Untersuchungen zur Molekularen Pathogenese der Nephronophthise

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Untersuchungen zur Molekularen Pathogenese der Nephronophthise

Aus der Medizinischen Universitätsklinik

Abteilung Innere Medizin IV

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

(Ärztlicher Direktor Prof. Dr. G. Walz)

Untersuchungen zur Molekularen Pathogenese der

Nephronophthise: Bedeutung der Tyrosinphosphorylierung

von Nephrocystin

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur

Erlangung des Medizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg im Breisgau

Vorgelegt 2006

von Matthias Johannes Hackl

geboren in Friedberg (Bayern)


- II -

Dekan : Prof. Dr. Christoph Peters

Erster Gutachter : Prof. Dr. Thomas Benzing

Zweiter Gutachter : PD Dr. Heymut Omran

Jahr der Promotion : 2007

Meiner Familie.

Meiner Freundin.

1


Inhaltsverzeichnis

- III -

1. Einleitung ........................................................................................................1

1.1. Einführung in das Krankheitsbild der Nephronophthise ..................................1

1.2. Molekularbiologie und Proteinbiochemie der juvenilen Nephronophthise.......2

1.2.1. Genetik ...........................................................................................................2

1.2.2. Gewebeexpression von Nephrocystin.............................................................3

1.2.3. Molekulare Struktur von Nephrocystin ............................................................4

1.2.4. Subzelluläre Lokalisation und Funktion...........................................................5

1.3. Überblick über das Protein Pyk2.....................................................................8

1.4. Überblick über das Protein Tensin..................................................................8

1.5. Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit .......................................................9

2. Methoden......................................................................................................10

2.1. Materialien und Lösungen.............................................................................10

2.1.1. Zellkultur .......................................................................................................10

2.1.2. Transfektionen ..............................................................................................10

2.1.3. Pulldowns……………………………………………………………………….. ...10

2.1.4. Immunpräzipitationen....................................................................................10

2.1.5. SDS-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Immunoblot................................10

2.1.6. Antikörper für Western Blot und Immunpräzipitation.....................................11

2.1.7. Materialien für Coomassie…………………………………………………….....11

2.1.8. DNA, Plasmide, Quickchange und rekombinante Proteine………………….. 11

2.2. Zellkultur .......................................................................................................12

2.3. Transfektion ..................................................................................................12

2.4. Ernten von HEK 293T-Zellen im Experiment ................................................13

2.5. In-vitro Interaktion………………………………………………………………… 13

2.6. Pulldown-Experiment....................................................................................14

2.7. Immunpräzipitation........................................................................................14

2.8. SDS-Gelelektrophorese und Immunoblot (Western Blot)..............................14

2.8.1. Eindimensionale Gelelektrophorese und Immunoblot...................................14

2.8.2. Zweidimensionale Gelelektrophorese...........................................................16

2.9. Proteinmarkierung mit 32 P und Phosphoaminosäurenanalyse......................17


- IV -

2.10. Zweidimensionale Identifizierung von Phosphorylierungsstellen ..................17

2.11. Coomassie-Blau-Färbung……………………………………………………… ..18

2.12. DNA, Plasmide, Quickchange und rekombinante Proteine…………………..18

3. Ergebnisse....................................................................................................20

3.1. NPHP1 wird durch Pyk2 phosphoryliert ........................................................20

3.2. Analyse der phosphorylierten Aminosäuren von NPHP1..............................20

3.3. Analyse der Phophorylierungsstellen von NPHP1 ........................................22

3.4. Mutation der Tyrosinphosphorylierungsstellen von NPHP1 ..........................22

3.5. Präzisierung der Interaktion von NPHP1 und Tensin....................................26

4. Diskussion ....................................................................................................28

5. Zusammenfassung .......................................................................................30

6. Literatur.........................................................................................................31

7. Anhang .........................................................................................................38

7.1. Abkürzungen.................................................................................................38

7.2. Danksagung..................................................................................................40

7.3 Lebenslauf ....................................................................................................41


1. Einleitung

- 1 -

1.1 Einführung in das Krankheitsbild der juvenilen Nephronophthise

Die familiäre juvenile Nephronophthise (Nephronophthise Typ 1, NPH1, FJN) ist die

häufigste vererbbare zystische Nierenerkrankung im Kindesalter und stellt aufgrund

ihrer Progredienz bis zum terminalen Nierenversagen eine der häufigsten Ursachen

für die Dialyse bei Kindern dar. Die Nephronophthise wird mit den medullären

zystischen Nierenerkrankungen, wegen ihrer ähnlichen Pathologie, zum MCKD/NPH-

Komplex (Hildebrandt et al., 1992; Spitzner and Avner, 1989) zusammengefasst.

Circa 10% aller dialysepflichtigen Niereninsuffizienzen im Kindesalter werden durch

die NPH verursacht, das Durchschnittsalter beim Eintritt der terminalen

Funktionsstörung liegt bei 13 Jahren (Hildebrandt et al., 1997b).

Das Krankheitsbild der juvenilen Nephronophthise wurde erstmals 1945 durch Smith

und Graham beschrieben. Wenige Jahre später prägten Fanconi, Hanhart und

Albertini den Begriff „familiäre juvenile Nephronophthise“ (Fanconi et al., 1951; Smith

and Graham, 1945).

Neben der juvenilen Nephronophthise (NPH1) können aufgrund des

Manifestationsalters des Nierenversagens zwei weitere Formen abgegrenzt werden.

Bei der infantilen Nephronophthise (NPH2) geht die Nierenfunktion im Schnitt

zwischen dem ersten und dritten Lebensjahr verloren, bei der adoleszenten Form

(NPH3 und NPH4) um das 19. Lebensjahr (Hildebrandt und Otto 2000).

Die NPH1 beginnt mit milden klinischen Symptomen, wobei die Fähigkeit zur

Harnkonzentrierung bereits früh deutlich reduziert ist. Zuerst fällt eine Polydipsie,

Nykturie und Enuresis nocturna auf (Hildebrandt und Omran 2001). Im weiteren

Verlauf treten eine Wachstumsretardierung, eine progressive Anämie und das

terminale Nierenversagen auf.

Makroskopisch zeigen sich Zysten an der corticomedullären Grenze, dem Übergang

zwischen Nierenrinde und Nierenmark. Die Nieren sind im Gegensatz zum

Erscheinungsbild der autosomal dominanten polyzystischen Nierenerkrankung nicht

vergrößert (Hildebrandt und Omran 2001). Die mikroskopischen renalen

Veränderungen sind durch die typische histologische Triade gekennzeichnet (Konrad

et al., 1998; Waldherr et al., 1982; Zollinger et al., 1980), (1) tubuläre Basalmembrandesintegration

(Verdickung und Rückbildung); (2) Atrophie und Ektasie bzw. Zystenbildung

vor allem im distalen Tubulus; (3) interstitielle Fibrose.


- 2 -

Darüber hinaus wird eine periglomeruläre Fibrose auffällig, die bereits früh im

Krankheitsverlauf auftritt. Im Rahmen der juvenilen Nephronophthise treten auch

extrarenale Manifestationen auf. Die okuläre, motorische Apraxie vom Typ Cogan

scheint auf dem gleichen genetischen Defekt zu beruhen, wie die rein renale

Manifestationsform der NPH1 (Betz et al. 2000, Cogan et al., 1952). Das Senior-

Loken-Syndrom beschreibt das gleichzeitige Auftreten von Nephronophthise und

Retinitis pigmentosa (Loken et al., 1961; Senior et al., 1961). Weiterhin wurde das

Joubert-Syndrom vom Typ B beschrieben, das NPH, Retinadegeneration, Kolobome

des Auges und Aplasie des Vermis cerebelli umfasst (Hildebrandt et al., 1998), eine

NPH mit Leberfibrose (Boichis et al., 1973) und das Mainzer-Saldino-Syndrom, das

sich durch kegelförmige Epiphysen äußert (Mainzer et al., 1970). Die

Nephronophthise kann also als eine Systemerkrankung verstanden werden.

Das makroskopische Erscheinungsbild der infantilen Nephronophthise (NPH2)

unterscheidet sich von der juvenilen Form durch vergrößerte Nieren und dem

Auftreten von Zysten außerhalb der corticomedullären Grenze. Mikroskopisch lässt

sich keine Unregelmäßigkeit der Basalmembran nachweisen (Otto et al., 2003). Die

Histologie der adoleszenten Formen (NPH3 und NPH4) gleicht der der NPH1

(Hoefele et al., 2004).

1.2 Molekularbiologie und Proteinbiochemie der juvenilen NPH

1.2.1 Genetik

Die Nephronophthise tritt mit einer Inzidenz von 1:100.000 auf und ist damit eine

vergleichsweise seltene Krankheit (Otto et al., 2005). Dennoch stellt sie die häufigste

hereditäre Ursache für ein dialysepflichtiges Nierenversagen im Kindes- und

Adoleszentenalter dar. Sie wird autosomal-rezessiv vererbt. Darin unterscheidet sich

die Nephronophthise von den medullären zystischen Nierenerkrankungen (MCKD),

die autosomal-dominant vererbt werden und sich später manifestieren. Gegenwärtig

sind zwei Formen der MCKD bekannt, bei Typ 1 kommt es im Durchschnitt im Alter

von 62 Jahren, bei Typ 2 im Alter von 32 Jahren zum terminalen Nierenversagen

(Hildebrandt und Otto, 2000).

Mittlerweile konnten Mutationen in sechs verschiedenen Genen kartiert, identifiziert

und die zugehörigen Proteine beschrieben werden (NPHP1-6). Das für die juvenile

Nephronophthise verantwortliche Gen wurde auf dem Chromosom 2q12-13 kartiert.

Ein Großteil der NPH-Patienten tragen in diesem Gen große homozygote Deletionen


- 3 -

(Antignac et al., 1993; Hildebrandt et al., 1993; Konrad et al., 1996). Durch

Positionsklonierung konnte das verantwortliche Gen NPHP1 praktisch zeitgleich von

zwei Arbeitsgruppen identifiziert werden (Hildebrandt et al., 1997a; Saunier et al.,

1997). Das NPHP1-Gen besteht aus 83.000 Basenpaaren, diese enthalten 20 Exone

und ergeben zusammen eine 4,5 kb große mRNA. Diese wird in das bis dahin

unbekannte, hochkonservierte SH3-Domänen-Protein Nephrocystin translatiert

(Hildebrandt and Otto 2000, Hildebrandt 1997b).

Die der infantilen Nephronophthise zugrunde liegende Mutation konnte auf

Chromosom 9q21-q22 kartiert werden (Haider et al., 1998). Das Gen NPHP2 kodiert

ein Protein mit dem Namen Inversin (Otto et al., 2003). Die entsprechende Knock-out

Maus zeigt einen der menschlichen Erkrankung ähnlichen Phänotyp mit Situs

Inversus und Zystennieren (Watanabe et al., 2003).

