ﺖ ﻣﻮش ﺴ آﭘﻮﭘﺘﻮز در ﺑﻼﺳﺘﻮﺳﻴ ﻣﻴﺰان اي ﺑﺮ اﺛﺮات اﻧﺠﻤﺎد ﺷﻴ

jri.ir

ﺖ ﻣﻮش ﺴ آﭘﻮﭘﺘﻮز در ﺑﻼﺳﺘﻮﺳﻴ ﻣﻴﺰان اي ﺑﺮ اﺛﺮات اﻧﺠﻤﺎد ﺷﻴ

انجماد شيشهاي و ميزان آپوپتوز در بلاستوسيست موشتازه سوكروزدكتر رجايي و ...0/5مولار به مدت پنج دقيقه قرار دادهشد.‏ پس از انتقال و انكوباسيون جنينها در محلولPB1 به منظور به تعادل رسيدن،‏ به محلول كشتM16منتقل گرديده و پس ازدو ساعت كشت ميزان ايندكسآپوپتوز بررسي گرديد.‏1رنگ آميزي TUNEL وPI‏:‏ رنگآميزيTUNEL وPIبراي بررسي فراگمنته شدن DNAطبق روش Brison و همكاران در سالدر بلاستوسيستها1997(16) انجامشد.‏ به طوريكه در ابتدا بلاستوسيستها،‏پس از شستشو با محلول دالبكو بافرفسفات(DPBS,Gibco) حاوي %0/3پليوينيل الكل(PBS/PVA3mg/ml) در محلول پارافرمالدئيد‎%37‎درPBS به مدت يك شب در درجه حرارت 4 o C(wako, Japan)ثابت شد.‏ سپس بعد از شستشو با ،PBS/PVA بهمدت40 دقيقه در محلول%0/1(Sigma, Germany)100 – Xدرصد تريتونبه منظور افزايشنفوذپذيري زونا پلوسيدا قرار داده شد.‏ بلاستوسيستهاپس از شسشو با PBS/PVA در محلول TUNEL(Wako, Japan)به مدتبراساس دستورالعمل شركت سازندهيك ساعت درحرارت 37 o Cانكوبه گرديد.‏براي كنترل منفي تعدادي بلاستوسيست فقط درمحلول فلوئورسنت به منظور اطمينان از عدمنشانه گذاري بدون آنزيم آنكوبه گرديد و براي كنترلمثبت،‏ تعدادي از بلاستوسيستها قبل از آنكوباسيوندر محلول ،TUNEL در50 µg/ml محلول(Sigma, Germany) DNase Ιبه مدت يك ساعتانكوبه گرديد.‏ پس از انكوباسيون بلاستوسيستهادر‎50µg/ml ازمحلول (Sigma, Germany) RNase Aبهمدت يك ساعت،‏ بلاستوسيستها با 50 ميكروگرم برميليليتر محلول(Sigma, Germany) PI به20 مدتدقيقه،‏ به منظور نشانهگذاري همه هستهها رنگآميزيزمينهاي گرديد.‏ سپس بلاستوسيستها پس از شستشودر محلول PBS/PVA با فشار كم لامل در يك قطره20µl از محلول(Oregon, USA) Antibleachingروي لام مونتاژ گرديد و پس ازبرمهر و موم كردنلبههاي لام با لاك ناخن،‏ لامها در زير ميكروسكوپمورد بررسيفلوئوروسنتقرار گرفت.‏(Olympus, Japan)روشهاي آماري:‏ نسبت سلولهاي آپوپتوتيك باشمارش سلولهايTUNEL مثبت به كل هستههايبلاستوسيست ‏(هستههايPI مثبت)‏در همانبلاستوسيست بر حسب درصد بعنوان ايندكس آپوپتوزمحاسبه گرديد و مقايسه ميانگين ايندكس آپوپتوزي برحسب درصد در گروه ها با آزمون T و در سطح معنيدارينتايج0/05انجام گرديد.‏همان طوري كه در شكل شمارة1- الفديده ميشودتمام بلاستومرهاي جنينهاي كنترل مثبت با تكنيكTUNEL نشانه گ زاري شدند و حتي قطعات هستهFragmentation) (DNA در بعضي از هستهها بهصورت قطعات كوچك زرد رنگي به خوبي قابل مشاهدههستند و هيچ يك از بلاستومرهاي جنينهاي كنترلمنفي با تكنيك TUNEL نشانهگزاري نشدند و فقط بارنگآميزي زمينهاي(PI)شدند ) شكل شمارةو.( ب-‏ 1به رنگ قرمز رنگآميزيشكل شمارة،1 ج -بلاستوسيستي از گروه كنترل را پس از رنگ آميزي باتكنيك TUNEL نشان ميدهد،‏ به طوري كه در شكلمشاهده ميشود تعداد چهار سلول آپوپتوتيك با رنگسبز مايل به زرد از بقيه سلولها كه رنگ PI را گرفتهاندبخوبي قابل تشخيص ميباشند.‏در بلاستوسيستهاي گروه تجربي كه پس از انجماد وذوب براي آپوپتوز رنگآميزي شدند،‏ سلولهايآپوپتوتيك با تكنيك TUNEL بخوبينشاندار شدندكاملاً‏ از سلولهاي غيرآپوپتوتيك كه با رنگآميزي1- Propidium IodideDownloaded from http://www.jri.ir17فصلنامه باروري و ناباروري/‏ زمستان 82

Weitere Magazine dieses Users
Ähnliche Magazine