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Identifikation und funktionale Charakterisierung von

Duftrezeptorproteinen in Säugetierkeimzellen

Identification and functional characterization of

odorant receptors in mammalian germ cells

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Annika Triller

aus

Dortmund

angefertigt am Lehrstuhl für Zellphysiologie,

Prof. Dr. Dr. Dr. Hanns Hatt

Bochum, Juli 2009


Referent: Prof. Dr. Dr. Dr. Hanns Hatt

Koreferent: Prof. Dr. Andreas Faissner


Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1 Die chemischen Sinne 1

1.2 Olfaktorische Rezeptoren 3

1.3 Die cAMP vermittelte Signaltransduktionskaskade 6

1.4 Ektopische Expression 8

1.5 Kalzium als zellulärer Messenger 9

1.6 Spermatogonien und ihre Differenzierung zu reifen Spermien 10

1.7 Spermien Morphologie 12

1.8 Exkurs: Der weibliche Zyklus 14

1.9 Ionenkanäle 15

1.9.1 Spannungsabhängige Kalium-Kanäle 16

1.9.2 Spannungsabhängige Ca 2+ -Kanäle 18

1.10 Exkurs: TRP-Kanäle 20

1.10.1 Die unterschiedlichen Subtypen 20

1.11 Nukleotidrezeptoren - P2 Rezeptoren 22

1.12 Ziel dieser Arbeit 23

2. Material 25

2.1 Chemikalien und Enzyme 25

2.1.1 Inhibitoren und Farbstoffe 26

2.1.2 Antikörper 26

2.2 Verbrauchsmaterialien und Kits 27

2.2.1 Geräte 27

2.2.2 Software 28

2.3 Zellen und Gewebe 28

2.4 Lösungen und Medien 29

2.5 Bakterienstämme 36

2.6 Oligonukleotide 36

2.7 Plasmide 37

I


2.8 Verwendete Duftstoffe 38

2.8.1 Antagonisten 41

2.8.2 Duftstoffe aus Vaginal,-und Follikelflüssigkeit 41

3. Methoden 42

3.1 Kultivierung der HEK293-Zelllinie 42

3.1.1 Auftauen von HEK293 Zellen 43

3.1.2 Transiente Transfektion 43

3.2 Sertoli-Spermatogonien Kokultur 44

3.3 Transformation von Bakterien 45

3.3.1 Anzucht von Bakterien 45

3.3.2 Plasmidaufreinigung im präparativen Maßstab („Maxiprep“) 45

3.4 Isolierung und Aufarbeitung von Gesamt-RNA 46

3.4.1 Isolierung von RNA 47

3.4.2 Dnase Verdau 48

3.5 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 48

3.6 Agarosegelelektrophorese 50

3.7 Immunzytochemie 50

3.8 Percoll®-Dichtegradientenzentrifugation 52

3.9 Der Fluoreszenzfarbstoff fura-2 53

3.9.1 Fluoreszenzemmission von fura-2 54

3.9.2 Beladung von HEK293-Zellen mit fura-2/AM 55

3.9.3 Spermienaufbereitung für Ca 2+ -Imaging-Experimente 55

3.9.4 Das Ca 2+ -Imaging-System 56

3.10 Konfokale Mikroskopie 57

3.11 Die Patch Clamp Technik 58

3.11.1 Patch Clamp Konfiguration 58

3.11.2 Herstellung der Pipetten 59

3.11.3 Badelektrode und Patchelektrode 60

3.11.4 Patch Clamp Protokolle 61

3.11.5 Liquid-Junction Potential 62

3.11.6 Analyseparameter 63

4. Ergebnisse 64

4.1 Das rezeptive Feld von OR1D2 64

4.1.1 Messung der Silizium Analoga Bourgeonal und Lilial 66

4.1.2 Screening natürlicher Duftstoffe 68

4.1.2.1 Identifizierung der einzelnen Liganden 74

II


4.2 Elektrophysiologische Charakterisierung von Spermatogonien

der Maus 79

4.2.1 Passive Membraneigenschaften von Spermatogonien 82

4.2.2 Untersuchung von spannungsabhängigen Kaliumkanälen 82

4.2.3 Messung von Kalium Einzelkanälen 87

4.2.4 Untersuchung von spannungsabhängigen Ca 2+ -Kanälen 88

4.2.5 Messung von Ca 2+ -Einzelkanälen 96

4.2.6 Der Effekt von 2-APB und Capsazepine auf Spermatogonien 97

4.3 ATP Rezeptoren in Spermatogonien 99

4.3.1 ATP-induzierte Ströme in Spermatogonien 99

4.3.2 Pharmakologisches Profil der ATP-induzierten Antworten 102

4.3.3 Experimente mit verschiedenen Extrazellulärlösungen 103

4.3.4 Expression von P2X Rezeptoren in Spermatogonien 105

5. Diskussion 107

5.1 Das rezeptive Feld von OR1D2 107

5.1.2 Messung von Silizium-Analoga der OR1D2-Agonisten

Bourgeonal und Lilial 109

5.2 Screening natürlicher Duftstoffe 110

5.3 Elektrophysiologische Charakterisierung von Spermatogonien

der Maus 111

5.3.1 Untersuchung von spannungsabhängigen Kaliumkanälen 112

5.3.2 Untersuchung von spannungsabhängigen Ca 2+ -Kanälen 112

5.4 Der Effekt von 2-APB und Capsazepine auf Spermatogonien 117

5.5 ATP Rezeptoren in Spermatogonien 118

5.6 Ausblick 120

6. Zusammenfassung 122

6.1 Summary 123

7. Abkürzungen 125

8. Literaturverzeichnis 130

9. Danksagung 155

10. Anhang 156

10.1 Lebenslauf 156

10.2 Publikationen 158

11. Erklärung 160

III


1. Einleitung

1.1 Die chemischen Sinne

Einleitung

Die chemischen Sinne sind verantwortlich für die Aufnahme von molekularen Signalen aus

der Umwelt und damit essentiell für das Überleben eines Organismus. Das chemosensorische

System lässt sich in zwei Subsysteme unterteilen, den Geschmacks- und den Geruchssinn

(gustatorisches bzw. olfaktorisches System), wobei sich beide Systeme vor allem durch die

Heterogenität der Stimuli von anderen sensorischen Modalitäten unterscheiden (Sehen,

Hören, Fühlen). Der Geschmacks- und der Geruchssinn lassen sich anatomisch und

funktionell differenzieren, wobei hier nur der Geruchssinn ausführlich beschrieben wird. Der

Geruchssinn zählt phylogenetisch zu den ältesten Sinnen, schon niedere Invertebraten (bsp.

Fadenwurm C. elegans) detektierten chemische, aber keine visuellen Reize. Allgemein dient

die Geruchswahrnehmung Tieren u. a. zur Nahrungslokalisation und sozialen

Kommunikation. Die Duftmoleküle werden entweder als flüchtige Moleküle aus der Luft oder

in wässriger Lösung aufgenommen.

Auch beim Menschen spielt der Geruchssinn eine bedeutende Rolle, wobei dieser kein

primärer Sinn, d.h. nicht lebensnotwendig ist. Der Mensch besitzt ca. 1000 Gene, die für

olfaktorische Rezeptoren kodieren. Allerdings sind davon nur ca. 350 Gene funktionell, bei

den übrigen Rezeptorgenen handelt es sich um Pseudogene. Trotzdem ist der Mensch in der

Lage mehrere tausend Düfte zu unterscheiden (Hatt, 2004). Zahlreiche Riechrezeptoren sind

in der Lage, ein Spektrum von Duftstoffen zu erkennen, allerdings kann auch ein einzelner

Duftstoff ein Spektrum von Rezeptoren aktivieren (Malnic et al., 1999, Hatt, 2004). Diese

kombinatorische Duftkodierung führt im Riechhirn zu spezifischen „räumlichen“

Aktivitätsmustern.

Die Geruchswahrnehmung beginnt, wenn flüchtige Duftmoleküle in der Atemluft an die

chemosensorischen Rezeptoren im Riechepithel (MOE = main olfactory epithelium/Regio

olfactoria) der Nase gelangen. Das MOE (Abb. 1.1A) befindet sich oberhalb der Conchen

(Nasenmuscheln) und besteht aus vier verschiedenen Zelltypen, den Riechzellen, den

Stützzellen, den Drüsenzellen und den Basalzellen (Abb. 1.1B links). Der Mensch besitzt ca.

30 Millionen Riechzellen, die sich nach ungefähr 4-6 Wochen durch das ausdifferenzieren

von Basalzellen erneuern (Hatt, 2004). Bei den Riechzellen handelt es sich um primäre

bipolare Sinneszellen, die an ihrem apikalen, dendritischen Ende feine Sinneshärchen (Zilien)

tragen, die in den Glykoprotein-reichen Riechschleim (Mucus) hineinragen (Farbman, 2000),

1


Einleitung

der die Duftmoleküle löst. In der Membran der Zilien befinden sich die Geruchsrezeptoren.

Durch die Anlagerung des Duftmoleküls an den Rezeptor wird eine biochemische

Signaltransduktionskaskade (s. Abschnitt 1.3) in Gang gesetzt. Dadurch entsteht ein

Aktionspotenzial am Axonhügel der Riechzelle, das entlang des Axons in den Bulbus

olfactorius (MOB, s. Abb. 1.1A) fortgeleitet wird (erste zentrale „Station“ der

Informationsverarbeitung). Die zellulären Elemente des MOB sind in radialen Schichten

angeordnet: 1. Glomerui und periglomeruläre Zellen (glomeruläre Schicht), 2. Mitralzellen

(Mitralzellschicht), und 3. Körnerzellen (Körnerzellschicht) (Abb. 1.1B, rechts).

Die meisten Säugetiere besitzen neben dem Riechepithel noch mindestens ein weiteres

Geruchssystem, das Vomeronasalorgan (VNO, Abb. 1.1A), das sich relativ zum Riechepithel

rostral in der Nase befindet und sich aus zwei knorpeligen Röhren beiderseits des basalen

Septums zusammensetzt. Das VNO dient primär zur Detektion von pheromonartigen

Substanzen. Pheromone spielen eine große Rolle bei der innerartlichen Kommunikation. Sie

dienen z.B. als Sexuallockstoffe und beeinflussen unmittelbar das Verhalten bzw. den

endokrinen Haushalt des Rezipienten.

Abb.1.1: Aufbau der Säugetiernase (Maus) A) Schematische Abbildung der Lage des MOE (Riechepithel),

MOB (Bulbus olfactorius), VNO (Vomeronasalorgan) und AOB (akzessorischer Bulbus) B) Aufbau des

Riechepithels (links) und des Bulbus olfactorius (rechts) (aus Mombaerts, 2004).

2


1.2 Olfaktorische Rezeptoren

Einleitung

1991 konnten erstmals Mitglieder der Multigenfamilie der Geruchsrezeptoren aus dem

Riechepithel der Ratte isoliert und als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren mit nachgeschalteter

Signaltransduktion identifiziert werden (Buck und Axel, 1991), wofür Linda B. Buck und

Richard Axel 2004 mit dem Nobel-Preis für Medizin und Physiologie ausgezeichnet wurden.

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren umfassen die größte Genfamilie im menschlichen Genom.

Diese heptahelikalen Proteine sind in der Zellmembran exprimiert und binden bsp. fast alle

bekannten Neurotransmitter wie Acetylcholin, Adrenalin und Noradrenalin, sowie

Chromophore (kovalent gebundenes 11-cis-Retinal im visuellen System), olfaktorische und

gustatorische Substanzen, Aminosäuren und extrazelluläres Ca 2+ (Broeck, 2001). GPCRs

zeigen keine Gesamtsequenzhomologie (Probst et al., 1992; Kolakowski, 1994) und die

Ligandenbindestelle und die Bindestelle für den G-Proteinkomplex sind spezifisch für

unterschiedliche GPCRs. Olfaktorische Rezeptoren gehören zu den GPCRs der Klasse A,

welche mit Abstand die größte Gruppe ist, und auch als Rhodopsin-ähnliche Rezeptoren

bezeichnet wird. Olfaktorische Rezeptoren besitzen ca. 330 Aminosäuren, die die Membran in

Form von kettenförmigen Helices durchziehen. Diese helikalen Transmembrandomänen sind

über intra- und extrazelluläre Schleifen (loops) miteinander verknüpft. Der extrazelluläre N-

Terminus weist putative Glykosylierungsstellen auf (Gat et al., 1994) und ist relativ klein. Der

C-Terminus liegt intrazellulär (Abb. 1.2). Am zytoplasmatischen Ende der dritten

Transmembrandomäne befindet sich das charakteristische DRY-Motiv (Asp-Arg-Tyr),

welches bei allen Mitgliedern der Gruppe A hoch konserviert ist und an der G-Protein

Aktivierung beteiligt ist (Wilbanks et al., 2002).

3


Einleitung

Abb.1.2: Modell der Sekundärstruktur des humanen olfaktorischen Rezeptorproteins OR17-40. Die

vertikalen Zylinder stellen die putativen heptahelikalen Transmembrandomänen dar. Hoch konservierte

Aminosäuren sind in blau dargestellt, hoch variable Strukturen in rot (aus Stryer, 2003).

Seit ihrer Entdeckung in der Ratte konnten olfaktorische Rezeptoren sowohl in Invertebraten

(Nematoden, Fruchtfliege) als auch in Vertebraten (Fische, Amphibien, Vögel und

Säugetiere) identifiziert werden, wobei sie in Säugetieren mit ca. 1000 Mitgliedern die größte

Genfamilie der Vertebraten bilden. Olfaktorische Rezeptoren können phylogenetisch in zwei

verschiedene Klassen eingeteilt werden, in Klasse I („fish-like“) und Klasse II („mammalianlike“)

Rezeptoren. OR der Klasse I wurden ursprünglich in Fischen identifiziert und man

vermutet, dass sie durch wasserlösliche Komponenten aktiviert werden. Diese Klasse wurde

aufgrund der früheren Annahme, dass es sich um evolutionäre Relikte in Säugetieren handelt

(Freitag et al., 1998) von der Säugetier-spezifischen Klasse II differenziert. Mittlerweile

konnte aber eine relativ große Zahl von intakten Klasse I OR Genen sowohl im menschlichen

Genom (Glusman et al., 2001), wie auch im Genom von Mäusen (Zhang und Firestein, 2002)

identifiziert werden. Im Gegensatz zu Rezeptoren der Klasse I werden Klasse II OR

vermutlich primär durch volatile Komponenten aktiviert (Mezler et al., 2001). Olfaktorische

Rezeptoren verteilen sich nahezu auf den gesamten menschlichen Chromosomensatz mit

Ausnahme der Chromosomen 20 und Y (Ben-Arie et al., 1994; Glusman et al., 2001). Fast

80% des OR Repertoires sind in 24 Clustern von 6-138 Genen angeordnet. Beim Menschen

sind inzwischen 17 OR kodierende Genfamilien bekannt, wovon allein vier Familien mehr als

100 Mitglieder besitzen. Die OR-Gene sind meist distal in der Nähe der Telomere lokalisiert

und zeigen untereinander zum Teil sehr hohe Sequenzhomologien (Trask et al., 1998a), die

zwischen 40 und 90 % liegen.

4


Einleitung

Bei der Maus konnten 1296 OR Gene (ca. 20 % Pseudogene) identifiziert werden, die sich in

228 Familien klassifizieren lassen. Die OR Gene sind in 27 Cluster auf allen

Mauschromosomen, außer 12 und Y verteilt (Zhang und Firestein, 2002). Mittlerweile konnte

nahezu die gesamte OR Genfamilie im Menschen und in der Maus identifiziert werden

(Glusman et al., 2001; Zhang und Firestein, 2002; Zhang et al., 2007).

Der erste menschliche olfaktorische Rezeptor, der sowohl im Riechepithel als auch in

humanen Spermien identifiziert werden konnte, ist OR1D2 (früherer Name: hOR17-4). Dieser

rekombinante Rezeptor konnte durch heterologe Expression in HEK293-Zellen charakterisiert

werden. Durch Untersuchungen von Struktur-Affinitätsbeziehungen gelang die Beschreibung

des molekularen rezeptiven Feldes. Dabei konnten der Ligand Bourgeonal sowie der

spezifische Antagonist Undekanal identifiziert werden. Durch Verhaltensstudien an

menschlichen Spermien konnte die funktionale Bedeutung von OR1D2 und dem

dazugehörigen Liganden Bourgeonal als Induktor für sowohl Chemotaxis, als auch für

Chemokinese gezeigt werden (Spehr et al., 2003; 2004). Chemotaxis ist als das zielgerichtete

Schwimmen entlang eines Konzentrationsgradienten definiert, Chemokinese beschreibt eine

Erhöhung der Flagellenschlagfrequenz und der Schwimmgeschwindigkeit. Damit wurde

erstmals ein für Säugetierspermien chemotaktisch aktiver Stoff gefunden. Bei gleichzeitiger

Applikation von Agonist und Antagonist unterdrückt Undekanal die „Antwort“ auf

Bourgeonal. Man geht daher davon aus, dass Undekanal, abhängig von den relativen

Duftstoffkonzentrationen, erfolgreich um die Bindestelle für Bourgeonal konkurriert, ohne

jedoch die nachfolgende Signaltransduktionskaskade auszulösen (Spehr et al., 2003).

Im Mausmodell konnte 2004 ebenfalls ein Spermienduftrezeptor (mOR23) charakterisiert

werden, welcher sowohl im olfaktorischen Epithel, als auch in den Testes exprimiert wird

(Fukuda et al., 2004). Bei dem potentiellen Liganden für diesen Rezeptor handelt es sich um

Lyral. Die Applikation von Lyral führt zu einer Erhöhung der intrazellulären Ca 2+ -

Konzentration in einem Teil der Spermatogonien sowie in reifen Spermien (Fukuda et al.,

2004). Fukuda et al. konnten auch zeigen, dass Bourgeonal keinen Ca 2+ -Anstieg in

Mäusespermien verursacht und somit einerseits kein funktionell OR1D2-orthologer Rezeptor

in Keimzellen der Maus exprimiert wird, andererseits Bourgeonal kein Ligand von mOR23 ist

(Fukuda et al., 2004).

Im Jahr 2006 fanden Fukuda et al. zudem heraus, dass mehrere Rezeptoren in einem

Spermatid exprimiert werden können und dass dieses Phänomen stadienspezifisch auftritt.

5


Einleitung

Die Frage, ob jedes Spermium das vollständige „Spermienrezeptor“-Repertoire oder nur einen

Teil exprimiert, ist bislang nicht geklärt.

Am Lehrstuhl für Zellphysiologie konnten bislang drei weitere olfaktorische Rezeptoren mit

dazugehörigem Ligand in menschlichen Spermien identifiziert werden (z.T. noch nicht

veröffentlichte Daten). Dabei handelt es sich um OR7A5/Myrac (Dissertation K. Schwane),

OR4D1/PI23472 (Diplomarbeit A.Triller) und PSGR/ß-Ionone (Dissertation W. Zhang).

1.3 Die cAMP vermittelte Signaltransduktionskaskade

Die Aktivierung der olfaktorischen Rezeptorneurone in Säugern erfolgt hauptsächlich über

einen cAMP-vermittelten Signalweg. Daneben wurde in der Vergangenheit ein paralleler IP3abhängiger

(Inositol-1,4,5-Triphosphat) Transduktionsweg postuliert (Boekhoff und Breer,

1990), wobei dieser in Säugetieren kontrovers diskutiert wurde. Bei Hummern und Fischen

konnte gezeigt werden, dass der cAMP-vermittelte Signaltransduktionsweg inhibitorisch

wirkt, wohingegen der IP3-Weg zu einer Depolarisation führt (Hatt und Ache, 1994). In

olfaktorischen Neuronen besteht die cAMP-vermittelte Signaltransduktionskaskade aus

verschiedenen Komponenten, dazu gehören die α-Untereinheit des heterotrimeren Golf

Proteins (Jones und Reed, 1989), die Adenylatzyklase III (Bakalyar und Reed, 1990) und ein

Kanal, der durch zyklische Nukleotide aktiviert wird (CNG Kanal) (Lowe et al., 1989; Zufall

et al., 1991). Die olfaktorische Signaltransduktion beginnt in den Zilien der ORN durch die

Bindung eines Duftstoffes an einen Rezeptor. Dies führt zu einer Konformationsänderung und

zur Aktivierung eines heterotrimeren G-Proteins, wodurch GDP gegen GTP ausgetauscht

wird und solange aktiv ist, bis GTP wieder zu GDP hydrolysiert wird. Im nicht aktivierten

Zustand besteht das G-Protein aus den assoziierten Untereinheiten α, β, und γ. Die α-

Untereinheit gehört zur Familie der P-Schleife-NTPasen, wobei die P-Schleife für die

Bindung des Nukleotids zuständig ist. Die α- und γ-Untereinheiten sind in der Regel über

kovalent gebundene Fettsäuren in der Membran verankert (Stryer, 2005). Die GTP gebundene

α-Untereinheit dissoziiert vom β/γ Komplex und aktiviert die Adenylatzyklase III, ein

membranständiges Protein mit vermutlich zwölf Transmembranhelices.

Durch die Wechselwirkung zwischen Golf und der Adenylatzyklase wird die Umwandlung

von ATP zu cAMP katalysiert (Abb. 1.3). Da jeder stimulierte Rezeptor zahlreiche Golf

Proteine aktiviert, werden hohe zytosolische Konzentrationen des zweiten Botenstoffes

(second messenger) cAMP gebildet. Die Öffnung einer entsprechend großen Anzahl von

zyklisch Nukleotid-gesteuerten (CNG) Kanälen führt schließlich zu einer enormen

6


Einleitung

Amplifikation des initialen chemischen Bindungssignals. Jede Kanalöffnung führt zu einem

unspezifischen Kationeneinstrom (Na + und Ca 2+ ) aus dem Extrazellulärraum ins Zellinnere

(Zufall et al., 1993; Frings et al., 1995; Torre et al., 1995). Dadurch steigt die intrazelluläre

Konzentration positiven Ladungen und es kommt zu einer Depolarisation der Zellmembran

(Restrepo et al., 1993a; Tareilus et al., 1995). Dieses Rezeptorpotential führt bei

überschwelliger Depolarisation zur Ausbildung von Aktionspotentialen am Axonhügel. Die

Depolarisation der Zilienmembran wird durch die Öffnung Ca 2+ -aktivierter Cl - -Kanäle

zusätzlich verstärkt (Restrepo et al., 1996), da Cl - -Ionen aufgrund ihrer in olfaktorischen

Neuronen relativ hohen intrazellulären Konzentration entlang des elektrochemischen

Gradienten aus der Zelle getrieben werden.

Die Kanäle, die den Chloridausstrom vermitteln, werden als CaCC Kanäle (Ca 2+ -activated

chloride channels) bezeichnet. CaCC Kanäle konnten das erste Mal in den Photorezeptoren

des Salamanders (Bader et al., 1982) und in Xenopus Oozyten (Barish, 1983; Miledi, 1982)

nachgewiesen werden und spielen eine Rolle in vielen physiologischen Prozessen. Mitglieder

der Proteinfamilie Tmem16 konnten kürzlich als Ca 2+ -aktivierte Cl - Kanäle identifiziert

werden. Die Expression der Tmem Gene wurde bei verschiedenen Arten von

Krebserkrankungen (Carles et al., 2006; Huang et al., 2006; West et al., 2004) und bei

gnathodiaphysealer Dysplasie (Tsutsumi et al., 2005) gefunden. Die Funktion ist aber nicht

geklärt. Zu der Tmem Familie zählt Tmem16a, der 2008 als CaCC Kanal in Xenopus Oozyten

identifiziert werden konnte (Schroeder et al., 2008). Kürzlich konnten Tmem Mitglieder

(Tmem16a, Tmem16b und Tmem16f) in der Plasmamembran und in der Membran von Zilien

im olfaktorischen Epithel der Maus nachgewiesen werden. Besonders Tmem16b konnte, im

Gegensatz zu den anderen Familienmitgliedern, auf einem sehr hohen Expessionslevel

nachgewiesen werden (Pifferi et al., 2009; Rasche et al., eingereicht).

7


Einleitung

Abb. 1.3: Schematische Darstellung der cAMP vermittelten Signaltransduktionskaskade. Die Bindung

eines Duftstoffmoleküls an einen spezifischen olfaktorischen Rezeptor (OR) bewirkt über die α- Untereinheit des

G-Proteins Golf die Aktivierung der Adenylatzyklase vom Typ III (AC III), und damit die Bildung von cAMP

und die Öffnung des CNG Kanals (modifiziert aus Hatt, 2004).

1.4 Ektopische Expression

Nach der Identifizierung von OR Genen im olfaktorischen Epithelium (Buck und Axel, 1991)

konnte OR-Expression ebenfalls in nicht olfaktorischen Geweben beobachtet werden

(ektopische Expression). Dazu zählte z.B. die OR Expression in peripheren Ganglien des

autonomen Nervensystems (Weber et al., 2002), in den Pyramidalneuronen des

Cerebralcortex (Otaki et al., 2004), in der Milz, im Dickdarm, in der Prostata (Raming et al.,

1998; Blache et al., 1998; Conzelmann et al., 2000; Yuan et al., 2001) und in der Niere

(Pluznick et al., 2009). Die Expression olfaktorischer Rezeptoren in Testesgeweben von

Mensch und Hund konnte erstmalig 1992 von Parmentier et al. gezeigt werden. Mittlerweile

konnten mehr als 50 Mitglieder der Riechrezeptorgenfamilie mit Hilfe der PCR-Technik aus

Testes cDNA verschiedener Spezies (Mensch, Hund, Ratte, Maus) amplifiziert werden

(Parmentier et al., 1992; Vanderhaeghen et al., 1997a; Vanderhaeghen et al., 1997b; Spehr et

al., 2003; Zhang et al., 2004; Feldmesser et al., 2006).

Die spezifischen Transkripte treten von den Urkeimzellen, über die verschiedenen

Entwicklungsstadien, bis zu den reifen Spermien auf (Fukuda et al., 2004). Anhand

immunhistochemischer Verfahren konnten olfaktorische Rezeptorproteine in epididymalen

Spermatiden und auf dem Mittelstück reifer Spermien (Mensch und Hund) gezeigt werden

(Vanderhaeghen et al., 1993; Walensky et al., 1995). Die bisher identifizierten testikulären

OR Gene befinden sich auf den Chromosomen 11, 17 und 19 (Vanderhaeghen et al., 1997).

8


Einleitung

Die Beobachtung der ektopischen Expression von putativen OR Genen führte zu der

Vermutung, das ein Teil der Säugetier OR Gene zusätzliche Funktionen in nichtolfaktorischen

Geweben ausüben. Die Allgemeingültigkeit dieser Hypothese konnte bis heute

nicht eindeutig bewiesen werden. Allerdings scheinen OR Proteine eine Rolle bei der

Spermien Chemotaxis zu spielen. Bei der menschlichen Ejakulation werden ca. 4 – 40 x 10 7

Spermien ausgeschüttet, von denen nur ca. 250 bis zur Ampulle (Ort der Befruchtung)

gelangen, was ein zufälliges Aufeinandertreffen von Spermium und Eizelle fast unmöglich

macht (Eisenbach et al., 1999; Eisenbach und Giojalas, 2006).

In einer Reihe verschiedener in vitro Studien konnte in humanen Spermien sowohl

Chemotaxis, als auch Chemokinese durch Follikelflüssigkeit induziert werden (Villanueva-

Diaz et al., 1992; Cohen-Dayag et al., 1995; Ralt et al., 1994).

Spehr et al. konnten 2003 den olfaktorischen Rezeptor OR1D2 in menschlichen Spermien

identifizieren und im darauf folgenden Jahr zeigen, dass der OR1D2-Ligand Bourgeonal eine

Erhöhung der zytosolischen Ca 2+ -Konzentration auslöst, die in Spermien chemotaktisches

sowie chemokinetisches Verhalten induziert.

Diese Daten konnten 2009 von der Arbeitsgruppe um Michael Eisenbach bestätigt werden.

Bourgeonal und Progesteron erhöhen in menschlichen Spermien die

Schwimmgeschwindigkeit, so dass die Linearität der Schwimmbewegung abnimmt und die

Spermien hyperaktiv werden (Gakamsky et al., 2009). Außerdem konnte durch verschiedene

Versuche gezeigt werden, dass humane Spermien einen Duftstoffgradienten durch zeitliche,

anstelle von räumlichen Konzentrationsvergleichen detektieren (Gakamsky et al., 2009).

1.5 Kalzium als zellulärer Botenstoff

Kalzium (Ca 2+ ) ist der am weitesten verbreitete zelluläre Botenstoff in diversen

Signaltransduktionskaskaden von Bakterien bis hin zu Säugetierneuronen (Clapham et al.,

2001). Dabei spielt Ca 2+ eine essentielle Rolle bei der Steuerung vieler Prozesse, wie z.B. dem

Zellwachstum und -stoffwechsel, bei Muskelkontraktionen, bei der Befruchtung, bei der

Hormonsekretion und bei der Apoptose. Die intrazelluläre Ca 2+ -Ionen Konzentration im

Zytosol der meisten Zellen beträgt ca. 0,1 µM, und ist damit ca. um einen Faktor 10.000

geringer als im extrazellulären Raum. Diese niedrige intrazelluläre Ca 2+ -Ionen Konzentration

wird durch endogene Chelatoren und Transportmechanismen reguliert (Ca 2+ -ATPasen,

Na + /Ca 2+ Antiportsystem). Ca 2+ bindet oft an Calmodulin, ein Ca 2+ -Sensor Protein, welches

bsp. eine Vielzahl von Ca 2+ -Kanälen reguliert, einschließlich des IP3 Rezeptors. Calmodulin

9


Einleitung

besitzt vier Ca 2+ -Bindestellen und kann nach Konformationsänderung andere Proteine binden

(Kretsinger, 1980). Der Ca 2+ -Calmodulin (Ca/CaM) Komplex reguliert die Aktivität vieler

Enzyme, wie z.B. Ca 2+ -Calmodulin-abhängige Proteinkinasen (CaM-Kinasen), welche auch

in Spermien vorkommen (Komponenten des Axonems) und eine Rolle bei der

Spermienbeweglichkeit spielen. Ca 2+ -Ionen werden entweder aus intrazellulären Speichern

freigesetzt oder fließen nach Kanalöffnungen aus dem Extrazellulärraum in das Zytoplasma.

Eine große Rolle bei der Speicherung und Freisetzung spielen das sarkoplasmatische und

endoplasmatische Retikulum, in deren Membranen sich spezielle Pumpen befinden, die unter

Verbrauch von ATP zwei Ca 2+ -Ionen vom Zytoplasma in das Lumen des Retikulums

transportieren. Das entsprechende Pumpenprotein wird als

sarkoplasmatische/endoplasmatische Ca 2+ -ATPase (SERCA) bezeichnet und stellt den

Hauptmechanismus für die Regulierung eines erhöhten intrazellulären Ca 2+ -Spiegels dar

(Schatzmann, 1989). Die Freisetzung des intrazellulären Ca 2+ kann durch second messengerabhängige

Signalwege, u.a. über IP3, zyklische ADP-Ribose (cADPR) oder Nikotinsäure-

Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NAADP) (Tsien et al., 1990; Albrieux et al., 1998; da Silva

und Guse 2000; van Gorp et al., 2002), ausgelöst werden.

1.6 Spermatogonien und ihre Differenzierung zu reifen Spermien

Bei Spermatogonien (insgesamt über 1 Milliarde in beiden Hoden, (Maus)) handelt es sich um

unreife, diploide Keimzellen, welche sich kontinuierlich mitotisch teilen und somit den

Reservepool von Spermien-Stammzellen bilden, die die Spermatogenese (erster Teil der

Entwicklung männlicher Keimzellen) durchlaufen. Gleichzeitig bilden die Spermatogonien

die basale Schicht des Keimepithels. Die Spermatogonien sind eingebettet in einem radialen

„Gerüst“ von Sertoli-Zellen (Stützzellen der Hodenkanälchen), die die Blut-Hoden-Schranke

bilden und nutritive Funktionen bei der Spermatogenese übernehmen. Man unterscheidet

aufgrund unterschiedlicher Kernmorphologien drei verschiedene Subtypen von

Spermatogonien. Dabei handelt es sich um Spermatogonien Typ A1 deren Nukleus durch

dichtes Chromatin dunkel gefärbt erscheint. Diese Zellen teilen sich, um Kopien von sich

selber zu produzieren und bilden einen lebenslangen Pool von Stammzellen für die

Spermatogenese. Des Weiteren gibt es Spermatogonien Typ A2 mit einem relativ hellen

Nukleus. Diese Zellen sind charakterisiert durch einen ellipsoiden Kern mit körnigem

Chromatin. Dieser Typ differenziert sich mitotisch zu Spermatogonien vom Typ B. Die

Spermatogonien vom Typ B sind ebenfalls mitotisch aktiv und differenzieren sich zu

10


Einleitung

primären Spermatozyten. Nach Abschluss dieser Zellteilungssequenz lösen sich die

Spermatogonien Typ B von der Wand des Keimtubulus und treten in die Meiose ein, wodurch

sekundäre Spermatozyten entstehen, die nur noch einen haploiden Chromosomensatz

aufweisen (Yanagimachi et al., 1994). Durch die meiotische Teilung II entstehen aus den

sekundären Spermatozyten die Spermatiden. Diese differenzieren sich ohne weitere Teilungen

über eine runde und gestreckte Form zu den Spermatozoen (Abb.1.4), welche aber noch die

Spermiogenese (Ausdifferenzierung der männlichen Keimzellen) durchlaufen müssen, wo sie

durch Membranveränderungen die Fähigkeit zur Bewegung erlangen (Thaler und Cardullo,

1995).