Für die adoleszente Form der Nephronophthise (NPH3) wurden der Genort 3q21-q22

kartiert. NPHP3 wurde in einer venezuelanischen Population identifiziert und kodiert

für ein Tetratrico Repeat-Protein unbekannter Funktion (Olbrich et al., 2003; Omran

et al., 2000). NPHP4 wurde auf Chromosom 1q36 lokalisiert und kodiert für ein mit

Nephrocystin interagierendes Protein, das mit ähnlichen Partnern wie Nephrocystin

interagiert (Mollet et al., 2005). Kürzlich wurde das NPHP5 – Gen identifiziert.

Mutationen in diesem Gen sind obligat mit dem Senior-Loken-Syndrom assoziiert

(Otto et al., 2005). NPHP6 kodiert für ein zentrosomales Protein namens CEP290

(Chan et al., 2006).

1.2.2. Gewebeexpression von Nephrocystin

Durch eine Northern-Blot-Analyse konnte eine Expression von Nephrocystin in

verschiedenen menschlichen Geweben nachgewiesen werden. Sortiert nach

abnehmender Expression, konnte in Hypophyse, Rückenmark, Schilddrüse, Trachea

und Niere (Otto et al., 2000) Nephrocystin mRNA nachgewiesen werden. Unsere

Arbeitsgruppe konnte Expression auf Proteinebene zumindest in Gehirn, Niere und

Hoden zeigen (Benzing et al., 2001). Die Expression in verschiedenen Geweben

erklärt die extrarenalen Manifestationen der juvenilen Nephronophthise. In der

Embryonalentwicklung der Maus lässt sich eine Nephrocystin-Expression ab E7,5 bis

E10,5 post coitum nachweisen. In der adulten Maus wird Nephrocystin am stärksten

in den Hoden exprimiert (Otto et al., 2000).


- 4 -

1.2.3 Molekulare Struktur von Nephrocystin

Nephrocystin ist zwischen unterschiedlichen Spezies hoch konserviert. Der Vergleich

der humanen Nephrocystinsequenz mit dem Maushomolog ergibt eine Identität der

Aminosäuresequenz von 83% und eine Ähnlichkeit von 91%. Auch im

Nematodenwurm und Modellorganismus Caenorhabditis elegans findet sich ein

Nephrocystinhomolog. Es zeigt eine Identität von 23% und ein Ähnlichkeit von 42%

zum humanen Homolog (Otto et al., 2000).

Nephrocystin ist ein Nicht-Membran-Protein mit mehreren Protein-

Interaktionsdomänen. Nephrocystin enthält:

1. drei sog. Coiled-Coil-Domänen (Aminosäure (aa) 10-27;49-68;89-105) (Donaldson

et al., 2000; Otto et al., 2000b)

2. zwei Cluster mit sauren Aminosäuren (Acidic Cluster, aa 120-147 und 221-227)

(Hildebrandt et al., 1997b)

3. eine SH3-Domäne (aa 157-208) (Hildebrandt et al., 1997a)

4. eine sog. Nephrocystin-Homologie-Domäne (NHD) am C-Terminus (aa 228-677)

(Donaldson et al., 2002)

Abb. 1: Domänenstruktur von Nephrocystin. CC, Coiled Coil-Domäne; SH3, Src Homologie

3-Domäne; AC, Acidic Cluster; NHD, Nephrocystin-Homologie-Domäne.

Bei Coiled-Coil-Domänen handelt es sich um amphipathische, α-helikale Strukturen,

die als Zylinder organisiert sind. In einer Windung wiederholt sich ein Heptade, die

erste und vierte Position wird durch hydrophobe Aminosäuren besetzt. Dadurch

entsteht auf der einen Seite ein hydrophober Pol, während die restlichen

Aminosäuren auf der gegenüberliegenden Seite einen hydrophilen Pol bilden

(Burkard et al., 2001; Lodish, 2000). Über hydrophobe Wechselwirkungen kann eine

Coiled-Coil-Domäne mit einer Anderen interagieren, indem sich die Stränge

ineinander winden. Auf diese Art interagieren beispielsweise auch die Proteine

Polycystin 1 und Polycystin 2, die bei der autosomal-dominanten polyzystischen

Nierenerkrankung mutiert sind (Tsoikas et al., 1997).

Acidic Clusters sind durch eine Ansammlung der sauren Aminosäuren Glutamat und

Aspartat gekennzeichnet. In den Acidic Clustern von Nephrocystin liegen zwischen


- 5 -

diesen Aminosäuren mehrere Serine, die klassische Phosphorylierungsstellen der

Casein Kinase II darstellen (S121, 123, 126, 129, 211) und in phosphoryliertem

Zustand die Interaktion mit dem Sortierprotein PACS-1 vermitteln (Schermer et al.,

2005).

SH3-Domänen sind klassische Proteininteraktionsmodule, die mit Prolin-reichen

Sequenzen des Partnerproteins interagieren. Typischerweise binden SH3-Domänen

an PxxP-Motive (P=Prolin; X=jede beliebige Aminosäure) und spielen ein große

Rolle bei Signaltransduktionsprozessen, z.B. bei der Signalübertragung an Zell-Zellund

Zell-Matrix-Kontakten.

Darüberhinaus verfügt Nephrocystin noch über weitere mögliche Interaktionsmotive

in der Aminosäuresequenz. Zu finden sind beispielsweise eine Bindungsstelle für

SH3-Domänen (P430), SH2-Domänen-Bindungsstellen (Y46, Y349, Y721),

Bindungsmotive für das Adaptorprotein 14-3-3 (S460), Phosphorylierungsmotive für

Kinasen der Src-Familie (Y721), Di-Leucin-basierte Motive (z.B. L27, L338, L653),

Endocytose-Motive („Yek1 clathrin coated pit recriutment motif for endocytosis“) und

eine Bindungsstelle für eine FHA-Domäne (T282).

1.2.4 Subzelluläre Lokalisation und Funktion

Die verschiedenen Proteininteraktionsdomänen von Nephrocystin deuten darauf hin,

dass Nephrocystin seine Funktion durch Protein-Protein-Interaktionen erfüllt. Trotz

intensiver Forschung beginnt sich diese Funktion nur langsam

herauszukristallisieren. Unsere Arbeitsgruppe konnte durch den Einsatz spezifischer

Antiseren zeigen, dass Nephrocystin, außer in einem perinukleären Kompartiment,

auch in primären Zilien von Nierenepithelien vorkommt (Otto et al., 2003). Alle

Nierenepithelien, wohl mit Ausnahme der interkalierenden Zellen des Sammelrohres,

besitzen, wie viele Zelltypen anderer Organe, ein einzelnes primäres Zilium

(=Monozilium) an ihrer apikalen Oberfläche. Dieses primäre Zilium ist unbeweglich

und besitzt ein 9+0 Mikrotubuli-Struktur, d.h. es existiert kein zentrales

Mikrotubuluspaar. Demgegenüber besitzt das motile (=bewegliche) Zilium, das z.B.

im respiratorischen Epithel der Atemwege vorkommt, eine typische 9+2 Mikrotubuli-

Struktur. Interessanterweise stellt das Verbindungszilium der Stäbchen der Retina

zum Zellkörper ein modifiziertes primäres Zilium dar (Latta et al., 1961; Rosenbaum

and Wittman 2002; Zimmermann, 1898) und NPHP-5 interagiert mit RPGR, einem


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Protein, das in Fällen der familiären Retinitis pigmentosa mutiert ist und in das

Verbindungszilium der Sehrezeptoren lokalisiert (Otto et al., 2005; Hong et al., 2003).

Darüber hinaus konnte eine Funktion bei der Erzeugung der Links-Rechts-

Asymmetrie in der Embryonalentwicklung gezeigt werden (Kramer-Zucker et al.,

2005). Kürzlich konnte die subzelluläre Lokalisation von Nephrocystin präzisiert

werden. Es ist in respiratorischen Epithelzellen in der Übergangszone des Ziliums,

direkt distal des Basalkörperchens, lokalisiert. Für diese Lokalisation ist die

Interaktion mit dem Sortierprotein PACS-1 notwendig (Schermer et al., 2005).

Die genaue Funktion von primären Zilien ist noch unklar, jedoch gibt es gute Evidenz

für eine Rolle des Ziliums in Nierenzellen als Flussensor (Schwartz et al., 1997). So

konnte nach Abbiegung des Ziliums ein Anstieg des intrazellulären Kalziums

nachgewiesen werden (Praetorius and Spring, 2001).

Eindeutig belegt werden konnte, dass eine ganze Reihe von zystische

Nierenerkankungen verursachenden Proteinen ins Monozilium der Niere lokalisiert

(Calvet, 2002; Calvet, 2003a; Calvet, 2003b; Igarashi and Somlo, 2002; Ong and

Wheatley, 2003). Dies gilt ebenso für die für die bei autosomal-dominanter

polyzystischer Nierenerkrankung mutierten Proteine Polycystin-1 und Polycystin 2

(Yoder et al., 2002a), das bei autosomal-rezessiv polyzystischer Nierenerkrankung

mutierte Fibrocystin/Polyductin (Harris and Rossetti, 2004; Ward et al., 2003), das

beim Cpk-Mausmodell zystischer Nieren mutierte Cystin (Hou et al., 2002) und das

bei der Orpk-Maus mutierte Polaris (Yoder et al., 2002b).

Für die Proteine Polycystin-1 und Polycystin-2 konnte gezeigt werden, dass sie als

Kalziumkanalkomplex im Zilium fungieren und damit mechanische Stimulation des

Ziliums ins Zellinnere kommunizieren (Nauli et al., 2003).


- 7 -

Abb. 2: Viele mit zystischen Nierenerkrankungen assoziierte Proteine wurden

mittlerweile in renalen Monozilien lokalisiert (Quelle: Watnick & Germino, Nat

Genetics 2003).

Zwischenzeitlich wurden einige Interaktionspartner von Nephrocystin ermittelt.

Nephrocystin interagiert mit Inversin (NPHP2), Nephrocystin-3 (NPHP3),

Nephrocystin-4 (NPHP4) und β-Tubulin, einem Grundbaustein der Mikrotubuli (Mollet

et al., 2002; Olbrich et al., 2003; Otto et al., 2003). Weiterhin konnte eine Interaktion

mit p130Cas demonstriert werden (Donaldson et al., 2000), einem Bestandteil fokaler

Adhäsionen (FA). Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass das Protein Tensin

durch Nephrocystin copräzipitiert werden kann (Benzing et al., 2001). Allerdings war

bisher nicht klar, ob es sich hierbei um eine direkte Interaktion handelt, oder ob diese

über p130Cas vermittelt wird, das direkt mit Tensin interagiert (Lo et al., 1997).

