zwei Elektrolyte: Leitelektrolyt (LE) und Endelektrolyt(TE)‣ Mobilität Leitelektrolyt > Mobilität aller Analyt-Ionen‣ Mobilität Endelektrolyt < Mobilität aller Analyt-Ionen‣ Anlegen konstanten Stroms Bildung eines Feldstärkengradients‣ Probenaufgabe der Proben-Ionen (A, B)an der Grenzfläche der beiden Elektrolyte‣ Feldstärkengradient verhindert Diffusionscharfer ZonengrenzenGerät schematischPD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemieBeckmann PACEQuellen• F. Lottspeich/H. Zorbas, Bioanalytik• H.Engelhardt, W.Beck, T. Schmitt, Kapillarelektrophorese• Altria, Kevin; http://www.ceandcec.com• Oliver J. Schmitz; www.kapillarelektrophorese.de• P.W. Atkins, Physikalische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische ChemiePD Dr. C. KasperTCIInstitut fürTechnische Chemie

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