Bedingt durch eine unvollständige Zytokinese während der Mitose bleiben die Keimzellen

über Interzellularbrücken (ca. 2-3 μm) miteinander verbunden, so dass Gruppen von

Keimzellen gleichen Reifestadiums miteinander verkettet sind und somit eine synchrone

Keimzellreifung möglich ist. Die Interzellularbrücken beinhalten normalerweise keine

Organellen oder Mikrotubuli und sie sind von der Zellmembran der Sertoli-Zellen getrennt.

Diese Brücken bleiben durch alle Reifestadien bestehen, bis die Spermatozoen in das Lumen

der Samenkanälchen freigesetzt werden.

In 6 Tage alten Mäusen existieren drei Subtypen von Typ A Spermatogonien. Der

vergleichsweise kleine Subtyp I besitzt eine nukleare Vakuole, der größere basophile Subtyp

II enthält Konglomerate aus Heterochromatin (inaktiv, kondensiert) und Subtyp III ist noch

größer, aber hell, mit großen Ansammlungen aus Heterochromatin. Die Interzellularbrücken

erscheinen zwischen Subtyp II und Subtyp III, während Subtyp I Spermatogonien als

Einzelzellen vorliegen. Subtyp II und Subtyp III sind etwa in der gleichen Anzahl vorhanden,

jeder Typ zu ca. 45%, Subtyp I zu ca. 10 % (Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction,

Third Edition).

11


Abb. 1.4: Spermienentwicklung. Dargestellt sind die verschiedenen Stadien der Spermienentwicklung

(modifiziert aus „Molecular Biology of the cell“, 4th Edition).

1.7 Spermien Morphologie

Einleitung

Der Grundaufbau eines Spermiums ist bei allen Säugetieren konserviert (McLeskey et al.,

1998). Die dreigliedrige Struktur setzt sich aus dem Kopf, dem Mittelstück und dem

Flagellum zusammen (Abb. 1.5A). Die Größe von Spermien variiert von Spezies zu Spezies,

menschliche Spermien sind ca. 60 µM lang, Hasenspermien ca. 46 µM, Mäusespermien ca.

120 µM, Rattenspermien ca. 190 µM und die Spermien vom chinesischen Hamster erreichen

eine Länge von bis zu 250 µM (Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction, Third

Edition). Der längsovale Kopf (2-5 μm) besteht aus einem großen haploiden Zellkern aus

dicht kondensiertem Chromatin, Zytoplasma und einer Akrosomkappe am anterioren Teil des

Kopfes (umgibt ca. 2/3 des Kopfes). Das Akrosom entsteht aus dem Golgi-Komplex und

beinhaltet hydrolisierende Enzyme, wie Akrosin (Yuan et al., 1995), Esterasen,

Hyaluronidasen und saure Proteinasen, die für das Spermium notwendig sind, um die

Schutzhülle (Corona radiata und Zona pellucida) der Oozyte bei der Fertilisation zu

durchdringen. Während der Akrosomreaktion verschmilzt der größte Teil der äußeren

Akrosommembran mit der Eizell-Plasmamembran.

Zwischen dem Kopf und dem Mittelstück befindet sich ein Verbindungsstück, das aus dem

Capitulum und mehreren Segmenten besteht. Das Mittelstück ist sehr mitochondrienreich. In

den Mitochondrien wird durch oxidative Phosphorylierung ATP produziert, welches die

12


Einleitung

Energie für den Flagellenschlag liefert. Das Flagellum besitzt ein zentral liegendes Axonem

bestehend aus dem charakteristischen 9 + 2 Mikrotubulussystem (2 zentrale getrennte

Mikrotubuli, um die 9 Doppeltubuli angeordnet sind). Bei den peripheren Doppeltubuli

besitzen die A-Tubuli 13 und die B-Tubuli 10 Protofilamente. Die 9 Doppeltubuli sind über

die Radialspeichen mit den zentralen Mikrotubuli verbunden (Abb. 1.5B). An den A-Tubuli

befinden sich Dyneinarme, die für die Bewegung verantwortlich sind. Dynein kann unter

ATP-Verbrauch die Mikrotubuli verschieben, so dass die äußeren Mikrotubuli an den inneren

entlang gleiten (Lehninger et al., 1994), was zu der Schlagbewegung des Flagellums führt.

Man kann zwei verschiedene Schlagbewegungen unterscheiden, den „konventionellen“

Flagellenschlag von Spermien, z.B. nach der Ejakulation, der durch eine symmetrische,

sinuswellenartige Form mit niedriger gleich bleibender Amplitude gekennzeichnet ist,

wodurch Spermien relativ gerade schwimmen. Im Gegensatz dazu wird der asymmetrische

Flagellenschlag mit hoher Amplitude bei hyperaktiven Spermien beobachtet, was in

zirkulären Schwimmbahnen resultiert (Yanagimachi, 1970, 1994; Ishijima et al., 2002). Die

aktive Bewegung dient dazu, die Spermien durch den weiblichen Reproduktionstrakt zum

Eileiter zu bringen, durch hyperaktive Bewegung hingegen kann sich ein Spermium nach der

Ovulation vom Epithel des Eileiters ablösen und die Cumulus Zellen sowie die Zona

pellucida durchdringen (Suarez et al.,1991, Stauss et al., 1995, Ho und Suarez, 2001).

Abb. 1.5 A) Konservierter Aufbau eines Säugetier-Spermiums, B) Struktureller Aufbau des 9 + 2

Mikrotubulisystems (modifiziert aus Turner et al. ,2006 und Linck, 2001).

13


1.8 Exkurs: Der weibliche Zyklus

Einleitung

Zu Beginn des Zyklus reift eine Eizelle im Follikel eines der beiden Eierstöcke. Für diesen

Reifeprozess ist das follikelstimulierende Hormon (FSH) verantwortlich, das in der

Hypophyse produziert wird. Durch das Wachsen des Follikels wird wiederum Östrogen

produziert. Das Östrogen bewirkt die Reifung einer befruchtungsfähigen Eizelle, sowie den

Transport und die Einnistung in die Gebärmutter. Außerdem ist es für den Aufbau der

Gebärmutterschleimhaut und für die Öffnung des Gebärmutterhalses verantwortlich. Wenn

die Östrogenproduktion ca. zur Zyklusmitte (~Tag 14) ihren Höhepunkt erreicht hat, wird das

luteinisierende Hormon (LH) aus der Hypophyse ausgeschüttet, was dazu führt, das der

Follikel aufplatzt und somit der Eisprung ausgelöst wird. Nach dem Eisprung bildet sich das

Follikelepithel unter dem Einfluss von LH zum Gelbkörper um, welches für die Produktion

von Progesteron verantwortlich ist. Das Progesteron hat mehrere Aufgaben. Zum einen sorgt

es dafür, dass die Schleimhaut der Gebärmutter auf die Einnistung der befruchteten Eizelle

vorbereitet wird und zum anderen führt es dazu, dass nach dem Eisprung die

Körpertemperatur um ca. 0,5 °C steigt. Wenn es zu keiner Befruchtung der Eizelle kommt,

entwickelt sich der Gelbkörper zurück und es kommt zur Menstruation. Der menschliche

Zyklus dauert ca. 25-35 Tage.

Abb. 1.6: Der weibliche Zyklus. Dargestellt sind die unterschiedlichen Hormonkonzentrationen abhängig von

der jeweiligen Zyklusphase (www.kiwu-wuki.de).

14


1.9 Ionenkanäle

Einleitung

Jede Zelle besitzt eine Zellmembran aus einer Lipiddoppelschicht, die das Zytosol und die

Zellorganellen von der Umgebung abgrenzt. In die Lipiddoppelschicht eingelagert werden

u.a. Transmembranproteine, wie z.B. Ionenkanäle, durch die ein Ladungstransport (Na + , K + ,

Ca 2+ oder Cl - ) zwischen Zytoplasma und Extrazellulärraum möglich ist. Diese passive

Diffusion entlang eines elektrochemischen Gradienten erfolgt mit sehr hohen Transportraten

von > 10 6 Ionen pro Sekunde (Hille, Ion channels of excitable membranes, Third Edition).

Ionenkanäle können in einem geschlossenen oder offenen Zustand vorliegen, wobei die

Öffnung durch verschiedene Signale ausgelöst werden kann, wie z. B durch eine Änderung

des Membranpotentials (spannungsabhängige Ionenkanäle), oder durch die Bindung eines

Neurotransmitters oder Botenstoffes (ligandengekoppelte Ionenkanäle). Viele Ionenkanäle

besitzen eine Ionenselektivität (Ladung des Ions, Größe und Hydrathülle des Ions,

Ladungsdichte usw.), d.h. sie sind nur für bestimmte Ionen permeabel. Die

(elektro)physiologisch wichtigsten Ionen sind Na + , K + , Ca 2+ oder Cl - .

Ionenkanalströme spielen eine wichtige Rolle bei verschiedenen in Spermien ablaufenden

Prozessen, wie z.B. bei der Hyperaktivität, Kapazitation und Akrosomreaktion. Während der

Ejakulation, vor der Fertilisation und um verschiedene Barrieren zu überwinden (z.B. die

Zona pellucida), müssen Säugetier-Spermien hyperaktiv werden. Das Schwimmverhalten und

die Hyperaktivität werden u.a. durch Ca 2+ und CNG Kanäle kontrolliert (Weyand et al.,

1994). Die Erhöhung des Ca 2+ -Spiegels auf der Grundlage der Entleerung zellulärer Ca 2+ -

Speicher wird anhand experimenteller Ergebnisse ebenfalls postuliert (Walensky und Snyder,

1995). Die Anstiege der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration werden vermutlich durch Öffnung

Ca 2 -permeabler Kanäle in der Plasmamembran vermittelt. Zu diesen Kanälen gehören

spannungsaktivierte Ca 2+ -Kanäle, CNG-Kanäle, TRPC2-Kanäle (beteiligt an der

Akrosomreaktion; Jungnickel et al., 2001; Florman et al., 2008) und CatSper Kanäle (Ren et

al., 2001).

CatSper1 und drei homologe Proteine (CatSper2 – 4) umfassen eine Familie von

spermienspezifischen Kanalproteinen, die 6 Transmembrandomänen besitzen. Die

Sequenzidentität unter den Mitgliedern der CatSper Familie erstreckt sich innerhalb der

Ionentransportdomäne zwischen 22 und 27 % (Lobley et al., 2003). CatSper1 und 2 sind

beide für die Hyperaktivität der Spermien verantwortlich (Ref.). Kirichok et al. fanden 2006

heraus, das CatSper1 ein alkalin-potenzierter, spannungsaktivierter Ca 2+ -selektiver Kanal ist.

15


Einleitung

In Spermien ist der Kanal hauptsächlich in der Plasmamembran des proximalen Flagellums

lokalisiert, nicht im Kopf oder Mittelstück (Ren et al., 2001)

1.9.1 Spannungsabhängige Kalium-Kanäle

Spannungsabhängige Kalium-Kanäle (Kv-Kanäle) bilden die Ionenkanalgruppe mit den

meisten bekannten Vertretern. Erstmalig phänotypisch postuliert wurden sie im Riesenaxon

des Tintenfischs (Hodgkin und Huxley, 1952), die erste Klonierung eines Kv-Gens hingegen

gelang 1987 aus der Drosophila Mutante Shaker (Tempel et al., 1987). K + -Kanäle öffnen sich

durch eine Änderung des Membranpotentials (Aktivierungsschwelle bei ca. -40 mV).

Allgemein lassen sich K + -Kanäle aufgrund der Topologie der porenbildenden α-Untereinheit

in drei verschiedene Gruppen einteilen, die sich in der Anzahl der Transmembrandomänen

und Porenschleifen (2TM-1P (Kir-Kanal), 4TM-2P (TWIK-Kanal) oder 6TM-1P (Kv-Kanal))

unterscheiden (Biggin et al., 2002). Die α-Untereinheit der spannungsabhängigen Kv-Kanäle

besteht aus sechs helikalen Transmembrandomänen (S1-S6) mit intrazellulären Carboxyl (C-)

und Amino (N-) Termini und besitzt eine Porendomäne zwischen S5 und S6 (P/H5) (Abb. 1.7

links). Die S4 Domäne enthält positiv geladene Aminosäuren, insbesondere Lysin und

Arginin (Papazian et al., 1991) und dient als Spannungssensor (Catterall, 1992). Wie oben

beschrieben öffnen Kv-Kanäle durch eine Änderung des Membranpotentials. Aktuelle

Untersuchungen der Kristallstruktur zeigen, dass zwischen Spannungssensor und Porenregion

eine Kontaktregion existiert, die von wenigen Aminosäuren gebildet und von S4, S5 und S6

geformt wird. Diese Region scheint die S4 Bewegung zu übermitteln, was in einer Öffnung

des Kanals resultiert. Des Weiteren konnte eine Kontaktregion zwischen S1 und der

Porenhelix in der Nähe der extrazellulären Oberfläche gefunden werden, die essentiell für die

Kv-Funktion ist (Lee et al., 2009).

Die bisher klonierten spannungsabhängigen Kalium-Kanäle lassen sich in sechs Subfamilien

einteilen, Shaker (Kv 1.1- 1.7), Shab (Kv2.1, 2.2), Shaw (Kv 3.1-3.4), Shal (Kv4.1-4.3),

eather-a-go-go (EAG) und slowpoke (Slo) (Roeper und Pongs, 1996).

16


Einleitung

Abb. 1.7: Spannungsabhängiger Kaliumkanal mit typischer 6 TM Struktur (S1-S6) und intrazellulären

N-und C-Termini (links). Rechts: Prototyp der Porendomäne (Querschnitt (KcsA K. Kanal)), das Innere des

Proteins ist in dunkelgrün dargestellt mit der Sekundärstruktur, die als Bänder für drei der vier Untereinheiten

gezeigt wird (aus Yellen, 2002).

Allgemein lassen sich spannungsabhängige Kalium-Kanäle in zwei funktionelle Kategorien

(‚delayed rectifier‘ und A-Typ Kanäle) einteilen, die sich durch ihre Aktivierungs- und

Inaktivierungskinetiken unterscheiden. Die ‚delayed rectifier‘ Kanäle sind durch eine

verzögerte Aktivierung nach der Depolarisation gefolgt von einer langsamen Inaktivierung

charakterisiert. ‚Delayed rectifier‘ Kanäle werden daher auch als „verzögerte Gleichrichter“

bezeichnet, da sie beim Ruhepotential fast immer geschlossen sind und sich nach einer

Depolarisation auf Potentiale positiver als -50 mV (Hodgkin und Huxley, 1952) öffnen. Man

kann drei verschiedene ‚delayed rectifier‘ Ströme aufgrund ihrer

Aktivierungsgeschwindigkeit unterscheiden, IKUR („ultra rapid“), IKR („rapid“) und IKS

(„slow“). A-Typ Kanäle hingegen sind durch vergleichsweise schnelles Öffnen und Schließen

während der Depolarisation charakterisiert. Oft werden A-Typ Kanäle in Neuronen

exprimiert, da sie es ermöglichen bei niedrigen Frequenzen rhythmisch zu feuern (Connor

und Stevens 1971), d.h. sie reagieren auf kontinuierliche Depolarisation mit einer Reihe von

Aktionspotentialen. Außerdem spielen sie eine Rolle bei der Umwandlung der Spikeform

(Zhang und McBain, 1995b) und kontrollieren u.a. die Signalausbreitung in Dendriten

(Hoffman et al., 1997). Obwohl A-Typ Kanäle als transient auswärts rektifizierende K + -

Kanäle beschrieben worden sind, gibt es Unterschiede in der Leitfähigkeit, der

Öffnungskinetik und den pharmakologischen Eigenschaften (Bekkers 2000, Kanold und

Manis, 1999, Korngreen und Sakmann 2000). Die Unterschiede des A-Typ Stroms kommen

durch die Heterogenität der zugrunde liegenden Kanäle zu Stande. Bekannt ist, dass Kv1.4,

17


Einleitung

Kv3.4, Kv4.1, Kv4.2 und Kv4.3 A-Typ Ströme vermitteln (Baldwin et al., 1991, Covarrubias

et al., 1991, Serodio et al., 1996).

Für die schnelle Inaktivierung von spannungsabhängigen Kalium-Kanälen konnte im Shaker

K + -Kanal der Aminoterminus identifiziert werden (N-Typ Inaktivierung). Für die langsame

Inaktivierung sind Strukturen in der Nähe des Carboxyterminus verantwortlich (C-Typ

Inaktivierung).

1.9.2 Spannungsabhängige Ca 2+ -Kanäle

Spannungsabhängige Ca 2+ -Kanäle konnten das erste Mal 1953 identifiziert werden (Fatt und

Katz, 1953). Diese Kanäle kommen in vielen verschiedenen Zelltypen vor, z.B. in Herz- und

Skelettmuskeln oder Neuronen, und sie vermitteln einen Ca 2+ -Einstrom infolge einer

Membrandepolarisation. Auch in Spermienvorläuferzellen und reifen Spermien konnten

spannungsabhängige Ca 2+ -Kanäle identifiziert werden, die z.B. eine Rolle bei der

Akrosomreaktion spielen (Darszon et al., 2001).

Spannungsabhängige Ca 2+ -Kanäle können basierend auf ihren Aktivierungsschwellen und

ihren pharmakologischen Eigenschaften in zwei verschiedene Subtypen eingeteilt werden:

Kanäle, die bereits bei niedrigen Membranspannungen aktiviert werden können (LVA „low

voltage-activated“) und Kanäle, die nur durch eine vergleichsweise positive

Membranspannung aktiviert werden können (HVA „high voltage-activated“) (Hagiwara et

al.,1975; Llinás und Yarom, 1981; Catterall, 2000). LVA Kanäle besitzen eine

Aktivierungsschwelle um -60 bis -40 mV und sind durch ein schnelles Öffnen und eine

schnelle Inaktivierung charakterisiert. Sie werden auch als T-Typ Ca 2+ -Kanäle bezeichnet (T

für transient). HVA Kanäle dagegen beginnen sich zu öffnen, wenn das Membranpotential der

Zelle auf ≥ -20 mV depolarisiert wird. Viele HVA-Kanäle sind durch einen verzögert

auftretenden Ca 2+ -Strom, der sich durch 1,4-Dihydropyridine (1,4-DHP) blockieren lässt, und

eine langsame Inaktivierung charakterisiert. Sie werden daher auch als L-Typ Ca 2+ -Kanäle

bezeichnet (L für lang anhaltend). Neben den L-Typ Kanälen konnten weitere HVA-Ca 2+ -

Kanäle identifiziert werden, die 1,4-DHP -insensitiv sind, aber sensitiv auf Polypeptid-Toxine

aus Kegelschnecken und Spinnengiften reagierten. Der ursprünglich in Neuronen

identifizierte, ω Conotoxin GVIA-sensitive Kanal wurde als N-Typ Kanal (N für neuronal)

bezeichnet (Dubel et al., 1992; Williams et al., 1992a). Ein kardialer, ω Agatoxin IVainhibierter

Kanal (Sather et al., 1993; Stea et al., 1994; Bourinet et al., 1999) wurde als P/Q-

18


Einleitung

Typ Kanal (P für Purkinje-Zellen) bezeichnet. Ein weiterer Toxin-resistenter Kanaltyp wurde

als R-Typ Kanal (R für resistent) bezeichnet (Randall und Tsien 1995).

Eine moderne, evolutionsorientierte Klassifizierung von spannungsabhängigen Ca 2+ -Kanälen

ist mittlerweile durch Sequenzanalysen der jeweiligen α1 Untereinheiten möglich. Bisher sind

drei strukturell und funktionell verwandte Familien bekannt, CaV1, CaV2 und CaV3 (Ertel et

al., 2000). Die CaV1 Subfamilie besteht aus vier Mitgliedern, die für L-Typ Kanäle kodieren

(CaV1.1 (α1S), CaV1.2 (α1C), CaV1.3 (α1D) und CaV1.4 (α1F)). Die CaV2 Subfamilie beinhaltet

die P/Q-Typ Kanäle (CaV2.1 (α1A), Mori et al., 1991; Starr et al., 1991), die N-Typ Kanäle

(CaV2.2 (α1B), Williams et al., 1992b) und die R-Typ Kanäle (CaV2.3, (α1E) Niidome et al.,

1992; Soong et al., 1993). Die CaV3 Subfamilie beinhaltet drei Mitglieder der T-Typ Kanäle,

CaV3.1 (α1G), CaV3.2 (α1H) und CaV3.3 (α1I) (Perez-Reyes et al., 1998).

Abb. 1.8: Phylogenetischer Vergleich aller bekannten spannungsabhängigen Ca 2+ -Kanäle (aus: Perez-

Reyes, 2003).

Der grundsätzliche Aufbau aller HVA Ca 2+ -Subtypen ist trotz verschiedener Eigenschaften

und zellulärer Verteilungen ähnlich. Sie besitzen neben den unterschiedlichen α1

Untereinheiten, welche in der Zellmembran lokalisiert sind und die Bindungsstelle für die

Ca 2+ -Blocker enthalten, eine intrazellulär gelegene ß-Untereinheit, sowie eine α2 Untereinheit,

die über eine Disulfidbrücke mit einer δ-Untereinheit verbunden ist (Catterall, 2000). In

CaV1.1 Kanälen konnte außerdem noch eine fünfte γ-Untereinheit gefunden werden.

19


1.10 Exkurs-TRP-Kanäle

Einleitung

Die Familie der TRP Kanäle (transient receptor potential) umfasst verschiedene Gruppen von

meist nicht selektiven Kationenkanälen, die eine hohe Sequenzhomologie und entsprechend

eine ähnliche Struktur aufweisen. Die ersten TRP Kanäle wurden 1969 in Drosophila

melanogaster beschrieben, wo sie eine Rolle bei der visuellen Wahrnehmung spielen (Hotta

et al., 1969). Molekularbiologisch identifiziert werden konnten sie 1989 von Craig Montell

und Mitarbeitern (Montell et al., 1989). TRP Kanäle kommen sowohl in erregbaren, als auch

in nicht erregbaren Zellen vor und erfüllen unterschiedliche Funktionen. Hefen z.B. nutzen

TRP Kanäle zur Wahrnehmung der Osmolarität ihrer Umgebung (Denis et al., 2002; Zhou et

al., 2003). Mäuse nutzen TRP Kanäle zur Pheromondetektion, wie z.B. für die

Geschlechtsunterscheidung (Stowers et al., 2002). Bei Säugetieren bis hin zum Menschen

agieren TRP Kanäle zur Wahrnehmung der Geschmacksrichtungen süß, bitter und umami,

sowie zur Temperaturunterscheidung (Zhang et al., 2003). TRP Kanäle sind nicht primär

spannungssensitiv. Sie depolarisieren die Zellen vom Ruhemembranpotential aus und

verschieben das Membranpotential auf ungefähr 0 mV (Clapham et al., 2001).

Die Familie der TRP Kanäle lässt sich in sechs Subfamilien, TRPC, TRPV, TRPM, TRPA,

TRPP und TRPML, gliedern (Ramsey et al., 2006). Der Aufbau und die grundsätzliche

Membrantopologie der TRP Kanäle ist analog zu Kv-Kanälen (s. Abschnitt 1.9.1). Je nach

Subtyp gibt es einige Unterschiede, z.B. liegen Ankyrin-Wiederholungssequenzen innerhalb

des intrazellulären aminoterminalen Endes von TRPC, TRPV und TRPA, wohingegen TRPC

und TRPM Prolin-reiche Regionen am carboxylterminalen Ende besitzen (Clapham et al.,

2003).

1.10.1 Die unterschiedlichen Subtypen

- Die TRPC Familie -

Die TRPC Familie („classic oder canonical TRP“) kann, basierend auf ihrer

Sequenzhomologie und funktionellen Ähnlichkeiten, in vier Subfamilien eingeteilt werden

(TRPC1, TRPC4,5, TRPC 3,6,7 und TRPC2). Der erste in Säugetieren identifizierte TRP

Kanal (TRPC1) formt heteromere Kanäle mit TRPC4 und/oder TRPC5 (Clapham et al.,

2001). TRPC4 und TRPC5 beinhalten eine C-terminale PDZ Bindungsdomäne die nicht in

anderen TRP Subtypen vorkommt. TRPC 3, TRPC 6, und TRPC 7 sind zu 75%

sequenzhomolog und formen nicht-selektive heteromere Kationenkanäle. Über TRPC2 ist

20


Einleitung

wenig bekannt. Bei Menschen scheint es sich um ein Pseudogen zu handeln (Liman et al.,

1999, Vannier et al., 1999).

- Die TRPV Familie -

Die TRPV Familie („vanilloid TRP“) besteht aus sechs Mitgliedern (TRPV1-6). TRPV1 und

TRPV2 werden durch den Liganden Capsaicin (8-Methyl-N-vanillyl-6-noneamid, Caterina et

al., 1997) oder durch eine Temperaturerhöhung (> 43°C) aktiviert, die als schmerzhaft

empfunden wird. Eine Erhöhung der Temperatur aktiviert ebenfalls TRPV3 (> 31°C) (Smith

et al., 2002, Xu et al., 2002) und TRPV4 (> 25°C) (Güler et al., 2002). Bei TRPV5 und

TRPV6 handelt es sich um Ca 2+ -selektive Kanäle (den Dekker et al., 2003), die nur wenig

Ähnlichkeit mit anderen TRPV Kanälen besitzen (22-24% Identität).

- Die TRPM Familie -

Die TRPM Familie („melastatin“) besteht aus acht Mitgliedern, die sich in fünf Hauptgruppen

einteilen lassen (TRPM1,3; TRPM4,5; TRPM6,7; TRPM2 und TRPM8). TRPM1 konnte

erstmals als ein Transkript, das eine verminderte Expression in Melanoma-Zellen zeigte,

identifiziert werden. Bei TRPM2 handelt es sich um einen Ca 2+ -permeablen Kanal, der durch

eine Nudix-Hydrolase Domäne charakterisiert ist. Eine Sonderstellung in der TRPM Familie

nehmen TRPM4 und TRPM5 ein, welche die einzigen monovalent-selektiven Ionenkanäle in

der TRP Familie sind, sowie TRPM6 und TRPM7, welche Ionenkanäle und Proteinkinase

Aktivität besitzen (Ramsey et al., 2006).

Bei TRPM8 handelt es sich um einen Kälterezeptor, der einerseits durch Temperaturen unter

25°C, andererseits durch Menthol und Icilin aktiviert werden kann (Peier et al., 2002).

- Die TRPA Familie -

TRPA unterscheidet sich von anderen TRP Kanälen durch ~14 Ankyrin-

Wiederholungssequenzen innerhalb des N-Terminus. Dieser Kanal wird durch Kälte (Story et

al., 2003) und Ca 2+ aktiviert (Dörner et al., 2007).

- Die TRPP Familie -

Die Proteine der polyzystischen Nierenerkrankung (PKD) formen die TRPP Familie. Diese

Kanäle sind Ca 2+ -permeabel und werden als TRPP2, TRPP3 und TRPP5 bezeichnet (Montell,

2001).

21


Einleitung

- Die TRPML Familie -

Die TRPML Familie (Mukolipin) ist in intrazellulären Vesikeln lokalisiert. TRPML1 scheint

ein nicht-selektiver Kanal zu sein, der bei niedrigen pH Werten inhibiert wird. Mutationen in

TRPML1 sind mit neurodegenerativen Krankheiten (Mukolipidose Typ IV) assoziiert (Qian

et al., 2005).

1.11 Nukleotidrezeptoren - P2 Rezeptoren

Nukleotide spielen u.a. eine wichtige Rolle als extrazelluläre Signalmoleküle und übernehmen

entscheidende regulatorische Funktionen in Zellen. Verschiedene Nukleotide wie z.B. ATP

und UTP sind in der Lage P2 Rezeptoren zu aktivieren. Diese Rezeptoren konnten 1993/1994

durch Klonierung und heterologe Expression charakterisiert werden (Abbrachio und

Burnstock, 1994; North, 2002). Je nach Subtyp handelt es sich um Rezeptoren für Purine

(ATP und ADP) oder Pyrimidine (UTP und UDP).

P2 Rezeptoren lassen sich, basierend auf ihrer molekularen Struktur und ihrem

Signaltransduktionsmechanismus in metabotrope G-Protein gekoppelte P2Y Rezeptoren und

ionotrope P2X Rezeptoren unterscheiden. P2Y Rezeptoren besitzen die GPCR-typischen 7

Transmembrandomänen, wobei das C-terminale Ende der Aminosäurekette intrazellulär und

das N-terminale Ende extrazellulär lokalisiert sind (North und Barnard, 1997). Mittlerweile

sind 8 verschiedene Subtypen bekannt, die sich in ihrer Ligandenspezifität und ihren

pharmakologischen Eigenschaften unterscheiden (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12,

P2Y13 und P2Y14). Die ionotropen P2X Rezeptoren repräsentieren ligandengesteuerte

Ionenkanäle (Abbracchio und Burnstock, 1994). Durch die Bindung von ATP an den

Rezeptor kommt es durch Konformationsänderungen zur Öffnung der Kanalpore. Der P2X

Ionenkanal ist permeabel für Na + , K + - und Ca 2+ -Ionen und somit zu einer schnellen

Signalübertragung und einer Erhöhung der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration fähig.

Die Familie der P2X Rezeptoren besteht aus sieben Subtypen (P2X1-7) (Ralevic und

Burnstock, 1998), wobei bis auf P2X6 alle P2X Rezeptorsubtypen Homooligomere bilden

können. Des Weiteren konnten auch heterooligomere Rezeptoren nachgewiesen werden, bei

denen es sich um P2X2/3, P2X1/5, P2X2/6 und P2X4/6 handelt. Die Rezeptoruntereinheiten

zeigen eine Aminosäuresequenzhomologie von 35% - 48% und ihre Größe liegt zwischen 384

– 595 Aminosäuren (North 2002). Die Struktur dieser Rezeptoren besteht aus zwei

Transmembrandomänen mit einer großen extrazelluären Schleife mit 10 konservierten

22


Einleitung

Cysteinresten, die Disulfidbrücken bilden. In der extrazelluären Schleife ist die ATP

Bindestelle lokalisiert (Fields und Burnstock, 2006).

P2 Rezeptoren werden in nahezu allen Geweben exprimiert und spielen eine wichtige Rolle in

der Neurotransmission (Burnstock, 1996), im zellulären Wachstum und in der

Zelldifferenzierung (Abbracchio, 1996). Außerdem wurde eine Rolle in der Steroidgenese in

Leydig-Zellen nachgewiesen (Foresta et al., 1996b). Foresta et al. konnten ebenfalls zeigen,

dass extrazelluläres ATP die Akrosomreaktion in menschlichen Spermien auslöst (Foresta et

al., 1992) und dass die Reaktion durch P2X Rezeptoren vermittelt wird (Foresta et al.,

1996b). Auch in den Testes (P2X1, P2X2, P2X3, P2X5 und P2X7) und in den Spermatogonien

(P2X2 und P2X3) von Ratten konnten P2X Rezeptoren durch Antikörperfärbungen

identifiziert werden (Glass et al., 2001). Die Funktion von P2X Rezeptoren in

Spermienvorläuferzellen ist bislang ungeklärt.

Abb. 1.9: Familie der P2 Rezeptoren A) Struktur von P2X Rezeptoren (M1 und M2 =

Transmembrandomänen, S-S = Disulfidbrücke). B) Struktur von P2Y Rezeptoren (modifiziert aus: Burnstock,

2007).

1.12 Ziel dieser Arbeit

Die vorliegende Arbeit untersucht verschiedene Aspekte chemosensorischer

Kommunikationsmechanismen in männlichen Säugetier-Keimzellen unterschiedlicher

Reifestadien. Im Fokus meines Interesses steht dabei einerseits die Funktion ektopisch in

reifen humanen Spermien exprimierter Riechrezeptorproteine, sowie andererseits die

elektrophysiologische Charakterisierung kultivierter Spermatogonien der Maus.

23


Einleitung

Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war die signifikante Erweiterung des molekularen rezeptiven

Feldes des humanen olfaktorischen Rezeptors OR1D2, um neue Informationen über die

Struktur der OR-Ligandenbindetasche zu erhalten. Dabei sollten Duftstoffe untersucht

werden, deren Aktivitätscharakteristika als Grundlage für molekulare Modelle der Rezeptor-

Liganden-Interaktion dienen können. Das erweiterte Ligandenprofil soll dabei Hinweise auf

die grundsätzliche Mechanistik der OR-Liganden-Wechselwirkung im Kontext

konkurrierender Modellvorstellungen (sterisches ‚lock-and-key‘ Modell versus

Vibrationstheorie) geben.

Eine weitere wichtige physiologische Fragestellung im Kontext der Funktion ektopisch

exprimierter Spermienrezeptoren betrifft die Identität natürlich vorkommender (endogener)

OR-Liganden. In der vorliegenden Arbeit sollen daher die Aktivitätsprofile von Vaginal- und

Follikelflüssigkeit an rekombinant exprimierten Spermienrezeptoren mit Hilfe bildgebender

Verfahren bestimmt und aktive Substanzfraktionen nach verschiedenen chemischen Kriterien

aufgearbeitet werden. Auf Basis dieser Struktur-Funktionsanalysen sollen potentielle

Liganden identifiziert werden, deren physiologische Funktion daraufhin Gegenstand

zukünftiger Experimente sein kann.

Ein paralleles Forschungsprojekt soll erstmals detaillierte Daten über die

elektrophysiologischen Eigenschaften von kultivierten Spermatogonien der Maus generieren.

Die Physiologie dieses für die Spermatogenese entscheidenden Zelltyps ist bislang nahezu

unbeschrieben. Daher soll im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Kokultursystem von

Spermatogonien und Sertoli-Zellen etabliert und für elektrophysiologische Ableitungen mit

Hilfe der Patch-clamp Technik genutzt werden. Dabei soll zunächst eine grundsätzliche

Charakterisierung von spannungsaktivierten Membranleitfähigkeiten durchgeführt und darauf

aufbauend, eine potentielle Funktion verschiedener Signalsubstanzen untersucht werden.