Außerdem konnten wir eine direkte Interaktion von Nephrocystin mit Pyk2

nachweisen (Benzing et al., 2001). Um der Funktion dieser Interaktion näher zu

kommen, wurden die Experimente dieser Arbeit durchgeführt. Deswegen folgt

zunächst ein kurzer Überblick über das Protein Pyk2.


1.3 Überblick über das Protein Pyk2

- 8 -

Die Proline-reiche-Tyrosin-Kinase-2 (Pyk2) ist auch unter den Namen RAFTK, FAK2,

CAK-β und CADTK bekannt. Von Pyk2 existieren zwei Splice-Varianten, eine 106

kDa und eine 110 kDa schwere Isoform. Die stärkste Gewebeexpression von Pyk2

lässt sich im zentralen Nervensystem (110kDa Isoform) und in hämatopoetischen

Zelllinien (106kDa Isoform) nachweisen, in geringerem Maße wird Pyk2 in Leber,

Niere und Hoden exprimiert (Dikic et al., 1998). Subzellulär ist Pyk2 diffus im

Zytoplasma verteilt mit einer Konzentration in der perinukleären Region. Hierin

unterscheidet sich Pyk2 von der verwandten Fokalen-Adhäsions-Kinase (FAK), die in

allen Gewebetypen vorkommt und an die Fokalen Adäsionen lokalisiert.

Pyk2 kann durch zahlreiche Stimuli aktiviert werden, darunter Anstieg des

intrazellulären Calciums, Stressignale, wie Tumornekrosefaktor-α, hyperosmolare

Umgebung oder UV-Strahlung, G-Protein-Rezeptor-Agonisten wie Angiotensin II

oder Thrombin, Wachstumsfaktoren wie VEGF oder PDGF und pH-Verschiebung im

Nierenepithel (Orr et al., 2004; Gluck, 2004).

Neben der bereits beschriebenen Interaktion von Nephrocystin mit Pyk2 konnte

unsere Arbeitsgruppe ebenfalls zeigen, dass Pyk2 durch Coexpression von

Nephrocystin verstärkt phosphoryliert wird (Benzing et al., 2001).

Bei Aktivierung phosphorylieren sich Pyk2 Moleküle gegenseitig am Tyrosin Y 402 . An

dieses bindet anschließend die Kinase Src über Ihre SH2-Domäne und

phosphoryliert die Tyrosine Y 579 und Y 580 der Kinasedömäne von Pyk2. Dadurch wird

diese aktiv, und Pyk2 kann selbst Zielproteine nachgeschalteter

Signaltransduktionskaskaden phosphorylieren (Park et al., 2004)

Mittlerweile sind etliche Effektormoleküle von Pyk2 bekannt, die Pyk2 mit dem

MAPK/ERK und JNK Signaltransduktionswegen verknüpfen. Darüber hinaus scheint

Pyk2 vielfältige Funktionen in der Zelle zu regulieren, z.B. Proliferation,

Differenzierung und Adhäsion (Avraham et al., 2000).

1.4 Überblick über das Protein Tensin

Das Protein Tensin besteht aus 1735 Aminosäuren, die von einer 7,7kb großen

cDNA kodiert werden. Die berechnete molekulare Masse liegt bei 185 kDa, im

Western Blot läuft Tensin jedoch auf der Höhe eines 220 kDa Proteins. Dieses


- 9 -

Phänomen entsteht durch die ungewöhnlich langsam wandernde Zentralregion (306-

1168) (Chen et al., 2000). Tensin konnte an Fokalen Adhäsionen (FA) lokalisiert

werden (Lo et al., 1994), außerdem konnte unsere Arbeitsgruppe eine Interaktion mit

NPHP1 nachweisen (Benzing et al., 2001). Tensin enthält zwei Bindungsstellen für

FAs, eine im N-Terminus und eine im C-Terminus. Außerdem enthält das Protein

eine Actin-Bindungsdomäne, eine SH2-Domäne und eine Phosphotyrosin-Bindungs-

Domäne (PTB-Domäne). Über die FA- und Actin-Bindungsbereiche kann Tensin eine

Verknüpfung zwischen Fokalen Adhäsionen und dem Zytoskelett der Zelle

herstellen. Über die SH2-Domäne können weitere Effektormoleküle gebunden

werden. Nur wenn beide FA-Bindungsstellen und die SH2-Domäne intakt sind,

fördert Tensin die Zellmigration (Chen et al., 2003). Zwischenzeitlich wurden drei

weitere Proteine der Tensinfamilie identifiziert: Tensin2, Tensin3 und Cten, deren

Proteindomänen weitgehend konserviert sind (Chen et al., 2002; Cui et al., 2004; Lo

and Lo, 2002).

Die mRNA von Tensin wird in vielen Geweben exprimiert, am deutlichsten kann sie

in Herz und Niere gefunden werden. Interessanterweise erscheinen Tensin

Knockout-Mäuse bei Geburt normal, entwickeln jedoch anschließend eine

progressive zystische Nierenerkrankung und sterben an Nierenversagen. Die

Histologie der Tensin -/- Mausniere erinnert an die der menschlichen

Nephronophthise (Lo et al., 1997; Lo 2004).

1.5 Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit

Obwohl aufgrund intensiver Forschungsarbeit immer wieder neue Interaktionspartner

des Nephrocystins publiziert werden, ist die genaue Funktion des Proteins immer

noch unklar. Es wird angenommen, dass es an der Signaltransduktion extrazellulärer

Signale, wie mechanischem Stress, osmotischen und chemischen Reizen, ins

Zellinnere beteiligt ist (Watnick and Germino, 2003). Unsere Arbeitsgruppe konnte

die Interaktion von NPHP1 mit Pyk2 nachweisen, jedoch war bisher kein von Pyk2 in

der Folge phosphoryliertes Protein bekannt.

Diese Arbeit beschäftigte sich deshalb mit der Phosphorylierung von NPHP1 durch

Pyk2 und der Interaktion von tyrosinphosphoryliertem NPHP1 mit Tensin.


2. Methoden

2.1 Materialien und Lösungen

- 10 -

Für die Experimente wurden die hier kurz aufgelisteten Lösungen verwendet.

2.1.1 Zellkultur

- DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium) (Bio Whittaker) mit 4,5 g/l

Glucose mit 2,5 mM L-Glutamine und Zusatz von 5% Kälberserum und Eisen

- Trypsin-EDTA mit HBSS ohne Magnesium und Calcium

- PBS: 136 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 6,25 mM Na2 HPO4; 1,5mM KH2PO4

- HEK 293T- Zellen (human embryonic kidney), Prof. Dr. B. Seed (Harvard

Medical School, Boston)

2.1.2 Transfektionen

- Calciumchlorid 0.25 M

- 2x HEBS (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonat) mit pH 7,09 (50 mM

Hepes; 280 mM NaCl, 10mM KCl; 1,5 mM Na2HPO4; 12 mM Dextrose)

2.1.3 Pulldowns

- Amylose-Beads (New England Biolabs)

- Glutathion-Sepharose Beads (Amersham)

2.1.4 Immunpräzipitationen

- IP- Puffer: 1% Triton X-100; 20 mM Tris pH 7.5; 50 mM NaCl; 50 mM NaF;

15 mM Na4P2O7; 0.1 mM EDTA; 2 mM Na2VO4; 44 mg/ml PMSF

- Anti-Flag (M2)- Beads (Sigma)

2.1.5 SDS-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Immunoblot

Sammelgel: 5% Polyacrylamid; 125 mM Tris pH 6,8; 0,1 % SDS; 0,05% APS; 0,1%

TEMED

Trenngel: 10% Polyacrylamid; 375 mM Tris pH 8,8; 0,1 % SDS; 0,05% APS;

0,05% TEMED


Puffer:

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- 2x Lämmli-Puffer: 100 mM Tris pH 6,8; 4% SDS, 20% Glycerol, 0,2%

Bromphenolblau, 100 mM DTT

- Laufpuffer: 25 mM Tris pH 8,3; 0,1% SDS; 192 mM Glycin

- Transferpuffer: 25 mM Tris pH 8,3; 0,1% SDS; 192 mM Glycin; 20%

Methanol;

- Waschpuffer: 10 mM Tris pH 7.5; 100 mM NaCl; 0,1% Tween- 20

Sonstige Materialien:

- BSA (Bovines Serum Albumin) (Sigma): 5% im Waschpuffer

- Membran: PolyScreen PVDF Transfer Membrane (Life Science)

- Visualisierunglösung Enhanced Chemiluminescence :

100 mM Tris pH 8,5; 2,5 mM Luminol; 0,4 mM Coumarinsäure, 1,5% H2O2

- Filme für Western Blot- Entwicklung: Fudji Medical X-Ray Film

2.1.6 Antikörper für Western Blot, Immunpräzipitation und Immunfluoreszenz

- Anti - Flag ® M2 monoklonaler Antikörper (Sigma): Western Blot: 1: 3000

Verdünnung

- Anti – HA polyklonaler Antikörper (Santa Cruz): Westernblot: 1: 500

Verdünnung

- Anti - Src (Santa Cruz)

- Anti - MBP polyklonaler Antikörper (New England Biolabs)

- Anti - pY99 (Transduction)

- Anti - Pyk2 (Transduction)

- Anti - NPHP1 polyklonaler Antikörper (Cocalico Biologicals, Reamstown, PA)

Western Blot 1,5 µg/ml

2.1.7 Materialien für Coomassie

- Fixierlösung: 12% Trichloressigsäure

- Coomassielösung: 8% (NH4)2SO4; 1,6% H3PO4; 0,08% Coomassie Brilliant

Blue G250; 20% Methanol.

- Entfärbungslösung: 20% Methanol

2.1.8 DNA, Plasmide, Quickchange und rekombinante Proteine

- T4- Ligase (New England BioLabs)


- Pfu- Polymerase (Stratagene)

- 12 -

- QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)

- Restriktionsenzyme (New England BioLabs)

- Bakterielle Expressionsvektoren: Für MBP-getaggte Proteine: pmalC3 (New

England BioLabs); für GST-getaggte Proteine: pGEX4-T3 (Stratagene)

2.2 Zellkultur

Für die verschiedenen Versuche wurden HEK293T-Zellen verwendet, die in 10cm

Schalen in DMEM (Dulbecco`s Modified Eagle´s Medium) kultiviert wurden. Die

Schalen wurden in einem befeuchteten Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.

