PDF Download - Laborwelt

Wissenschaft TargetsucheAbb. 2: Mit der CSC-Technologie werden glykosylierte Peptide von Zelloberflächenproteinen inmehreren Schritten aufgereinigt. Die Protokollschritte beinhalten: 1. Biotinylierung vonglykosylierten Oberflächenproteinen, 2. Zelllyse und Trypsinverdau, 3. Affinitätsaufreinigungder biotinylierten Peptide, 4. Enzymatische Elution der Peptide, 5. MassenspektrometrischeAnalyse, 6. Identifizierung des Peptids und Proteins.Beispiel Glykosylierungen und das Vorhandenseinhydrophober Transmembrandomänen.Deshalb sind sowohl die Identität als auchdie Funktion vieler Zelloberflächenproteineheute wenig bis gar nicht bekannt.Während bioinformatisch derzeit ein Anteilvon rund 3.000 Zelloberflächenproteinen amGesamtproteom prognostiziert wird, sind mitknapp 400 verlässlich CD-annotierten Oberflächenmolekülenerst ein Bruchteil davonexperimentell bestätigt und durch Antikörperauf der Zelloberfläche detektierbar.Die Cell Surface Capturing-TechnologieMit der Entwicklung der Cell Surface Capturing(CSC)-Technologie am Institut fürMolekulare Systembiologie der ETH Zürich(www.imsb.ethz.ch/researchgroup/wbernd)und dem Institut für Systems Biology (www.systemsbiology.org/) in Seattle/USA wurdeeine neue Technologie geschaffen, um dieseSchwierigkeiten bei der Analyse von Oberflächenproteinenzu umgehen 3,4 . Sie ermöglichtdie gezielte Anreicherung von Peptiden, dieaus extrazellulären Proteindomänen vonZelloberflächenproteinen stammen.Die CSC-Technologie basiert auf der Biotinylierungder Glykane von Zelloberflächenproteinen(Abb. 1) und der anschließendenAffinitätsanreicherung der biotinyliertenGlykopeptide (Abb. 2). Die kovalente Biotinylierungder Glykoproteine, die auf derlebenden Zelle erfolgt, ermöglicht es, eineMomentaufnahme des zellulären Glykoproteomsder Zelloberfläche zu gewinnen. ImAnschluss an die Biotinylierung der Glykoproteineerfolgt die Zellhomogenisierung, derTrypsinverdau der Mikrosomenfraktion undschließlich die Affinitätsaufreinigung mittelsimmobilisiertem Streptavidin, welchesanschließend stringent mit Lösungsmittelngewaschen wird. Die enzymatische Elutionder Peptide mit N-Glykosidase F (PNGase F)katalysiert die hydrolytische Abspaltung derAsparagin-gebundenen Glykanketten vonden Peptiden. Diese Abspaltung führt zurDesamidierung des Asparagins – die darausresultierende Massendifferenz von einemDalton zwischen Asparagin und Aspartatlässt sich mittels LC-MS-Analyse nachweisen 5 .Somit erlaubt der Nachweis der modifiziertenGlykosylierungsmotive auch eine zuverlässigeIdentifizierung der genauen Positionder N-Glykosylierungsstellen von Zelloberflächenproteinen.Beispielsweise sind dieErgebnisse der CSC-Analyse einer Schwannzelllinie(MSC80) in Abbildung 3 visualisiert.In dieser CSC-Analyse wurden mehr als 291Oberflächenglykoproteine identifiziert, darunter45 CD-annotierte Moleküle. Insgesamtwurden 1.033 Glykopeptide identifiziert, beidenen jeweils ein desamidiertes NXS/T-Glykosylierungsmotiv bei der massenspektrometrischenAnalyse nachgewiesen werdenkonnte. Die CSC-Technologie erlaubt somitdie Erkundung der Zelloberfläche aus der Vogelperspektiveund zeigt deren Komplexitätohne vorgängige Hypothesen 3 .Quantifizierung von Expressionsveränderungenan der ZelloberflächeDie CSC-Technologie ermöglicht es, eineumfassende Zelloberflächenanalyse ohneZuhilfenahme von Antikörpern innerhalbeines einzigen Experimentes durchzuführen.Kombiniert mit quantitativen massenspektrometrischenMethoden lassen sich nichtnur die Identität der Oberflächenproteine,sondern auch deren Expressionsmengengenauer definieren. Eine vergleichendeProteinquantifizierung kann mit oder ohneIsotopenmarkierung erfolgen 6 . Um diePeptidmengen ohne zusätzliche Isotopenmarkierungzu bestimmen, werden Peptideunterschiedlicher Proben getrennt voneinandermassenspektrometrisch analysiert undanschließend aufgrund ihrer Eigenschaftenwie Masse und Elutionszeit einander zugeordnetund in den unterschiedlichen Probenmiteinander verglichen 7 .Eine Proteinquantifizierung ohne Isotopenmarkierungwurde angewandt, um veränderteExpressionsmuster von Oberflächenproteinenwährend der Differenzierungembryonaler Stammzellen der Zelllinie 159-2 8in neuronale Vorläuferzellen zu bestimmen.Insgesamt wurden in diesem Experiment 341Oberflächenproteine quantifiziert, wovon 53annotierte CD-Moleküle waren. Die quantifiziertenProteine deckten verschiedenemolekulare Funktionensgruppen ab, wiezum Beispiel Rezeptoren, Ionenkanäle undAdhäsionsmoleküle. Jede Funktionsgruppewar von Veränderungen betroffen. BekannteVeränderungen, wie die verminderte Expressiondes LIF-Rezeptors oder die verstärkteExpression des FGF-Rezeptors 2 während derDifferenzierung, konnten bestätigt werden.Zudem wurden noch eine Vielzahl an Neuentdeckungengemacht 3 . Die CSC-Technologieermöglichte es umfassend und detailliert,die weitreichenden Veränderungen der Zelloberflächewährend der Differenzierungquantitativ zu erfassen.Vergleich von Zelltypen mitdem Zelloberflächen-ProteinatlasEine ganze Reihe von Forschungsgruppenwendet mittlerweile die CSC-Technologiean, um die Zusammensetzung der Proteinean der Zelloberfläche bestimmter Zelltypenaufzuschlüsseln. Dabei können 300 bis 400Oberflächenproteine pro Zelltyp identifiziertwerden. Viele Fragestellungen zielen daraufab, aus den identifizierten Proteinen ein Setvon wenigen Markern zu definieren, eineArt Zellsignatur, welche für die diagnostischeIdentifizierung einer Zelle ausreichen.Aus einigen hundert Proteinen diejenigenauszuwählen, die spezifisch für eine Zellesind, ist nicht trivial. Es wäre hilfreich zuwissen, welche Proteine auch auf anderenZell- oder Gewebetypen identifiziertworden sind. Um solche Zelloberflächen-Signaturen zu vergleichen und möglichezellspezifische Markerproteine in einemsubtraktiven Verfahren auszuwählen, wurdeder Zelloberflächenatlas entwickelt, dermomentan (Stand Juni 2009) Informationenüber das Zelloberflächenproteom von mehrals 40 Zelltypen enthält. Mit Hilfe diesesZell oberflächenproteinatlas‘ ist es nunmöglich, schnell zu bestimmen, welche Proteineschon auf anderen Zellen identifiziertwurden und welche vielversprechend füreine weitere Validierung mit komplementärenMethoden wie Durchflusszytometrie,14 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009 LABORWELT