24


2. Material

2.1 Chemikalien und Enzyme

Acetylcholin Sigma

Agar Invitrogen

Agarose Invitrogen

Ampicillin Sigma

ATP Fermentas

BSA Sigma

Kalziumchlorid Riedel-de Haen

Collagenase Sigma

Concanavalin A ( ConA) Sigma

DMSO Fluka

dNTP`s Invitrogen

Ethidiumbromid Serva

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Merck

F-10 (HAM) Gibco BRL

FBS superior Biochrom

Forskolin Sigma

GABA Sigma

Glucose Applichem

Glycin Sigma

Go Taq DNA Polymerase Promega

HEPES Gibco BRL

IBMX Calbiochem

Isopropanol J. T. Baker

MgATP Sigma

NaGTP Sigma

Natriumchlorid Baker

Percoll Amersham Biosciences

Pluronic F-68 Gibco BRL

Taq-Polymerase Invitrogen

TRIzol Invitrogen

Material & Methoden

25


Trypsin/EDTA Gibco BRL

Tween-20 Solution Perkin Elmer

Material & Methoden

Die Bezugsquelle der hier nicht aufgeführten Chemikalien ist im Text vermerkt. Alle

Chemikalien wurden im höchsten Reinheitsgrad (p.A.) bezogen, sofern keine anderen

Angaben erfolgten.

2.1.1 Inhibitoren und Farbstoffe

2-APB Sigma

4-AP Sigma

Alexa Fluor Hydrazides Molecular probes

Capsazepine Sigma

DAPI Molecular probes

Fura-2 (AM) Molecular probes

Fluo-4 Molecular probes

Mibefradil TOCRIS

Nimodipine TOCRIS

Omega-Agatoxin IVa Biotrend

omega-Conotoxin GVIA Biotrend

omega-Conotoxin MVIIC TOCRIS

Suramin Sigma

TEA-Cl Sigma

TNP ATP Biotrend

2.1.2 Antikörper

Alexa fluor 488 goat anti rabbit Invitrogen

Alexa fluor 532 goat anti rabbit Invitrogen

Alexa fluor 633 goat anti rabbit Invitrogen

Anti CaV3.2 (host rabbit) Alomone Labs

DAZL Santa Cruz Biotechnology

26


2.2 Verbrauchsmaterialien und Kits

Material & Methoden

Borosilikat Glaspipetten Science Products

Kulturschalen und -flaschen Nunc GmbH, Falcon, Sarstedt

Micro Spin S200HR-Säulen Amersham Biosciences

Neubauer Zählkammer Brand

Pipettenspitzen Sarstedt

Plastikröhrchen (steril, 15ml und 50ml) Greiner, Falcon

Reaktionsgefäße: 1,5 ml und 0,5 ml Sarstedt

Sterilfilter Sarstedt

Wizard SV Gel and PCR Clean-up System Promega

Pure Yield Plasmid Maxiprep Promega

QIAGEN Plasmid Kit Qiagen

QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen

QIAquick PCR Purification Kit Qiagen

2.2.1 Geräte

Bakterienbrutschrank Heareus

Bakterienschüttler Certomat R

CCD Kamera Imago

Gefrierschrank (-30°C) AEG

Konfokales Mikroskop Zeiss (LSM 510 Meta)

Laser: Argon (458, 488, 514 nm),

HeNe (543, 633 nm), MaiTai

(Spectra Physics)

Kühlschrank Privileg

Laborzentrifuge Minifuge RF, Heareus

Mikroforge MF-830 Narishige

Mikromanipulator Eppendorf Typ 5170

Mikroskop Zeiss Axiovert 135 TV

pH-Meter Mettler Toledo Typ 1120

Photometer Thermo Electron Corp. Heλios γ

27


Material & Methoden

Pipetten Pipetman, Gilson

Eppendorf Research

Polychrome II Photonics

Puller PC-10 Narishige

Thermocycler MiniCycler, MJ Research

Tischzentrifuge Eppendorf 5457 C

Ultrazentrifuge Sorvall RC5-B Plus

Vakuum Zentrifuge DNA Speed Vac, DNA 110,Savant

Vortex Snijders

Wasserbad Memmert

XE-Lampe USHIO Typ UXL-75XO

Zellkultur Inkubator Heareus

2.2.2 Software

Folgende Software wurde verwendet:

CorelDraw X3 Graphics Suite

FitMaster, Heka Elektronik

Igor Pro 6.0.3, Wavemetrics

LSM 510 Meta, Zeiss

PatchMaster, Heka Elektronik

SigmaPlot, Systat Software Inc

TILLvisION, TILL Photonics

2.3 Zellen und Gewebe

HEK293 (Human Embryonal Kidney Cells)

Testes (Human, Maus)

Sertoli/Spermatogonien Kokultur (Maus)

28


2.4 Lösungen und Medien

Agar-Platten 15g/l Agar in LB-Medium

autoklaviert 15 min, 121°C

Ampicillin-Stammlösung 100 mg/ml in H2O

BSA-Stammlösung 1mg/ml BSA in H2O

dNTP-Mix 10 mM dATP

10 mM dCTP

10 mM dGTP

10 mM dTTP

Ethidiumbromid-Stammlösung 10 mg/ml in H2O

HBS (2x) 300 mM NaCl

50 mM HEPES

3 mM Na2HPO4

HEK293-Medium 500 ml DMEM (Invitrogen)

50 ml FBS (10%)

5 ml MEM

5 ml Pen / Strep-Lösung

isotonische Percoll Lösung 9 Teile Percoll

1 Teil 1,5 M NaCl

LB-Medium (pH 7,4) 10 g/l Trypton

10 g/l NaCl

5,0 g/l Hefeextrakt

autoklaviert

Material & Methoden

29


Lyse-Puffer 10 mM Tris-HCl; pH 7,9

1 mM EDTA

15 % Sucrose

2 mg/ml Lysozym

MEM-Medium 500 ml MEM

Earle’s

L-Glutamin

PBS- - (pH 7,2) 2,7 mM KCl

1,5 mM KH2PO4

137 mM NaCl

8,1 mM Na2HPO4

PBS ++ (pH 7,3-7,5) 2,7 mM KCl

1,5 mM KH2PO4

137 mM NaCl

8,1 mM Na2HPO4

0,9 mM CaCl2

0,48 mM MgCl2

Percoll Lösung 55% 5,5 ml isot. Percoll

4,5 ml HAM

Percoll Lösung 80% 8 ml isot. Percoll

2 ml F-10 (HAM)

Material & Methoden

Pen/Strep-Lösung (Invitrogen) 10.000 U Penicillin/ml physiol.

NaCl-Lösung

PCR-Puffer (10x) 100 mM Tris-HCl, pH 8,8

500 mM KCl

0,8 % Nonidet P40

30


Puffer P1 (Resuspendierungspuffer) 50 mM Tris-Cl, pH 8,0

10 mM EDTA

100 µg/ml RNase A

Puffer P2 (Lysepuffer) 200 mM NaOH

1 % SDS

Puffer P3 (Neutralisierungspuffer) 3,0 M Kaliumacetat, pH 5,5

Puffer QBT (Äquilibrierungspuffer) 750 mM NaCl

50 mM MOPS, pH 7,0

15 % Isopropanol

0,15 % Triton X-100

Puffer QC (Waschpuffer) 1 M NaCl

50 mM MOPS, pH 7,0

15 % Isopropanol

Puffer QF (Elutionspuffer) 1, 25 M NaCl

50 mM Tris-HCl, pH 8,5

15 % Isopropanol

Ringer-Lösung, pH 7,4 140 mM NaCl

5 mM KCl

10 mM Glucose

2 mM MgCl2

1 mM CaCl2

10 mM HEPES

Material & Methoden

Sertolizell-Spermatogonien-Medium 500 ml DMEM

10% FBS

5 ml Pen/Strep

5 ml MEM Amino Acid Solution (Gibco

BRL)

0,01% Nucleosine Solution (Sigma)

31


Material & Methoden

10 ng/ml EGF (Sigma)

0,1 mg/ml Growth Hormone Releasing

Factor (Sigma)

5 µM Retinol (Sigma)

5 µg/ml Insulin (Sigma)

5 µg/ml Transferrin (Sigma)

100 nM Testosterone (Sigma)

10 ng/ml Insulin-like Growth Factor

(Sigma)

Stimulation Puffer (pH 7,4) 5 mM HEPES

1x Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS)

0,5 mM IBMX

0,1% (w/v) BSA

TE 10 mM Tris-HCl, pH 8,0

1 mM EDTA

Trypsin-EDTA (Gibco) 0,05% Trypsin

0,53 mM EDTA

1X Control Puffer 5 mM HEPES

0,4x HBSS

0,18% (v/v) Tween 20

0,1% (w/v) BSA

- Lösungen für die Elektrophysiologie -

Pipettenlösung 1 (Intra 1) 143 mM KCl

pH = 7,1 (eingestellt mit NaOH) 10 mM HEPES

Osmolarität = 290 mOsm 1 mM EGTA

(eingestellt mit Glukose) 2 mM KOH

1 mM MgATP

0,5 mM Na2GTP

32


Pipettenlösung 2 (Intra 2) 110mM CsCl

pH = 7,1 (eingestellt mit CsOH) 20 mM TEA-Cl

Osmolarität = 290 mOsm 2 mM MgCl2

(eingestellt mit Glukose) 0.3 mM CaCl2

1 mM EGTA

10 mM HEPES

2 mM MgATP

1 mM Na2GTP

Badlösung 1 (Extra 1) 140 mM NaCl

pH = 7,3 (eingestellt mit NaOH) 5 mM KCl

Osmolarität = 300 mOsm 10 mM Glukose

(eingestellt mit Glukose) 2 mM MgCl2

1 mM CaCl2

10 mM HEPES

Badlösung 2 (Extra 2) 110 mM NaCl

pH = 7,4 (eingestellt mit NaOH) 5 mM CsCl

Osmolarität = 300 mOsm 15 mM TEA-Cl

(eingestellt mit Glukose) 10 mM BaCl2

1 mM MgCl2

10 mM HEPES

Badlösung 3 (Extra 3) 110 mM NaCl

pH = 7,4 (eingestellt mit NaOH) 5 mM CsCl

Osmolarität = 300 mOsm 15 mM TEA-Cl

(eingestellt mit Glukose) 10 mM CaCl2

1 mM MgCl2

10 mM HEPES

Material & Methoden

33


Standard TEA Extra 130 mM NaCl

pH = 7,3 (eingestellt mit NaOH) 15 mM TEACl

Osmolarität = 300 mOsm 1 mM MgCl2

(eingestellt mit Glukose) 1 mM EGTA

10 mM HEPES

0,8 mM CaCl2

Standard 4-AP Extra 135 mM NaCl

pH = 7,3 (eingestellt mit NaOH) 10 mM 4-AP

Osmolarität = 300 mOsm 1 mM MgCl2

(eingestellt mit Glukose) 1 mM EGTA

10 mM HEPES

0,8 mM CaCl2

Standard Cs + Extra 140 mM NaCl

pH = 7,3 (eingestellt mit NaOH) 5 mM CsCl

Osmolarität = 300 mOsm 1 mM MgCl2

(eingestellt mit Glukose) 1 mM CaCl2

10 mM HEPES

ECl + 20mV Cs + Extra 50 mM NaCl

pH = 7,3 (eingestellt mit NaOH) 5 mM CsCl

Osmolarität = 300 mOsm 1 mM CaCl2

(eingestellt mit Glukose) 1 mM MgCl2

10 mM HEPES

90 mM MeSO4

90 mM NaOH

ECl + 20mV TEA Extra 50 mM NaCl

pH = 7,3 (eingestellt mit NaOH) 5 mM TEACl

Osmol = 300 mOsm 1 mM CaCl2

(eingestellt mit Glukose) 1 mM MgCl2

10 mM HEPES

Material & Methoden

34


90 mM MeSO4

90 mM NaOH

Extra NMDG + only 140 mM HCl

pH = 7,3 (eingestellt mit NMDG/HCl) 145 mM NMDG

Osmolarität = 300 mOsm 12 mM Glucose

(eingestellt mit Glukose) 10 mM HEPES

1 mM EGTA

low Ca 2+ - Extra 135 mM NaCl

pH = 7,3 (eingestellt mit NaOH) 5 mM EGTA

Osmolarität = 300 mOsm 4 mM CaCl2

(eingestellt mit Glukose) 5 mM KCl

10 mM NaOH

1 mM MgCl2

10 mM HEPES

Na + free Extra 140 mM HCl

pH = 7,3 (eingestellt mit NMDG/HCl) 140 mM NMDG

Osmolarität = 300 mOsm 10 mM HEPES

(eingestellt mit Glukose) 5 mM KCl

1 mM CaCl2

1 mM MgCl2

Na + free Extra 2 131 mM HCl

pH = 7,3 (eingestellt mit NMDG/HCl) 131 mM NMDG

Osmolarität = 300 mOsm 10 mM HEPES

(eingestellt mit Glukose) 5 mM KCl

10 mM CaCl2

1 mM MgCl2

Material & Methoden

35


2.5 Bakterienstämme

Material & Methoden

Der Bakterienstamm E. coli XL1-Blue (Genotyp: recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17,

supE44, relA1, lac. ,F‘[proAB, lacIqZM15, Tn10, (Tetr)]), stammt aus der Sammlung des

Lehrstuhls für Zellphysiologie der Ruhr-Universität.

2.6 Oligonukleotide

OR-Rezeptoren

Primer Sequenz

HTPCR 16 up 5’- TCA ATC CTG ACT GTC CAA GGA AAA TGA TTG-3’

HTPCR 16 down 5’- AAA GAC TTT CCT CCA TTT TTC ATG TGG-3’

HT-2 up 5’- TCC ACC ATG GCC TAT TTT CCA ATT CTC-3’

HT-2 down 5’- AGG CCT AGG TGT TAA ATT TTG CTG CC-3’

HGMP07J up 5’- TCC ACC ATG GTT TTA TGT TTC AGA TTT GGG-3’

HGMP07J down 5’- ATG TTG ACA GCC TCA GGA GAA CTC TTC-3’

HGMP07I up 5’- TCC ACC ATG ATG GGA CAA AAT CAA ACC AGL-3’

HGMP07I down 5’- ACT GGA TAA ACT ATG TAA TAG CTC CAA GTG-3’

HGMP07E up 5’- TCC ACC ATG GAT GGA GGC AAC CAG AGT GAA GG-3’

HGMP07E down 5’- ATA GTC TCC ACT TTA ATG CTG TCT TTC C-3’

HTPCR 86 up 5’- TCC ACC ATG GAA CCA GGA AAT GAT ACA CAA ATT TC-3’

HTPCR 86 down 5’- ATG ACA GTT ACT ACC TCT GAA GCT TAG AGC-3’

17-40- CT up-nar 1 5’- GTC GGC GCC TAC AGC TTC AGA AAC CCT GAT GTG C-3’

17-40-Cla 1-3’ 5’- GCC ATC GAT AGC CAG TGA CCG CCT CCC TG-3’

17-209 3-Primer 5’-TAC ATC ACT GAT GCA ACT GTG TCC-3’

17-209 5-Primer 5’-GCA GAT GCC – GC TTT GTG TCC ACC-3’

17-210 3-Primer 5’-TAC ATC ACA GCC ATG ACA GTG TCC-3’

17-210 5-Primer 5’-TCT GAC CTC TGC TTT TCC TCG GTC-3’

ATP Rezeptoren (P2X)

Primer Sequenz

P2X1 Forward 5’- ATG CTA GCC TGC CCT TGA CC -3’

P2X1 Reverse 5’- CCT GGG GTC CCA GGC CCT GG -3’

P2X2 Forward 5’- ATG GCC GCT GCA CAG CCC CG -3’

P2X2 Reverse 5’- CTG GTG ATG ATG CTG ACT AC -3’

P2X3 Forward 5’- ATG AGC TAA CTC AAG AGT GG -3’

P2X3 Reverse 5’- GGG GCT TGA GGA AAA GAG CC -3’

P2X4 Forward 5’- ATG GCA GGC TGC TGC TCC G -3’

P2X4 Reverse 5’- CCT GCG TCT GGT TCA CGG TG -3’

P2X5 Forward 5’- ATG GGC CAG GCG GCC TGG AA -3’

P2X5 Reverse 5’- CCT GCC GCT GGT TAG GAG TC -3’

P2X6 Forward 5’- ATG CAG TTG CAG CCA GCA GG -3’

P2X6 Reverse 5’- GAA CAC GTT CTC TCC CTG TG -3’

P2X7 Forward 5’- ATG CCG GCT TGC TGC AGC TG -3’

P2X7 Reverse 5’- CAT GAC AAA GAA TGA GTT CC -3’

36


Ca 2+ -Kanäle

Material & Methoden

Primer Sequenz

P/Q-Type Forward 5’- ATG TCC CGA GCG CGC TCC C -3’

P/Q-Type Reverse 5’- CCT GAG CCT CCT CCG CCT GC -3’

N-Type Forward 5’- ATG GTC CGC TTC GGG GAC GA -3’

N-Type Reverse 5’- CAG TTG GCG ATG ATG GTG GC -3’

L-Type Forward 5’- ATG ATT GGG CCT TTG TTC A -3’

L-Type Reverse 5’- CTG ACG GTA GAG ATG GTT GC -3’

L-Type Forward 5’- ATG AAC CTT CCG ACA TTT TC -3’

L-Type Reverse 5’- CTT TGG GAG AGA GAT CCT AC -3’

R-Type Forward 5’- ATG GCT CGC TTC GGG GAG GC -3’

R-Type Reverse 5’- AGA CGA TGC AGT TGG CAA TG -3’

L-Type Forward 5’- ATG TCG GAA TCT GAA GTC GG -3’

L-Type Reverse 5’- CAG TTG GCA AAG ATT GTC AG -3’

T-Type Forward 5’- ATG ACC GAG GGC ACG CTG GC -3’

T-Type Reverse 5’- CCA GCA TGC TAA TGT GCT CG -3’

L-Type Forward 5’- ATG GAG CCG CCC TCA CCC CA -3’

L-Type Reverse 5’- GGA AGC CGT AGG CTA TGA TC -3’

2.7 Plasmide

pcDNA3 (Invitrogen)

Dieser Vektor besitzt eine Größe von 5,4 kB

und leitet sich von dem Plasmid pRCCMV ab.

Die Genexpression wird von der CMV major

immediate early Enhancer/Promotor-Region

reguliert, außerdem enthält er das

Polyadenylierungssignal des bovinen

Wachstumshormons (BGH), ein Neomycin-

Resistenzgen, ein Ampicillin-Resistenzgen

sowie die T7- und Sp6-Promotoren.

37


2.8 Verwendete Duftstoffe

Bourgeonal, Quest

Lilial

Sila-Bourgeonal, Givandan

Sila-Lilial, Givandan

Vertomugal/ Myrac, Symrise/Henkel

PI23472

Lyral

Si

Si

OH

Material & Methoden

O

O

O

38


2832

4565

6739

6839

7780

7800

11539

Material & Methoden

O

O

O

O

O

39


14610

22083

22650

23827

24576

24801

24854

Material & Methoden

O

40


2.8.1 Antagonisten

Undekanal, Fluka

2.8.2 Duftstoffe aus Vaginal,- und Follikelflüssigkeit

Phenylessigsäure, Sigma-Aldrich

ß-Ionon, Fluka

Alpha-Ionon, Symrise

ß-Damascenon, Symrise

Sotolon, Sigma-Aldrich

Material & Methoden

41


3. Methoden

- Zellkultur -

Furaneol, Fluka

Buttersäure, Sigma-Aldrich

1-Octen-3one, Sigma-Aldrich

5-Alpha-Androst-16-en-3-one,

Sigma-Aldrich

3.1 Kultivierung der HEK293-Zelllinie

Material & Methoden

Die HEK 293 Zelllinie stammt von primären, menschlichen, embryonalen Nierentumorzellen

(Human Embryonal Kidney Cells) ab, die durch den DNA-haltigen Adenovirus Typ 5 (Ad 5)

transformiert wurde (Graham et al., 1977). Die Kultivierung der HEK 293 Zellen erfolgte in

T75 - Zellkulturflaschen (Nunc) mit 15 ml D-MEM Medium bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit

und 5 % CO2. Das Medium wurde mit 50 ml (10 % (v / v)) FBS superior, 5 ml (1 %) MEM

nichtessentieller Aminosäure-Lösung, sowie 5 ml (1 U/µg) Pen / Strep supplementiert.

Die Zellen wurden alle vier bis fünf Tage (ca. 80 % Konfluenz) im Verhältnis 1:10

subkultiviert, indem sie mit 0,05 % Trypsin und 0,5 mM EDTA in PBS abgelöst, bei 800 g

sedimentiert und in 10 ml frischem DMEM + Zusatzstoffe resuspendiert wurden. Die für die

42


Material & Methoden

Experimente benötigten Kulturschalen (Sarstedt Ø 35mm) wurden mit einer Zelldichte von

2,5 x 10 4 Zellen/ ml ausgesät.

Abb. 3.1: HEK 293 Zellen im Durchlicht (Phasenkontrast, 20fache Vergrösserung).

3.1.1 Auftauen von HEK 293 Zellen

Zelllinien werden für eine Langzeitlagerung in Kryoröhrchen bei -196 °C in flüssigem

Stickstoff aufbewahrt. Aufgrund der toxischen Wirkung des Gefrierschutzmittels DMSO bei

RT, wurden die Zellen rasch im 37 °C Wasserbad aufgetaut und in einem sterilen

Zentrifugenröhrchen mit 20 ml vorgewärmten Kulturmedium verdünnt. Es folgte eine 5

minütige Zentrifugation bei 1000 rpm. Das entstandene Pellet aufgetauter HEK 293 Zellen

wurde in 10 ml Kulturmedium resuspendiert und in einer T75-Zellkulturflasche (Nunc)

ausgesät. Nach 3-tägiger Kultivierung konnten die HEK293 Zellen expandiert werden.

3.1.2 Transiente Transfektion

Die HEK 293 Zellen wurden 2 Tage vor der Transfektion mit einer Zelldichte von 2,5 x 10 4 /

ml in 35 mm Sarstedt-Schälchen ausgesät. Nach zwei Tagen entsprach der Zellrasen einer 50-

60 %-igen Konfluenz und konnte transfiziert werden.

Die Transfektion erfolgte nach der Kalzium-Phosphat-Methode (Gorman et al., 1990). Die zu

übertragene DNA bindet sich an ausgefallenes Kalziumphosphat, das durch Vermischung von

Kalziumchlorid und Natriumphosphat entsteht. Diese Präzipitate werden von den Zellen

durch Endozytose aufgenommen.

43


Material & Methoden

Der 1 ml Transfektionsansatz (für 5 Kulturschalen) enthielt 410 µl H2O versetzt mit 40 µl der

jeweiligen Plasmid DNA (1 µg/µl), sowie 50 µl einer 2,5 M CaCl2 Lösung. Tropfenweise

wurde 500 µl 2 x HBS hinzugegeben und durch 5 Luftblasen, die mit Hilfe einer 1000 µl

Pipette gebildet wurden, vorsichtig gemischt. Nach einer 15 minütigen Inkubation bei RT

wurde der Ansatz in das Medium der Kulturschale geträufelt und die Zellen in den CO2-

Inkubator zurückgestellt. Ungefähr 24 h später (Übernacht-Transfektion) wurde das Präzipitat

durch einen Mediumwechsel entfernt und die Zellen abermals für 24 h in DMEM Medium bei

37 °C und 5 % CO2 inkubiert.

Tabelle1: Transfektionsansatz für die Transfektion von HEK 293 Zellen

Substanz /

Konzentration

H20

DNA

(1 µg/µl)

CaCl2

(2,5 M)

2x HBS

Volumen (µl) 410 40 50 500

3.2 Sertoli-Spermatogonien Kokultur

Zur Herstellung der Sertoli-Spermatogonien Kokultur wurden beide Hoden männlicher

C57/Bl6 Mäuse direkt nach Dekapitierung am postnatalen Tag 7 präpariert (s. Abb….) und in

2 ml MEM Medium gesammelt. Nach Entfernung der Tunica albuginea wurden die Tubuli

seminiferi in 1 ml MEM gesammelt, vorsichtig mit einer Pinzette auseinandergezupft und in

ein 15 ml Plastikröhrchen mit 1 ml Collagenase (2 mg/ml in PBS -- ) überführt und für 5 min

bei 37 °C im Wasserbad verdaut. Um den Verdau zu stoppen, wurden 3 ml

Spermatogonienmedium zu den Zellen hinzugegeben. Danach wurde die Zellsuspension für 8

min bei 390 g abzentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes wurde das Zellpellet

vorsichtig in 2 ml Trypsin/EDTA resuspendiert und erneut für 5 min verdaut. Zum Abstoppen

wurden wiederum 3 ml Spermatogonienmedium zu den Zellen hinzugegeben und diese

wurden ein weiteres Mal für 10 min bei 390 g abzentrifugiert.

Das Zellpellet wurde dann in 8 ml Spermatogonienmedium (für 8 Schälchen) resuspendiert

und in Falcon Schälchen auf einem Glasdeckgläschen ausgesät. Die Kultivierung der Zellen

erfolgte die ersten 3 Tage im Brutschrank bei 37 °C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit und die

darauf folgende Zeit bei 35 °C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit. Am ersten Tag in Kultur

wurde 1 ml Medium hinzugegeben und an jedem weiteren Tag wurde die Hälfte des Mediums

entfernt und durch frisches ersetzt.

44


Material & Methoden

Abb. 3.2 A: Lage der Hoden im Körper Abb. 3.2 B: Präparierter linker Hoden, Abb. 3.2 C: Präparierter

rechter Hoden.

3.3 Transformation von Bakterien

Zur Transformation wurden 30 µl kompetente Bakterien (XL1 Blue) mit 1 µl rekombinanter

Plasmid-DNA vermischt und 15 min auf Eis inkubiert. Nach anschließendem Hitzeschock (90

s, 42 °C) wurde der Ansatz auf LB-Agarplatten, die zur Selektion auf rekombinante Bakterien

entsprechende Antibiotika enthielten, ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

3.3.1 Anzucht von Bakterien

Die Anzucht einer Bakterienkultur erfolgte in 200 ml LB-Medium mit der entsprechenden

Antibiotikaresistenz (100 mg/ml Ampicillin).

Dazu wurde eine Kolonie in das oben genannte Medium überimpft und bei 37 °C und 250

rpm über Nacht im Warmluftschüttler bebrütet.

3.3.2 Plasmidaufreinigung im präparativen Maßstab („Maxiprep“)

Zur Isolation von hochreiner Plasmid-DNA im präparativen Maßstab wurde das Plasmid-

Isolations-Kit der Firma Qiagen verwendet (Qiagen Plamid Maxi Kit). Die Lyse der Bakterien

erfolgt durch alkalischen Aufschluss (Birnboim und Doly, 1979) und die Reinigung der

Plasmid-DNA über Anionenaustauscher, die die spezifische DNA binden.

Durch Waschschritte bei mittlerer Salzkonzentration wurden RNA, Proteine, Farbstoffe und

niedermolekulare Verunreinigungen entfernt. Anschließend konnte die Plasmid-DNA mit

A.dest eluiert werden.

Es wurden je nach zu isolierender Plasmidmenge entsprechende Volumina Bakterienkultur

herangezogen, die dann gemäß den Herstellerangaben aufgearbeitet wurden.

45


- DNA Fällung -

Material & Methoden

Die anschließende Natriumacetat-Fällung dient der gleichzeitigen Konzentration und

Entsalzung der DNA.

Dazu wurde die gelöste DNA mit 1/10 Vol. Natriumacetat und 21/2 fachen Volumen 100 %

Ethanol vermischt und für 20 min auf Eis inkubiert. Nach einer 10 minütigen Zentrifugation

mit 14000 rpm bei Raumtemperatur (RT) wurde der Überstand verworfen und das DNA

Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen. Der Ansatz wurde kurz geschwenkt und nochmals für 5

min bei 14000 rpm (RT) zentrifugiert. Vorsichtig wurde der komplette Überstand

abgenommen, um das Pellet gründlich trocknen zu lassen. Anschließend wurde das Pellet in

einer entsprechenden Menge A. dest aufgenommen.

- Quantifizierung der DNA und RNA -

Die Bestimmung der DNA und RNA Konzentration erfolgte durch photometrische

Messungen (Sambrook et al., 1989). Mit der gemessenen Extinktion (optische Dichte, OD)

bei einer Wellenlänge von 260 nm wurde der Gehalt mittels folgender Formel berechnet:

DNA-Konzentration [µg / µl] = OD260 x Verdünnungsfaktor x 0,05

RNA-Konzentration [µg / µl] = OD260 x Verdünnungsfaktor x 0,04

3.4 Isolierung und Aufarbeitung von Gesamt – RNA

Zur Minimierung von Kontaminationen durch Ribonukleasen und der damit verbundenen

Gefahr der Degradation der RNA wurden alle Geräte mit 3 % H2O2 gereinigt und

ausschließlich RNase freie Lösungen verwendet. Ferner wurden Handschuhe getragen, um die

Übertragung der RNasen von der Haut auf die Probe zu vermeiden.

Die Isolierung von Gesamt-RNA aus menschlichem Testesgewebe erfolgte nach der TRIzol

Methode (Total RNA Isolation Reagent), die eine Modifizierung der von Chomczynski u.

Sacchi (1987) entwickelten Methode darstellt.

TRIzol ist eine monophasische Lösung aus Phenol und Guanidinisothiocyanat, die während

der Homogenisierung von Gewebe die Zellen und ihre Bestandteile zerstört, während die

RNA nicht beeinträchtigt wird.

46


Material & Methoden

Die Trennung von RNA und DNA basiert auf den unterschiedlichen Löslichkeitsverhalten

beider Nukleinsäuren in organischen Lösungsmitteln bei saurem pH-Wert. Durch eine

Phasentrennung unter Chloroform Einfluss befindet sich die RNA in der oberen wässrigen

Phase und die DNA in der unteren Phenol – Chloroform – Phase.

In der Regel wurden 100 mg tiefgefrorenes Gewebe in 1 ml TRIzol mit Hilfe eines Douncers

homogenisiert und anschließend zur kompletten Dissoziation von Nukleoproteinkomplexen

5 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 200 μl Chloroform wurde die Probe für 15 s kräftig

geschüttelt, 2 – 3 min bei RT inkubiert und zur Phasentrennung 15 min in einer

Tischzentrifuge (Eppendorf) bei 13.000 rpm zentrifugiert. Die dabei entstandene RNA-haltige

wässrige Phase wurde vorsichtig abpippetiert und in ein neues RNase freies Reaktionsgefäß

überführt. Zur Fällung der RNA wurden 500 μl Isopropanol zugegeben und gemischt. Nach

10 minütiger Inkubation bei RT wurde die RNA durch Zentrifugation (10 min, 13.000 rpm)

pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das RNA Pellet mit 1 ml 70 % Ethanol (v/v)

zur Entfernung von Salzen gewaschen und erneut zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde

getrocknet und in 100 μl RNase freiem Wasser bei 60 °C für 10 min gelöst. Die

Konzentration der RNA Lösung wurde photometrisch durch Messung der OD260 bestimmt.

Die Lagerung der RNA Lösung erfolgte bei – 70 °C.

3.4.1 Isolierung von RNA

Neben der Aufreinigung mit TRIzol wurde noch eine weitere Methode zur Aufreinigung von

Ribonukleinsäuren verwendet, dazu wurde das RNeasy Mini Kit von Qiagen benutzt. Das

RNeasy Verfahren kombiniert die selektiven Bindungseigenschaften einer Silicagel-Membran

mit der Mikrozentrifugationstechnik. Ein spezielles Hochsalz-Puffersystem ermöglicht die

Bindung von bis zu 100 µg RNA an die RNeasy Silicagel-Membran.

Das Ausgangsmaterial wurde zunächst mit RNase freiem Wasser auf ein Volumen von 100 µl

eingestellt und dann in 350 µl denaturierenden Puffer, der Guanidinisothiocyanat enthält,

lysiert und homogenisiert, wodurch RNasen sofort inaktiviert werden.

Durch Zugabe von 250 µl 96 – 100 % Ethanol wurden optimale Bindungsbedingungen

hergestellt und die Probe dann auf eine RNeasy Mini - Säule aufgetragen.

Die Flüssigkeit wurde durch Zentrifugation (10.000 rpm, 15 s) der Säule in einer

Tischzentrifuge von der RNA getrennt, eluiert und verworfen.

Die Gesamt-RNA bindet an die Membran, während die übrigen Substanzen effizient durch

den RPE Puffer ausgewaschen und somit abgetrennt werden. Die qualitativ hochwertige RNA

47


Material & Methoden

wurde dann mit mindestens 30 µl RNase-freiem Wasser während einer 1 minütigen

Zentrifugation bei 10.000 rpm eluiert. Die Lösung wurde in einem RNase freiem 1,5 ml

Collection – Tube (Qiagen) aufgefangen und bei – 70 °C gelagert.

3.4.2 DNase Verdau

Zur Herstellung von cDNA wurde DNA -freie RNA benötigt. Dazu wurden die RNA Proben

mit DNase I verdaut. Pro 20 µl RNA wurden 1 µl DNase (1 U/µl) verwendet

und in einem Puffer mit mittlerer Salzkonzentration für 60 min bei 37 °C inkubiert.

3.5 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die Polymerase-Ketten-Reaktion stellt eine hochsensitive Methode dar, um einen kurzen

genau definierten Teil eines DNA-Strangs zu vervielfältigen (Mullis und Faloona, 1987). Die

PCR kann deshalb sowohl analytisch zum Nachweis von Sequenzen als auch präparativ zur

Synthese von DNA Fragmenten definierter Länge genutzt werden.

Der PCR Prozess besteht aus einer Serie von Zyklen, jeder Zyklus besteht aus drei

temperaturabhängigen Schritten.