Der Umgang mit den Zellen fand nur unter einem sterilen Abzug statt, um das

Kontaminationsrisiko möglichst gering zu halten. Die Subkultivierung der konfluenten

Zellen erfolgte durch eine Trypsinisierung und 1:5 Passage. Dabei wurde zuerst das

alte Medium abgesaugt. Anschließend erfolgte ein kurzer Waschschritt mit sterilem

PBS (25°C), bevor 1-2ml Trypsin in kleinen Tropfen gleichmäßig über die Zellen

verteilt wurde. Dann wurden die 10cm Schalen nochmals für 1 bis 2 Minuten in den

Brutschrank gestellt, um das Ablösen der Zellen zu verbessern. Nachdem die Zellen

durch die Trypsinisierung größtenteils nicht mehr adhärent waren, erfolgte nun die

Aufnahme der Zellen in 9ml Medium (37°C) und die Verteilung der Zellen auf eine

gemäß dem Passageverhältnis vorbereitete Anzahl von 10cm Schalen.

2.3 Transfektion

Am Vortag gesplittete, ca. 75% konfluente HEK-293T wurden mit der Calcium-

Phosphat-Methode (Chen und Okayama, 1987) transient transfiziert. Diese Methode

nutzt die Fähigkeit der Zellen aus, Calciumphosphatkristalle zu phagozytieren. Auf

diese Weise kann kopräzipitierte Plasmid-DNA in die Zellen eingebracht werden. 10-

20µg DNA wurden in ein Eppendorfgefäß pipettiert. Unter dem sterilen Abzug

wurden dann 500µl 0.25M Calciumchlorid zur DNA zugegeben. Weitere 500µl 2x

HEBS wurden unter stetigem Tropfen in das Gefäß pipettiert, während dieses auf

dem Schüttler kontinuierlich durchmischt wurde. Für die Bildung der DNA-

Calciumphosphat-Kopräzipitate ist es wichtig, 2x HEBS langsam und unter

ständigem Mischen zur DNA-Lösung zu geben. Weiterhin ist der pH-Wert des HEBS

entscheidend, denn nur in einem pH-Bereich von 6.9 - 7.5 bilden sich Kristalle in


- 13 -

einer Größe, die von den Zellen phagozytiert werden kann (Chen and Okayama,

1987; Graham and van der Eb, 1973; Loyter et al., 1982).

Nun gab man 980µl dieser Transfektionslösung tropfenweise in das Kulturmedium

der Zellen. Die DNA wurde zusammen mit den Kristallen durch Phagozytose in das

Zellinnere aufgenommen (Loyter et al., 1982). Nach 6-8 Stunden wurde die

Transfektion gestoppt, indem durch einen Mediumwechsel verbliebene, freie CaPO4-

Kristalle entfernt wurden. Die Zellen wurden über Nacht in dem ausgetauschten

Medium inkubiert.

2.4 Ernten der HEK293T-Zellen im Experiment

Zuerst wurde das Medium abgesaugt. Anschließend wurden die Zellen mit

gekühltem PBS (4°C) gespült, wobei der PBS-Strahl senkrecht auf die Zellen

gerichtet wurde. Durch mehrmaliges Wiederholen dieses Vorgangs, gelang es alle

Zellen zu lösen. Die PBS-Lösung wurde zusammen mit den darin befindlichen Zellen

in ein 15ml Falcon-Röhrchen überführt. Im folgenden wurden die Falconröhrchen für

5 min bei 1000rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, das

Pellet in 1 ml Lysier-Puffer resuspendiert und die Suspension in Eppendorfgefäße

überführt. Nach 15minütiger Inkubation auf Eis wurden die Eppendorfgefäße für 15

min bei 13000 rpm und 4°C zentrifugiert. Mit dem anschließend abgenommenen

Überstand erfolgte ein Immunpräzipitation, ein Pulldown oder direkt ein Westernblot.

2.5 In-vitro Interaktion von Proteinen

Ein in vitro-Interaktions-Experiment weist die direkte Interaktion zweier rekombinant

hergestellter Proteine nach. Die unaufgereinigten GST.hTensin Trunkationen wurden

in verschiedenen Ansätzen über 60 min auf dem Überkopfschüttler bei 4 °C an

Glutathion-Beads gebunden. Die Beads wurden 3x mit PBS gewaschen, die

F.NPHP1 Proben auf die trockenen Pellets pipettiert und 1 Stunde auf dem

Überkopfschüttler bei 4 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Beads mit PBS

wurden sie in 40 µl Laemmli-Puffer resuspendiert, für 5 min auf 95°C erhitzt, und es

schloss sich eine Western Blot-Analyse an.


2.6 Pulldown-Experiment

- 14 -

In einem Pulldown-Experiment wird die Interaktion eines rekombinant in E. coli

hergestellten Proteins mit Proteinen aus Zelllysaten nachgewiesen. Vorher wurden

HEK 293T Zellen, wie oben beschrieben, transfiziert und geerntet. Das Zelllysat

wurde mit zuvor affinitätspurifiziertem MBP.Tensin 1428-1580 (gebunden an Amylose

Beads) bzw. GST.Tensin SH2 (gebunden an Glutathion Beads) für 60 Minuten auf

dem Überkopfschüttler inkubiert. Die Beads wurden mehrmals mit Lysier-Puffer

intensiv gewaschen, das Pellet wurde anschließend in 40 µl 2x Lämmli-Puffer

resuspendiert, 5 min auf 95 °C erhitzt und auf ein SDS-PAGE Gel aufgetragen.

2.7 Immunpräzipitation

Zuvor transfizierte HEK 293T-Zellen wurden in PBS geerntet (siehe 2.4) und in 1 ml

Lysier-Puffer lysiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (13000 rpm, 15 min, 4 °C)

wurde der Überstand abgenommen. 40 µl davon wurden als Lysat separat

aufbewahrt, während mit 900 µl Überstand die eigentliche Immunpräzipitation

durchgeführt wurde. Nach einer Ultrazentrifugation (45000 rpm, 30 min, 4 °C) wurde

der Überstand mit antikörperbesetzten Beads inkubiert. Für anti-FLAG

Immunpräzipitationen wurden kommerziell erhältliche M2-Beads verwendet, bei

denen anti-FLAG Antikörper kovalent an Agarose-Kügelchen gebunden sind. Durch

Zentrifugieren wird ein Komplex aus Bead, Antikörper, präzipitiertem Protein und

kopräzipitiertem Protein am Boden angereichert. Die Immunkomplexe wurden

mehrfach intensiv mit Lysierpuffer gewaschen und anschließend das nach dem

letzten Waschschritt verbliebene Pellet, ebenso wie die Lysate, in 40 µl 2x Lämmli-

Puffer resuspendiert. Nach 5minütigem Erhitzen wurden die Proben auf ein SDS-

PAGE Gel aufgetragen.

2.8 SDS-Gelelektrophorese und Immunoblot (Western Blot)

2.8.1. Eindimensionale Gelelektrophorese und Immunoblot

Ziel der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ist es, Proteine größenabhängig zu

trennen und durch einen Western Blot dauerhaft auf einer Membran zu fixieren.

Durch spezifische Antikörpernachweisreaktionen können einzelne Proteine sichtbar

gemacht werden (Towbin et al., 1979). Mit der Western-Blot Analyse können Größe


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und relative Menge der aufgetragenen Proteine bestimmt werden. Zudem können

durch gezielte Antikörperwahl in der Nachweisreaktion posttranslationale

Modifikationen ermittelt werden.

Nach dem Ernten und der Lyse der Zellen (s. oben) wurden die Lysate mit 40 µl 2x

Lämmli-Puffer versetzt und für 5 min bei 95 °C denaturiert. Das darin enthaltene

Reduktionsmittel DTT spaltet vorhandene Disulfidbrücken, wodurch Proteinkomplexe

getrennt und Proteine aufgefaltet werden. Durch das Detergenz SDS werden die

Proteine nicht nur solubilisiert, sondern sie erhalten auch eine stark negative

Gesamtladung, weshalb ihre elektrophoretische Beweglichkeit ausschließlich von

ihrer Größe abhängt.

Nachdem die Proben in die Taschen des 7-15% Polyacrylamidgels (Acrylamid

polymerisiert durch TEMED und APS) geladen wurden, wanderten die Proteine

zunächst im Sammelgel bei 70 V für 30 min gemeinsam in Richtung Anode. Danach

wurden die Proteine für 2 Stunden im Trenngel bei 20 mA gemäß ihrer Größe

aufgetrennt. Unmittelbar im Anschluss erfolgte der elektrophoretische Transfer auf

eine proteinbindende Membran im Semi-Dry-Verfahren (Towbin et al., 1979). Dabei

wurden die Proteine durch Anlegen einer Spannung (12 V, 50 min) aus dem Gel auf

eine Polyvinylidenfluoridmembran (Gultekin and Heermann, 1988) übertragen.

Weil die Membran jegliches Protein, damit auch die Antikörper, unspezifisch bindet,

ist es essentiell alle noch nicht besetzten Membranbindungsstellen durch eine

mindestens einstündige Inkubation in BSA (5% BSA in Waschpuffer) bei 37°C oder

bei 4°C über Nacht abzusättigen.

Alle weiteren Inkubationsschritte erfolgten bei Raumtemperatur. Zunächst wurde die

Membran dreimal mit Waschpuffer gewaschen, dann für 30 Minuten mit dem

Primärantikörper inkubiert. Anschließend wurde überschüssiger Antikörper, der

keine Bindung eingegangen war, durch erneutes dreimaliges Waschen entfernt.

Daraufhin erfolgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper, der gegen den Fc-Teil

des Primärantikörpers gerichtet und zur Detektion an Meerrettich-Peroxidase

gekoppelt war (Kricka, 1993). Nachdem die Membran erneut dreimal gewaschen

worden war, wurde sie in Visualisierungslösung inkubiert, um die

Chemilumineszenzreaktion zu starten. Die Lichtreaktion wurde mit Röntgenfilmen in

der Dunkelkammer detektiert.


- 16 -

2.8.2 Zweidimensionale Gelelektrophorese

Im Gegensatz zur eindimensionalen SDS-PAGE werden bei der 2D-

Gelelektrophorese die Proteine nicht nur nach ihrem Molekulargewicht, sondern auch

nach ihrem Ladungszustand aufgetrennt. Durch diese zweite Dimension der

Proteinauftrennung nach ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften ergibt sich

eine hervorragende Trennschärfe und ein hohes Separationsvermögen.

a) Probenaufbearbeitung und Rehydrierung

Mit dem Lysat transfizierter HEK 293T-Zellen wurde eine Koimmunpräzipitation

durchgeführt. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Beads mit 135 µl 2D-

Lysierpuffer gemischt und für mindestens 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Ab

diesem Zeitpunkt wurden alle weiteren Schritte wegen der geringen Löslichkeit des

Harnstoffs bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Inkubation wurde die Probe

bei 13.000 rpm und 25°C für 30 min zentrifugiert. Daraufhin wurde 130 µl Überstand

abgenommen und mit 2,5 µl 2D-Standard versetzt. Davon wurden 125 µl auf die 11

cm langen IPG-Streifen pH 3-10 (Biorad) aufgetragen und mit 1 ml Mineralöl

überschichtet. Die Streifen wurden nun 12 bis 15 Stunden bei einer angelegten

Spannung von 50 V rehydriert.

b) erste Dimension und Äquibrilierung

Im Rahmen dieser ersten Dimension wurden die Proteine in der Probe nach ihrem

isoelektrischen Punkt pH-abhängig aufgetrennt. Dazu wurden immobilisierte pH-

Gradienten (IPG)-Streifen verwendet. Diese IPG-Streifen werden durch

Kopolymerisation von Acrylamidmonomeren mit Acrylamidderivaten mit puffernden

Seitengruppen hergestellt, aus deren Mischungsverhältnis sich nach Henderson und

Hasselbalch ein regionaler pH ergibt (Bjellqvist et al., 1982). Nach der Rehydrierung

wurden zwischen den IPG-Streifen und den Elektroden der Fokussierkammer

Elektrodenpapiere (ElektrodeWicks, Biorad) eingelegt. Das Fokussierungsprogramm

wurde an der Spannungsquelle mit 200 V für eine Stunde, anschließend mit 500 V

für eine Stunde und schließlich mit 4000 V Höchstspannung für vier Stunden

programmiert. Dabei wurde der maximale Stromfluß von 50 µA pro Gel immer

gewahrt. Die Fokussierung wurde immer bis zum Erreichen von mindestens 13.000

Volt-Stunden durchgeführt. Nach der ersten Dimension wurden die IPG-Streifen

unter mäßigem Schütteln erst 20 min in der Äquibrilierlösung 1, anschließend

ebenfalls 20 min in der Äquibrilierlösung 2 inkubiert und schließlich kurz in 2D-

Laufpuffer gewaschen.


c) zweite Dimension:

- 17 -

Bei der zweiten Dimension handelt es sich um eine SDS-PAGE mit

Minigradientengelen von 9% bis 16,5%, die durch einen Gradientenformer der Firma

Biorad hergestellt wurden. Der IPG-Streifen wurde mit 0,5% Agarose über dem Gel

eingegossen. Daraufhin wurde an die Gele für eine Stunde ein Strom von 5 mA pro

Gel und für weitere zwei bis drei Stunden ein Strom von 25 mA pro Gel angelegt.

2.9 Proteinmarkierung mit 32 P und Phosphoaminosäurenanalyse

6-wells mit subkonfluenten HEK293T-Zellen wurden für 6 bis 8 Stunden mit

phosphatfreiem DMEM und 32 P (1-2 mCi/ml) inkubiert. Anschließend wurden die

Zellen geerntet und lysiert, FLAG-Nephrocystin wurde immunpräzipitiert, mit einer

10% SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran geblottet (siehe 2.4, 2.7,

2.8). Das mittels des Phosphoimagers (BAS2000, Fuji) identifizierte Membranstück

mit der NPHP1-Bande wurde ausgeschnitten und in 6 M HCl für 1 h bei 110°C

hydrolysiert. Nach einer Vakuumtrocknung wurde die Probe zusammen mit einem

nicht-radioaktiven Ninhydrin-gefärbten Phosphoaminosäurenstandard in einer

zweidimensionalen Elektrophorese aufgetrennt.

2.10 Zweidimensionale Identifizierung von Phosphorylierungsstellen

Ausgeschnittene PVDF-Membranstücke mit radioaktiven Proteinen (siehe 2.9)

wurden mit 0,5% Polyvinylpyrrolidin 40 in 0,6% Essigsäure für 30 min bei 37°C

geblockt. Nach ausgiebigem Waschen mit Wasser wurde membrangebundenes

Nephrocystin in situ mit Trypsin in 50mM NH4HCO3 für 12 h bei 37 °C gespalten. Die

freigesetzten Proteinfragmente wurden vakuumgetrocknet und mit Perameisensäure

für 1 h auf Eis oxidiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Ammoniak (final 20%

(v/v)) gestoppt. Anschließend wurden die Proben eingefroren und vakuumgetrocknet

und ein weiterer Trypsinverdau wurde für 12 h bei 37 °C durchgeführt. Nach einer

Vakuumtrocknung wurden die Proben in Elektrophoresepuffer resuspendiert

(Ameisensäure, Essigsäure, Wasser, 46:156,1790 (v/v/v)) und auf Zellulose-

Dünnschichtplatten in der ersten Dimension elektrophoretisch aufgetrennt (2000 V,

40 min in Elektrophoresepuffer). Im Anschluss daran erfolgte die


- 18 -

chromatographische Auftrennung in der zweiten Dimension für 15 h (Isobuttersäure,

1-Butanol, Pyridin, Essigsäure, Wasser, 1250:38:96:58:558 (v/v/v/v/v)). Die

phosphorylierten Peptide wurden mit Hilfe der PosphorImager-Analyse detektiert und

durch eine 15minütige Inkubation in 20%iger (v/v) Acetonnitrillösung in einem

Ultraschallwasserbad aus der Zellulosematrix herausgelöst. Die Proteine wurden

mittels Edman-Abbau sequenziert, wofür der Festphasensequenzierer ABI477

verwendet wurde. Proben aus 20 Sequenzierungszyklen wurden gesammelt,

getrocknet und auf ihren radioaktiven 32 P-Gehalt hin mittels PhosphorImager

untersucht.

2.11 Coomassie-Blau-Färbung

Diese Färbung ist eine Methode für den quantitativen Nachweis von Proteinen. Der

Farbstoff Coomassie Brilliant Blau bindet unspezifisch an Proteine. Aufgrund seiner

Affinität zu Proteinen färbt er Proteine stärker als die Gelmatrix, so dass durch

intensives Entfärben nur die Proteine im Gel als blaue Banden sichtbar bleiben.

Das Gel einer Polyacrylamidelektrophorese wurde für 15 Minuten in Fixierlösung und

für 30 min in Commassie-Lösung bei Raumtemperatur inkubiert. Das nun fast

homogen blaugefärbte Gel wurde durch Entfärbelösung entfärbt, bis nur noch blau

gefärbte Proteinbanden sichtbar waren und diese mit Hilfe einer Durchlichtaufnahme

(GS800, Biorad) dokumentiert.

2.12 DNA, Plasmide, Quickchange und rekombinante Proteine

Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide wurden mit Standardtechniken in die

Expressionsvektoren pcDNA3, pcDNA6 und pCdm8 kloniert. Kürzere Abschnitte von

vollständigen Genen zur Expression verschiedener Proteinfragmente (Trunkationen)

wurden durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und anschließende Subklonierung

gewonnen. Diese Fragmente wurden anschließend für die Bestimmung der

Bindungsmotive in interagierenden Proteinen verwendet. Alle Konstrukte wurden

durch Sequenzierung in 2 Richtungen verifiziert.

Die F.NPHP1 Tyrosin-zu-Phenylalanin-Punktmutationskonstrukte wurden durch

Quickchange Mutagenese mittels des Stratagene Quickchange Site Directed

Mutagenesis Kit hergestellt. Das Ausgangsplasmid wurde mit einer Proof-Reading-

Frame-Polymerase (Pfu) und zwei Oligonukleotiden ampilifiziert, die die gewünschte

Punktmutation und eine diagnostische Schnittstelle enthielten. Anschließend wurde

das in Bakterien hergestellte Ausgangsplasmid mit einem methylierungsabhängigen


- 19 -

Restriktionsverdau abgebaut und das übriggebliebene neusynthetisierte Konstrukt

mit der Punktmutation in Bakterien transformiert. Alle Konstrukte wurden mit dem E.

coli-Stamm MC1061 generiert, durch Sequenzierung verifiziert und mit dem Qiagen

Mega Prep Kit amplifiziert. Rekombinante Proteine wurden in 1L- Kulturen des E. coli

Stamms BL21 hergestellt, in den das gewünschte Plasmid transformiert worden war.


3. Ergebnisse

- 20 -

3.1 NPHP1 wird durch Pyk2 phosphoryliert

Die Interaktion zwischen Pyk2 und NPHP1 konnte bereits zu einem früheren

Zeitpunkt durch unsere Arbeitsgruppe demonstriert werden (Benzing et al., 2001).

Bisher war aber noch kein Protein bekannt, das, nach der Aktivierung von Pyk2

durch NPHP1, von Pyk2 phosphoryliert wird. Ein Ziel meiner Arbeit war es, nach

Zielproteinen für die Pyk2-Phosphorylierung zu suchen. Hierzu wurden HEK 293T

Zellen transient mit FLAG-getaggtem Nephrocystin und entweder Wildtyp Pyk2

(Pyk2 wt ), dem funktionell aktiven Protein, oder Kinase-inaktivem Pyk2 (Pyk2 kd ), einer

funktionell inaktiven Variante, die nicht in der Lage ist andere Proteine zu

phosphorylieren, transfiziert. Nachdem die Zellen für vier Stunden in serum-freiem

Medium inkubiert worden waren, wurden sie geerntet, lysiert, und eine

Immunpräzipitation schloss sich an. Nephrocystin wurde mit M2-Beads, an die ein

anti-FLAG Antikörper gekoppelt ist, präzipitiert und die angereicherten Proteine

wurden mit einem Western-Blot aufgetrennt. Der Blot wurde mit einem anti-

Phosphotyrosin Antikörper inkubiert, der spezifisch phosphoryliertes Tyrosin erkennt

(Abb. 3a). In der Gegenwart von Pyk2 sind vier deutliche Banden von

tyrosinphosphorylierten Proteinen zu erkennen. Eine der Banden stellt Pyk2 dar, das

von Nephrocystin präzipitiert wird und stark phosphoryliert ist. Eine andere Bande

konnte als NPHP1 identifiziert werden, das in der Gegenwart von Wildtyp Pyk2 stark

phosphoryliert ist. Die Tatsache, dass die Überexpression der Kinase-inaktiven Pyk2

Variante die Tyrosinphosphorylierung der präzipitierten Proteine unterbindet,

demonstriert deutlich, dass diese Phosphorylierung von der Pyk2 Aktivität abhängt.

Die Lysate zeigen gleiche Expressionslevel von F.NPHP1 und HA.Pyk2 wt bzw.

HA.Pyk2 kd . Damit konnten wir NPHP1 als Zielprotein der Tyrosinphoshorylierung von

Pyk2 identifizieren.

3.2 Analyse der phosphorylierten Aminosäuren von NPHP1

Um herauszufinden, ob NPHP1 auch an Serin- und Threonin-Seitenketten durch

Pyk2 phosphoryliert wird, führten wir eine Phosphoaminosäurenanalyse durch.