Tabelle 2: Standardprotokoll für eine PCR

Schritt Temperatur Zeit

Denaturierung 94 °C 5 min

Annealing 55 °- 65 °C 1 min

Elongation 72 °C 1 min

Auffüllen 72 °C 10 min

Abkühlung 4 °C bis zur Entnahme der Probe

Zunächst wurde die Matrizen DNA auf 94 °C erhitzt, um die Stränge zu trennen

(Denaturierung). Dabei werden die Wasserstoffbrückenbindungen, die die beiden DNA

Stränge zusammenhalten, aufgebrochen.

Anschließend erfolgte durch die Erniedrigung der Temperatur, bei ca. 55 °C die Anlagerung

der Primer an die DNA Stränge (Annealing), wobei der eine Primer an den Sense-, und der

andere an den Antisense-Strang der Template DNA bindet. Die Annealingtemperatur richtet

sich nach der Schmelztemperatur der verwendeten Oligonukleotide, und lässt sich

näherungsweise mit folgender Formel berechnen:

48


TM = 2 °C · (A + T) + 4 °C · (G + C)

Material & Methoden

Im letzten Schritt kommt es bei einer Temperatur von 72 °C zu einer Verlängerung

(Elongation), bei dem die DNA-Polymerase die fehlenden Stränge mit Nukleotiden auffüllt.

In sich wiederholenden Zyklen (Denaturierung, Annealing, Elongation) wird so das DNA-

Fragment amplifiziert.

Auch die neu synthetisierten DNA Moleküle dienen wieder als Matrize für den nächsten

Amplifikationszyklus, daher ist die PCR eine Methode um DNA exponentiell zu

amplifizieren. Die Dauer der Synthese ist abhängig von der Länge des amplifizierenden

Produktes, wobei die DNA-Polymerasen etwa 1000 Nt/min verknüpfen.

Für die DNA- Synthese wurden die thermostabilen Taq- und Pfu- DNA-Polymerasen in

einem Mischungsverhältnis 1: 20 U verwendet, da letztere den Vorteil einer

Korrekturlesefunktion bot. Die Polymerase-Ketten-Reaktionen wurden in automatischen

Thermozyklern (MiniCycler, MJ Research) durchgeführt. Die Enzymzugabe erfolgte nach

einem hot start bei einer Temperatur von 80 °C. Nach Beendigung der Reaktion wurde der

Thermocycler bis zur Entnahme der Proben auf 4 °C gekühlt.

Alle Reagenzien wurden auf Eis vermischt und anschließend in den Thermocycler überführt.

(Reaktionsansatz s. Tabelle)

Zur Analyse wurde 1/10 des PCR-Ansatzes mit Probenpuffer versetzt und in einem

analytischen Agarosegel aufgetrennt. Zu jeder PCR wurden Wasserkontrollen angesetzt, diese

enthielten alle Bestandteile der anderen PCR Ansätze mit Ausnahme der Template DNA.

Tabelle 3 : Zusammensetzung eines typischen PCR-Mix

Reagenz Menge

10 x PCR – Puffer 100 µl

MgCl2 (12,5 mM) 60 µl

dNTP – Mix (25 mM) 8 µl

H2O 832 µl

Gesamtvolumen 1 ml

Tabelle 4 : PCR-Ansatz

Reagenz Menge

PCR – Mix 50 µl

Primer 1 0,3 µl

Primer 2 0,3 µl

DNA 1 µl

49


3.6 Agarosegelelektrophorese

Material & Methoden

Die Agarosegelelektrophorese ist eine Methode, um DNA Stränge nach ihrer Größe

aufzutrennen. Dazu wird ein elektrisches Feld verwendet, um die negativ geladenen DNA

Moleküle durch das Gel zu ziehen, wobei sich ein kleineres DNA Molekül schneller durch

das Gel bewegt, als ein größeres. Um die Stränge der unbekannten DNA-Moleküle

bestimmen zu können, wurden Standard DNA Fragmente (Gibco) verwendet.

Die Agarosegelkonzentration wurde entsprechend der Größe der aufzutrennenden Fragmente

bestimmt, wenn nicht anders angegeben, wurden 1 % Gele verwendet.

Der gewünschte Anteil an Agarose wurde in 1 x TBE Puffer aufgekocht, mit Ethidiumbromid

(0,4 µg/ml) versetzt und in die Gelkammer gegossen, wobei ein Plexiglaskamm in das Gel

hineingesteckt wird, um die Probentaschen auszusparen. Nach Erstarren des Gels wird 1 x

TBE Puffer als Laufpuffer über das Gel gegossen und der Kamm entfernt. Die

aufzutrennenden Proben wurden mit 1/5 Volumen DNA Probenpuffer versetzt und

anschließend in die Geltaschen aufgetragen. Die DNA Fragmente wurden elektrophoretisch

mit einer konstanten Spannung von 5 V/cm getrennt. Das Gel wird dann unter einer UV

Lampe (312 nm) betrachtet, da das Ethidiumbromid, das sich in die DNA eingelagert hat, im

ultravioletten Licht fluoresziert und mit einer CCD Kamera fotografiert.

3.7 Immunzytochemie

Grundlage der Immunzytochemie oder Antikörperfärbung ist eine Antigen-Antikörper

Reaktion. Dabei erfolgt ein Nachweis von spezifischen Proteinen in Geweben, da es zu einer

Bindung zwischen einem Primärantikörper und dem entsprechendem zell- und

gewebespezifischen Antigen kommt. In einem zweiten Schritt wird ein Sekundärantikörper

aufgetragen. Dieser bindet spezifisch den Primärantikörper und ist entweder an einen

fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt oder löst eine Enzym-Substrat-Reaktion aus.

-Färbungen mit einem Antikörper-

Für den immunzytochemischen Nachweis von Proteinen in Sertoli Spermatogonien Kulturen

wurden diese zuerst kurz mit PBS -- gewaschen und dann in 4 % PFA (gelöst in PBS -- ) 45 min

bei RT fixiert. Nach zweimaligem Waschen mit einer Blocklösung (1 % BSA und 0,01 %

Triton in PBS -- ) wurden die Kulturen für 1 h mit derselben Blocklösung inkubiert, um

50


Material & Methoden

unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Nach Entfernung der Blocklösung wurde der

Primärantikörper aufgetragen (1:200 Verdünnung in Blocklösung, DAZL, oder Anti-Cav3.2)

und die Zellen für 1 h bei RT inkubiert. Danach wurde der Primärantikörper durch

dreimaliges Waschen (2 x 10 min, 1 x 20 min) mit Blocklösung entfernt, worauf die

Inkubation mit dem jeweils passenden Sekundärantikörper (1:200 Verdünnung, goat anti

rabbit 488, 532 oder 633) für 45 min bei RT erfolgte. Da ein Fluophor-gekoppelter

Sekundärantikörper verwendet wurde, geschah dies in Dunkelheit. Auch der

Sekundärantikörper wurde durch drei Waschschritte (2 x 10 min, 1 x 20 min) mit der

Blocklösung entfernt. Danach wurden 2 ml PBS -- auf die Zellen gegeben und die Kulturen

unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht.

Falls Zellkerne mit dem DNA Farbstoff DAPI (1:100) gefärbt wurden, erfolgte diese nach

dem letzten Waschschritt und zwar für 15 min bei RT, danach wurde erneut gewaschen.

Zur Kontrolle, ob eine unspezifische Färbung durch den Sekundärantikörper erfolgte, wurden

bei Kontrollkulturen anstelle des Primärantikörpers die Blocklösung aufgetragen und dann

mit dem Sekundärantikörper inkubiert. Die Fluoreszenzintensität wurde dann zwischen

Kontrollkulturen und den Kulturen mit der spezifischen Färbung verglichen.

-Doppelfärbungen mit Antikörpern aus dem gleichen Tier-

Doppelfärbungen mit Primärantikörpern, die in der gleichen Tierart (Kaninchen) gewonnen

wurden, wurden bis zur Inkubation mit den Primärantikörpern ebenso durchgeführt wie oben

beschrieben. Dann wurde allerdings der 1. Primärantikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert.

Am nächsten Tag erfolgte ebenfalls ein dreimaliges Waschen (2 x 10 min, 1 x 20 min) mit der

Blocklösung und die Inkubation mit dem passenden Sekundärantikörper. Zur Entfernung des

Sekundärantikörpers wurde viermal mit Blocklösung gewaschen (3 x 10 min, 1 x 30 min).

Danach wurden die Kulturen für 1 h in Blocklösung mit 2 % Kaninchen Serum (1:50

Verdünnung) bei RT inkubiert. Es folgte ein viermaliges Waschen mit der Blocklösung (3 x

10 min, 1 x 30 min). Nach dem Waschen wurden die Zellen für 1 h in Blocklösung mit

affiniPure Fab fragments gαr IgG (1:50 Verdünnung) inkubiert. Es folgten vier weitere

Waschschritte und die Inkubation des 2. Primärantikörpers über Nacht bei 4 °C. Reste des 2.

Primärantikörpers wurden mit vier Waschritten (3 x 10 min, 1 x 30 min) entfernt und danach

wurden die Zellen wiederum für 1 h bei RT mit dem 2. Sekundärantikörper inkubiert. In

51


Material & Methoden

einem letzten Schritt wurde der 2. Sekundärantikörper durch viermaliges Waschen (3 x 10

min, 1 x 30 min) entfernt und 2 ml PBS -- auf die Zellen gegeben.

3.8 Percoll®-Dichtegradientenzentrifugation ( Spermienaufbereitung )

Das Ziel der Spermienaufbereitung ist, eine möglichst konzentrierte und gereinigte

Spermiensuspension zu erhalten. Dazu dient die Percoll Dichtegradientenzentrifugation, die

von Pertoft und Laurent (1977) entwickelt wurde.

Percoll ist ein kolloidales Silikat mit einer Polyvinylpyrrolidon Beschichtung, die beim

zentrifugieren durch die kolloidalen Eigenschaften Dichtegradienten ausbildet, wobei sich die

motilen Spermien von anderen Ejakulatbestandteilen auf dem Boden des Gefäßes absetzen, da

sie schwerer sind, als die übrige Flüssigkeit. Der größte Teil immotiler Spermien befindet sich

nach der Zentrifugation in den oberen Percoll-Schichten.

Zur Spermienaufbereitung dienten zwei isotonische Percoll-Lösungen (80 % u. 55 %), die

zuerst auf 36 °C erwärmt wurden und dann übereinander pipettiert wurden. 15 ml

Plastikröhrchen wurden mit 3 ml 80 % Percoll-Lösung befüllt und dann mit 3 ml 55 %

Percoll-Lösung überschichtet, wobei die 55 % Lösung tropfenweise an der Gefäßwand

entlang auf die dichtere Phase pipettiert wurde.

Das Ejakulat wurde nach seiner Verflüssigung (30 min Inkubation bei 36 °C) langsam auf

diese Phasen gegeben. Der Ansatz wurde dann für 40 min bei 1400 rpm (RT) zentrifugiert.

Als nächstes folgte der Waschschritt, bei dem das restliche Percoll entfernt wurde, dabei

wurde der Überstand von dem Spermienpellet genommen und das Pellet in 10 ml

vorgewärmter Ringerlösung wieder aufgenommen. Es folgte eine weitere Zentrifugation für

15 min bei 1400 rpm (RT), der Überstand wurde wieder abgenommen und das Pellet in 2 ml

Ringerlösung aufgenommen.

52


3.9 Der Fluoreszenzfarbstoff fura-2

Material & Methoden

Ca 2+ -Ionen haben als Botenstoffe eine wichtige physiologische Funktion in der Zelle. Der

Farbstoff fura-2 wurde zur Bestimmung der freien, intrazellulären Ca 2+ -Konzentration in

tierischen und pflanzlichen Zellen entwickelt. Dieser Ca 2+ -sensitive und - selektive

Fluoreszenzindikator leitet sich strukturell von dem Ca 2+ -Chelator EGTA ab. Ein fura-2

Molekül chelatiert Ca 2+ an vier Carboxylgruppen.

Abb. 3.3: Strukturformel des fura-2-Moleküls (aus: Noninvasive techniques in cell biology, Wiley Liss,1990).

Die Carboxylgruppen bilden einen Hohlraum, in dem das positive geladene Ca 2+ -Ion

gebunden wird. Durch seine positive Ladung werden die freien p-Orbitalelektronen der

Stickstoffatome vom jeweiligen Benzolring weg, in Richtung des gebundenen Ions gelenkt.

Diese Veränderung in der Struktur führt zu einem veränderten Absorptionsverhalten des fura-

2 Moleküls. Der dynamische Bereich der fura-2 Ca 2+ -Affinitätskurve ist günstig für

physiologische Ca 2+ -Konzentrationsmessungen. Die Dissoziationskonstante (KD-Wert)

beträgt in physiologischer Lösung etwa 0.25 µM. Dies entspricht dem Bereich zellulärer Ca 2+ -

Signale (0.1-1 µM).

53


3.9.1 Fluoreszenzemmission von fura-2

Material & Methoden

Die Fluoreszenzintensivität von fura-2 ist von der Wellenlänge des Anregungslichts und der

Ca 2+ Konzentration abhängig. In Ca 2+ -freier Lösung wird ein Intensitätsmaximum bei einer

Anregung mit 365 nm gemessen. Dieses Maximum verschiebt sich in Gegenwart hoher Ca 2+ -

Konzentrationen auf 340 nm. Bei einer Anregung mit 360 nm ist die Fluoreszenz unabhängig

von der Ca 2+ -Konzentration (isosbestischer Punkt) (Abb.3.4). Meist wird die fura-2

Fluoreszenz durch Anregung sowohl mit 340 nm als auch mit 380 nm gemessen. Bei einer

Erhöhung der Ca 2+ -Konzentration ergeben sich gegenläufige Änderungen der

Fluoreszenzintensität. Bei einer Anregung mit 340 nm nimmt die Intensität der Fluoreszenz

zu, bei einer Anregung mit 380 nm nimmt sie ab. Die nahezu simultane Messung der

Fluoreszenzintensität mit zwei Anregungswellenlängen (340 nm und 380 nm) hat einen

weiteren Vorteil. Die gemessene Fluoreszenzintensität bei der jeweiligen

Anregungswellenlänge ist nicht nur abhängig von der Ca 2+ -Konzentration, sondern auch von

der Farbstoffkonzentration, der Zelldicke sowie den optischen Eigenschaften der

Messapparatur. Diese Faktoren werden sich bei direkt aufeinanderfolgenden Messungen

kaum verändern. Bildet man nun den Quotienten der Fluoreszenzintensitäten bei 340 nm

(F340) und 380 nm (F380), kürzen sich die konstant bleibenden Faktoren heraus und man erhält

eine Messgröße (F340/F380), die nur von der Ca 2+ -Konzentration abhängig ist.

Abb. 3.4: Anregungsspektrum von fura-2 für verschiedene Ca 2+ -Konzentrationen (aus: Noninvasive

techniques in cell biology, Wiley Liss, 1990).

54


3.9.2 Beladung von HEK 293 Zellen mit fura-2/AM

Material & Methoden

Zur Messung der intrazellulären Konzentration freier Ca 2+ -Ionen wurden Kulturen zwei Tage

nach der Transfektion verwendet. Die Beladung der Zellen erfolgte mit dem

Fluoreszenzfarbstoff fura-2/AM. Dabei handelt es sich um einen lipophilen,

membranpermeablen Acetoxymethylester. Der Farbstoff kann in dieser Form durch die

Membran in alle Zellkompartimente diffundieren. Im Zytosol werden dann die

Esterbindungen durch endogene, unspezifische Esterasen aufgespalten und somit der

membranundurchlässige Ca 2+ -sensitive fura-2 Farbstoff hydrolisiert.

Das Beladen der Zellen erfolgte durch eine 30 minütige Inkubation in 1 ml Ringer mit 3 µM

fura-2/AM unter Lichtausschluss. Bei längerer Inkubationszeit werden die Zellen mit dem

Farbstoff überladen. Diese Überladung ist zu vermeiden, da bei sehr hohen fura-2

Konzentrationen überproportional viele fura-2 Moleküle im Ca 2+ -freien Zustand vorliegen.

Überwiegt der Anteil der Ca 2+ -freien fura-2 Moleküle auch während einer Erhöhung der

intrazellulären Ca 2+ -Konzentration, so kann die resultierende Fluoreszenzänderung weniger

fura-2 Moleküle nicht detektiert werden.

Um das überschüssige Fura-2/AM zu entfernen, wurde die farbstoffhaltige Lösung nach der

Inkubationszeit durch 1 ml Ringerlösung ersetzt.

3.9.3 Spermienaufbereitung für Ca 2+ - Imaging-Experimente

Die Spermienaufbereitung erfolgte wie oben beschrieben. Nach der letzten Zentrifugation

wurde die OD bestimmt um die richtige Zellkonzentration für das Kalzium Imaging zu

erhalten, diese sollte bei einer Wellenlänge von 260 nm zwischen 0,035 und 0,04 nm liegen.

Zur Beladung der Spermien wurden in 1 ml Spermien-Ringerlösung 7,5 µl Fura (7,5 µM)

gegeben. Danach wurden jeweils 2 ml der beladenen Spermienringerlösung auf ein mit Con A

beschichtetes Glasdeckgläschen in einem Falconschälchen gegeben. Aufgrund der

Beschichtung bleiben die Spermien auf diesem Deckglas haften und erlauben so Experimente

ohne starke Bewegungen der Zellen. Nach einer Beladungszeit von 45 min wurde die

Spermienringerlösung durch 2 ml vorgewärmter Ringerlösung ersetzt.

55


3.9.4 Das Ca 2+ -Imaging-System

Material & Methoden

Die Untersuchung von Veränderungen der zytosolischen Kalziumkonzentrationen in Echtzeit

in HEK 293 Zellen und Spermien erfolgte mit einem Ca 2+ -Imaging-System. Dieses System

besteht aus einem Monochromator (T.I.L.L. Photonics) sowie aus einem inversen Mikroskop

(Axiovert 100, Zeiss), das auf einem schwingungsgedämpften Tisch platziert ist und über ein

spezielles Objektiv mit hoher UV- Transmission verfügt (Zeiss, Achroplan 40 x / 0,6 korr).

Die Anregung der Zellen erfolgte mit zwei alternierenden, zur Fluoreszenzmessung

geeigneten Wellenlängen (340 nm und 380 nm). Die Fluoreszenzsignale wurden mit einer

gekühlten CCD Kamera (Imago, PXL 37, Photometrics) aufgenommen. Die Steuerung des

Systems und die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm TILL VisION 3.3.

Bei der Durchführung der Messungen wurden die Zellen alternierend für je 150 ms mit den

Exzitationswellenlängen 340 nm und 380 nm angeregt. Das Bild der Zellen wurde auf einem

CCD Chip gespeichert und einzelne Flächenelemente konnten als „region of interest“ (ROI)

markiert werden. Mit diesem Verfahren konnten mehrere fura-2 beladene Zellen gleichzeitig

in einem Experiment gemessen und anschließend einzeln ausgewertet werden.

Die verwendeten Duftstoffe wurden in dem Konzentrationsverhältnis 1: 10.000, was etwa

einer Konzentration von 500 µM entspricht, in Ringerlösung gelöst und in sechs

Bevorratungsspritzen gefüllt. Diese Bevorratungsspritzen sind über Schläuche an ein

Applikationssystem angeschlossen. Der Applikationskopf besteht aus sechs Kanälen mit

einsetzbaren Superfusionskanülen. Dieser Applikationskopf kann mit einem 3D-Manipulator

bewegt werden. Die Fließgeschwindigkeit innerhalb des Applikationssystems wird mit

Druckluft reguliert und ist über ein Manometer stufenlos einstellbar. Die Applikation der

Stimulationslösungen wurde über manuell schaltbare Elektroventile gesteuert. Gegenüber der

Applikationskanülen liegt ein Absaugröhrchen. Diese Absaugung sichert eine vollständige

Entfernung der applizierten Substanzen, da mehr abgesaugt als zugegeben wird und somit der

Agonist quantitativ entfernt wird. Außerdem bietet es den Vorteil, dass nur lokal begrenzte

Bereiche von der Stimulationslösung überspült werden.

56


3.10 Konfokale Mikroskopie

Material & Methoden

Die konfokale Laser Scanning Mikroskopie (LSM) ermöglicht eine dreidimensionale

Abbildung eines Objekts, da optische Schnitte durch das Präparat erzeugt werden, die zu

einem dreidimensionalen Bild zusammengesetzt werden. Hierbei beleuchtet der Laserstrahl

nur einen kleinen Objektbereich, da das Licht, das nicht aus der Fokusebene stammt durch die

Detektionslochblende (Pinhole) ausgeblendet wird. Die Anregungslochblende wiederum

fokussiert das Sichtfeld auf eine Punkt (konfokale Anordnung). Durch scannen des Präparats

(Punkt für Punkt) mit zwei zueinander orthogonalen Scanspiegeln entsteht mittels einer

Rasteroptik in x-y- Richtung ein vollständiges virtuelles Bild des Objekts. Durch das Scannen

in z-Richtung erreicht man zusätzlich verschiedene Tiefenscans.

Besonders geeignet ist die konfokale Mikroskopie für Fluoreszenzmessungen, da die

Fluoreszenzmoleküle mit dem Laser in einer bestimmten Wellenlänge angeregt werden

können und die Streulichtempfindlichkeit durch das Punkt für Punkt scannen unterdrückt

wird.

Alle Immunzytochemischen Abbildungen wurden mit einem LSM 510 Meta (Zeiss)

aufgenommen. Dabei wurde ein Achroplan 40x/0,8W Objektiv verwendet.

Abb. 3.5: Schematischer Aufbau eines konfokalen Mikroskops.

57


3.11 Die Patch Clamp Technik

Material & Methoden

Zur Messung von Strömen durch einzelne Ionenkanäle in der Membran von Spermatogonien

wurde die Patch Clamp Technik verwendet. Diese Technik wurde von Erwin Neher und Bert

Sakmann (1976) entwickelt und 1991 mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet. Das

Besondere dieser Methode ist die Messung von nur wenigen Ionenkanälen auf einer extrem

kleinen Membranfläche (Patch), womit sogar Einzelkanalmessungen möglich sind. Der Strom

durch einzelne Kanalproteine liegt im Bereich von nur wenigen pA und geht somit leicht im

Rauschen unter. Die Entwicklung spezieller “patch-clamp“ Verstärker machte es möglich,

diese kleinen Ströme mit extrem hoher Zeitauflösung zu registrieren.

Um das Rauschen möglichst klein zu halten, muss der Patch elektrisch von seiner Umgebung

isoliert werden. Dafür sind Lipidmembranen besonders gut geeignet, da sie eine sehr dichte

Verbindung mit Glas eingehen. Um diesen hohen Abdichtwiderstand zu erreichen, wird die

Pipette auf die Zellmembran aufgesetzt und durch Anlegen eines Unterdrucks in der Pipette

wird die Membran etwas in die Pipette hineingezogen. Für den Abdichtwiderstand (Seal)

zwischen Pipette und Zellmembran sind mehrere Komponenten wie z.B. Wasserstoffbrücken

und Van der Waals Kräfte verantwortlich (Aldrich et al., 1983). Wenn der Widerstand

zwischen Pipette und Membran mehrere GigaOhm (GΩ) beträgt, spricht man von einem

„Gigaseal“.

3.11.1 Patch Clamp Konfigurationen

Nach Bildung des Gigaseals liegt bereits die On-cell Konfiguration, bzw. cell-attached

Konfiguration vor (s. Abb. A). In dieser Konfiguration kann das Membranstück der Zelle,

welches an der Pipettenspitze sitzt auf ein bestimmtes Potential „geklemmt“ werden.

Allerdings ist das Membranpotential am Patch nicht genau bestimmbar, da die Ladung der

intrazellulären Seite unbekannt ist und sich unter diesen Bedingungen nicht kontrollieren

lässt.

Wenn nun in der On-cell Konfiguration ein Pipettenunterdruck angelegt wird, kommt es zu

einem Aufbrechen des Membranfleckens und man spricht von der Whole-cell Konfiguration

(s. Abb. B). In der Whole-cell Konfiguration erhält die Pipette einen direkten Zugang zum

Zellinneren und es kommt zu einem Lösungsaustausch zwischen dem Zytosol der Zelle und

der Lösung in der Pipette. Hier ist es nun möglich die Zellmembran auf ein definiertes

Potential zu bringen und den Strom, der über die gesamte Zellmembran fließt, zu messen.

58


Material & Methoden

Durch eine Rückwärtsbewegung der Pipette aus der cell-attached Konfiguration erreicht man

die Inside-out Konfiguration (s. Abb. C). Die ursprüngliche zytoplasmatische Seite der

Zellmembran weist nach außen zur Badlösung.

Bei der Outside-out Konfiguration (s. Abb. D) wird von der Whole-cell Konfiguration

ausgehend die Pipette langsam zurückgezogen. Die extrazelluläre Oberfläche des

Membranflecks weist hier zur Badlösung.

Abb. 3.6: Die vier Patchkonfigurationen (modifiziert aus: Hille, Ion channels of excitable membranes, Third

Edition).

3.11.2 Herstellung der Pipetten

Für die Patch Clamp Messungen wurden Pipetten aus Borosilikatglas (Øinnen = 1,05 mm,

Øaussen = 1,5 mmm, Länge = 80 mm) verwendet. Diese wurden an jedem Versuchstag neu

hergestellt, um Verschmutzungen (z.B. Staub) der Pipetten vorzubeugen. Zur Herstellung der

Pipetten wurde ein Pipettenrohling vertikal in ein Pipettenziehgerät eingespannt, in der Mitte

mit einem Heizwendel erhitzt (2 Heizstufen, 1. 65°C, 2. 48°C ) und in die Länge gezogen, so

dass zwei Pipetten entstanden. Danach wurde der Spitzenrand der Pipetten durch

Hitzepolieren mit einer Microforge geglättet. Der Pipettenwiderstand betrug 6-7 MΩ. Kurz

vor dem Experiment wurde die Pipette mit der jeweiligen Pipettenlösung befüllt (Intra 1oder

2).

Jede Pipette wurde pro Versuch nur einmal verwendet, da die Pipetten für die Sealbildung

absolut frei von Verschmutzungen (z.B. Membranreste) sein müssen.

59


3.11.3 Badelektrode und Patchelektrode

Material & Methoden

Zur Messung der über die Zellmembran fließenden Ströme, wurden eine Badelektrode und

eine Patchelektrode verwendet, welche aus chlorierten Silberdrähten (Ag + /AgCl) bestehen.

Dabei hat die Badelektrode die Aufgabe, die Lösung in der Messschale elektrisch zu erden.

Die Badelektrode ist über eine Agarbrücke (gefüllt mit 4 % Agarose und 150 mM KCl) mit

der Lösung verbunden. Die Patchelektrode hingegen schafft einen elektrischen Zugang zum

Zellinneren. Auf die Patchelektrode wird bei jedem Versuch eine neue Glaskapillare gestülpt,

die mit der Pipettenlösung gefüllt ist und luftdicht mit dem Elektrodenhalter verbunden wird.

An dem Elektrodenhalter befindet sich allerdings eine kleine Öffnung, um den Druck in der

Pipette zu regulieren. Mit Hilfe einer Injektionsspritze, die über einen Schlauch mit dem

Elektrodenhalter verbunden ist, wird ein Unterdruck in der Pipette erzeugt und die Membran

etwas in die Pipette hineingezogen. Über ein Mundstück, das nach Erzeugung des GigaOhm

Widerstandes an denselben Schlauch angeschlossen wird, wird durch leichtes Saugen die

Zellmembran aufgebrochen.

Abb. 3.7: Aufbau eines Elektrodenhalters (www.heka.com).

60


3.11.4 Patch Clamp Protokolle

Abb. 3.8: Die verschiedenen Patch-Clamp Protokolle.

Material & Methoden

Zur Registrierung von Ionenbewegungen über die Zellmembran wurden folgende Protokolle

verwendet:

Zur Untersuchung der Aktivierung spannungsabhängiger Ionenkanäle wurden zwei

verschiedene Messprotokolle verwendet. Beim ersten Vorpuls-Protokoll (s. Abb. 3.8A) wurde

ein Vorpuls ausgehend vom Haltepotential (-40 mV) auf -100 mV (100 ms) geklemmt,

gefolgt von mehreren Spannungssprüngen von -90 mV bis +70 mV (jeweils + 10 mV). Nach

den Spannungsprüngen wurde für 50 ms auf -80 mV geklemmt. Der Filterfaktor betrug 7,0

(2,86 kHz), die Anzahl der Sweeps 15, das Sweep Interval 1 s und das Sampel Intervall 50 µs

(20 kHz). Das zweite Vorpuls-Protokoll (s. Abb. 3.8B) unterscheidet sich vom ersten

Vorpulsprotokoll lediglich in der Spannung des Vorpulses. Hier wurde ein Vorpuls ausgehend

vom Haltepotential (-40 mV) auf -30 mV (100 ms) geklemmt, ebenfalls gefolgt von

Spannungssprüngen von -90 mV bis +70 mV (jeweils + 10 mV). Nach den

Spannungssprüngen wurde für 50 ms auf -80 mV geklemmt. Der Filterfaktor betrug 7,0 (2,86

kHz), die Anzahl der Sweeps 15, das Sweep Interval 1 s und das Sampel Intervall 50 µs (20

kHz).

61


Material & Methoden

Zur Untersuchung von Kanalinaktivierungen wurde das Inaktivierungprotokoll (s. Abb. 3.8C)

genutzt. Dabei wurde die Zelle ausgehend vom Haltepotential (-40 mV) durch

Spannungssprünge von -120 mV bis +20 mV (jeweils + 10 mV) geklemmt. Nach jedem

Spannungssprung wurde für 200ms auf +50 mV, dann für 150 ms auf -80 mV geklemmt. Der

Filterfaktor betrug 7,0 (2,86 kHz), die Anzahl der Sweeps 15, das Sweep Interval 3 s und das

Sampel Intervall 50 µs (20 kHz).

Zur Messung von einzelnen Kanälen wurde das Einzelkanalprotokoll (s. Abb. 3.8D)

verwendet. Hier wurde die Zelle ausgehend vom Haltepotential (-40 mV) kurz auf – 100 mV

geklemmt und danach wurden Spannungssprünge von -50 mV bis + 90 mV (jeweils + 10

mV) durchgeführt. Der Filterfaktor betrug 7,0 (2,86 kHz), die Anzahl der Sweeps 15, das

Sweep Interval 5 s und das Sampel Intervall 50 µs (20 kHz).

Neben den oben beschriebenen Protokollen, bei denen die Spannung sprunghaft verändert

wurde, wurden auch Protokolle mit kontinuierlicher Spannungsveränderung (sogenannte

„Rampen“) verwendet. Bei dem ersten Spannungs-Rampenprotokoll (s. Abb. 3.8E) wurde

eine Rampe von + 100 mV zu -100 mV gefahren (Dauer = 1500 ms). Der Filterfaktor betrug

7,0 (2,86 kHz), die Anzahl der Sweeps 140, das Sweep Interval 5 s und das Sampel Intervall

50 µs (20 kHz). Bei dem zweiten Spannungs-Rampenprotokoll (s. Abb. 3.8F) wurde eine

Rampe von - 100 mV zu + 100 mV gefahren (Dauer = 500 ms). Der Filterfaktor betrug 4,0

(2,50 kHz), die Anzahl der Sweeps 100, das Sweep Interval 5 s und das Sampel Intervall 100

µs (10 kHz).

3.11.5 Liquid-Junction Potential

Da es an den Grenzflächen von Flüssigkeiten unterschiedlicher Zusammensetzung zu

Potentialverfälschungen kommt, wurde dieses Liquid-Junction Potential (LJP) berechnet und

eine entsprechende Korrektur vorgenommen. Im patch-clamp Experiment entsteht dieses LJP

sowohl am Übergang zwischen extra- und intrazellulärer Lösung, sowie an der Grenzfläche

zwischen Pipettenlösung und Zellinnerem. Die Potentialdifferenz über der Zellmembran lässt

sich mit folgender Formel beschreiben:

VM = VP - VL (VP = Spannungspotential, VL = LJP zwischen Pipetten- und Badlösung)

62


Material & Methoden

Zur Berechnung des Liquid-Junction Potentials wurde die Software „Junction Potential

Calculator“ verwendet. Die Berechnung des Liquid-Junction Potentials ergab für die hier

verwendeten Lösungen 4,1 mV (Pipettenlösung 1/Badlösung 1) und 4 mV (Pipettenlösung

2/Badlösung 1). Die Korrektur des Liquid-Junction Potentials erfolgte nicht während der

Messungen, sondern wurde bei der Auswertung berücksichtigt.

3.11.6 Analyseparameter

Die Analyse der Aktivierungs- und Inaktivierungskurven (Maximalstrom gegen Spannung)

erfolgte mit der Software „Fitmaster“ durch Nutzer definierte Cursoreinstellungen.

63


4. Ergebnisse

4.1 Das rezeptive Feld von OR1D2

Ergebnisse

Spehr et al. gelang es 2003 am Lehrstuhl für Zellphysiologie der Ruhr-Universität Bochum

einen von Spermien exprimierten Geruchsrezeptor (OR1D2) zu identifizieren. In derselben

Arbeit wurde mittels rekombinanter Expression dieses Rezeptors in menschlichen

Nierentumorzellen (HEK293-Zellen) ein OR1D2-spezifischen Ligand gefunden

(Bourgeonal). Dieser Ligand wirkt auf humane Spermien chemotaktisch und chemokinetisch.

Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das 2003 beschriebene molekulare rezeptive Feld

von OR1D2 signifikant zu erweitern, um neue Informationen über die Struktur der

Ligandenbindetasche dieses ektopisch auf humanen Spermien expremierten Rezeptors zu

erhalten. Aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der kristallographischen

Strukturanalyse von Membranproteinen, sind die genauen Wechselwirkungen zwischen einem

olfaktorischen Rezeptor und einem aktivierenden Geruchsmolekül bis heute weitgehend

unbekannt. Generell basieren die meisten Rezeptor-Liganden Modelle auf einem „Schlüssel-

Schloss“ Prinzip (sterische Theorie), das eine räumliche Wechselwirkung zwischen den

Aminosäureseitenketten einer Ligandenbinderegion und einem strukturell „passenden“

Molekül beschreibt. Eine andere Theorie, die sog. Vibrationstheorie, wurde 1996 von Luca

Turin entwickelt (Turin, 1996: A spectroscopic mechanism for primary olfactory reception.