Hierzu wurden F.NPHP1 und Pyk2 wt bzw. Pyk2 kd exprimierende HEK 293T Zellen mit

32

P radioaktiv markiert. Anschließend wurde NPHP1 immunpräzipitiert,


- 21 -

elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und das entsprechende Membranstück

ausgeschnitten. Nephrocystin wurde vollständig hydrolysiert. Die Aminosäuren

wurden durch zweidimensionale Gelelektrophorese aufgetrennt, wobei zusammen

mit der Probe ein Ninhydrinstandard geladen wurde. Dieser wurde anschließend auf

den Film des PhosphorImagers übertragen (Kreise auf der Abbildung). Bei der

Koexpression von NPHP1 mit Pyk2 kd fällt eine hohe basale Phosphorylierung der

Serin-Seitenketten ins Auge (Abb. 3b). Wird hingegen NPHP1 zusammen mit der

Wildtyp-Variante Pyk2 wt koexprimiert, lässt sich eine deutliche Zunahme der

Phosphorylierung von Threonin- und Tyrosin-Seitenketten nachweisen. Aufgrund des

hohen basalen Phosphorylierungslevels der Serin-Seitenketten, lässt sich keine

Aussage über eine eventuelle Serinphosphorylierung ableiten.

Abb. 3: Pyk2 induziert Phosphorylierung von Nephrocystin. A, HEK 293T Zellen, transient mit

FLAG-getaggtem Nephrocystin (F.NPHP1) und HA-getaggtem Wildtyp Pyk2 (HA.Pyk2 wt ) bzw. einer

kinase-inaktiven Variante (HA.Pyk2 kd ) transfiziert, wurden für 4 h in serum-freiem Medium inkubiert,

lysiert und mit einem anti-FLAG Antikörper immunpräzipitiert. Die Präzipitate wurden mit einer SDS-

PAGE aufgetrennt und die Tyrosinphosphorylierung wurde durch einen anti-Phosphotyrosin

Antikörper nachgewiesen (pY99, oberer Teil). Die starke Tyrosinphosphorylierung des präzipitierten

Nephrocystin und des co-präzipitierenden Pyk2 war von der Pyk2 Aktivität abhängig. Die

Expressionslevel von HA.Pyk2 und F.NPHP1 in den Lysaten werden gezeigt (mittlerer und unterer

Teil). B, Phosphoaminosäurenanalyse von präzipitiertem Nephrocystin nach in vivo Markierung von

transient transfizierten HEK 293T Zellen mit 32 P. Phosphorylierte Aminosäuren wurden durch

Komigration eines Ninhydrin-gefärbten Standards identifiziert (angedeutet durch Kreise)


- 22 -

3.3 Analyse der Phophorylierungsstellen von NPHP1

Um die Positionen der phosphorylierten Aminosäuren im Protein in vivo zu

identifizieren, wurde die 32 P Markierung von HEK293T Zellen wiederholt. Die mit

F.NPHP1 und Pyk2 wt bzw. Pyk2 kd transfizierten Zellen wurden anschließend lysiert,

F.NPHP1 wurde immunpräzipitiert und die mit SDS-PAGE und Westernblot erhaltene

Bande in situ einem kompletten tryptischen Verdau unterzogen. Die Peptidfragmente

wurden in der ersten Dimension durch eine Elektrophorese und in der zweiten

Dimension durch eine aufsteigende Chromatographie aufgetrennt und durch

Autoradiographie visualisiert (Abb. 4a). Im Vergleich der Ansätzen mit Pyk2 kd und

Pyk2 wt fallen sechs Stellen mit Peptidfragmenten auf, die abhängig von der Pyk2

Aktivität phosphoryliert werden. Diese Stellen wurden aus der Zellulosematrix eluiert.

Mit einem Teil des Eluates wurde erneut eine Phosphoaminosäurenanalyse

durchgeführt, die ergab, dass in zwei Peptidfragmenten ausschließlich

Phosphotyrosine und keine Phosphoserine oder Phosphothreonine vorhanden waren

(N1 und N2; Abbildung nicht gezeigt). Der Rest des Eluates von N1 und N2 wurde für

eine Edman-Sequenzierung verwendet. Hierbei wird in jedem Zyklus die N-terminale

Aminosäure abgetrennt und das entstehende Aminiosäurenderivat an eine Membran

gebunden. Durch Autoradiographie kann anschließend bestimmt werden, in welchem

Zyklus eine radioaktive Aminosäure, in diesem Fall phosphoryliertes Tyrosin,

abgespalten wurde. Durch die Kombination dieser Daten mit den vorhergesagten

Fragmenten eines tryptischen Verdaus (www.expasy.org/tools/peptide-mass.html)

ließ sich die Aminosäuresequenz der Peptidfragmente bestimmen. Hierdurch

konnten die Tyrosine Y46 und Y349 von NPHP1 als Phosphorylierungsstellen der

Kinase Pyk2 identifiziert werden (Abb. 4b).

3.4 Mutation der Tyrosinphosphorylierungsstellen von NPHP1

Neben den beiden experimentell ermittelten Tyrosinphosphorylierungsstellen 46 und

349 wurde eine dritte Tyrosinphosphorylierungsstelle an Position 721 von

Nephrocystin durch die Programme Scansite und NetPhos vorhergesagt

(https://scansite.mit.edu, http://www.cbs.dtu.dk/services/Netphos). Um die Funktion

der einzelnen Phosphorylierungsstellen näher zu untersuchen, wurden in dem

NPHP1-Konstrukt Punktmutationen der drei identifizierten Tyrosine zu

Phenylalaninen erzeugt. Auf diese Weise entstanden die Konstrukte F.NPHP1 Y46F ,


- 23 -

Abb. 4: Identifizierung von Nephrocystin Phosphorylierungsstellen mit zweidimensionaler

Phosphopeptidanalyse. A, HEK 293T Zellen, transient transfiziert mit FLAG getaggtem Nephrocystin

(F.NPHP1) und Wildtyp Pyk2 (Pyk2 wt ) bzw. kinase-inaktiver Pyk2 (Pyk2 kd ), wurden mit 32 P markiert,

lysiert und einer Immunpräzipitation mit anti-FLAG Antikörper unterzogen. Die Präzipitate wurden

mittels SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine Nitrozellulosemembran transferiert, in situ mit Trypsin verdaut

und auf Dünnschichtchromatographieplatten mit Hochspannungselektrophorese und aufsteigender

Chromatographie aufgetrennt. + und – geben die Orientierung der Spannung während der

Elektrophorese an. Die aufgetrennten Phosphopeptide wurden mit einem PhosphoImager sichtbar

gemacht. Zwei Pyk2-abhängige Phosphopeptidfragmente konnten als ausschließlich Phosphotyrosin

enthaltende Proteine identifiziert werden (N1 und N2, markiert mit Kreisen). B, Mit dem Eluat der

Proteine N1 und N2 wurde eine Edman-Squenzierung durchgeführt, die die Position der

phosphorylierten Tyrosin-Seitenketten im Peptid identifizierte. Die tryptischen Peptidfragmente wurden

mit Hilfe des PEPTIDEMASS Programms vorausgesagt. Dieser Ansatz erlaubte die Identifikation der

phosphorylierten Tyrosine an Position 46 und 349 in Nephrocystin.

F.NPHP1 Y349F und F.NPHP1 Y721F . Zusammen mit Wildtyp F.NPHP1 wt wurden diese

Konstrukte in HEK293T Zellen transient mit leerem Kontrolvektor, HA-getaggter Pyk2

oder Src Y527F , einer konstitutiv aktiven Mutante von c-Src, koexprimiert. Die Zellen

wurden anschließend lysiert und die FLAG-getaggten NPHP1-Konstrukte wurden mit

einem anti-FLAG Antikörper präzipitiert. Nach der Auftrennung mit einer SDS-PAGE

wurde der Western Blot mit einem anti-Phosphotyrosin Antikörper inkubiert. Während

sich bei der Kotransfektion der NPHP1-Konstrukte mit einem leeren Kontrolvektor

erwartungsgemäß keine Banden nachweisen ließen, zeigten alle NPHP1-Varianten,


- 24 -

sowohl der Wildtyp als auch die drei einzelnen Tyrosin-zu-Phenylalanin-Mutationen,

bei der Koexpression mit Pyk2 das gleiche Bandenmuster mit vier deutlichen Banden

wie in Abbildung 3a (Abb. 5a). In allen Versuchsansätzen waren die Banden von

phosphoryliertem NPHP1 (und Pyk2) deutlich zu identifizieren. Dies zeigt, dass die

Mutation einer Einzelnen der drei Tyrosinphosphorylierungsstellen nicht ausreichend

ist, um die Phosphorylierung von NPHP1 durch Pyk2 zu unterbinden.

c-Src, eine Kinase die bei Pyk2 Aktivierung mit Pyk2 assoziiert und selbst aktiviert

wird (Blaukat et al., 1999), ist bei Kotransfektion seiner konstitutiv-aktiven Variante

Src Y527F in der Lage Wildtyp NPHP1 zu phosphorylieren (Abb. 5a). Während diese

Phosphorylierung von den Mutationen F.NPHP1 Y46F und F.NPHP1 Y349F nicht

beeinträchtigt wird, hebt die Mutation F.NPHP1 Y721F die Phosphorylierung von

NPHP1 vollständig auf. Dies lässt darauf schließen, dass NPHP1 an der Aminosäure

Tyrosin Y721 von Src phosphoryliert wird.

Nachdem die drei Einzelmutationen der fraglichen Phosphorylierungsstellen keinen

Effekt bezüglich der Phosphorylierung von F.NPHP1 gezeigt hatten, clonierten wir

ein Kontstrukt, bei dem jedes der drei Tyrosine Y46, Y349 und Y721 zu Phenylalanin

mutiert ist. Dies geschah durch konsekutives Einfügen von Punktmutationen durch

eine Quickchangemutagenese. Das entstandene Konstrukt F.NPHP1 Y46,349,721F

wurde ebenso wie das Wildtyp Konstrukt F.NPHP1 wt zusammen mit Pyk2 wt oder

Pyk2 kd in HEK 293T Zellen transfiziert und durch anti-FLAG Antikörper präzipitiert. In

beiden Versuchsansätzen mit Pyk2 kd , der kinase-inaktiven Pyk2 Variante, waren

keine phosphorylierten Banden sichtbar (Abb. 5b). Während die Kotransfektion der

Wildtyp-Konstrukte Pyk2 wt und F.NPHP1 wt das typische Muster von vier

phosphorylierten Banden ergab (siehe auch Abb. 3a und 5a), war bei der

Kotransfektion von Pyk2 wt mit der Tripelmutante F.NPHP1 Y46,349,721F die unterste

phosphorylierte Bande nicht mehr nachweisbar. Diese Bande repräsentiert

phosphoryliertes Nephrocystin. Wir folgern daher aus diesem Experiment, dass die

Tyrosinphosphorylierung von NPHP1 durch Pyk2 an den Tyrosinen Y46, , Y349 und

Y721 stattfindet. Die Mutation aller drei Tyrosine, nicht jedoch eines Einzelnen, hebt

diese Phosphorylierung auf.