Chem. Senses). Danach detektieren Geruchsrezeptoren Duftstoffe anhand intrinsischer

Molekülvibrationen. Die theoretischen Erwägungen von Turin fanden ein erstaunliches

Medienecho, obwohl die Vibrationstheorie bis dato nie experimentellen Tests unterzogen

wurde.

Durch Struktur-Funktionsanalysen an rekombinant exprimierten Riechrezeptoren lassen sich

experimentell grundlegende Erkenntnisse über die Mechanistik olfaktorischer Rezeptor-

Liganden-Interaktion gewinnen. OR1D2 wurde für die in der vorliegenden Arbeit

beschriebenen Versuche ausgewählt, da dieser Rezeptor sowohl in olfaktorischen

sensorischen Neuronen, als auch in menschlichen Spermien identifiziert wurde und einer der

wenigen olfaktorischen Rezeptoren ist, für den ein molekulares rezeptives Feld bekannt ist.

Bourgeonal ist bis jetzt der potenteste identifizierte Agonist für OR1D2. Daher wurden für die

Struktur-Funktionsanalysen Duftstoffe ausgewählt, die entweder aufgrund ihres

psychophysischen Wahrnehmungsprofils oder ihrer chemischen Struktur Ähnlichkeiten mit

Bourgeonal aufweisen (Triller et al., 2008).

64


Ergebnisse

Für die Versuche wurden HEK293-Zellen 2 Tage vor der Messung mit dem OR1D2 Plasmid

transfiziert und nach Applikation verschiedener Duftstoffe auf Änderungen der intrazellulären

Ca 2+ -Konzentration untersucht. Die getesteten Duftstoffe sind nicht namentlich aufgeführt,

sondern besitzen Zahlenkodierungen, da sie noch nicht patentiert sind. Bei der Identifizierung

aktivierender Liganden muss beachtet werden, dass in dem genutzten HEK-Zell-System nur

einmal eine Duftrezeptor-induzierte Veränderung der Ca 2+ -Konzentration gemessen werden

kann, danach reagieren die Zellen nicht mehr (Spehr et al., 2003, Abb. 4.1 C).

Um die Änderungen der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration zu detektieren, wurde das

bildgebende Ca 2+ -Imaging Verfahren genutzt. Mit dem Ca 2+ -Imaging Verfahren können

Messungen sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsniveau durchgeführt werden.

Dabei werden in Echtzeit Veränderungen der zytosolischen Ca 2+ -Konzentration fluoreszenzratiometrisch

gemessen.

Abb. 4.1: Das rezeptive Feld von OR1D2 A) Messung der Ca 2+ Änderungen in mit OR1D2 tranzfizierten

HEK293-Zellen. Nur das Molekül 23872 induziert in diesem Test transiente Ca 2+ -Signale. In der untersten Reihe

sind die Änderungen der [Ca 2+ ]i in Falschfarben dargestellt. Neben der Abbildung ist die verwendete

Farbkodierung des Verhältnisses der Fluoreszenzintensitäten, welche der [Ca 2+ ]i entsprechen, dargestellt. B)

24576 induziert transiente Ca 2+ -Signale. C) 24801 induziert transiente Ca 2+ -Signale. Die Düfte wurden in einer

Konzentration von 500 µM appliziert. Die Pfeile zeigen den Applikationsbeginn, die Applikationsdauer betrug

10 s. D) Das rezeptive Feld von OR1D2 mit allen getesteten Duftstoffen.

65


Ergebnisse

Abbildung 4.1 A zeigt beispielhaft eine Originalspur nach Applikation eines OR1D2

Agonisten (23827), sowie zwei inaktiver Duftstoffe (22650 und 14610). Applikation des

Duftstoffes 23827 (500 µM) erzeugte in ca. 1 % der getesteten Zellen einen transienten

Anstieg der zytosolischen Ca 2+ -Konzentration. In Abbildung 4.1 A (unten) sieht man

Beispielbilder von OR1D2-transfizierten HEK293-Zellen, deren intrazelluläre Ca 2+ -

Konzentration durch Falschfarbenverwendung dargestellt wird. Nach 30 s bzw. 90 s wurden

die Duftstoffe 22650 bzw. 14610 fokal für 5 s appliziert. Beide Applikationen induzierten

keinen detektierbaren Anstieg der Ca 2+ -Konzentration. Nach 150 s wurde der Duftstoff 23827

appliziert. Hier zeigt eine HEK293-Zelle einen transienten Anstieg der intrazellulären Ca 2+ -

Konzentration, was durch einen Falschfarbwechsel von blau (niedrige Ca 2+ -Konzentration) zu

rot (hohe Ca 2+ -Konzentration) verdeutlicht wird (s. Abb. 4.1 unten). Abbildungen B und C

zeigen ebenfalls Beispielspuren aktiver Substanzen (ca. 1 % der getesteten Zellen zeigten

einen transienten Anstieg der zytosolischen Ca 2+ -Konzentration nach Applikation von 24576

und 24801). In Abbildung D ist das rezeptive Feld von OR1D2 mit allen in der vorliegenden

Arbeit getesteten Substanzen zu sehen. Die inaktiven Substanzen sind im äußeren Ring

(dunkles Grau) dargestellt, die aktiven im Zentrum (helles Grau). Bei den aktiven Substanzen

handelt es sich vorwiegend um Aldehyde, sowie wenige Ketone mit einem aromatischen

Ring. Analog der ursprünglich publizierten Ergebnisse (Spehr et al., 2003) scheint der Aromat

bzw. die Ringstruktur sowie die Länge der Kohlenstoffkette zwischen Ring und funktioneller

Gruppe entscheidend für die Aktivität der Liganden zu sein (Triller et al., 2008). Es sind

demnach strukturelle (sterische) Eigenschaften, die die Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung

bestimmen.

4.1.1 Messung der Silizium Analoga Bourgeonal und Lilial

Um die Wechselwirkung zwischen einem Duftstoff und einem Rezeptor weiter zu

untersuchen, wurde bei den potenten OR1D2-Agonisten Bourgeonal und Lilial (s. Abb. 4.2

A) das in para-Position an den Aromaten gebundene Kohlenstoffatom gegen ein

Siliziumatom ausgetauscht (Abb. 4.1 D). Da der C/Si Austausch nur geringen Einfluss auf die

elektrostatische Molekülform ausübt, ändert sich der sterische Charakter der substituierten

Duftstoffe lediglich vernachlässigbar (Abb. 4.2 D). Allerdings verändern sich der

Geruchsschwellenwert und die begleitenden Nuancen. In den Abbildung 4.2 A und B ist zu

sehen, dass sich der Rezeptor im rekombinanten System (HEK293-Zellen) auch durch die

Silizium Analoga Sila-Bourgeonal und Sila-Lilial aktivieren lässt. Beide Duftstoffe wurden in

66


Ergebnisse

einer Konzentration von 500 µM appliziert und induzierten in etwa 1 % der getesteten Zellen

eine Änderung der Ca 2+ -Konzentration. Als Kontrolle dienten nicht transfizierte HEK293-

Zellen, in denen keine Änderung der Ca 2+ -Konzentration induziert werden konnte. Basierend

auf diesen Ergebnissen und der aufgeklärten Kristallstruktur des Rinder-Rhodopsins

(Palczewski et al., 2000) wurde ein OR1D2-Homologiemodell aufgestellt (Doszczak et al.,

2007). Die Ergebnisse (Abb. 4.2 D) zeigen, dass aktive Liganden in einer sehr ähnlichen

räumlich definierten Position gebunden werden. Die Formyl-Funktionen aller Liganden gehen

dabei je zwei Wasserstoffbrückenbindungen ein, allerdings von unterschiedlicher Stärke. Die

Siliziumanaloga zeigen niedrigere Bindungsenergien als die Kohlenstoff-Verbindungen, was

mit der höheren Van-der-Waals-Abstoßung des sterischen Trimethylsilyl-Rests

zusammenhängt.

Abb. 4.2: Messung der Ca 2+ Änderungen in OR1D2 transfizierten HEK293-Zellen nach Applikation von

Bourgeonal und Lilial A), sowie Sila-Bourgeonal und Sila-Lilial B). Die Duftstoffe wurden in einer

Konzentration von 500 µM appliziert. Die Applikationsdauer betrug 10 s. ATP diente als Positivkontrolle. C)

Ca 2+ -Messungen an menschlichen Spermien. Die Konzentration der applizierten Duftstoffe betrug 50 µM und

die Applikationsdauer betrug 10 s. D) Homologiemodell des OR1D2 Rezeptors.

Wie schon oben beschrieben handelt es sich bei OR1D2 auch um einen so genannten

„Spermienrezeptor“. Frühere Experimente zeigten, dass sich menschliche Spermien durch

Bourgeonal und Lilial aktivieren lassen, deshalb wurden die Siliziumanaloga ebenfalls im

nativen System an menschlichen Spermien getestet. Auch in diesem nativen System kommt es

nach Applikation der Duftstoffe zu einem Anstieg der zytosolischen Ca 2+ -Konzentration

67


Ergebnisse

(s. Abb. 4.2 C). Dabei liegt der EC50 Wert für Lilial bei 10 µM, für Sila-Lilial bei 20 µM, für

Bourgeonal bei 10 µM und für Sila-Bourgeonal bei 15 µM.

Spehr et al. fanden 2003 außerdem mit dem aliphatischen Aldehyd Undekanal einen OR1D2-

Antagonisten. Da die Rezeptoraktivität nach Vorinkubation mit Undekanal und

anschließender Koapplikation von Undekanal und Bourgeonal blockiert wurde, stellte sich die

Frage, ob sich auch das Siliziumanalogon Sila-Bourgeonal durch Undekanal blockieren lässt.

Für diese Versuche wurde zunächst durch Sila-Bourgeonal ein Ca 2+ -Anstieg ausgelöst. Nach

30 s Undekanal-Präinkubation wurden Undekanal und Sila-Bourgeonal koappliziert. Wie in

Abb. 4.2 C dargestellt, hat Undekanal ebenfalls eine antagonistische Wirkung bei

Koapplikation mit Sila-Bourgeonal.

Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass es die elektronische Oberflächenstruktur

eines Moleküls ist, die die Wechselwirkungen eines Riechstoffs mit seinen olfaktorischen

Rezeptoren bestimmt und nicht die Vibration eines Moleküls.

4.1.2 Screening natürlicher Duftstoffe

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Identifikation eines natürlich vorkommenden

Liganden für die bereits am Lehrstuhl für Zellphysiologie charakterisierten

Spermienrezeptoren (OR1D2, OR7A5, OR4D1 und PSGR; Spehr et al., 2003; Dissertation K.

Schwane; Diplomarbeit A. Triller; Dissertation W. Zhang; Neuhaus et al., 2009). Alle bisher

gefundenen agonistischen Duftstoffe (OR1D2/Bourgeonal; OR7A5/Myrac; OR4D1/PI23472;

PSGR/ß-Ionon) werden industriell synthetisiert und kommen in dieser Form endogen nicht

vor. Daher ist die Existenz und Identität natürlicher Liganden sowohl für OR1D2, als auch für

andere Spermienrezeptoren, sowie die Identität und Lokalisation ligandensezernierender

Zellen eine entscheidende physiologische Fragestellung. Um diese Frage experimentell zu

beantworten, wurde humane Follikel- und Vaginalflüssigkeit an rekombinant expremierten

Spermienrezeptoren getestet und ihre Auswirkung auf die Rezeptoraktivität mit dem Ca 2+ -

Imaging Verfahren gemessen.

In Vorversuchen wurden sowohl die Vaginal-, als auch die Follikelflüssigkeiten verschiedener

Spenderinnen in aufsteigenden Konzentrationsreihen an untransfizierten HEK293-Zellen

getestet. Da in diesen Körpersekreten u.a. viele Hormone enthalten sind, die unterschiedliche

Zelltypen aktivieren können, war die Untersuchung der zellulären Signalaktivität dieser

Substanzen zunächst unter Kontrollbedingungen zwingend erforderlich.

68


Ergebnisse

Da die Vaginalflüssigkeit von Spenderinnen stammte, die sowohl hormonell, als auch

hormonfrei verhüten, wurden auch die Kontrollversuche jeweils mit Vaginalflüssigkeit

derselben Spenderinnen durchgeführt, um hormonell bedingte Unterschiede auszuschließen

bzw. gegebenenfalls festzustellen.

Während des weiblichen Zyklus kommt es zu einer Regulation verschiedener Hormonspiegel,

deswegen wurden die Vaginalflüssigkeiten zyklusabhängig, d.h. einerseits zu Beginn des

Zyklus (Tag 1-15), andererseits in der zweiten Phase des Zyklus (Tag 16-28), untersucht.

Während der ersten Hälfte des Zyklus (Follikelphase) bleibt die Konzentration der Hormone

FSH, LH, Östrogen und Progesteron nahezu gleich. An Tag 13/14 (Eisprung) kommt es zu

einer Erhöhung von FSH, LH und Östrogen. In der zweiten Hälfte des Zyklus

(Gelbkörperphase) folgt eine Erhöhung von Östrogen und Progesteron. Für diese Versuche

wurde die Vaginalflüssigkeit von fünf verschiedenen Spenderinnen getestet. Davon haben

drei Spenderinnen hormonell verhütet, 2 Spenderinnen nicht.

Vaginalflüssigkeit, die am Anfang des Zyklus entnommen wurde löste weder bei

Spenderinnen mit hormoneller Verhütung (s. Abb. 4.3 A) und B)), noch bei Spenderinnen

ohne hormonelle Verhütung (s. Abb. 4.3 C)) unspezifische Signale in HEK293-Zellen aus (s.

Abb.4.3), unabhängig von der applizierten Konzentration. Insgesamt wurden ~ 1440 Zellen

untersucht (4 Messtage; 4 Transfektionen).

69


Ergebnisse

Abb. 4.3: Messung der Ca 2+ -Änderungen in untransfizierten HEK293-Zellen nach Applikation von

Vaginalflüssigkeit (früher Zyklus) in unterschiedlichen Konzentrationen. A) Spenderin mit hormoneller

Verhütung. B) Spenderin mit hormoneller Verhütung. C) Spenderin ohne hormonelle Verhütung. Die

Applikationsdauer betrug 10 s. ATP diente als Positivkontrolle.

Bei Vaginalflüssigkeit, die zum Ende des Zyklus entnommen wurde, konnte beobachtet

werden, dass das Vaginalsekret aller Spenderinnen (mit/ohne hormonelle Verhütung) in HEK

293-Zellen zytosolische Anstiege der Ca 2+ -Konzentration ab einer Verdünnung von 1:1000

auslöste (Abb. 4.4). Insgesamt wurden ~ 2200 Zellen getestet (5 Messtage; 5 Transfektionen).

70


Ergebnisse

Abb. 4.4: Messung der Ca 2+ -Änderungen in untransfizierten HEK293-Zellen nach Applikation von

Vaginalflüssigkeit (später Zyklus) in unterschiedlichen Konzentrationen. A) Spenderin mit hormoneller

Verhütung, Vaginalflüssigkeit ab einer Konzentration von 1:1000 induziert transiente Ca 2+ -Signale. B)

Spenderin mit hormoneller Verhütung, Vaginalflüssigkeit ab einer Konzentration von 1:1000 induziert transiente

Ca 2+ -Signale. C) Spenderin ohne hormonelle Verhütung, Vaginalflüssigkeit ab einer Konzentration von 1:1000

induziert transiente Ca 2+ -Signale. Die Applikationsdauer betrug 10 s. ATP diente als Positivkontrolle.

Für die Kontrollexperimente der Follikelflüssigkeitsstudien wurde Follikelflüssigkeit von drei

unterschiedlichen Spenderinnen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, das bei zwei von drei

Spenderinnen zelluläre Ca 2+ -Signale bei Verdünnungen ≥1:1000 ausgelöst wurden (s. Abb.

4.5 A) und B)). Insgesamt wurden ~ 2000 Zellen getestet (5 Messtage; 5 Transfektionen),

wobei nach Applikation der Follikelflüssigkeit von Spenderin 1 und 2 in allen getesteten

Zellen eine Antwort beobachtet werden konnte. Nach Applikation der Follikelflüssigkeit von

Spenderin 3 (s. Abb. 4.5 C)) konnte hingegen keine transiente Erhöhung der intrazellulären

Ca 2+ -Konzentration in HEK293-Zellen gezeigt werden.

71


Ergebnisse

Abb. 4.5: Messung der Ca 2+ -Änderungen in untransfizierten HEK293-Zellen nach Applikation von

Follikelflüssigkeit in unterschiedlichen Konzentrationen. A) Spenderin 1, Follikelflüssigkeit ab einer

Konzentration von 1:1000 induziert transiente Ca 2+ -Signale. B) Spenderin 2, Follikelflüssigkeit ab einer

Konzentration von 1:1000 induziert transiente Ca 2+ -Signale. C) Spenderin 3, Follikelflüssigkeit ab einer

Konzentration von 1:1000 induziert keine transienten Ca 2+ -Signale. Die Applikationsdauer betrug 10 s. ATP

diente als Positivkontrolle.

Als nächstes wurde die potentielle Wirksamkeit dieser verschiedenen Flüssigkeiten an

rekombinant exprimierten Rezeptoren (OR1D2, OR4D1, OR7A5 und PSGR) in

Konzentrationen, die keine unspezifischen (Hormon)-Antworten auslösen (1:10000), getestet.

In diesen Experimenten wurde untersucht, ob in diesen Körpersekreten Substanzen enthalten

sind, die den entsprechenden Rezeptor aktivieren können. Diese Versuche (Abb. 4.6) zeigten,

dass Follikelflüssigkeit eine Aktivierung der Rezeptoren OR7A5, (2000 Zellen getestet, 1%

antwortende Zellen, 5 Messtage, 5 Transfektionen), PSGR (1600 Zellen getestet, 1,9%

antwortende Zellen, 4 Messtage, 4 Transfektionen) und OR4D1 (1600 Zellen getestet, 0,9%

antwortende Zellen, 4 Messtage, 4 Transfektionen) hervorrief. Vaginalflüssigkeit aktivierte

die Rezeptoren OR1D2 (s. Abb. 4.7, 1440 Zellen getestet, 1,1% antwortende Zellen, 4

Messtage, 4 Transfektionen), OR7A5 (1760 Zellen getestet, 1,25% antwortende Zellen, 4

Messtage, 4 Transfektionen) und PSGR (1920 Zellen getestet, 0,9% antwortende Zellen, 4

Messtage, 4 Transfektionen). Als Kontrolle wurden ~ 3000 untransfizierte Zellen gemessen,

bei denen keine Antworten beobachtet wurden.

72


Ergebnisse

Abb. 4.6: Messung der Ca 2+ -Änderungen in OR4D1 A), OR7A5 B), PSGR C) und OR1D2 D)

expremierten HEK293 Zellen nach Applikation von Follikelflüssigkeit. Die Follikelflüssigkeit wurde in

einer Konzentration von 1:10000 appliziert. Die Pfeile zeigen den Applikationsbeginn. Die Applikationsdauer

betrug 10 s. ATP diente als Positivkontrolle.

Abb. 4.7: Messung der Ca 2+ -Änderungen in OR1D2 A), OR7A5 B), PSGR C) und OR4D1 D)

expremierten HEK293-Zellen nach Applikation von Vaginalflüssigkeit. Die Vaginalflüssigkeit wurde in

einer 1:10000 Konzentration appliziert. Die Pfeile zeigen den Applikationsbeginn. Die Applikationsdauer betrug

10 s. ATP diente als Positivkontrolle.

73


Ergebnisse

Zur Untersuchung einzelner Substanzen bzw. Duftstoffe, die in der Vaginalflüssigkeit und /

oder der Follikelflüssigkeit enthalten sind, wurden beide Flüssigkeiten mittels

gaschromatographischer Analysen (durchgeführt von unserem Kooperationspartner,

Arbeitsgruppe um Dr. Andrea Büttner) am Fraunhofer Institut (Freising) fraktioniert. Dabei

konnten folgende Duftstoffe identifiziert werden:

Follikelflüssigkeit: Buttersäure, α-Ionon, ß-Ionon, 1-Octen-3-on, 5-α-Androsten-3-one

Vaginalflüssigkeit: Buttersäure, Furaneol, Phenylessigsäure, Sotolon, α-Ionon, ß-Ionon,

ß-Damascenon, 1-Octen-3-on

4.1.2.1 Identifizierung der einzelnen Liganden

Zunächst wurden HEK293-Zellen mit den jeweiligen Plasmiden (OR1D2, OR4D1, OR7A5

und PSGR) transient transfiziert und anschließend anhand der Ca 2+ -Imaging Methode

untersucht. In diesen Untersuchungen konnten für den Rezeptor OR1D2 die Duftstoffe 1-

Octen-3-on und Buttersäure als potentielle Liganden identifiziert werden (s. Abb. 4.8 A und

B). Etwa 0,9 % der getesteten Zellen (~2000 Zellen, 5 Messtage, 5 Transfektionen) reagierten

mit einem transienten Ca 2+ -Anstieg nach Applikation von 1-Octen-3-on (s. Abb. 4.8 A)) und

ungefähr 1,3 % nach Applikation von Buttersäure (s. Abb. 4.8 B). Abbildung 4.8 C fasst alle

mit molekular identifizierten Follikel- bzw. Vaginalsekretinhaltsstoffen erzielten Ergebnisse

in einer Übersicht zusammen. In dem äußeren Bereich (dunkles Grau) sind alle getesteten

inaktiven Substanzen mit ihren Strukturformeln dargestellt. Im inneren, hell unterlegten Kreis

sind die jeweils aktiven Substanzen aufgeführt. Bei allen Versuchen dienten untransfizierte

HEK293-Zellen als Negativkontrolle.

74


Ergebnisse

Abb. 4.8: Messung der Ca 2+ -Änderungen in OR1D2 expremierten HEK293 Zellen nach Applikation von

1-Octen-3-on A) und Buttersäure B). C) Zusammenfassung aller getesteten Duftstoffe. Die Düfte wurden in

einer 1:10000 Konzentration (~ 500 µM) appliziert. Die Pfeile zeigen den Applikationsbeginn. Die

Applikationsdauer betrug 10 s. ATP diente als Positivkontrolle.

Für den Rezeptor OR7A5 konnte der Duftstoff Furaneol als potentieller endogener Agonist

identifiziert werden. Etwa 1 % der getesteten Zellen (~2000 Zellen, 5 Messtage, 5

Transfektionen) reagierten mit einem transienten Ca 2+ -Anstieg nach Applikation von Furaneol

(s. Abb. 4.9 A)). Abbildung 4.9 B fasst alle getesteten Duftstoffe in einer Übersicht

zusammen.

75


Ergebnisse

Abb. 4.9: Messung der Ca 2+ -Änderungen in OR7A5 expremierten HEK293 Zellen nach Applikation von

Furaneol A). B) Zusammenfassung aller getesteten Duftstoffe. Die Düfte wurden in einer 1:10000

Konzentration (~ 500 µM) appliziert. Die Pfeile zeigen den Applikationsbeginn. Die Applikationsdauer betrug

10 s. ATP diente als Positivkontrolle.

Die Experimente an OR4D1 zeigten das 5-α-Androst-16-en ein aktivierender Duftstoff für

diesen Rezeptor ist. Etwa 1 % der getesteten Zellen (~2000 Zellen, 5 Messtage, 5

Transfektionen) reagierten mit einem transienten Ca 2+ -Anstieg nach Applikation von 5-α-

Androst-16-en (s. Abb. 4.10 A)). Abbildung 4.10 B fasst alle Ergebnisse in einer Übersicht

zusammen.

Abb. 4.10: Messung der Ca 2+ -Änderungen in OR4D1 expremierten HEK293 Zellen nach Applikation von

5-α-Androst-16-en A). B) Zusammenfassung aller getesteten Duftstoffe. Die Düfte wurden in einer 1:10000

Konzentration (~ 500 µM) appliziert. Die Pfeile zeigen den Applikationsbeginn. Die Applikationsdauer betrug

10 s. ATP diente als Positivkontrolle.

76


Ergebnisse

Bei den Ca 2+ -Imaging Experimenten an transient mit PSGR transfizierten HEK293-Zellen

konnte kein aktivierender Ligand gefunden werden (s. Abb. 4.11). Allerdings wurde in

vorangegangenen Studien am Lehrstuhl für Zellphysiologie (Neuhaus et al., 2009) der

Duftstoff ß-Ionon als PSGR-Ligand identifiziert. Auch ß-Ionon wurde von Dr. Büttner als

Bestandteil von sowohl Vaginal-, als auch Follikelflüssigkeit identifiziert, als bereits

bekannter Agonist aber in dieser Experimentreihe nicht erneut getestet.

Abb. 4.11: Zusammenfassung der an transient mit PSGR transfizierten HEK293-Zellen getesteten

Duftstoffe.

Parallel zu den Ca 2+ -Imaging Experimenten an HEK293-Zellen wurden auch

Aktivitätsuntersuchungen an humanen Spermien durchgeführt. Diese Experimente zeigten,

das auch humane Spermien durch die Applikation von Vaginalflüssigkeit in allen getesteten

Konzentrationen aktiviert werden konnten (s. Abb. 4.12 A; 1:1.000.000 bis 1:1.000).

Experimente mit Follikelflüssigkeit zeigten hingegen, dass Spermien erst bei einer relativ

niedrigen Verdünnung von 1:1000 einen zytosolischen Ca 2+ -Anstieg zeigen (s. Abb. 4.12 B).

77


Ergebnisse

Abb. 4.12: Messung der Ca 2+ -Änderungen nach Applikation von Vaginalflüssigkeit und Follikelflüssigkeit

in humanen Spermien. A) Vaginalflüssigkeit induziert in allen getesteten Konzentrationen transiente Ca 2+ -

Signale. B) Follikelflüssigkeit ab einer Konzentration von 1:1000 induziert transiente Ca 2+ -Signale. Die

Applikationsdauer betrug 10 s.

Auch die einzelnen Substanzen, die als aktivierende Liganden für die jeweiligen Rezeptoren

identifiziert werden konnten (OR1D2 = 1-Octen-3-on, Buttersäure, OR7A5 = Furaneol,

OR4D1 = 5-α-Androst-16-en) aktivierten humane Spermien (s. Abb. 4.13 A und B). Die

Duftstoffe wurden in einer Konzentration von 500 µM für jeweils 10 s appliziert.

Abb. 4.13: Messung der Ca 2+ -Änderungen in menschlichen Spermien nach Applikation der im

rekombinanten System identifizierten Liganden. A) 1-Octen-3-on und Furaneol induzieren transiente Ca 2+ -

Signale. B) 5-α-Androst-16-en und Buttersäure induzieren transiente Ca 2+ -Signale. Die Applikationsdauer betrug

10 s. Die Düfte wurden in einer Konzentration von 500 µM appliziert.

78


4.2 Elektrophysiologische Charakterisierung von Spermatogonien der Maus

Ergebnisse

In den Testes der Maus werden täglich ca. 100-200 Millionen Spermien gebildet. Um diese

Zahl zu produzieren, durchlaufen Spermatogonien kontinuierlich Zellteilungs- und

Differenzierungsprozesse und entwickeln so haploide Gamenten, die Spermatozoen. Diese

Prozesse werden durch externe Signale kontrolliert, die u.a. die elektrischen Eigenschaften

der Zellmembran modifizieren. Allgemein spielen Ionenströme durch Ionenkanäle eine

Schlüsselrolle bei verschiedenen Prozessen, die in Spermien ablaufen, wie z.B. bei der

Kapazitation und Akrosomreaktion. Bisher wurden Ca 2+ , Na + , K + und Cl - permeable Kanäle

mit unterschiedlichen Leitwerten und Eigenschaften in Spermien identifiziert. Beispielsweise

vermitteln Ca 2+ -Kanäle den Influx von extrazellulärem Ca 2+ bei der Akrosomreaktion

(Florman et al., 1998). Für K + -Kanäle konnte gezeigt werden, dass sie bei der Zellvermehrung

und -differenzierung eine physiologische Rolle spielen (Hirono et al., 1994; Miki et al.,

2001). Verschiedene Kalium Kanäle sind in unterschiedlichen Typen von Keimzellen

exprimiert, was auf diverse Funktionen während des Ablaufs der Spematogenese hindeutet

(Gong et al., 2002).

Ionenkanäle spielen also eine wichtige Rolle sowohl in reifen Spermien als auch in der

Spermatogenese. Allerdings ist nicht bekannt, in welchem Reifestadium der

Spermienvorläuferzellen diese Ionenkanäle erstmals exprimiert werden. Da Spermatogonien

die Stammzellen der Spermatogenese und ihre physiologischen Eigenschaften bis heute

weitgehend unbekannt sind, repräsentieren sie einen sehr interessanten Zelltyp im

reproduktiven Kontext. Der vorliegende Teil beschäftigt sich daher mit der

elektrophysiologischen Charakterisierung von Spermatogonien der Maus.

Für die elektrophysiologische Charakterisierung von murinen Spermatogonien wurde zuerst

eine Sertolizell-Spermatogonien Kokultur etabliert. Spermatogonien lassen sich aufgrund

ihrer charakteristisch runden Morphologie gut von dem darunter liegenden Sertolizellrasen

(‚feeder layer‘) unterscheiden (s. Abb. 4.14 A-D). Im Gegensatz zu reifen Spermien betreiben

Spermatogonien eine hohe Proteinbiosynthese, außerdem sind sie relativ resistent gegenüber

äußeren Einflüssen und eignen sich so gut für die Primärkultur.

Abbildungen 4.14 A und B zeigen eine repräsentative Sertolizell-Spermatogonien Kokultur

nach 2 Tagen in vitro bei einer 10- bzw. 20-fachen Vergrößerung. Gut zu erkennen sind der

Sertolizellrasen (s. Pfeil, Abb. 4.14 B, links) und die darauf liegenden Spermatogonien

79


Ergebnisse

(s. Pfeilspitze, Abb. 4.14 B, rechts). Aufgrund unvollständiger Zytokinese während der

Mitose, bleiben die Spermatogonien über intrazelluläre Brücken miteinander verbunden.

Abbildungen 4.14 C (10x Vergrößerung) und D (40x Vergrößerung) zeigen die gleiche Kultur

nach 6 Tagen in vitro. Zu diesem Zeitpunkt kann man erkennen, dass die Zellen sich weiter

ausdifferenziert haben und Gruppen von 4-16 Spermatogonien bilden (s. Abb. 4.14 D).

Abb. 4.14: Kultivierte Spermatogonien an unterschiedlichen Tagen in vitro. A) Spermatogonienkultur 2

Tage in vitro, 10x Vergrößerung. B) Spermatogonienkultur 2 Tage in vitro, 20x Vergrößerung. C)

Spermatogonienkultur 6 Tage in vitro, 10x Vergrößerung. D) Spermatogonienkultur 6 Tage in vitro, 40x

Vergrößerung. Phasenkontrast Aufnahmen.

Um die Identität der Zellen als Spermatogonien zu verifizieren, wurden Antikörperfärbungen

gegen das Spermatogonien-spezifische Protein DAZL (deleted in azoospermia-like)

durchgeführt. Eine Mutation im DAZ Gen führt zu Infertilität (NCBI, Entrez Gene, Gene

ID:1618). Die Abbildungen 4.15 A1-A4 zeigen Fluoreszenz-Antikörperfärbungen gegen

DAZL an Spermatogonien an verschiedenen Tagen in Kultur (Abb. A1 = Tag 2, Abb. A2 =

Tag 3, Abb. A3 = Tag 4, Abb. A4 = Tag 6). Zu erkennen ist, unabhängig vom jeweiligen

Kulturstadium, eine membranständige Fluoreszenzfärbung. In Abbildung 4.15 A5 (Tag 6)

sieht man DAPI Färbungen zur Lokalisation der Zellkerne. Gut zu erkennen ist, dass

Spermatogonien vergleichsweise wenig Zytoplasma aufweisen. Zur Kontrolle der Spezifität

des Sekundärantikörpers wurden Färbungen ohne 1. Antikörperinkubation durchgeführt

80


Ergebnisse

(s. Abb. 4.15 A6 = Tag 6). Die an verschiedenen Tagen in Kultur aufgenommenen

Fluoreszenzbilder (Abb. 4.15 A1-A4) zeigen deutlich, dass sich die Spermatogonien in Kultur

weiter ausdifferenzieren. Um sicherzustellen, dass während die nachfolgend beschriebenen

elektrophysiologischen Ableitungen tatsächlich an Spermatogonien und nicht an Sertolizellen

oder anderen testikulären Zelltypen durchgeführt wurden, wurden die untersuchten Zellen

während der Patch-clamp Messungen im whole-cell Modus mit dem in der Pipettenlösung

enthaltenen Fluoreszenzfarbstoff AlexaFluor® 488 Hydrazid markiert (s. Abb. 4.15 B).

Dadurch konnten untersuchte Zellen nach den Experimenten (post-hoc) in der Kultur

gefunden und Antikörperfärbungen durchgeführt werden. Die Abbildungen 4.15 B1-B3

zeigen ein nach einer Patch-clamp Messung mit Alexa Hydrazid markiertes Spermatogonium

(B1). Die post-hoc Färbung derselben Zelle gegen DAZL (B2) ist in der Überlagerung (B3)

zu erkennen. Die DAZL-Färbung ist allerdings nicht mehr eindeutig membranständig, da es

mit Abzug der Patchpipette nach Beendigung der Messung zu einer Degeneration der

Zellstruktur kommt. Durch routinemäßige post-hoc Antikörperfärbungen (n = 18 Zellen, 7

Kulturen) konnten die Spermatogonien eindeutig identifiziert und somit gezeigt werden, dass

die erhobenen Daten die elektrophysiologischen Eigenschaften kultivierter Spermatogonien

widerspiegeln.

Abb. 4.15: Identifizierung von Spermatogonien durch immunzytochemische Färbungen mit DAZL. A)

Spermatogonien an verschiedenen Tagen in Kultur (A1 = Tag 2; A2 = Tag 3; A3 = Tag 4; A4 = Tag 6; A5 = Tag

6, DAPI Färbung; A6 = Tag 6, Kontrolle, ohne 1. Antikörper). B) Doppelfärbung mit Alexa Hydrazid und

DAZL.

81


4.2.1 Passive Membraneigenschaften von Spermatogonien

Ergebnisse

Die elektrophysiologische Charakterisierung der kultivierten Spermatogonien erfolgte mit

Hilfe der Patch-Clamp Technik im whole-cell Modus (s. Abb. 4.16). In dieser Konfiguration

lassen sich die aufsummierten Ströme durch alle Kanäle der Zellmembran messen. Dafür

wurden die Zellen innerhalb von 2-9 Tagen nach Kultivierung untersucht. Direkt nach

Erreichen der whole-cell Konfiguration lag das Ruhemembranpotential der Spermatogonien

bei -50 bis -60 mV (n = 10 Zellen; 4 Kulturen), was für nicht neuronale Zellen relativ negativ

ist. Des Weiteren zeigen diese Zellen einen sehr hohen Eingangwiderstand von ca. 8 Gigaohm

(GΩ). Im Ruhezustand sind demnach nur wenige Ionenkanäle geöffnet. Die Kapazität der

Zellen ist aufgrund des geringen Volumens mit ca. 6,6 pF (n = 20 Zellen; 5 Kulturen)

vergleichsweise niedrig.

Abb. 4.16: Spermatogonium während einer elektrophysiologischen Ableitung im whole-cell Modus. Zu

erkennen ist eine Sertolizell-Spermatogonien Kokultur mit einem Spermatogonium (S) und einer Patchpipette

(P).

4.2.2 Untersuchung von spannungsabhängigen Kaliumkanälen

Zunächst wurden die Spermatogonien auf die potentielle Expression spannungsabhängiger

Kaliumkanäle untersucht. Spannungsaktivierte Kaliumkanäle (Kv-Kanäle) lassen sich in 2

Typen einteilen, den A-Typ und den ‚delayed rectifier‘ Typ. A-Typ Kanäle sind dadurch

charakterisiert, dass sie sich während der Depolarisation sehr schnell öffnen und wieder

schließen und erst durch Hyperpolarisation erneut aktivierbar werden. Die ‚delayed rectifier’

Kanäle dagegen sind durch eine verzögerte Aktivierung gefolgt von einer langsamen

Inaktivierung charakterisiert.

82


Ergebnisse

In Abbildung 4.17 sind die Ergebnisse der Untersuchung der „steady-state“ Aktivierung von

A-Typ Kalium Kanälen in Maus-Spermatogonien aufgetragen. In den gezeigten

Experimenten wurden zwei unterschiedliche Vorpuls-Protokolle verwendet, um die

veränderte Aktivierbarkeit eines A-Typ Stroms bei verschiedenen Spannungen auszunutzen.

Um einen potentiellen A-Typ Strom zu aktivieren, wurde beim ersten Versuchsprotokoll,

ausgehend vom Haltepotential, ein hyperpolarisierender Vorpuls von -100 mV geklemmt,

gefolgt von verschiedenen depolarisierenden Potentialschritten (s. Abb. 4.17 A). Die

Vorpulsklemmspannung wurde beim zweiten Protokoll auf -30 mV eingestellt. Während der

nachfolgenden Depolarisationsschritte sollte ein A-Typ-artiger Strom aufgrund der bei -30

mV bereits erfolgten Inaktivierung nicht mehr zu sehen sein (s. Abb. 4.17 B). Wie in

Abbildung 4.17 A gezeigt, induziert eine Depolarisation nach hyperpolarisierendem Vorpuls

u.a. einen schnell inaktivierenden auswärts gerichteten Strom, der den Kriterien eines A-Typ

Stroms entspricht. Die nachfolgende Plateauphase spricht für die Existenz eines weiteren

Stromtyps. Abbildung 4.17 B zeigt ebenfalls auswärts gerichtete Ströme, die, ausgehend von

einem -30 mV Vorpuls, durch verschiedene depolarisierende Klemmspannungen induziert

werden. Allerdings wird nach der Vordepolarisation auf -30 mV kein transienter Strom

aktiviert. Um nur den A-Typ-Anteil des Gesamtstroms zu isolieren, wurden die durch das

zweite Pulsprotokoll induzierten Ströme von den ursprünglich gemessenen Strömen

abgezogen. Nach dieser Subtraktion ist der Vorpuls-sensitive A-Typ Strom gut zu erkennen

(s. Abb. 4.17 C).

Neben der Aktivierung des Stromes wurde auch dessen Inaktivierung charakterisiert. Zur

Untersuchung der Kanalinaktivierung wurden variable Vorpulspotentiale von -120 mV bis

+20 mV geklemmt. Davon ausgehend wurden die Zellen jeweils auf ein positives Potential

depolarisiert. Bei Vorpuls-Depolarisationen ≥ -60 mV ist ein A-Strom-artiger Verlauf kaum

noch zu erkennen.

Die Abbildungen E und F zeigen quantitativ die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung bzw.

Inaktivierung des A-Typ Stroms. Abbildung E zeigt den maximal induzierten A-Typ Strom

als eine Funktion der aktivierenden Depolarisationsspannung. Ebenfalls analysiert wurde die

Aktivierungskinetik (als ‚Inset‘ in Abb. E gezeigt) durch Anlegen exponentieller Fits an die

Anstiegsphase des Stroms und Berechnung der jeweiligen Zeitkonstanten (tau). Alle Werte

liegen zwischen 5 und 10 ms und zeigen keine signifikanten Unterschiede. Die

Aktivierungskinetik ist damit nicht signifikant spannungsabhängig (n = 7). In Abbildung 4.17

F (Inset) ist analog die Inaktivierungskinetik des A-Typ Stroms aufgetragen. Auch hier lässt

sich keine Spannungsabhängigkeit feststellen (n = 5).

83


Ergebnisse

Abb. 4.17: „Steady-state“ Aktivierung und Inaktivierung des A-Typ-artigen Kalium Kanals in

kultivierten Spermatogonien der Maus. A) Auswärts gerichtete Ströme eines Spermatogoniums nach

Anwendung des ersten Vorpuls-Protokolls. B) Auswärts gerichtete Ströme desselben Spermatogoniums nach

Vorpuls-Depolarisation auf -30 mV. C) Anteil eines A-Typ-artigen Kanals, ermittelt durch die Subtraktion der

Auswärtsströme (A - B). D) Inaktivierung des A-Typ Stroms. E) Strom-Spannungsbeziehung und Inaktivierung

(Tau) des A-Typ Kalium Stroms. F) Maximaler Strom der Inaktivierung und die Inaktivierungskinetik (Tau).

84


Ergebnisse

Um die Existenz eines A-Typ Stroms in kultivierten Spermatogonien der Maus zu bestätigen,

wurden pharmakologische Tests durchgeführt. Dafür wurde 4-Aminopyridine (4-AP) genutzt,

das A-Typ Ströme selektiv inhibiert (Pelhate et al., 1975). Für diese Experimente wurde das

bereits beschriebene hyperpolarisierende Vorpuls-Protokoll genutzt (s. o.). In Abbildung 4.18.

A kann man den durch depolarisierende Spannungssprünge (-100 mV bis +70 mV) aktivierten

Kalium Strom unter Kontrollbedingungen in der whole-cell Konfiguration sehen. In

Abbildung 4.18 B (identisches Pulsprotokoll) ist die vollständige Inhibition des A-Typ

Stroms nach Einwaschen von 10 mM 4-AP zu sehen. Durch die Subtraktion der unter 4-AP

gemessenen Ströme (Abb. 4.18 B) von den unter Kontrollbedingungen gemessenen Werten

(Abb. 4.18 A), kann der 4-AP-sensitive Stromanteil isoliert werden (s. Abb. 4.18 C).

Abb. 4.18: Der Effekt von 4-AP auf A-Typ Ströme in Spermatogonien. A/B) Auswärts gerichtete Ströme

eines Spermatogoniums im ersten Vorpuls-Protokoll vor und nach Applikation mit 10 mM 4-AP. C) Geblockter

Anteil des A-Typ Stroms ermittelt durch die Subtraktion der Ströme nach der Applikation mit 10 mM 4-AP von

den Strömen vor der Applikation mit 10 mM 4-AP.

Wie bereits in Abbildung 4.17 A gezeigt, existiert in murinen Spermatogonien neben dem A-

Typ Strom noch ein weiterer verzögert aktivierter Kv-Strom. Bei diesem handelt es sich um

85


Ergebnisse

einen ‚delayed rectifier‘-artigen Strom. Zur Aktivierung dieses ‚delayed rectifier’ Stromes

wurde die Membranspannung der Spermatogonien, ausgehend von einem Haltepotential von

-100 mV, auf verschiedene depolarisierende Potentiale geklemmt (s. Abb. 4.19 A). Die

Aktivierungsschwelle des ‚delayed rectifier’ Stromes lag bei ca. -20 mV (n = 9), wie man in

Abbildung 4.19 B sehen kann. Hier ist quantitativ die Spannungsabhängigkeit des ‚delayed

rectifier‘-artigen Stromes aufgetragen. Zur weiteren Charakterisierung dieses Stromes wurde

der Kaliumkanalblocker Tetraethylammoniumchlorid (TEA) genutzt, der diesen

Kaliumkanaltyp blockiert. Wie Abbildung 4.19 A zeigt, inhibiert die Applikation von 10 mM

TEA den ‚delayed rectifier’ Strom. Dieser Effekt war reversibel (s. Abb. 4.19 A). Das

Diagramm in Abbildung 4.19 C beschreibt quantitativ die Spannungsabhängigkeit der

Aktivierungskinetik des ‚delayed rectifier’ Stromes. Verglichen mit den kinetischen

Eigenschaften des A-Typ Stromes (s. Abb. 4.17 E) liegt hier eine deutlich

spannungsabhängige Aktivierungskinetik vor.

Abb. 4.19: Spermatogonien besitzen einen zweiten spannungsabhängigen Kaliumkanal, den ‚delayed

rectifier’. A) Effekt von TEA auf ‚delayed rectifier’ Ströme. Whole-cell ‚delayed rectifier’ Ströme vor und nach

Applikation mit 10 mM TEA. B) Die Aktivierungsschwelle des ‚delayed rectifiers’. C) Die Aktivierungskinetik

des ‚delayed rectifier’ Stromes.

86


Ergebnisse

Zusammengefasst zeigen die vorliegenden Experimente, das kultivierte Spermatogonien

spannungsaktivierte Kaliumkanäle vom A-Typ und ‚delayed rectifier’ Typ exprimieren.

Beide Typen konnten während des gesamten Kultivierungszeitraumes (Tag 2-9) gemessen

werden. Von allen untersuchten Zellen zeigten 18 % einen A-Typ-artigen (n = 10/57 Zellen)

und 23 % einen ‚delayed rectifier’-artigen Strom (n = 17/74 Zellen).

4.2.3 Messung von Kalium Einzelkanälen

Da Spermatogonien einen sehr hohen Eingangswiderstand besitzen (s. o.) war es außerdem

möglich, Einzelkanalaktivitäten zu messen, was äußerst schwierig ist. Der

Eingangswiderstand beschreibt die elektrische Dichte der Zelle und zeigt somit die Höhe des

Eingangswiderstandes an, wie viele Ionenkanäle im Ruhezustand geöffnet sind. Um

Einzelkanäle messen zu können, muss das Hintergrundrauschen so gering wie möglich sein.

In Abbildung 4.20 A kann man Kalium Einzelkanäle erkennen. Die Kanaldichte ist äußerst

gering, in der Regel sind nur 1 oder 2 Kanäle geöffnet. Nach einer sehr kurzen „offen“ Zeit,

geht der Strom wieder auf die Grundlinie zurück (Kanal geschlossen). Die gemessenen

Einzelkanäle konnten durch Einwaschen einer TEA Lösung inhibiert werden. Diese Inhibition

war reversibel. Die Inhibition durch TEA spricht dafür, das es sich um ‚delayed rectifier’artige

Kanäle handelt, allerdings scheint noch ein weiterer Kanal beteiligt zu sein (s. Abb.

4.20 B).

87


Ergebnisse

Abb. 4.20: Messung von Kalium Einzelkanälen. A) Zu sehen sind Kalium Einzelkanäle. B) Block der

Einzelkanäle durch TEA.

4.2.4 Untersuchung von spannungsabhängigen Ca 2+ -Kanälen

Da viele Ionenkanäle und insbesondere Ca 2+ -Kanäle in reifen Spermien eine wichtige Rolle,

z.B. bei der Akrosomreaktion spielen (Darszon et al., 2001), wurde in einer weiteren

Experimentreihe die Expression von Ca 2+ v-Kanälen in Spermatogonien untersucht. Dabei ist

vor allem interessant, ob und welche Ca 2+ v-Kanälen schon in diesem frühen Stadium

funktionell exprimiert werden.

Für diese Versuchsreihe wurden die gleichen Spannungsprotokolle verwendet, die schon bei

der vorangegangenen Charakterisierung der Kv-Kanäle eingesetzt wurden (s. o.). Allerdings

wurden andere Lösungen verwendet, um Ca 2+ v-Kanäle zu isolieren. In der Pipettenlösung

wurde Kalium durch Cäsium ersetzt und TEA zugegeben, um die Kaliumkanäle zu

blockieren. In der Perfusionslösung wurde Kalzium durch Barium ersetzt, um die Ca 2+ -

Ströme zu vergrößern. Dabei konnten zwei unterschiedliche Ca 2+ v-Stromtypen identifiziert

88


Ergebnisse

werden. Zum einen konnte ein Strom gemessen werden, der schon bei relativ schwachen

Depolarisationen aktiviert wird und eine schnelle Inaktivierung zeigt, was für die Existenz

eines T-Typ Kanals spricht. Zum anderen wurden Ströme abgeleitet, die erst bei relativ hohen

Membranspannungen aktiviert wurden und nur langsam inaktivierten, was für einen oder

mehrere HVA Kanaltypen spricht (L-, N-, P-, Q- und / oder R-Typ Kanäle) (s. Abb. 4.21 A

und B). Durch die Subtraktion der jeweils abgeleiteten Ströme konnte der Anteil des T-Typartigen

Stroms isoliert werden (s. Abb. 4.21 C).

Abb. 4.21: Spermatogonien besitzen spannungsabhängige Ca 2+ -Kanäle. A/B) Repräsentative whole-cell Ca 2+

Ströme aktiviert in Mäuse Spermatogonien durch zwei verschiedene Vorpuls-Protokolle. C) Durch

Differenzbildung kann der Anteil eines T-Typ-artigen Kanals isoliert werden.

89


Ergebnisse

Um die Existenz eines T-Typ Stromes weiter zu bestätigen, wurde Mibefradil verwendet, eine

Substanz, die vorzugsweise Ca 2+ -Kanäle vom T-Typ inhibiert (CaV 3.1, CaV 3.2, CaV 3.3

(Martin et al., 2000)). Die chemische Struktur von Mibefradil, ein Tetralol-Derivat,

unterscheidet sich von anderen Ca 2+ -Antagonisten. Nach Etablierung der whole-cell

Konfiguration und Aktivierung T-Typ-artiger Ca 2+ v-Ströme durch das beschriebene

hyperpolarisierende Vorpuls-Protokoll, konnte durch die Applikation von 10 µM Mibefradil

eine vollständige Inhibition des T-Typ-artigen Kanals erreicht werden (Abb. 4.22 A). Durch

die Subtraktion der Ströme unter Mibefradilbedingungen von denen unter

Kontrollbedingungen, kann der inhibierte Stromanteil des T-Typ Stroms isoliert werden (s.

Abb. 4.22 A, rechts). Bei der Quantifizierung der Stromamplitude konnte gezeigt werden,

dass die zugrunde liegende Kanalaktivierungsschwelle bei ca. -50 mV liegt (s. Abb. 4.22 B).

In Abbildung 4.22 C und D ist die spannungsabhängige Inaktivierungskinetik als

Zeitkonstante Tau eines monoexponentiellen Fits der Gesamtströme (Kontrollbedingungen)

und der isolierten T-Typ Ströme (Kontrollbedingung – Mibefradilbedingungen) aufgetragen.

Abb. 4.22: Mibefradil blockiert T-Typ Kanäle in Spermatogonien. A) Ströme eines Spermatogoniums im

ersten Vorpuls-Protokoll vor und nach Applikation mit 10 µM Mibefradil, sowie der geblockte Anteil des T-Typ

Stroms ermittelt durch Differenzbildung. B) Aktivierungsschwelle des T-Typ Kanals. C) Inaktivierungskinetik

der Gesamtströme. Die Inaktivierungskinetik ist spannungsabhängig. D) Inaktivierungskinetik der isolierten T-

Typströme. Die Inaktivierungskinetik ist spannungsabhängig.

90


Ergebnisse

Das Balkendiagramm in Abbildung 4.23 zeigt den Effekt aller getesteten Pharmaka auf die

transiente Ca 2+ v-Stromkomponente in einer Übersicht. Die Antwortamplitude in Anwesenheit

verschiedener Blocker ist auf die Kontrollbedingungen normiert dargestellt. Lediglich

Mibefradil (n = 5) induziert eine signifikante Reduktion der Amplitude auf 19,8 %. Die

Blockerantwortamplitude von ω Conotoxin MVIIC lag bei 74,6 % (n = 7), von Nimodipine

bei 78,5 % (n = 2), von ω Conotoxin GVIA bei 87 % (n = 2) und von Agatoxin IVa bei 67,5

% (n = 2). Bei ω Conotoxin MVIIC handelt es sich um ein Peptidtoxin der Fische jagenden

Kegelschnecke Conus magnus. Dieser Ca 2+ -Kanal Antagonist blockt N,- P, und Q-Typ

Kanäle. Ein weiteres Toxin aus der Kegelschnecke (Conus geographus) ist ω Conotoxin

GVIA, welches N-Typ Kanäle inhibiert. Agatoxin IVa wird aus dem Gift der

Trichternetzspinne (Agelenopsis aptera) gewonnen und inhibiert P-Typ Kanäle.

Zur näheren Subtypidentifikation des T-Typ Kanals wurden RT-PCR Experimente und

Antikörperfärbungen durchgeführt. Durch die RT-PCR Experimente konnte gezeigt werden,

das Mäuse Spermatogonien den T-Typ Kanal CaV3.2 exprimieren. Aus Mäusen (P7

(postnataler Tag 7) und adult) wurden Gewebeproben entnommen und RNA nach dem in

Abschnitt 3.4.1 beschriebenen Verfahren isoliert. Abbildung 4.23 B zeigt repräsentativ die

Ergebnisse einer RT-PCR mit spezifischen Primern basierend auf der Sequenz von CaV3.2.

Die Spuren 1-4 zeigen PCR Produkte aus Herz (adult), Testis (P7), Testis (adult) und

kultivierten Spermatogonien (P7) cDNA. Die Produkte wurden zur Bestätigung der

molekularen Sequenzidentität sequenziert.

Des Weiteren wurden Doppelantikörperfärbung gegen DAZL und CaV3.2 an Spermatogonien

durchgeführt. Zu erkennen ist in Abbildung 4.23 C (links und Mitte) eine membranständige

Fluoreszenzfärbung, sowohl bei der DAZL Färbung als auch bei der anti-CaV3.2 Färbung.

Abbildung 4.23 C (rechts) zeigt beide Färbungen überlagert. Somit konnte gezeigt werden,

das Spermatogonien den T-Typ Kanal CaV3.2 exprimieren.

91


Ergebnisse

Abb. 4.23: CaV3.2 Proteine sind in Spermatogonien exprimiert. A) Übersicht der getesteten Antagonisten. B)

RT-PCR mit spezifischen Primern basierend auf der Sequenz von CaV3.2. Das Molekulargewicht des Standards

ist links gezeigt. C) Antikörperfärbungen mit DAZL und CaV3.2.

In Abbildung 4.24 wurden verschiedene Ca 2+ v-Kanalblocker in einem

Spannungsrampenprotokoll (- 100 mV bis + 100 mV) getestet. Nach elektrophysiologischer

Identifikation eines T-Typ Kanals anhand einer Aktivierungsschwelle bei ca. -50 mV wurde

10 µM Mibefradil eingewaschen, wodurch es zu einer vollständigen Inhibition des T-Typ

Kanals kam. Dieser Block war, wie in Abbildung 4. 24 A zu sehen ist, reversibel.

Nach Aktivierung des T-Typ Kanals wurden 750 nM ω Conotoxin MVIIC eingewaschen,

wodurch, wie erwartet, kein Block des T-Typ Kanals hervorgerufen wurde (s. Abb. 4.24 B,

Mitte). Als Positivkontrolle wurde ebenfalls 10 µM Mibefradil eingewaschen, was zu einer

direkten Inhibition des T-Typ Kanals führte (s. Abb. 4.24 B, rechts).

92


Ergebnisse

Abb. 4.24: Blockerexperimente des T-Typ Kanals in einem Strom-Rampenprotokoll. A) Einwaschen des

Blockers Mibefradil führt zu einem vollständigen Block des T-Typ Kanals, der teilweise reversibel ist. B)

Einwaschen des Blockers ω Conotoxin MVIIC führt zu keinem Block des T-Typ Kanals.

Wie bereits in Abbildung 4.21 A erkennbar, exprimieren Spermatogonien auch Ca 2+ -Kanäle,

die erst durch positivere Membranspannungen aktiviert werden. Um diese Kanäle zu isolieren

wurde auf einen Vorpuls von -30 mV, gefolgt von weiteren Depolarisationsschritten,

geklemmt (s. Abb. 4.25 A). Die Quantifizierung der induzierten Ströme ergab, dass die

Aktivierungsschwelle bei ca. -20 mV lag (s. Abb. 4.25 B). In Abbildung 4.25 C ist die

Inaktivierungskinetik dieses Stromes aufgetragen. Es lässt sich keine Spannungsabhängigkeit

erkennen. Auch hier wurden zur weiteren Identifizierung und Charakterisierung des Kanals

pharmakologische Tests durchgeführt. Da der abgeleitete Strom den Kriterien eines L-Typ

Kanals entspricht, wurde zuerst Nimodipine, ein L-Typ Blocker, getestet. Die Versuche mit

diesem Blocker zeigten allerdings keine Strominhibition (n = 4). Daher wurden nun

spezifische Blocker für N-, P-, Q- und R-Typ Kanäle getestet. Nach Einwaschen von 750 nM

ω Conotoxin MVIIC konnte eine reversible antagonistische Wirkung beobachtet werden (s.

Abb. 4.25 D, Mitte). Des Weiteren wurde Agatoxin IVa getestet. Dieser Blocker hatte

allerdings, wie in Abbildung 4.25 E zu sehen ist, keinen Effekt.

Das Diagramm in Abbildung 4.25 F zeigt alle getesteten Blocker in einer Übersicht. Nur ω

Conotoxin MVIIC (n = 7) inhibiert mit einer normierten Restamplitude von 29 % diesen

Kanal. Werden die extrazellulären Kationen durch NMDG ersetzt, bleibt nur eine

Restamplitude von 26 % übrig (n = 3). Die Antwortamplitude unter Nimodipine lag bei 85,8

% (n = 4), unter ω Conotoxin GVIA bei 96,7 % (n = 4) und unter Agatoxin IVa bei 96 % (n =

6).

93


Ergebnisse

Abb. 4.25: Spermatogonien besitzen Ca 2+ -Kanäle, die durch hohe Membranspannung aktiviert werden.

A) Aktivierung des Kanals durch das 2. Vorpuls-Protokoll. B) Aktivierungsschwelle des Kanals. C)

Inaktivierungskinetik des Kanals. D) Einwaschen des Blockers ω Conotoxin MVIIC führt zu einem Block des

Kanals. E) Einwaschen des Blockers Agatoxin IVa führt zu keinem Block des Kanals. F) Übersicht aller

getesteten Blocker.

Abbildung 4.26 zeigt pharmakologische Experimente auf Basis des geschilderten

Spannungsrampenprotokolls (s. o.) zur Identifikation von sowohl LVA, als auch HVA Ca 2+ v-

Kanälen, potentiell exprimiert in den gleichen Zellen. Nach Identifikation von nicht näher

spezifizierten HVA Ca 2+ v-Kanälen wurde 750 nM ω Conotoxin MVIIC eingewaschen,

wodurch eine deutliche Stromreduktion erreicht wurde. Ein ebenfalls aktivierter LVA Ca 2+ v-

Kanal wurde nicht inhibiert. Durch Auswaschen des Inhibitors konnte die Reversibilität

dieses Kanalblocks gezeigt werden (s. Abb. 4.25 A).

94


Ergebnisse

Außerdem wurden ω Conotoxin GVIA sowie ω Agatoxin IVa getestet. Beide spezifischen

Ca 2+ v-Kanalinhibitoren (N- bzw. P/Q-Typ) zeigten keinen Effekt, weder auf den LVA-, noch

den HVA-Strom.

Abb. 4.26: Blockerexperimente des T-Typ Kanals und des noch nicht identifizierten Kanals in einem

Strom-Rampenprotokoll. A) Einwaschen des Blockers ω Conotoxin MVIIC führt zu einem Block des noch

nicht identifizierten Kanals, nicht aber des T-Typ Kanals. B/C) Einwaschen der Blocker ω Conotoxin GVIA und

Agatoxin IVa führt zu keinem Block in beiden Typen.

Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass Spermatogonien sowohl Ca 2+ v-Kanäle des

Typs 3.2 exprimieren, die bei vergleichsweise niedrigen Depolarisationen aktiviert werden

und eine schnelle Inaktivierung zeigen, als auch HVA Ca 2+ v-Kanäle, deren molekulare

Identität noch nicht genau bestimmt werden konnte. Insgesamt konnten in 22 % aller

getesteten Zellen Ca 2+ v-Ströme (n = 745 Zellen, davon 159 Zellen mit Ca 2+ v-Strom)

beobachtet werden, wovon 69 % T-Typ Kanäle (n = 109 Zellen) waren und 31 % Ca 2+ v-

Kanäle (n = 50 Zellen) die durch hohe Membranspannung aktiviert werden konnten. In 7,5 %

der Zellen (n = 12) konnten beide Ca 2+ v-Kanal Typen beobachtet werden.

95


Ergebnisse

Beide Arten von Ca 2+ v-Strömen wurden vor allem an den Tagen 7-9 in Kultur gemessen.

Die Wahrscheinlichkeit Ca 2+ v-Kanäle in kultivierten Spermatogonien nachzuweisen stieg

proportional zur jeweiligen Kultivierungsdauer. An den Tagen 3 und 4 in Kultur konnten

lediglich je eine Zelle mit deutlich erkennbaren Ca 2+ v-Strömen identifiziert werden.

4.2.5 Messung von Ca 2+ -Einzelkanälen

Auch unter den Bedingungen für Ca 2+ v-Kanäle, war es möglich Einzelkanäle zu messen.

Abb. 4.27: Messung von Ca 2+ Einzelkanälen

96


4.2.6 Der Effekt von 2-APB und Capsazepine auf Spermatogonien

Ergebnisse

In allen untersuchten Kulturen konnten Ströme abgeleitet werden, die aufgrund ihrer

individuellen Strom-Spannungs-Kennlinien nicht eindeutig als „klassische“

spannungsaktivierte Ionenkanäle identifizieren werden konnten. Da die gemessenen

Kennlinien (s. Abb. 4.28 A-D, Kontrollspur (links)) Ähnlichkeiten mit TRP-Kanälen

aufwiesen, wurden die Blocker 2-APB und Capsazepine getestet. Der Antagonist 2-APB

blockt in der TRPC Familie TRPC1-6, sowie in der TRPM Familie TRPM2-3 und TRPM8.

Der Antagonist Capsazepine hingegen blockt in der TRPM Familie TRPM8, sowie in der

TRPV Familie TRPV1 (siehe www.clapham.tch.harvard.edu). Für die Versuche wurde 2-

APB in einer Konzentration von 50 µM eingesetzt und Capsazepine in einer Konzentration

von 20 µM. Spannungsrampen von -100 mV bis +100 mV zeigten, das sich in 51 % aller

gemessenen Zellen Ströme durch 2-APB blockieren ließen (n = 34/67) (s. Abb. 4.28 A). Des

Weiteren konnte in 26 % aller gemessenen Zellen (n = 16/61) ein Effekt von Capsazepine

beobachtet werden (s. Abb. 4.28 B). In Experimenten, bei denen die Wirkung beider

Antagonisten in denselben Spermatogonien untersucht wurde, zeigte, dass eine individuelle

Zelle entweder nur durch 2-APB (s. Abb. 4.28 D, n = 8) oder nur durch Capsazepine inhibiert

wurde (s. Abb. 4.28 C, n = 2). Keine der getesteten Zellen ließ sich durch beide Antagonisten

beeinflussen.

Zur weiteren Untersuchung wurde mit Ruthenium Rot ein dritter, vergleichsweise

unspezifischer Antagonist getestet. Ruthenium Rot inhibiert TRPC3, TRPM6 und TRPV1-6

(www.clapham.tch.harvard.edu). Keine der getesteten Zellen wurde durch Ruthenium Rot

inhibiert.

97


Ergebnisse

Abb. 4.28: Der Effekt von 2-APB und Capsazepine auf Spermatogonien. A) Blockierung der Ströme durch

50 µM 2-APB. B) Blockierung der Ströme durch 20 µM Capsazepine. C) Blockierung der Ströme durch 20 µM

Capsazepine, aber nicht durch 50 µM 2-APB. D) Blockierung der Ströme durch 50 µM 2-APB, aber nicht durch

20 µM Capsazepine.

98


4.3 ATP Rezeptoren in Spermatogonien

Ergebnisse

Als Stammzellen teilen sich Spermatogonien fortlaufend (mitotische Proliferation), um einen

Reservepool für die Spermatogenese zu bilden. Neben neuen Stammzellen können auch

primäre Spermatozyten aus den Spermatogonien hervorgehen, die sich in einer Meiose zu

reifen Spermien differenzieren. Bislang ist unklar, welche Signale die mitotische Proliferation

und/oder die Ausdifferenzierung induzieren oder beeinflussen. Ebenso unbekannt ist, ob

Spermatogonien untereinander oder auch mit den benachbarten Zelltypen, wie z.B. Sertoli

Zellen, kommunizieren. Von Neuronen ist bekannt, das sie untereinander auf chemischem

Weg kommunizieren und dafür so genannte Neurotransmitter nutzen, wie z.B. GABA,

Glutamat oder Acetylcholin. Diese Neurotransmitter werden häufig an den Synapsen, die als

Schnittstellen der neuronalen Kommunikation die Nervenzellen verbinden, freigesetzt.

Da es sich bei Spermatogonien nicht um Neurone handelt, wurde hier untersucht, ob das

ubiquitäre ATP eine Rolle bei der Zellkommunikation spielt. Obwohl lange diskutiert, ist

inzwischen die Funktion von ATP, dem wichtigsten Energielieferanten der Zelle, als

extrazellulärer Signalstoff bewiesen. Zudem wurden verschiedene Freisetzungsprozesse

beschrieben (vesikuläre Freisetzung, ABC („ATP-binding cassette“) -Transporter, Connexin

oder Pannexin Halbkanäle) (Abbracchio et al., 2009), die ATP auch als Botenstoff für Zellen

ohne synaptische Strukturen interessant machen.

4.3.1 ATP-induzierte Ströme in Spermatogonien

Um zu überprüfen, ob Spermatogonien ATP Rezeptoren exprimieren, wurden die Zellen mit

extrazellulärem ATP (100 µM) stimuliert. In diesen Experimenten antworteten 51,5 % der

getesteten Zellen (n = 232/451) auf ATP Zugabe. Die Stimulation mit verschiedenen ATP

Konzentrationen zeigte, dass das Antwortverhalten der Spermatogonien dosisabhängig ist. Es

wurde ATP in den Konzentrationen von 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM und 100 µM getestet (s.

Abb. 4.29 A). Das Interstimulus Intervall betrug 60 s. Insgesamt wurden 33 Zellen gemessen

und die gemittelten, absoluten Maximalamplituden sind in Abb. 4.29 B dargestellt. Die

gemittelten, normalisierten Maximalamplituden konnten mit Hilfe der Hill Gleichung gefittet

werden (s. Abb. 4.29 C). Es ergab sich ein EC50 Wert von etwa 5 µM.

Um zu klären, ob Spermatogonien auch auf andere Neurotransmitter reagieren, wurden

GABA, Glutamat, Acetylcholin, Glycin und Serotonin getestet. Bei allen Versuchen mit

diesen Neurotransmittern konnten keine Ströme in Spermatogonien beobachtet werden

99


Ergebnisse

Abb. 4.29.: Spermatogonien antworten dosisabhängig auf ATP. A) Mit verschiedenen ATP Konzentrationen

induzierte Ströme in Spermatogonien. Haltepotential -60 mV. B) ATP Dosis-Wirkungsbeziehung, absolute

Ströme. C) ATP Dosis-Wirkungsbeziehung, normalisierte Ströme.

Um das Desensitisierungsverhalten der ATP-induzierten Ströme zu untersuchen, wurden

Versuche mit zunehmender Applikationsdauer durchgeführt. Ausgehend von einer

Applikationsdauer von 100 ms wurde die Stimulationszeit jeweils um das 2,5 fache erhöht

(250 ms, 625 ms, 1,5 s und ca. 4 s, Interstimulus Intervall 60 s). Die ATP Konzentration

betrug immer 100 µM. Es wurden zwei verschiedene Antwortverhalten beobachtet.