- 25 -

Abb. 5: Mutation der Tyrosin 46, 349 und 721 unterbindet die Pyk2-abhängige

Phosphorylierung von Nephrocystin. A, Die Tyrosine 46, 349 und 721 in Nephrocystin wurden zu

Phenylalanin mutiert und FLAG-getaggte Versionen dieser Einzelmutanten wurden mit leerem Vektor

(Spuren 1, 4, 7, 10), HA-getaggter Pyk2 (Spuren 2, 5, 8, 11) oder Src Y527F , einer konstitutiv aktiven

Variante von c-Src, (Spuren 3, 6, 9, 12) kotransfiziert. Nephrocystin wurde mit einem anti-FLAG

Antikörper präzipitiert und auf Tyrosinphosphorylierung untersucht (anti-pY99, oberer Teil). Durch

Anfärben auf Pyk2, Nephrocystin und Src in den Lysaten wurde eine gleichmäßige Beladung und

vergleichbare Proteinexpression nachgewiesen (untere Teile). B, Die kombinierte Mutation der

vorausgesagten Phosphorylierungsstellen unterbindet die Tyrosinphosphorylierung von Nephrocystin.

HEK293T Zellen wurden mit Wildtyp Nephrocystin (F.NPHP1) oder einer Tripel-Tyrosin-zu-

Phenylalanin-Mutante (F.NPHP1 Y46,349,721F ) zusammen mit Wildtyp Pyk2 (Pyk2 wt ) oder einer kinaseinaktiven

Variante (Pyk2 kd ) kotransfiziert. Nephrocystin wurde mittels anti-FLAG Antikörpern

präzipitiert und die Tyrosinphosphorylierung wurde mit dem phosphotyrosin-spezifischen Antikörper

pY99 kontrolliert (oberer Teil). Das Vorhandensein gleichwertiger Proteinmengen von Nephrocystin in

den Präzipitaten (mittlerer Teil) und in den Lysaten (unterer Teil) wird demonstriert.


- 26 -

3.5 Präzisierung der Interaktion von NPHP1 und Tensin

Wir hatten bereits früher die Interaktion von NPHP1 mit Tensin nachweisen können

(Benzing et al., 2001). Bisher war aber noch unklar, ob es sich um eine direkte oder

eine indirekte Proteininteraktion handelt und über welche Proteindomänen diese

Interaktion vermittelt wird. Bei der Analyse der Domänenstruktur von Tensin fallen

zwei potentielle Proteininteraktionsdomänen auf, eine Src-Homologie-2-Domäne

(SH2, Aminosäure 1461-1563) und eine Phosphotyrosin-Bindungs-Domäne (PTB,

Aminosäure 1594-1735) (Abb. 6a). Um die Lokalisation der Interaktion innerhalb des

Tensinmoleküls näher zu untersuchen, generierten wir GST.getaggte Trunkationen

von Tensin, die das gesamte Protein abdecken (1-650, 622-1081, 1050-1590, 1576-

1736). In dem anschließend durchgeführten in vitro-Interaktionsexperiment konnten

wir zeigen, dass nur die Trunkation GST.Tensin 1050-1590 in der Lage ist F.NPHP1 zu

binden (Abb. 6b). Die ursprünglich eingesetzte Menge an NPHP1 ist in der Spur links

außen abgebildet. Dies belegt zum einen, dass die Interaktion zwischen NPHP1 und

Tensin eine direkte Proteininteraktion ist. Zum zweiten wird damit die an der

Interaktion beteiligte Region in Tensin auf die Aminosäuren 1050 bis 1590 eingeengt.

Nachdem die SH2-Domäne von Tensin die einzige bekannte Proteininteraktionsdomäne

in dieser Region ist, erzeugten wir eine weitere GST-getaggte Tensin-

Trunkation (GST.Tensin SH2), die lediglich die SH2-Domäne enthielt. Mit dieser

Trunkation führten wir ein Pulldown-Experiment durch, um herauszufinden, ob diese

Domäne in der Lage ist endogenes NPHP1 zu binden. Hierzu wurden HEK293T

Zellen gerntet und mit an Gluthation Sepharose Beads gebundenem GST.hTensin

SH2 inkubiert. Die Abbildung (Abb. 6c) zeigt, dass die SH2 Domäne von Tensin

alleine ausreichend ist, um endogenes NPHP1 zu zurückzuhalten. Zwar war jetzt die

Region der Interaktion bekannt, aber die eventuelle Regulation dieser Interaktion lag

noch völlig im Dunkeln. Um diese Fragestellung zu adressieren, führten wir ein

weiteres Pulldown-Experiment durch. HEK 293T Zellen wurden mit F.RGS,

F.NPHP1 wt oder F.NPHP1 Y46,349,721F transfiziert, geerntet und lysiert. Die Lysate

wurde mit an Amylose Beads gebundenem MBP.Tensin 1428-1580 , das ebenfalls

lediglich die SH2-Domäne enthält, inkubiert. Überraschenderweise wurde nur das

Wildtyp-Konstrukt von der Tensin SH2-Domäne gebunden (Abb. 6d). Die Mutation

der drei Pyk2 Phosphorylierungsstellen in NPHP1 hebt diese Interaktion auf. Dies ist

ein starkes Indiz dafür, dass diese Interaktion durch Phosphorylierung reguliert

werden kann. Gleichzeitig unterstreicht dieses Experiment die physiologische


- 27 -

Bedeutung der drei phosphorylierten Tyrosinseitenketten, die durch unsere Versuche

identifiziert werden konnten.

Abb. 6: Die SH2-Domäne von Tensin interagiert phosphorylierungsabhängig mit NPHP1. A,

Domänenstruktur von Tensin. Tensin enthält im C-Terminus eine Src-Homologie-2-Domäne (SH2)

und eine Phosphotyrosin-Bindungs-Domäne (PTB). B, In vitro-Interaktion mit verschiedenen GSTgetaggten

Tensin-Trunkationen. Nur die Tensin-Trunkation GST.hTensin 1050-1590 ist in der Lage

F.NPHP1 zu präzipitieren. Die eingesetzte Menge F.NPHP1 ist in der Spur links außen zu sehen. C,

Pulldown-Experiment mit der SH2-Domäne von Tensin (GST.hTensin SH2). Diese ist in der Lage

endogenes NPHP1 zu präzipitieren, interagiert jedoch nicht mit dem Kontrollprotein GFP. Expression

von GST.hTensin SH2 im Coomassie gezeigt (unterer Teil). D, Pulldown-Experiment mit der SH2-

Domäne von Tensin (MBP.Tensin 1428-1580 ). Die Interaktion mit NPHP1 erfolgt

phosphorylierungsabhängig, die SH2-Domäne bindet F.NPHP1 wt , jedoch nicht die Tripelmutante

F.NPHP1 Y46,349,721F , deren Tyrosine nicht phosphoryliert werden können. Expressionslevel aller

beteiligten Proteine im unteren Teil abgebildet.


4. Diskussion

- 28 -

Diese Arbeit identifiziert NPHP1 als neues Zielprotein der Pyk2 Tyrosinkinase-

Aktivität. Jedoch geht aus unseren Daten nicht hervor, ob NPHP1 direkt von Pyk2

oder durch eine von Pyk2 abhängige Kinase phosphoryliert wird. Interessanterweise

ist die aufgereinigte, rekombinant hergestellte Pyk2-Kinase in der Lage Nephrocystin

in vitro zu phosphorylieren (Daten nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass

wenigstens einer der Phosphorylierungsschritte direkt durch die Kinaseaktivität von

Pyk2 erfolgt. Die Funktion, die Nephrocystin in vivo ausübt, ist nach wie vor unklar.

Gegenwärtig wird angenommen, dass Nephrocystin Teil eines sensorischen

Übertragungsweges ist, der extrazelluläre Signale wie mechanischen Stress und

osmotische oder chemische Reize in das Innere der Zelle weiterleitet (Watnick et al.,

2003; Igarashi et al., 2002). Diese Hypothese wird durch eine kürzlich erschienene

Studie unterstützt, die belegt, dass die C. elegans-Homologe von NPHP1 und

NPHP4 in zilientragenden, sensorischen Neuronen exprimiert sind. Nur das

Ausschalten beider Proteine, nicht jedoch eines einzelnen, führt in mutierten

Männchen zu einer abgeschwächten Antwort auf Paarungsreize (Jauregui et al.,

2005). Dies spricht dafür, dass Nephrocystin und Nephrocystin-4 eine wichtige und

teilweise redundante Aufgabe bei der Übertragung sensorischer Signale aus dem

Zilium in das Zellinnere spielen. Der molekulare Mechanismus dieser

Signalübertragung liegt jedoch noch im Dunkeln. Wir zeigen hier, dass die

Tyrosinkinase Pyk2 die Phosphorylierung von Nephrocystin an drei

Tyrosinseitenketten induziert und damit die Proteininteraktionen reguliert.

Interessanterweise wurde Pyk2 als Calcium-abhängige Tyrosinkinase entdeckt (Lev

et al., 1995). Die Calcium-abhängige Signaltransduktion in Nierenzellen als Antwort

auf mechanische Reize wie Flüssigkeitsströmung wurde kürzlich dem Rezeptor-

Ionenkanal TRPP2/Polycystin-2, der in den Monozilien der Niere lokalisiert ist,

zugeschrieben (Nauli et al., 2003). Daher ist es vorstellbar, dass die Aktivierung der

ziliären Signaltransduktion (z.B. als Resultat einer Flüssigkeitsströmung) einen

vorübergehenden Anstieg des intrazellulären Calciums bewirkt, der an die Calciumabhängige

Tyrosinkinase Pyk2 weitergeleitet wird, die die Proteininteraktionen von

Nephrocystin reguliert. Daher wäre es sehr interessant zu untersuchen, ob die

subzelluläre Lokalisation von Nephrocystin in TRPP2/Polycystin-2 Knockout Zellen

verändert ist.