Abbildung 4.30 A zeigt beispielhaft eine Zelle, bei der alle Applikationen einen Strom

induzieren, jedoch ändert sich die Form der Antwort mit verlängerter Applikationsdauer. Bei

den ersten drei Stimuluslängen ist keine Desensitisierung erkennbar, erst ab einer

Stimulationszeit von 1,5 s desensitisiert der Strom leicht. Wird die Zelle 4 s stimuliert, tritt

eine deutliche Desensitisierung in Gegenwart des Agonisten auf (n = 11).

Abbildung 4.30 B zeigt eine Zelle des anderen Typs, bei der die Amplitude des ATPinduzierten

Stroms mit zunehmender Stimuluslänge immer weiter abnimmt. Wird für 1,5 s

und 4 s stimuliert, können keine klar erkennbaren Ströme induziert werden (n = 15).

100


Ergebnisse

Abb. 4.30: Experimente mit verlängerter ATP Applikationsdauer. A) Zelltyp 1: mit verlängerter

Applikationsdauer ändert sich vor allem die Form der ATP-induzierten Antwort. B) Zelltyp 2: mit verlängerter

Applikationsdauer ändert sich vor allem die Amplitude der ATP-induzierten Antwort.

Um die Purinrezeptor-Expression näher zu charakterisieren, wurden verschiedene

antagonistisch wirkende Pharmaka getestet. Zuvor wurden Kontrollexperimente durchgeführt,

um eine mögliche Desensitisierung der Antwort zu untersuchen. Nur Zellen, deren ATPinduzierten

Ströme keine Desensitisierung zeigen, sind für die Analyse der Inhibitoreffekte

geeignet. ATP wurde in einer Konzentration von 30 µM appliziert, gefolgt von weiteren

Stimulationen mit kürzer werdenden Interstimulus Intervallen (3 min, 1 min, 20 s).

Wie man in Abbildung 4.31 A erkennen kann, ist ein Interstimulus Intervall von 3 min

geeignet, da keine Desensitisierungseffekte auftreten. Im Gegensatz dazu ist bei einem

Interstimulus Intervall von 1 min und von 20 s eine deutliche Desensitisierung zu beobachten.

Die Amplitude der ATP Antwort betrug am Anfang des Experiments 39 pA, 3 min nach

vorheriger Applikation 38,5 pA, 1 min nach vorheriger Applikation 14,5 pA und 20 s nach

vorheriger Applikation 6 pA (s. Abb. 4.31 B, n = 12).

Für alle nachfolgenden Blockerexperimente wurde das Interstimulus Intervall von 3 min

zwischen ATP und ATP + Inhibitor Applikation verwendet.

101


Ergebnisse

Abb. 4.31: Kontrollexperiment mit einer Verkürzung des Interstimulus Intervalls. A) ATP-induzierte

Antworten nach Verkürzung des Interstimulus Intervalls von 3 min, zu 1 min, zu 20 s. B) Amplitude der ATP

induzierten Antwort nach 1. Applikation, 3 min nach vorheriger Applikation, 1 min nach vorheriger Applikation

und 20 s nach vorheriger Applikation.

4.3.2 Pharmakologisches Profil der ATP-induzierten Antworten

Zur Charakterisierung der ATP Rezeptoren wurden zwei verschiedene Antagonisten der P2

Rezeptorfamilie getestet, Suramin und TNP-ATP. Bei Suramin handelt es sich um einen

relativ unspezifischen Antagonisten für verschiedene Rezeptoren der P2X Familie. Geblockt

werden die homomeren Rezeptoren P2X1-7 und der heteromere Rezeptor P2X2/6. TNP-ATP

hingegen blockt P2X1-4, P2X7, P2X2/3 und P2X1/5 (Dunn et al., 2001). Beide Antagonisten

wurden in Konzentrationen eingesetzt, die diese Rezeptoren inhibieren (Suramin = 50 µM,

TNP-ATP = 10 µM). Nach erstmaliger Gabe von ATP in einer Konzentration von 30 µM für

5 s, wurde nach 3 min ATP und Suramin koappliziert, ebenfalls für 5 s. Alle getesteten Zellen

(n = 21) zeigten einen Blockereffekt nach ATP/Suramin Applikation (s. Abb. 4.32 A). Die

Amplitude der ATP Antwort wurde um ca. 46 % nach Suramin Applikation verringert (s.

Abb. 4.32 B).

Des Weiteren wurde TNP-ATP getestet, auch hier folgte nach erstmaliger Gabe von ATP

nach 3 min eine Koapplikation von ATP und TNP-ATP. Insgesamt wurden 28 Zellen getestet,

in 13 dieser Zellen konnte ein Blockeffekt von TNP-ATP registriert werden (s. Abb. 4.32 C).

102


Ergebnisse

Die Amplitude der ATP Antwort wurde in Gegenwart von TNP-ATP um 35 % verringert (s.

Abb. 4.32 D). Die ATP-induzierten Ströme der übrigen 15 Zellen hingegen wurden nicht von

TNP-ATP verringert, sondern (s. Abb. 4.32 E) sogar um 12 % vergrößert (s. Abb. 4.32 F).

Abb. 4.32: Die Wirkung der Antagonisten Suramin und TNP-ATP auf die ATP-induzierte Antwort in

Spermatogonien. A) Blockereffekt von Suramin auf die ATP-induzierte Antwort. B) Amplitude der ATPinduzierten

Antwort vor und während der Suramin Applikation. C) Blockereffekt von TNP-ATP auf die ATPinduzierte

Antwort. D) Amplitude der ATP-induzierten Antwort vor und während der TNP-ATP Applikation.

E) Kein Blockereffekt von TNP-ATP auf die ATP-induzierten Antwort. F) Amplitude der ATP-induzierten

Antwort vor und während der TNP-ATP Applikation.

4.3.3 Experimente mit verschiedenen Extrazellulärlösungen

Da es nur wenige selektive P2X Antagonisten gibt, ist eine genaue Charakterisierung der P2X

Rezeptoren nicht möglich. Es ist allerdings bekannt, dass verschieden P2X Rezeptoren

sensitiv auf einige Ionen (z.B. Ca 2+ , Mg 2+ , Zn) reagieren (North und Surprenant, 2000). Aus

103


Ergebnisse

diesem Grund wurden Experimente mit verschiedenen Extrazellulärlösungen durchgeführt,

um die vorhandenen ATP Rezeptoren weiter zu charakterisieren. Für diese Experimente

wurden drei verschiedene Lösungen verwendet, die sich in ihrem Ca 2+ und Na + -Gehalt

unterschieden. Zum einen wurde eine Lösung mit wenig Ca 2+ untersucht (freie Ca 2+ -

Konzentration 470 nM). Zum anderen wurden zwei verschiedene Na + -freie Lösungen (Na + -

frei 1 und Na + -frei 2) verwendet. Diese beiden Lösungen unterschieden sich nur im Ca 2+ -

Gehalt, die Na + -freie Lösung 2 enthielt mehr Ca 2+ (10 mM) als die Na + -freie Lösung 1 (1

mM). Die ausgewerteten Antwortamplituden wurden in %, normalisiert an den

Kontrollbedingungen dargestellt (s. Abb. 4.33 B, D, F).

Nach erstmaliger Applikation von ATP (30 µM) in normaler Salzlösung (Kontrollbedingung,

100 %) für 5 s folgte nach 3 min eine ATP Applikation in der Lösung mit niedriger Ca 2+ -

Konzentration, ebenfalls für 5 s. Die Antwortamplitude wurde unter diesen Bedingungen fast

halbiert (Antwortamplitude = 57 %, n = 15, s. Abb. 4.33 A Mitte und B). Danach folgte

wieder nach 3 min eine ATP Gabe in der Na + -freien Lösung 1. Die Antwortamplitude war

äußerst gering oder gar nicht mehr vorhanden (Antwortamplitude = 5 %, n = 15) wie man in

Abbildung 4.33 A und B erkennen kann. Um eine mögliche Desensitisierung der Antwort

auszuschließen, wurden die Lösungen außerdem in einer anderen Reihenfolge getestet. Wie

man aber in Abbildung 4.33 C und D sehen kann, handelt es sich nicht um einen

Desensitisierungseffekt (Antwortamplitude Na + -freie Lösung 1 = 4,5 %, Antwortamplitude

Lösung mit wenig Ca 2+ 50 %, n = 11). Die Ergebnisse sind nahezu identisch zu den

Ergebnissen zuvor.

Versuche mit der zweiten Na + -freien Lösung zeigten ebenfalls äußerst geringe oder gar keine

Antwortamplituden (Antwortamplitude = 3 %, s. Abb. 4.33 E und F, n = 11). Diese

Ergebnisse zeigen, dass extrazelluläres Na + benötigt wird, um ATP Rezeptoren zu aktivieren.

Ca 2+ scheint auf die hier vorhandenen P2X Rezeptoren in den verwendeten Konzentrationen

keinen Blockereffekt zu haben.

104


Ergebnisse

Abb. 4.33: Die Wirkung verschiedener Extrazellulärlösungen auf die ATP-induzierte Antwort in

Spermatogonien. A) Der Effekt von einer Lösung mit wenig Ca 2+ und Na + freier Lösung 1 auf die ATPinduzierte

Antwort. B) Antwortamplitude in % nach Applikation verschiedener Lösungen normalisiert an

Kontrollbedingungen. C) Der Effekt von Na + freier Lösung 1 und einer Lösung mit wenig Ca 2+ auf die ATPinduzierte

Antwort. D) Antwortamplitude in % nach Applikation verschiedener Lösungen normalisiert an

Kontrollbedingungen. E) Der Effekt von Na + freier Lösung 2 auf die ATP-induzierte Antwort.

F) Antwortamplitude in % nach Applikation von Na + freier Lösung 2 normalisiert an Kontrollbedingungen.

4.3.4 Expression von P2X Rezeptoren in Spermatogonien

Zur weiteren Identifizierung der P2X Rezeptoren wurden RT-PCR Experimente durchgeführt.

Diese Experimente ergaben eine Expression von P2X3 in Spermatogonien. Die Ergebnisse

sind repräsentativ in der nachfolgenden Abbildung dargestellt (s. Abb. 4.34). Die PCR wurde

mit spezifischen Primern basierend auf der Sequenz von P2X3 durchgeführt. Dies ergab aus

cDNA von Gehirn (adult), Herz (adult), Testis (P7/adult) und kultivierte Spermatogonien (P7)

PCR Produkte mit einer Größe von ~ 350 bp. Als Negativkontrolle dienten HEK293-Zellen

und H2O, wobei keine PCR Produkte entstanden.

105


Abb. 4.34: RT-PCR mit spezifischen Primern basierend auf der Sequenz von P2X3.

.

Ergebnisse

106


5. Diskussion

Diskussion

Seit der Entdeckung olfaktorischer Rezeptorproteine im Riechepithel von Säugetieren (Buck

und Axel, 1991) konnte die Expression von OR Genen ebenfalls in nicht olfaktorischen

Geweben gezeigt werden, einschließlich Testes und Spermien (Parmentier et al., 1992;

Vanderhaeghen et al., 1997). Spermien OR scheinen eine (oder mehrere) Funktion(en) in dem

komplexen Prozess der Fertilisation auszuüben. Diese Hypothese konnte 2003 erstmals

anhand der Identifikation sowohl eines humanen testikulären OR als Spermienrezeptor

(OR1D2), als auch eines OR1D2-spezifischen chemotaktisch und chemokinetisch aktiven

Liganden (Bourgeonal) untermauert werden (Spehr et al., 2003). Allerdings sind die genauen

physiologischen Prozesse der Spermien-Eizell Kommunikation bislang weitestgehend

unaufgeklärt, so dass ektopisch exprimierte olfaktorische Rezeptoren in humanen Spermien

ein interessantes Forschungsgebiet darstellen, um neue Erkenntnisse über die Fertilisation in

Säugetieren zu gewinnen.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit habe ich mich mit der funktionalen Charakterisierung des

humanen testikulären olfaktorischen Rezeptors OR1D2, sowie mit der Identifikation von

endogen vorkommenden potentiellen Liganden beschäftigt. Diese Studien sind besonders im

Kontext fertilisationsrelevanter chemischer Kommunikationsprozesse von grundlegendem

wissenschaftlichem Interesse. Die Untersuchungen wurden sowohl im heterologen (HEK293-

Zellen), wie auch im nativen System (humane Spermien) durchgeführt. Dabei besteht eine

grundsätzliche Schwierigkeit bei der heterologen OR Expression darin, dass die rekombinant

exprimierten Proteine oft nur unzureichend in die Plasmamembran eingebaut werden. Gerade

Riechrezeptoren verbleiben oft in großen Mengen in den Membranen des ER oder Golgi

Apparates (Ivic et al., 2002).

Neben den Untersuchungen über die Rolle von Riechrezeptorproteinen in reifen männlichen

Keimzellen, habe ich mich der elektrophysiologischen Charakterisierung von Spermatogonien

gewidmet, um grundlegende Membranpotential-abhängige Eigenschaften dieses nur

rudimentär beschriebenen Spermienvorläufer-Zelltyps aufzuklären.

5.1 Das rezeptive Feld von OR1D2

Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Charakterisierung und Erweiterung des

molekularen rezeptiven Feldes des humanen olfaktorischen „Spermienrezeptors“ OR1D2, um

neue Informationen über die Struktur der Ligandenbindetasche dieses ektopisch exprimierten

107


Diskussion

Rezeptors zu erhalten. Bei OR1D2 handelt es sich um einen der wenigen olfaktorischen

Rezeptoren, deren molekulares rezeptives Feld durch rekombinante Struktur-

Funktionsanalysen bereits in Teilen beschrieben wurde (Spehr et al., 2003). Dieser Datensatz,

sowie die Ergebnisse ähnlicher Untersuchungen anderer Gruppen (Malnic et al., 1999;

Araneda et al., 2001), lassen vermuten, dass einerseits eine enge Korrelation zwischen

strukturellen Ligandenparametern und dem jeweiligen Aktivierungspotential am Rezeptor

vorliegt, und andererseits Substanzen, die einen bestimmten OR aktivieren, einen ähnlichen

Duftstoffcharakter besitzen.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit untermauern, dass die Bindungsstelle von OR1D2

eine starke Präferenz für Aldehyde besitzt, da nur sehr wenige nicht-aldehydische Duftstoffe

gefunden wurden, die den Rezeptor aktivieren, wie z.B. das Keton 6739. Ersetzt man bsp. bei

aktiven Substanzen die funktionale Aldehydgruppe durch eine Keto- (bsp. 14610) oder

Amidgruppe (2832), resultiert aus dieser Modifikation ein inaktiver Duftstoff. Auch bei den

getesteten Nitrilen (bsp. 24854) handelt es sich um inaktive Substanzen. Die Existenz einer

aromatischen Ringstruktur scheint ebenfalls wichtig für eine Ligandenaktivität zu sein. In

vielen Fällen resultiert die totale oder teilweise Hydrogenierung des aromatischen Ringes in

einem Verlust der Aktivität, was bsp. anhand der teilweise hydrogenisierten inaktiven

Substanz 22083 verdeutlicht wird. Es konnten allerdings auch aktive Duftstoffe, wie z.B.

24801 (s. Abschnitt 4.1, Abb. 4.1) identifiziert werden, deren Ligandenaktivität nicht zu

erwarten war. Dieser aktive Duftstoff weist eine der inaktiven Substanz 22650 sehr ähnliche

chemische Struktur auf.

Zusammengefasst konnte das rezeptive Feld von OR1D2 signifikant erweitert werden. Analog

zu den Ergebnissen von Spehr et al., 2003 konnte dabei bestätigt werden, dass der Aromat

bzw. die Ringstruktur, sowie die Länge der Kohlenstoffkette zwischen Ring und funktioneller

Gruppe (i.d.R. eine Aldehydgruppe) entscheidend für die Aktivität eines potentiellen

Liganden zu sein scheint. Durch weitere Untersuchungen identifizierter aktiver Substanzen,

die an verschiedenen Positionen strukturell verändert werden, könnten die aktivierenden

chemischen Strukturen weiter eingegrenzt und bsp. einem Rhodopsin-basierten

Bindetaschestrukturmodell zugrunde gelegt werden. Analoge Ansätze werden am Lehrstuhl

für Zellphysiologie bereits für andere humane Rezeptoren verfolgt (Gelis et al., in

Vorbereitung).

108


5.1.2 Messung von Silizium-Analoga der OR1D2-Agonisten Bourgeonal und Lilial

Diskussion

Gezielte strukturelle Veränderungen wurden ebenfalls an den OR1D2 Liganden Bourgeonal

und Lilial vorgenommen. Beide Duftstoffe gehören zu den potentesten bislang beschriebenen

OR1D2-Aktivatoren. Daher wurden bei diesen Substanzen die Auswirkungen des

Austausches eines para-ständigen Kohlenstoffatoms gegen ein Siliziumatom untersucht. Ein

im Rahmen einer Kollaboration mit Leszek Doszczak und Reinhold Tacke aufgestelltes

Homologiemodell der OR1D2 Rezeptorbindetasche zeigte, dass sowohl „konventionelle“

Liganden, als auch die untersuchten Silizium-Analoga in sehr ähnlichen Positionen gebunden

werden. Die Siliziumanaloga zeigen dabei allerdings niedrigere Bindungsenergien als die

Kohlenstoff-Verbindungen.

An OR1D2-exprimierenden HEK293-Zellen konnte nachfolgend gezeigt werden, dass die

Siliziumanaloga von Bourgeonal und Lilial den Rezeptor OR1D2 tatsächlich aktivieren, und

diese Ergebnisse konnten auch auf das native System (humane Spermien) übertragen werden.

Des Weiteren wurde die Wirkung des Kohlestoffaustausches auf die antagonistische Wirkung

von Undekanal untersucht. Die durchgeführten Experimente zeigten, dass Undekanal

ebenfalls eine antagonistische Wirkung bei Koapplikation von Sila-Bourgeonal ausübt

(s. Abschnitt 4.1.1, Abb. 4.2). Somit scheint der Austausch des Kohlenstoffatoms gegen ein

Siliziumatom nicht für die Funktionalität der Duftstoffe entscheidend zu sein.

Es gibt verschiedene Theorien, wie Duftmoleküle die Geruchswahrnehmung hervorrufen.

Dazu zählt zum einen die Modellvorstellung, dass, analog eines „Schlüssel-Schloss-Prinzips“

die Oberflächenstruktur eines Moleküls (sterisches Modell) für die Rezeptoraktivierung

entscheidend ist. Eine andere, experimentell nicht bestätigte Theorie besagt, dass die

Vibration eines Moleküls die Rezeptoraktivierung bewirkt. Diese Vibrationstheorie (Luca

Turin) basiert auf einem quantenmechanischen Phänomen, demnach durch Moleküle

schwache Ströme (Tunnelströme) fließen können, die durch Schwingungen der Moleküle

verstärkt oder abgeschwächt werden. Gemäß der Vibrationstheorie fließt bei der Duftstoff-

Rezeptor Wechselwirkung zwischen elektronenreichen und elektronenarmen Regionen des

Rezeptors ein Tunnelstrom, der dann zu der Duftwahrnehmung führen soll.

Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass die

Oberflächenstruktur eines Moleküls ausschlaggebend dafür ist, die Wechselwirkung eines

Duftstoffes mit dem dazugehörigen Rezeptor zu bestimmen und nicht die Vibration des

Moleküls.

109


5.2 Screening natürlicher Duftstoffe

Diskussion

Da alle bisher gefundenen agonistischen Duftmoleküle für den Rezeptor OR1D2 synthetisch

produzierte Substanzen sind, die als Naturstoffe nicht vorkommen, ist eine entscheidende

Frage, welche die im physiologischen System wirkenden natürlichen Aktivatoren sind und

von welchen Zellen diese produziert und ggf. sezerniert werden. Um diesen Fragen

nachzugehen, habe ich im Folgeprojekt nach dem/den natürlich vorkommenden Liganden

gesucht. Dabei wurden die Aktivitätsprofile von Vaginal- und Follikelflüssigkeit an

rekombinant exprimierten Spermienrezeptoren mit Hilfe bildgebender Verfahren bestimmt

und aktive Substanzfraktionen nach verschiedenen chemischen Kriterien aufgearbeitet, um

deren aktive molekularen Komponenten bestimmen zu können.

Follikelflüssigkeit beinhaltet sowohl Sekrete der Eizelle, als auch der umliegenden Zellen des

Cumulus oopharus, sowie eine Vielzahl weiterer bioaktiver Substanzen (Rom et al., 1987;

Vanluchene et al., 1991). In verschiedenen experimentellen Ansätzen konnte gezeigt werden,

dass Follikelflüssigkeit die Spermienphysiologie und -bewegung beeinflusst (Eisenbach et al.,

1992; Chao et al., 1991). Des Weiteren stimuliert Follikelflüssigkeit die chemotaktische und

chemokinetische Aktivität, sowie die Hyperaktivität von Spermien (Ralt et al., 1994).

Die hier durchgeführten Untersuchungen an respektive OR1D2, OR4D1, OR7A5 oder PSGRexprimierenden

HEK293-Zellen führten zur Identifikation von vier verschiedenen, potentiell

endogen aktiven Liganden (1-Octen-3-on und Buttersäure (OR1D2), Furaneol (OR7A5) und

5-α-Androst-16-en (OR4D1)). Nach der Identifizierung der Liganden im rekombinanten

System, konnten die gezeigten Aktivierungsprofile auch auf das native System (humane

Spermien) übertragen werden (s. Abschnitt 4.1.2.1, Abb. 4.8; 4.9; 4.10; 4.13). Alle

identifizierten Liganden aktivierten humane Spermien. In dieser Arbeit konnten damit

erstmalig natürlich vorkommende Duftstoffe identifiziert werden, die von Spermien

exprimierte OR im rekombinanten System aktivieren und gleichzeitig transiente Ca 2+ -

Antworten in humanen Spermien induzieren. Die physiologische Funktion der einzelnen

Substanzen in vivo konnte im zeitlichen Rahmen der vorliegenden Arbeit allerdings nicht

geklärt werden.

Überraschenderweise besitzen einige der endogen aktiven Liganden nicht die strukturellen

Eigenschaften, die laut unserer Studien entscheidend für die Aktivität eines potentiellen

Liganden sein sollten (s. o.). Dazu gehören Buttersäure und 5-α-Androst-16-en. Allerdings ist

es nicht abwegig, dass Buttersäure und 5-α-Androst-16-en Liganden sind, da sich auf dem

Weg des Spermiums bis zur Eizelle im weiblichen Genitaltrakt der pH-Wert verschiebt, wofür

110


Diskussion

Buttersäure verantwortlich sein könnte und somit die Spermien leitet. Des Weiteren ändern

sich auch die Hormone und Hormonkonzentrationen auf diesem Weg, wobei dann 5-α-

Androst-16-en eine Rolle spielen könnte.

Das zielgerichtete Schwimmen von Spermien entlang eines Konzentrationsgradienten im

weiblichen Genitaltrakt spielt eine große Rolle bei der Fertilisation (Spehr und Hatt, 2004;

2005). In der Zukunft wird es daher gerade im Kontext der Spermien-Eizell Kommunikation

interessant sein zu testen, ob die hier identifizierten endogenen OR-Liganden in humanen

Spermien chemotaktische und chemokinetische Bewegungen auslösen. Sollte dies der Fall

sein, könnte die Identifikation antagonistischer Duftmoleküle eine hormonfreie Alternative zu

bisherigen Kontrazeptiva darstellen. Ebenfalls könnten „maßgeschneiderte“ Analoga

endogener Liganden zur Verbesserung der Erfolgschancen bei der in-vitro-Fertilisation

beitragen.

5.3 Elektrophysiologische Charakterisierung von Spermatogonien der Maus

Die Spermatogenese ist ein komplexer zellulärer Vorgang, bei dem sich die diploiden

Stammzellen (Spermatogonien) differenzieren und durch Mitose und Meiose an spezifischen

Zeitpunkten innerhalb des spermatogenischen Zyklus teilen, um haploide Spermatozoen zu

erzeugen. Damit dieser komplexe Vorgang in einer geregelten Weise abläuft, müssen

Zelldifferenzierung und -teilung präzise durch chemische Signale kontrolliert werden. Die

relevanten Signalsubstanzen werden dabei entweder von Zellen innerhalb der

Samenkanälchen (Tubuli seminiferi) abgegeben oder von extratubulären Zellen (bsp. Leydig-

Zellen) sezerniert, wobei letztere durch die sog. „Blut-Hoden-Schranke“ nur peripher

lokalisierte Zelltypen innerhalb der Tubuli erreichen können. Im Kontext chemischer

Kommunikation verschiedener Keimzelltypen scheinen Änderungen des Membranpotentials

der Stammzellen einen wichtigen Teil der Signalmechanismen darzustellen (Gong et al.,

2002).

Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit habe ich mich mit der elektrophysiologischen

Charakterisierung von Spermatogonien befasst, da die elektrophysiologischen Eigenschaften

dieses Zelltyps bislang unaufgeklärt sind. Hierfür wurde ein Kokultursystem von Sertolizellen

und Spermatogonien etabliert. Die Identifikation der Spermatogonien im Kultursystem

erfolgte mittels immunzytochemischer Fluoreszenzfärbungen (s. Abschnitt 4.2, Abb. 4.15).

111


5.3.1 Untersuchung von spannungsabhängigen Kaliumkanälen

Diskussion

Die elektrophysiologischen Eigenschaften der Spermatogonien wurden mit Hilfe der Patchclamp

Technik in der „whole-cell“ Konfiguration charakterisiert. Mittels dieser Methode

konnten zwei verschiedene Typen spannungsabhängiger Kaliumkanäle identifiziert werden.

Hierbei handelt es sich um A-Typ Kanäle und ‚delayed rectifier’ Kanäle (s. Abschnitt, Abb.

4.17; 4.19) die sich vor allem durch ihre Aktivierungs- und Inaktivierungskinetiken

unterscheiden. A-Typ Kanäle werden oft in Nervenzellen beschrieben, da sie es Neuronen

ermöglichen, bei niedrigen Frequenzen rhythmisch zu feuern (Connor und Stevens, 1971),

d.h. sie reagieren auf langandauernde Depolarisation mit einer Reihe von Aktionspotentialen.

Außerdem spielen A-Typ Kanäle eine Rolle bei der Umwandlung der Aktionspotentialform

(Zhang und McBain, 1995b) und kontrollieren die Signalausbreitung in Dendriten (Hoffman

et al., 1997). ‚Delayed rectifier’ Kanäle kommen neben Neuronen häufig in kardialen

Geweben vor. In der vorliegenden Arbeit konnte die Identität dieser Kanaltypen sowohl

anhand charakteristischer Strom-Spannungs-Kennlinien, als auch durch pharmakologische

Untersuchungen bestätigt werden. A-Typ Kanäle reagieren sensitiv auf 4-AP (s. Abschnitt

4.2.2, Abb. 4.18) in einem Konzentrationsbereich von 3-10 mM und sind insensitiv gegenüber

TEA. ‚Delayed rectifier’ Kanäle werden, bsp. in Neuronen (Jackson und Bean, 2007) oder

glatter Muskulatur (Mc Gahon et al., 2005), durch den nichtselektiven Kaliumkanalblocker

TEA inhibiert (s. Abschnitt 4.2.2, Abb. 4.19).

Die biologische Signifikanz der Expression spannungsaktivierter Kaliumkanäle in

Spermatogonien muss in zukünftigen Folgeexperimenten weiter untersucht werden. Es könnte

sein, dass diese Kanäle das Ruhemembranpotential und/oder die intrazelluläre Ca 2+ - und K + -

Konzentration regulieren und dadurch bsp. die Zellproliferation kontrollieren (Tsevi et al.,

2005). Sie könnten ebenso an der Regulation des Zellvolumens während der Spermatogenese

beteiligt sein (Cooper und Yeung, 2007).

5.3.2 Untersuchung von spannungsabhängigen Ca 2+ -Kanälen

Spermienmotilität, Kapazitation und Akrosom-Reaktion hängen maßgeblich von transienten,

intrazellulären Ca 2+ -Konzentrationsanstiegen ab (Garbers, 2001). Da Spermien jedoch kein

endoplasmatisches Retikulum besitzen und das Akrosom nicht als Ca 2+ -Speicher fungiert

(Kobori et al., 2000), werden Anstiege der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration vermutlich

durch Öffnung Ca 2+ -permeabler Kanäle in der Plasmamembran vermittelt, wie z.B. durch

112


Diskussion

spannungsabhängige Ca 2+ -Kanäle. Eine Frage, die in dieser Arbeit beantwortet werden sollte,

war, in welchem Stadium der Spermatogenese welche Ca 2+ -Kanaltypen exprimiert werden.

Bis jetzt konnten nur Ca 2+ V-Kanäle vom T-Typ in Spermien identifiziert werden (Arnoult et

al., 1998; Santi et al., 1996). Durch RT-PCR Experimente an frisch dissoziierten

Spermienvorläuferzellen (Spermatozyten) der Maus konnte ebenfalls gezeigt werden, das

diese zwei verschiedene T-Typ Kanäle exprimieren, CaV3.1 (Sakata et al., 2001) und CaV3.2

(Jagannathan et al., 2002), wobei die Expressionsrate von CaV3.2 in Spermienvorläuferzellen

weitaus größer ist, als die von CaV3.1 (Stamboulian, et al., 2004). Mittels

elektrophysiologischer Ableitungen, pharmakologischer Untersuchungen und

immunzytochemischer Methoden konnten in dieser Arbeit neben den spannungsabhängigen

Kaliumkanälen auch zwei verschiedene Ca 2+ V-Kanäle identifiziert werden. Dabei handelt es

sich zum einen um einen T-Typ Kanal, der bereits durch schwache Depolarisationen aktiviert

wird und eine schnelle Inaktivierung zeigt, und zum anderen um einen Kanal, der der durch

relativ starke Depolarisationen aktiviert wird und langsam inaktiviert, was für einen L-, N-,

P-, Q- oder R-Typ Kanal spricht (s. Abschnitt 4.2.4, Abb. 4.21). T-Typ Kanäle werden in

einer Vielzahl von Geweben, einschließlich Herz, Niere, glatter Muskulatur, Spermien und

vieler endokriner Organe, exprimiert. Diese Kanäle sind in eine Reihe physiologischer

Prozesse einbezogen, wie z.B. beim „Feuern“ von Neuronen, bei der Hormonausscheidung,

bei der Kontraktion von glatten Muskeln und bei der Fertilisation. Allgemein sind die

elektrophysiologischen Eigenschaften von T-Typ Kanälen verschiedener Zelltypen einander

relativ ähnlich. Deutliche Unterschiede konnten bei der Inaktivierung und den

pharmakologischen Eigenschaften beobachtet werden (Perez-Reyes, 2003).

Der erste selektive Antagonist, der für T-Typ Kanäle beschrieben wurde, ist Mibefradil (Ertel

et al., 1997). Dieser Antagonist wurde u.a. auch in der vorliegenden Arbeit für die

pharmakologischen Untersuchungen eingesetzt (s. Abschnitt 4.2.4, Abb. 4.22). Mibefradil

blockt alle T-Typ Kanäle mit ähnlicher Potenz (Martin et al., 2000). Es konnte gezeigt

werden, das Mibefradil T-Typ Kanäle in Spermatozyten und die Akrosomreaktion in reifen

Spermien blockiert (Arnoult et al., 1996; Arnoult et al., 1998; Florman et al., 1992). T-Typ

Kanäle in Spermatozyten scheinen durch Tyrosin- und Calmodulin-abhängige Proteinkinasen

reguliert zu werden (Arnoult et al., 1997; López-González et al., 2001).

Wie unter 1.9 beschrieben spielen Ca 2+ -Kanäle neben der Akrosomreaktion eine

entscheidende Rolle bei der Kapazitation. Die Kapazitation von Spermien ist ein komplexer

physiologischer Ablauf, der Spermien befähigt, die Zona pellucida (ZP) und die Zellmembran

der Eizelle zu durchdringen. Während der Kapazitation werden dekapazitierende Faktoren,

113


Diskussion

hauptsächlich Cholesterol (Cross und Mahasreshti, 1997), von der Oberflächenmembran

entfernt und es kommt zu einer Umverteilung der Proteine auf der Oberfläche der

Spermatozoen. Der intrazelluläre pH-Wert und der Ca 2+ -Spiegel steigen. T-Typ Kanäle

könnten dabei mitwirken, den intrazellulären Ca 2+ -Spiegel potentialabhängig einzustellen.

Bei der Akrosomreaktion werden hydrolysierende Enzyme freigesetzt, deren Wirkung

entscheidend für das Durchdringen der Zona pellucida ist. Als typischer Sekretionsprozess ist

ein Ca 2+ -Einstrom unbedingt notwendig, um die Akrosomreaktion in Spermien aller Spezies

einzuleiten (Darszon et al., 2001). Nach Aktivierung eines Rezeptors in der Plasmamembran

durch Bindung an ZP3-Proteine der Zona pellucida (Felix, 2005), resultiert einerseits ein

G-Protein gekoppelter Signalweg in der Aktivierung der Phospholipase C (PLC) und der

Produktion von IP3 und DAG, andererseits ein transienter Ca 2+ -Einstrom durch T-Typ Kanäle.

Die simultane Öffnung von T-Typ Kanälen und Entleerung intrazellulärer Ca 2+ -Speicher geht

einher mit der Aktivierung von „store-operated“ Kanälen (SOCs) und produziert einen

anhaltenden Ca 2+ -Einstrom, der direkt zu einem akrosomalen Exozytose-Vorgang führt

(s. Abb. 5.1, Felix, 2005).

Abb.5.1: Schematische Darstellung der Akrosomreaktion in Mäusespermien. Dargestellt ist die Bindung

eines Spermiums an die Zona pellucida des Eies (rechts) und die Einleitung der Akrosomreaktion (links)

(modifiziert aus Felix, 2005).

114


Diskussion

In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig die Existenz von CaV3.2 T-Typ Kanäle in

Spermatogonien durch RT-PCR Experimente, elektrophysiologische Ableitungen und

pharmakologische Untersuchungen (Mibefradil) gezeigt werden. Somit besitzen Spermien

schon im ersten Stadium ihrer Entwicklung Ca 2+ v-Kanäle. Diese könnten in jenem frühen

Stadium an der Induktion und Steuerung des Proliferationsprozesses beteiligt sein.