- 29 -

Das Protein Tensin rückte ins Blickfeld der Nephronophtise Forschung, als eine

Tensin Knockout Maus einen Phänotyp entwickelte, der dem der menschlichen

Nephronophthise sehr ähnlich war (Lo et al., 1997). Um die Hypothese zu testen,

dass Nephrocystin und Tensin eine Funktion im selben Signalübertragungsweg

erfüllen, führte unsere Arbeitsgruppe eine Immunpräzipitation durch und konnte eine

Interaktion von NPHP1 mit Tensin nachweisen (Benzing et al., 2001). Bisher waren

jedoch eventuelle die Interaktion vermittelnde Proteine, die interagierenden

Domänen und die Regulation der Interaktion unbekannt. Wir konnten nun zeigen,

dass es sich um eine direkte Interaktion handelt und diese phosphorylierungs-

abhängig ist. Vorstellbar ist zum Beispiel, dass Tensin im Übertragungsweg eine

Funktion unterhalb von Nephrocystin erfüllt. Wenn NPHP1 von Pyk2, z.B. als

Reaktion auf eine Beugung des Ziliums, phosphoryliert wird, könnte dieses mit

Tensin assoziieren. Von Tensin ist bekannt, dass es mit fokalen Adhäsionen und

dem Zytoskelett der Zelle assoziiert. Somit könnten über NPHP1 und Tensin

extrazelluläre Signale mit Zellmotilität und Zellpolarität verknüpft werden. Diese

Hypothese wird durch Versuche zur Zellmotilität mit Tensintrunkationen unterstützt

(Chen et al., 2003). Es konnte gezeigt werden, dass Tensin nur dann in der Lage ist,

die Zellmigration zu fördern, wenn beide Bindungsstellen für die fokalen Adhäsionen

und die SH2-Domäne intakt sind. Zusammenfassend verbinden unsere

Untersuchungen also zum ersten Mal die Rolle der NPHP1-induzierten Aktivierung

von Pyk2 mit einem dynamischen Zusammenbau des Nephrocystin-

Proteinkomplexes, der auch Tensin beinhaltet.


5. Zusammenfassung

- 30 -

Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren Untersuchungen zur molekularen

Pathogenese der Nephronophthise, der häufigsten angeborenen zystischen

Nierenerkrankung bei Kindern. Die Nephronophthise ist eine autosomal-rezessive

Erkrankung und für etwa 10% der Kinder mit dialysepflichtiger Niereninsuffizienz

verantwortlich. Wir konnten in dieser Arbeit Nephrocystin als Zielprotein der Pyk2-

Tyrosinkinase identifizieren. Nephrocystin wird durch das NPHP1-Gen kodiert, das

bei der familiären juvenilen Nephronophtise (FJN, NPH1) mutiert ist. Nephrocystin ist

ein Mulitadaptorprotein, welches ins Monozilium von Nierenepithelien lokalisiert.

Durch Analyse der Tyrosinphosphorylierungsstellen konnten wir die Tyrosine an den

Positionen 46, 349 und 721 als Pyk2-Phosphorylierungsstellen identifizieren. Durch

die Mutation eines Einzelnen der drei Tyrosine wurde die Phosphorylierung von

NPHP1 nicht beeinträchtigt. Die Phosphorylierung von Nephrocystin wurde jedoch

vollkommen aufgehoben, wenn alle drei Tyrosine zu Phenylalanin mutiert wurden.

Wir können mit dieser Arbeit zeigen, dass die Proteine Nephrocystin und Tensin

direkt miteinander interagieren und die Interaktion über die SH2-Domäne von Tensin

vermittelt wird. Gleichzeitig identifizierten wir Tensin als Protein dessen Interaktion

mit Nephrocystin durch Phosphorylierung reguliert wird.


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7. Anhang

7.1 Abkürzungen

- 38 -

• aa - amino acid

• Abb. - Abbildung

• ADPKD - autosomal dominant polycystic kidney disease

• Aminosäuren - X- beliebige Aminosäure, F- Phenylalanin, L- Leucin,

P- Prolin, S- Serin, Y- Tyrosin

• APS - Ammoniumperoxidsulfat

• BSA - Bovines Serum Albumin

• C. elegans - Caenorhabditis elegans

• C-Terminus - Carboxy-Terminus; Proteinende mit COOH-Gruppe

• CADTK - calcium dependent tyrosine kinase

• CAK-β - cell adhesion kinase beta

• cDNA - cloned DNA

• Cpk - congenital polycystic kidney

• Cten - COOH-terminal tensin-like molecule

• DMEM - Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium

• DNA - deoxyribonucleic acid

• DTT - Dithiothreitol

• E7.5/E10.5 - Tag 7,5 bzw. 10,5 der Embryonalentwicklung

• E. coli - Eschericha coli

• EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure

• ERK - extracellular signal related kinase

• F. - FLAG epitope tag

• Fc - Antikörperteil, crystallizable fragment

• FA - fokale Adhäsion

• FAK - focal adhesion kinase

• FAK2 - focal adhesion kinase 2 (=Pyk2)

• FHA - forkhead assosciated domain

• FJN - familiäre juvenile Nephronophthisis

• FLAG - Proteinmarkierungssequenz (DYKDDDDK)

• h - human

• HA. - Hämagglutinin (Proteinmarkierungssequenz)

• HBSS - Hank`s balanced salt solution

• HEBS - 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonat

• HEK - human embryonic kidney

• GFP - green fluorescent protein

• GST. - Glutathion-S-Transferase (Proteinmarkierungssequenz)

• IP - Immunpräzipitation

• IPG - immobilisierter pH-Gradient

• JNK - c-Jun N-terminal kinase

• kd - kinase dead

• kDa - Kilodalton

• M2 - kommerzieller Antikörper, gerichtet gegen die FLAG-

Sequenz


- 39 -

• MAP - mitogene activated protein kinase

• MBP. - Maltose bindendes Protein (Proteinmarkierungssquenz)

• MCKD - medullary cystic kidney disease

• mRNA - messenger ribonucleic acid

• N-Terminus - Amino-Terminus; Proteinende mit NH2-Gruppe

• NHD - Nephrocystin-Homologie-Domäne

• NPH - Nephronophthise

• NPH1 - juvenile Nephronophthise

• NPH2 - infantile Nephronophthise

• NPH3 - adulte Nephronophthise

• NPH4 - adulte Nephronophthise

• NPHP1 - Nephrocystin

• NPHP2 - Inversin

• NPHP3 - Nephrocystin-3

• NPHP4 - Nephroretinin oder Nephrocystin-4

• NPHP5 - Nephrocystin-5

• Orpk - Oak Ridge polycystic kidney

• p130 Cas - Crk-associated substrate

• PAGE - Polyacrylamid-Gelelektrophorese

• PBS - phosphate buffered saline

• PTB - phosphotyrosine-binding

• PVDF - Polyvinylidenfluorid

• Pyk2 - Prolin-reiche Tyrosinkinase 2

• RAFTK - related adhesion focal tyrosine kinase

• SDS - sodium dodecyl sulfate

• SH2 - src homology domain 2

• SH3 - src homology domain 3

• Src - Tyrosinkinase; zuerst entdeckt im Rous sarcoma virus

• TEMED - N,N,N,N-Tetramethylethylendiamid

• TRP - Tetratrico Repeat-Protein

• v/v - Volumen / Volumen

• wt - Wildtyp


7.2 Danksagung

- 40 -

Diese Arbeit wurde nur durch die Mithilfe vieler Menschen ermöglicht, denen ich an

dieser Stelle danken möchte.

Zuallererst meinem Doktorvater Prof. Dr. Thomas Benzing, der es mir ermöglichte

diese Arbeit in seinem Labor anzufertigen, mich konsequent trotz aller Rückschläge

motivierte und mir ständig mit Rat und Lösungsvorschlägen zu Seite stand.

Außerdem ermöglichte er mir einen 6monatigen Aufenthalt am Karolinska Institut in

Stockholm, Schweden, der ein weiterer großartiger Teil meiner wissenschaftlichen

Ausbildung war.

Herrn Dr. Bernhard Schermer danke ich für die umfangreiche Einführung in das

Labor, die ständige Erreichbarkeit, die sehr gute Betreuung und die Fortbildungen

während meiner Zeit im Labor. Ohne ihn hätten die Experimente dieser Arbeit

deutlich mehr Zeit in Anspruch genommen.

Die angenehme Arbeitsatmosphäre im Labor war zu einem großen Teil den MTAs zu

verdanken. Deswegen möchte ich Christina Engel, Stefanie Keller, Charlotte Meyer

und Birgit Rimli für ihre Geduld, ihre technische Expertise und ihren Humor,

besonders bezüglich unseres Musikgeschmacks, danken.

Einen schnellen Start im Labor verdanke ich meinen Vordoktoranden, Julia Beyerle,

Markus Gödel und Stefan Zschiedrich, die mir etliche Fehler ersparten. Meinen

Mitdoktoranden Roman Müller und Daniel Petraschka danke ich für das gemeinsame

Durchleben einer arbeits- und frustationsreichen Zeit, die nichtsdestotrotz viel Spaß

gemacht und etlichen Nebel hervorgebracht hat.

Schließlich wäre diese Arbeit nicht ohne die Unterstützung meiner Famile,

insbesondere meiner Freundin, möglich gewesen, die während der experimentellen

Phase deutlich häufiger auf mich verzichten mussten.


7.3 Lebenslauf

- 41 -

• Name : Matthias Hackl

• Geburtsdatum : 15. April 1980

• Geburtsort : Friedberg (Bayern)

• Eltern : Vater : Hans Hackl

Mutter : Anneliese Hackl

• Geschwister : eine ältere Schwester

• Schulbildung : 1986 - 1990 Grundschule in Wehringen

1990 - 1999 Leonhard - Wagner – Gymnasium

in Schwabmünchen

• Schulabschluss : 1999 Abitur

• Grundwehrdienst : Juli 1999 bis April 2000 als Sanitäter in Horb

und Dillingen/Donau

• Studium : Humanmedizin seit dem WS 2000/2001 an der

Albert-Ludwig-Universität Freiburg

Physikum August 2002

1. Staatsexamen August 2003

2. Staatsexamen März 2006

• Famulaturen : Herz- und Gefäßchirurgie, Universitätsklinikum

Freiburg Februar / März 2003

Gynäkologie und Geburtshilfe, Klinikum Landsberg

September 2003

Radiologie, Gemeinschaftspraxis Radiologie München

Februar – April 2005

Anästhesie und Intensivmedizin, Herzklinik der

Universität München am Augustinum, Oktober 2005

• Doktorarbeit : „Untersuchungen zur Molekularen Pathogenese der

Nephronophthise: Bedeutung der Tyrosinphosphorylierung


- 42 -

von Nephrocystin“ seit 02/2004 in der AG Benzing,

Nephrologie, Universitätsklinikum Freiburg

• Forschungsaufenthalt :

„Funktion der Neph-Proteine im Zebrafisch“, Gruppe

Arindam Majumdar, Karolinska Institut Stockholm,

Schweden, April bis September 2005

• Stipendien : Stipendium e-fellows.net seit November 2001

Stipendiat der Bayer-Studien-Stiftung seit April 2003

Stipendium der Boehringer Ingelheim Stiftung, Aufenthalt

Karolinska Institut, Schweden, April bis September 2005

• Sonstige Qualifikationen :

Abschluss der Ausbildung zum Rettungssanitäter im Juli

2000

• Freizeitengagement :

Mitarbeit in der offenen Fachschaft Medizin seit 2000

Finanzwart des oFa Medizin Freiburg e.V. 2002-2004

Engagement im Rettungsdienst und in der

Schnelleinsatzgruppe des Roten Kreuzes Freiburg

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