Bei der spannungsaktivierten Quantifizierung des T-Typ Kanals in Spermatogonien konnte

gezeigt werden, dass die Aktivierungsschwelle des T-Typs bei ca. -50 mV liegt und die

Inaktivierungskinetik spannungsabhängig ist. In der Literatur wurden für T-Typ Kanäle in

dissoziierten Spermienvorläuferzellen eine Aktivierungsschwelle bei -60 mV und eine

ebenfalls spannungsabhängige Inaktivierungskinetik beschrieben (Arnoult et al., 1996a). Die

Kanalcharakteristika in dem späteren Entwicklungsstadium ähneln damit den T-Typ

Kanaleigenschaften in kultivierten Spermatogonien.

Der zweite Ca 2+ V-Kanal, der in der vorliegenden Arbeit in Spermatogonien gefunden wurde,

konnte nicht eindeutig molekular identifiziert werden. Aufgrund der Aktivierung bei relativ

positiven Membranspannungen und durch die langsame Inaktivierung scheint es sich hier um

einen HVA-Kanal (high voltage-activated, L-, N-, P-, Q- und R-Typ Kanal) zu handeln.

HVA-Kanäle konnten noch nicht in Spermatogonien oder weiter differenzierten Keimzellen

beschrieben werden. Bislang wurde spekuliert, dass diese Kanäle in der Zellmembran der

Spermienvorläuferzellen in einem funktionellen inaktiven Zustand vorliegen könnten und

eventuell durch post-translatorische Änderungen nur in Spermien aktiviert werden (Serrano et

al., 1999). HVA-Kanäle wurden in glatten Muskeln, in Herzmuskeln und in Neuronen

beschrieben und lassen sich gewöhnlich gut anhand ihrer pharmakologischen Eigenschaften

unterscheiden. L-Typ Ca 2+ V-Kanäle lassen sich durch Dihydropyridine (1,4-DHP) blockieren,

N-Typ Kanäle durch ω Conotoxin GVIA, P/Q-Typ Kanäle durch ω Agatoxin IVa und R-Typ

Kanäle sind resistent gegenüber diesen Toxinen.

Die pharmakologischen Untersuchungen an dem hier identifizierten HVA-Kanal sind nicht

eindeutig einem bestimmten Kanaltyp zuzuordnen. Da der Kanal funktionelle Ähnlichkeiten

mit einem L-Typ Kanal aufweist, wurde eine potentielle Wirkung von Nimodipine untersucht.

Allerdings ließen sich die Ströme nicht durch Nimodipine inhibieren, was dafür spricht, das es

sich nicht um einen klassischen L-Typ Kanal handelt. Untersuchungen mit ω Conotoxin

MVIIC (blockt N-, P-, Q- Typ Kanäle) zeigten eine antagonistische Wirkung. Die

Experimente mit spezifischen Blockern von N-, P- und Q-Typ Kanälen ergaben allerdings,

dass weder ω Conotoxin GVIA noch Agatoxin IVa eine Hemmung dieses Kanaltyps

115


Diskussion

bewirkten. Dieser Befund war anhand der Untersuchungen mit Conotoxin MVIIC nicht zu

erwarten (s. Abschnitt 4.2.4, Abb. 4.25). Trotzdem spricht sehr viel für einen N-Typ Kanal, da

N-Typ Kanäle in reifen Mäusespermien exprimiert werden (Wennemuth et al., 2000) und sich

diese Kanäle reversibel durch ω Conotoxin MVIIC inhibieren lassen (Liu et al., 1996), was

auch in dieser Arbeit gezeigt werden konnte. Dass in der vorliegenden Arbeit keine Inhibition

durch ω Conotoxin GVIA beobachtet wurde, liegt eventuell an der verwendeten

Blockerkonzentration von 1 µM. In einigen Arbeiten wurde eine Konzentration von 3-5 µM

verwendet (Wennemuth et al., 2000; D’Ascenzo et al., 2004). Daher müssen weitere

Experimente mit erhöhten Inhibitorkonzentrationen in Zukunft durchgeführt werden, um das

pharmakologische Profil des nicht molekular identifizierten HVA-Kanals eindeutig

herauszuarbeiten.

Ein weiterer Kanalkandidat ist der R-Typ Kanal. Dieser Kanal wird ebenfalls in

Mäusespermien exprimiert (Wennemuth et al., 2000). Dabei ist bekannt, dass R-Typ Kanäle

nicht durch die genannten Toxine geblockt werden. Gegen einen R-Typ-Kanal spricht aber,

dass sich der hier identifizierte Kanal durch ω Conotoxin MVIIC inhibieren lässt, während in

der Literatur beschriebene R-Typ Kanäle nicht durch diesen Antagonisten inhibiert werden.

Ein weiterer Grund für die nicht eindeutige Identifikation dieses Kanaltyps könnte bsp. auch

die Expression einer bislang unbekannten Splice-Variante oder der Einfluss verschiedener

β-Untereinheiten sein. Außerdem müssen in erneuten Experimenten (Positivkontrollen) die

benutzten Antagonisten noch mal auf ihre Funktionalität überprüft werden. Die ebenfalls noch

ausstehende RT-PCR-basierte Identifikation spezifischer HVA-Kanal-Transkripte in RNA

Extraktionen aus Spermatogonienkulturen wird weiteren Aufschluss über die molekulare

Identität des hier charakterisierten Kanaltyps geben.

Wie schon in den Ergebnissen beschrieben, kamen beide Typen von Ca 2+ V-Kanälen in der

Regel erst ab Tag 7 in Kultur vor. Diese Ergebnisse passen zu den Untersuchungen von

Hagiwara und Kawa. Diese konnten zeigen, dass die Anzahl der Ca 2+ V-Ströme während der

Spermatogenese zunimmt, während die Anzahl der Kaliumkanäle abnimmt (Hagiwara und

Kawa, 1984). Eine Hypothese ist, dass die Reduzierung der Kaliumströme hilfreich für die

Aktivierung der Ca 2+ -Ströme ist, da die Zellen bei reduzierter Kaliumkanal-Expression

leichter depolarisieren können (Hagiwara und Kawa, 1984). Ob die Anzahl der Kaliumkanäle

hier ebenfalls abnimmt, ist nicht eindeutig festzustellen, da bei allen Ca 2+ -Kanal

Untersuchungen extrazelluläre Lösungen verwendet wurden, deren ionale und

pharmakologische Zusammensetzung Kaliumkanäle blockiert.

116


Diskussion

Warum Spermatogonien gerade diese Typen von Kalium- und Ca 2+ -Kanälen besitzen, ist

noch nicht abschließend geklärt. Es könnte sein, das diese Kanäle funktionale Gegengewichte

zueinander darstellen. Demnach kommt es bei kurzzeitiger relativ geringer Depolarisation zur

Aktivierung von einerseits T-Typ Ca 2+ -Kanälen (Depolarisation) und andererseits A-Typ

Kaliumkanälen (Repolarisation), so dass das Membranpotential ausbalanciert werden kann.

Eine vergleichbare Balance könnte bei anhaltenden, stärkeren Depolarisationen von ‚delayed

rectifier’ Kaliumkanälen und den noch nicht identifizierten HVA Ca 2+ -Kanälen eingestellt

werden.

5.4 Der Effekt von 2-APB und Capsazepine auf Spermatogonien

An verschiedenen Prozessen die in reifen Spermien ablaufen, wie z.B. bei der

Akrosomreaktion (Darzson et al., 2001.), konnte die Beteiligung von TRP Kanälen

nachgewiesen werden. Besonders die TRPC Familie scheint bei der Akrosomreaktion eine

Rolle zu spielen. Mitglieder der TRPC Familie bilden Ca 2+ -leitende Kanäle, die am PLC

abhängigen Ca 2+ -Eintritt mitwirken (Montell, 2005, Putney, 2007). Verschiedene TRPC

Kanäle sind in reifen Spermien exprimiert. TRPC1, TRPC2 und TRPC5 sind im Kopf

lokalisiert, wo die Spermien mit der Zona pellucida interagieren und wo die Akrosomreaktion

abläuft (Trevino et al., 2001; Jungnickel et al., 2001; Stamboulian et al., 2005). Ein

erheblicher Anteil des ZP3 hervorgerufenen Ca 2+ -Einstroms wird dabei durch TRPC2

herbeigeführt (Jungnickel et al., 2001).

Auch in Spermienvorläuferzellen der Maus konnte die Expression von trp Genen gezeigt

werden (Trevino et al., 2001). Die Funktion der verschiedenen TRPs in Spermien ist

weitestgehend unbekannt. TRP Kanäle, die im Flagellum gefunden wurden, könnten eine

Rolle bei der Bewegung, vor allem bei der Hyperaktivität spielen, die äußert wichtig bei der

Fertilisation ist.

In dieser Arbeit konnten in allen untersuchten Kulturen Ströme gemessen werden, die nicht

eindeutig als klassische spannungsaktivierte Ionenkanäle identifiziert werden konnten

(s. Abschnitt 4.2.6, Abb. 4.28). Diese Ströme wiesen Ähnlichkeiten mit TRP-Kanälen auf.

Zur weiteren Charakterisierung dieser Kanäle wurden pharmakologische Untersuchungen mit

zwei TRP-Kanal-Antagonisten (2-APB und Capsazepine) durchgeführt, die eine relativ große

Anzahl verschiedener TRP Kanäle inhibieren. Der Antagonist 2-APB blockt in der TRPC

Familie die Kanalsubtypen TRPC1-6, sowie in der TRPM Familie die Subtypen TRPM2-3

und TRPM8. Der Antagonist Capsazepine hingegen blockt in der TRPM Familie den

117


Diskussion

TRPM8-Kanal, sowie in der TRPV Familie den TRPV1-Subtyp

(www.clapham.tch.harvard.edu). Die Hälfte aller untersuchten Zellen zeigte Ströme, die sich

durch 2-APB inhibieren ließen. Weitere 25% Zellen zeigten hingegen durch Capsazepine

inhibierte Ströme. Die Tatsache, dass nicht alle untersuchten Zellen einen Blockeffekt

zeigten, könnte bsp. an der Existenz von sowohl Typ A, als auch Typ B Spermatogonien in

unterschiedlichen, vom Kulturstadium abhängigen Verhältnissen liegen. Die Strom-

Spannungs-Kennlinie und Kinetik dieser Ströme lässt auf einen TRPM8 Kanal schließen.

Dagegen spricht allerdings, dass bei Experimenten, in denen beide Antagonisten getestet

wurden, jeweils nur ein Antagonist wirksam war. Der rekombinant exprimierte TRPM8-

Kanal wird sowohl durch 2-APB, als auch durch Capsazepine blockiert. Beide Blocker

wurden in Konzentrationen eingesetzt, die, gemäß den Literaturangaben

(www.clapham.tch.harvard.edu), einen vollständigen Block auslösen.

Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass die Expression von

TRP Kanälen in Spermatogonien eine realistische Hypothese darstellt, vor allem da TRP

Kanäle in reifen Spermien exprimiert werden und eine Rolle bei verschiedenen Prozessen

spielen. Allerdings müssen die hier erbrachten Ergebnisse, durch weitere Untersuchungen

(bsp. RT-PCR Experimente) bekräftigt werden. Sollte sich die Existenz von TRP Kanäle in

diesem frühen Stadium der Spermienentwicklung bestätigen, könnte es sein, das sie in einem

funktionell inaktiven Zustand vorliegen und erst bei der Akrosomreaktion eine aktive Rolle

übernehmen.

5.5 ATP Rezeptoren in Spermatogonien

Der Hoden besteht zum überwiegenden Teil aus den Tubuli seminiferi, in denen die

Spermatogenese abläuft. Die Zwischenräume der Tubuli beinhalten die Leydig Zellen, die

Testosteron produzieren, sowie Stützgewebe, Blut- und Lymphgefäße. Keimzellen und

Sertolizellen sind die einzigen Zelltypen die innerhalb der Tubuli seminiferi vorliegen und

beide stehen in engem Kontakt zueinander (Dym und Fawcett, 1970; Burkitt et al., 1993). Die

hier untersuchten Spermatogonien repräsentieren die Stammzellen der Spermatogenese, die

im Hoden kontinuierlich Teilungs- und Differenzierungsprozesse durchlaufen. Welche

Kommunikationssignale diese Zellen dabei untereinander und mit den Sertolizellen nutzen ist

nicht geklärt.

Eine mögliche Rolle bei der Kontrolle der Keimzellentwicklung wird für purinerge

Rezeptoren diskutiert. Im Besonderen wird angenommen, dass purinerge Rezeptoren in einer

118


Diskussion

bestimmten Keimzellpopulation eine Rolle bei der Kontrolle der verschiedenen

Entwicklungsstadien spielen, die zeitgleich im adulten Hoden existieren (Glass et al., 2001).

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, das Spermatogonien mindestens zwei

verschiedene Populationen von P2X Rezeptoren besitzen. Eine Population zeigte bei ATP

Applikation schnell desensitisierende Ströme, eine andere Population zeigte hingegen relativ

langsam desensitisierende Ströme. Die Kinetik dieser Ströme erinnert an die rekombinant

exprimierten P2X Rezeptorsubtypen P2X1-4 und P2X2/3. Zur weiteren Charakterisierung

wurden pharmakologische Tests mit Suramin und TNP-ATP durchgeführt (s. Abschnitt 4.3.2,

Abb. 4.32), wobei sich alle getesteten Zellen durch Suramin blocken ließen, aber nicht alle

Zellen TNP-ATP-sensitiv waren, was ebenfalls für verschiedene Subpopulationen spricht. Die

sichere Identifizierung einzelner P2X Rezeptoren durch Antagonisten ist sehr schwierig, da

bislang keine wirklich spezifischen Inhibitoren identifiziert wurden. Durch die hier genutzten

Antagonisten konnten die möglichen vorhandenen P2X Rezeptoren aber eingegrenzt werden.

Suramin blockt in der verwendeten Konzentration P2X1-7 und P2X2/6, nicht aber P2X2/3,

P2X1/5 und P2X4/6, so dass diese Heteromultimäre ausgeschlossen werden können.

Schwieriger ist es bei TNP-ATP, da ein Teil der Zellen geblockt wurde, der andere Teil aber

nicht. TNP-ATP blockt in der verwendeten Konzentration, P2X1-4, P2X7 und P2X2/3 und

P2X1/5, nicht aber P2X5, P2X4/6 und P2X2/6 (Dunn et al., 2001). Zur weiteren Eingrenzung

wurden verschiedene Extrazellulärlösungen verwendet, bei denen es sich einerseits um eine

Lösung mit niedriger Ca 2+ -Konzentration handelt, andererseits um zwei verschiedene Na + -

freie Lösungen, die sich im Ca 2+ -Gehalt unterschieden (Na + freie Lösung 1 = 1 mM Ca 2+ , Na +

freie Lösung 1 = 10 mM Ca 2+ ). Bei allen Versuchen mit der Lösung mit niedriger Ca 2+ -

Konzentration konnte entweder keine oder nur eine geringfügig kleinere ATP

Antwortamplitude beobachtet werden. Ca 2+ blockt bereits bei extrazellulären Konzentrationen

von 2,9 mM P2X7 Rezeptoren (North 2002) (hier verwendet 4 mM). Somit kann dieser

Rezeptor ausgeschlossen werden. Bei beiden verwendeten Natriumlösungen wurde die ATP

Antwort blockiert, somit scheinen die Zellen extrazelluläres Na + zu benötigen, um ATP

Rezeptoren zu aktivieren (s. Abschnitt 4.3.3, Abb. 4.33). Durch RT-PCR Versuche konnten

P2X3 Rezeptoren in Spermatogonien identifiziert werden (s. Abschnitt 4.3.3, Abb. 4.34). Dies

konnte auch durch die pharmakologischen Untersuchungen unterstützt werden. Des Weiteren

haben Ca 2+ -Konzentrationen in einem Bereich von 1-10 mM keinen Effekt auf P2X3

Rezeptoren bei einmaliger ATP Applikation (North und Surprenant, 2000).

Der P2X3 Rezeptor konnte auch in Spermatogonien der Ratte identifiziert werden (Glass et

al., 2001). Glass et al. konnten außerdem P2X2 identifizieren. Beide Rezeptoren werden oft in

119


Diskussion

sensorischen Neuronen koexprimiert (Cook et al., 1997) und können Heteromultimäre formen

(Lewis et al., 1995), welche ebenfalls in Spermatogonien identifiziert werden konnten (Glass

et al., 2001). P2X2 und P2X3 wurden beide in der gleichen Entwicklungsstufe gefunden. P2X2

konnte in der vorliegenden Arbeit nicht identifiziert werden, eventuell ist P2X2 im

Mausmodell erst zu einem späteren Zeitpunkt vorhanden. Es spricht aber viel dafür das noch

andere P2X Rezeptoren in Spermatogonien exprimiert werden. Suramin und TNP-ATP

blockieren P2X3 Rezeptoren, aber ein Teil der getesteten Zellen wurde nicht durch TNP-ATP

geblockt. Ob Spermatogonien über ATP kommunizieren konnte im Rahmen der vorliegenden

Arbeit nicht geklärt werden, diese Frage stellt jedoch einen wichtigen Ansatz für zukünftige

in-situ Experimente dar. Vieles spricht dafür, das P2X Rezeptoren an der Spermatogenese

und bei der Akrosomreaktion beteiligt sind. P2X2 und P2X3 konnten beide in der

Membranregion, aus der sich das Akrosom entwickelt, gefunden werden (Toshimori, 1998).

Foresta et al. konnten zeigen, dass die Akrosomreaktion in menschlichen Spermien über ATP

vermittelte Ionenkanäle (P2X) ausgelöst werden kann und die Inkubation von menschlichen

Spermien mit ATP die in vitro Fertilisationsrate (Foresta et al., 1996a) erhöht. Dieser

stimulatorische Effekt kann durch P2 Antagonisten inhibiert werden. Schon 1977 fand

Karuhn heraus, das beim Zeitpunkt der Ovulation ein Anstieg der ATP Konzentration in den

Sekreten des weiblichen Genitaltrakts und in Follikelflüssigkeit erfolgt (Kahrun, 1977). Somit

scheinen ATP Rezeptoren auch eine physiologische Rolle bei der in vivo Reproduktion zu

spielen. Dieser Ansatzpunkt bietet enorme Möglichkeiten in der in vivo und in vitro

Fertilisation, sowie in der Entwicklung hormonfreier Kontrazeptiva.

5.6 Ausblick

Durch die Erweiterung des rezeptiven Feldes von OR1D2, die Identifikation endogener

Liganden, sowie durch die elektrophysiologische Charakterisierung von Spermatogonien

konnten neue Einsichten in die molekulare Komplexität der Fertilisation gewonnen werden.

Ein Schwerpunkt zukünftiger Arbeiten wird in der Beantwortung der letzten hier noch

offenen Fragen liegen, bezüglich des noch nicht identifizierten HVA Kanals und der

möglichen Existenz von TRP Kanälen in Spermatogonien. Ein weiteres Ziel ist die

physiologische Rolle der endogenen Liganden im Kontext der Spermium-Eizell

Kommunikation zu klären. Hierzu sollen Spermienmotilitäts- und Bewegungsstudien, wie sie

bereits für den OR1D2 Liganden Bourgeonal, den OR7A5 Liganden Myrac und den OR4D1

Liganden PI23472 erfolgten, durchgeführt werden. Des Weiteren sollen Antagonisten für

120


Diskussion

diese Liganden identifiziert werden, die eine Grundlage für die Entwicklung hormonfreier

Alternativen zu bisherigen Kontrazeptiva darstellen könnten.

121


6. Zusammenfassung

Zusammenfassung

Olfaktorische Rezeptorproteine (OR) spielen eine zentrale Rolle bei der Detektion und

Unterscheidung von Geruchsmolekülen. Neben der Expression im olfaktorischen Epithelium,

werden Mitglieder der OR Familie auch ektopisch in nicht-olfaktorischen Geweben, wie z.B.

im Testis, exprimiert. 2003 konnte erstmals ein testikulärer OR (OR1D2) in humanen

Spermien identifiziert, heterolog exprimiert und funktional charakterisiert werden (Spehr et

al., 2003).

Im Rahmen meiner Promotion habe ich verschiedene molekulare, zelluläre und

physiologische Aspekte chemosensorischer Kommunikationsmechanismen in männlichen

Säugetier-Keimzellen unterschiedlicher Reifestadien untersucht. Auf molekularer Ebene habe

ich mich mit der Identifikation und Struktur-Funktions-Wechselwirkung verschiedener

potentieller OR1D2 Liganden beschäftigt, um das molekulare rezeptive Feld dieses Rezeptors

zu erweitern und damit neue Informationen über die Struktur der Ligandenbindetasche dieses

ektopisch exprimierten Rezeptors zu erhalten. Mit Hilfe bildgebender Analyseverfahren

(Ca 2+ -Imaging) wurde das Aktivierungsprofil des rekombinant in HEK293-Zellen

exprimierten Rezeptors durch strukturverwandte sowie strukturell modifizierte

Ligandenkandidaten getestet. Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten fünf

weitere OR1D2-Liganden identifiziert werden. Darüber hinaus zeigen die erhobenen Daten,

dass auch bei Geruchsrezeptoren eine OR-Liganden-Interaktion von den zueinander

passenden Oberflächenstrukturen der Bindetasche einerseits, sowie der jeweiligen Liganden

andererseits (sterisches ,lock-and-key’ Modell) abhängt. Damit konnte die sog.

Vibrationstheorie erstmals anhand experimenteller in-vitro Daten widerlegt werden.

In einer Reihe von Folgeexperimenten wurden die Aktivitätsprofile verdünnter Vaginal- und

Follikelflüssigkeit sowohl an OR1D2, als auch an weiteren am Lehrstuhl für Zellphysiologie

identifizierten, rekombinant exprimierten Spermienrezeptoren (OR4D1, OR7A5 und PSGR)

bestimmt. In einem kollaborativen Ansatz konnten durch gaschromatographische Analysen

verschiedene molekulare Bestandteile der Follikel- und Vaginalsekrete identifiziert werden,

von denen insgesamt vier Substanzen aktivierend auf verschiedene Rezeptoren wirkten.

Damit konnte erstmalig OR-Aktivierung (rekombinant und in humanen Spermien) durch

natürlich vorkommende Liganden beschrieben werden (OR7A5-Furaneol, OR4D1-5α-

Androst-16-en, OR1D2-Buttersäure und 1-Octen-3-on).

Parallel zu den geschilderten Experimenten, habe ich zellulär-physiologische Aspekte der

Biologie unreifer, männlicher Säugetierkeimzellen im Mausmodell untersucht. Im Fokus

122


Zusammenfassung

dieses Teilprojektes standen die bislang unbeschriebenen elektrophysiologischen

Eigenschaften kultivierter Spermatogonien. In einem Spermatogonien-Sertolizell-

Kokultursystem konnten sowohl spannungsaktivierte K + - und Ca 2+ -Kanäle unterschiedlichen

Typs, als auch P2X-Rezeptoren identifiziert und charakterisiert werden. Darüber hinaus

konnten zahlreiche Hinweise auf die Expression von TRP-Kanälen in Spermatogonien

erbracht werden.

Durch die Kombination zellbiologischer und molekularbiologischer Methoden, sowie

hochauflösender bildgebender Verfahren und elektrophysiologischer Ableittechniken konnten

in der vorliegenden Arbeit sowohl neue Erkenntnisse über die Rolle von olfaktorischen

Rezeptorproteinen im Kontext der Keimzellentwicklung, Spermienphysiolgie und

Fertilisation gewonnen, als auch die Physiologie muriner Spermatogonien erstmals in Kultur

elektrophysiologisch beschrieben werden.

6.1 Summary

Odorant receptors (ORs) play a central role in the detection and differentiation of odor

molecules. In addition to OR expression in sensory neurons of the olfactory epithelium, some

OR proteins are also found in ectopic tissues, e.g. in testes. In 2003, a human testicular

odorant receptor (OR1D2) was for the first time identified, recombinantly expressed, and

functionally characterized (Spehr et al., 2003).

During my graduate studies, I have examined different aspects of chemosensory

communication mechanisms in male germ cells at different stages of development. On the

molecular level, I characterized the receptive field of OR1D2 to provide novel structural

insight into the OR ligand binding pocket. Using recombinant expression in a heterologous

cell system (HEK293 cells) and live-cell Ca 2+ -imaging, the OR1D2 activation profile was

investigated by testing structurally related and modified ligand candidates. These experiments

resulted in the identification of five novel OR1D2 ligand molecules as well as the first

experimental in-vitro data showing that OR-ligand interaction is based on a ,lock and key’

concept , rather than on molecular vibrations as proposed by the ‘vibration theory’.

In a follow-up study, I screened constituents of various human bodily fluids (e.g. follicular

fluid, vaginal secretions) to identify endogenous ligands for both OR1D2 and several other

testicular ORs that had been identified by members of the department for cell physiology

(OR4D1, OR7A5 und PSGR). In a collaborative approach, various molecular constituents of

follicular fluid and vaginal secretions were identified by gas chromatography. Using

123


Zusammenfassung

recombinant OR expression and Ca 2+ -imaging, for the first time, endogenous ligands were

matched to specific sperm ORs (OR7A5-Furaneol, OR4D1-5α-Androst-16-en, OR1D2-

Buttersäure and 1-Octen-3-on).

In parallel I have examined the electrophysiological properties of immature male germ cells

of mice. This project is focussed on cultured mouse spermatogonia, since the physiology of

these cells is almost unknown. I could establish a coculture system of spermatogonia and

Sertoli cells and I identified voltage-activated K + and Ca 2+ channels. Furthermore, I found

different P2X receptors in spermatogonia and I was able to provide data suggesting the

expression of TRP channels in murine spermatogonia.

Using a combination of molecular and cellular methods as well as high-resolution Ca 2+ -

imaging and electrophysiological recording techniques, the present data provides new insights

into the role of mammalian ORs in the context of maturation of germ cells and physiological

properties of mammalian germ cells. In addition, this work represents the first

electrophysiological description of cultured mouse spermatogonia.

124


7. Abkürzungen

Abb. Abbildung

AC Adenylatzyklase

A. dest. destilliertes Wasser

ATP Adenosintriphosphat

Abkürzungen

2-APB 2-Aminoethoxydiphenyl borate

4-AP 4-Aminopyridine

BSA Rinderserumalbumin

bsp. beispielsweise

bzw. beziehungsweise

ca. circa

Ca 2+ Kalzium

CaCl2 Kalziumchlorid

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat

CCD Charge-coupled Device

cDNA komplementäre DNA

Cl - Chlorid

CNG zyklisch – nukleotidgesteuert

CsCl Cäsiumchlorid

DAG Diazylglyzerol

d.h. das heißt

DMEM Medium Dulbecco's Modified Eagle's

medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxyribonukleinsäure-Nukleotid

125


E. coli Escherischa coli

Abkürzungen

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGF epidermal growth factor

EGTA Ethylenglycoltetraessigsäure

ER endoplasmatisches Retikulum

FBS Fötales Kälber-Serum

FSH Follikel stimulierendes Hormon

GDP Guanosindiphosphat

ggf. gegebenenfalls

Golf α – Untereinheit des olfaktorischen

G-Proteins

G-Protein Guanosintriphosphat bindendes

Protein

GPCR G-Protein gekoppelter Rezeptor

GTP Guanosintriphosphat

HBSS Hank’s Buffered Salt Solution

HCl Salzsäure

HEK293-Zellen Human embryonic kidney

HEPES 4-12- Hydroxyethyl- piperazin-1-

Ethan- Sulfonsäure

H2O Wasser

IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine

i.d.R. in der Regel

i.G.z. im Gegensatz zu

IP3 Inositoltriphosphat

isot. isotonisch

K + Kalium

126


KCl Kaliumchlorid

kHz kiloherz

KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat

KOH Kaliumhydroxid

LB-Medium Luria-Bertani-Medium

LH Lutenisierendes Hormon

M Molarität

Abkürzungen

MEM Minimum Essential Medium

mg Milligramm

MeSO4 Methylsulfat

MgATP Magnesium Adenosintriphosphat

MgCl2 Magnesiumchlorid

MgSO4 Magnesiumsulfat

min Minuten

ml Milliliter

mM Millimolar

MOE main olfactory epithelium

ms Millisekunden

mV Millivolt

Na + Natrium

NaCl Natriumchlorid

NaGTP Natrium Guanosintriphosphat

NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat

Na2HPO4 Natriumhydrogenphosphat

nM nanomolar

NMDG N-Methyl-D-glucamin

127


O.D. Optische Dichte

Abkürzungen

OR olfaktorischer Rezeptor

ORN olfaktorische Rezeptorneurone

pA Picoamper

p.a. pro analysi

PBS phosphatgepufferte Salzlösung

PCR Polymerase Kettenreaktion

pcDNA Plasmidvektor der Firma

Invitrogen, der die cDNA des

zu exprimierenden Proteins enthält

Pen/Strep Penicillin/Streptomycin

pF Picofarad

pH negativer dekadischer Logarithmus

der Wasserstoffionenkonzentration

PLC Phospholipase C

RNA Ribonukleinsäure

rpm rounds per minute

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse Transkriptase –

Polymerase Kettenreaktion

s Sekunde

s. siehe

s.o. siehe oben

SOC store-operated channel

sog. so genannt

Tab. Tabelle

Taq DNA-Polymerase aus Th.

aquaticus

128


TE Tris-EDTA-Puffer

TEA Tetraethylammonium

TM Transmembrandomäne

u.a. unter anderem

UDP Uridindiphosphat

UTP Uridin-5’-triphosphat

v/v Volumen/Volumen

VNO Vomeronasalorgan

w/v Masse/Volumen

z.B. zum Beispiel

ZP Zona pellucida

z.T. zum Teil

µl microliter

µM micromolar (10 -6 M)

Abkürzungen

129


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9. Danksagung

Danksagung

Abschließend möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Doktorarbeit

beigetragen haben.

An erster Stelle möchte ich mich recht herzlich bei Herrn Prof. Dr. Dr. Dr. H. Hatt für die

Überlassung des interessanten Themas, die wissenschaftliche Betreuung, Förderung und die

Bereitstellung des Arbeitsplatzes bedanken.

Herrn Prof. Dr. A. Faissner danke ich für die freundliche Übernahme des Koreferats.

Besonderer Dank gilt Marc Spehr für die hervorragende und nette Betreuung, die

unerschöpfliche Geduld sowie die ständige Unterstützung und Vermittlung von detailliertem

Wissen, insbesondere bei der Einarbeitung in die Grundlagen der Elektrophysiologie.

Der Alma und Heinrich Vogelsang Stiftung, der Günter Esser Stiftung und der „Ruhr-

University Research School“ danke ich für die finanzielle Förderung dieser Arbeit.

Ein herzliches Dankeschön gilt allen Mitarbeitern des Lehrstuhls für Zellphysiologie und im

besonderen den Mitgliedern der Emmy Noether Nachwuchsgruppe für das angenehme

Arbeitsklima und für die ständige Bereitschaft, mich während meiner Promotion zu

unterstützen. Insbesondere danke ich Jasmin Gerkrath, Thomas und Sophie Veitinger,

Jennifer Spehr und Herrn H. Bartel für die technische Unterstützung.

Ebenso möchte ich mich bei meinen Freunden für die ausführlichen Korrekturen meiner

Arbeit, die ständige Hilfsbereitschaft und das Verständnis, das sie mir in den letzten Jahren

entgegengebracht haben, bedanken.

Mein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mir das Studium und die Promotion

ermöglicht und mich immer liebevoll unterstützt haben.

Ich widme diese Arbeit Johannes Triller und Günther Vogt, die immer an mich geglaubt

haben, aber leider das Ende dieser Arbeit nicht mehr miterleben durften.

155


10.Anhang

10.1 Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name Triller, Annika

Geburtsdatum 20.08.1979 in Dortmund

Nationalität deutsch

Private Adresse Kleine Beurhausstr.5

44137 Dortmund

Telefon 0231/2264491

E-Mail Adresse annika.triller@rub.de

Schulische Ausbildung

Anhang-Lebenslauf

1986 - 1990 Kreuzgrundschule Dortmund

1990 - 1999 Leibniz-Gymnasium Dortmund, Abschluss: Allgemeine Hochschulreife

Wissenschaftliche Ausbildung

1999 - 2006 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum

Abschluss als Diplom-Biologin am Lehrstuhl für Zellphysiologie bei

Prof. Dr. Dr. Dr. Hatt

Titel der Diplomarbeit:

„Olfaktorische Rezeptoren in humanen Spermien“

2006 - 2009 Anfertigung der vorliegenden Dissertation am Lehrstuhl für

Zellphysiologie bei Prof. Dr. Dr. Dr. Hatt mit dem Thema :

Identifikation und funktionale Charakterisierung von

Duftrezeptorproteinen in Säugetierkeimzellen“

Herbst 2009 voraussichtliches Ende der Promotion

156


Stipendien

Anhang-Lebenslauf

05/2006 - 05/2008 Promotionsstipendium der Alma und Heinrich Vogelsang Stiftung

02/2007 - 10/2009 Mitglied der von der DFG im Rahmen der Exzellenzinitiative

geförderten „Ruhr-University Research School“

10/2008 - 02/2009 Promotionsstipendium der Wilhelm und Günther Esser Stiftung

157


10.2 Publikationen

Publizierte Artikel

Anhang-Publikationen

1) Doszczak L., Tacke R., Kraft P., Weber HP., Triller A., Hatt H. (2007) Prediction versus

Perception: Probing the hOR17-4 olfactory receptor model with sila-analogs of bourgeonal

and lilial. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46: 3367-3371.

2) Triller A., Boulden EA., Churchill A., Hatt H., Englund J., Spehr M., Sell CS. (2008)

Odorant-Receptor Interactions and Odor Percept; a Chemical Perspective. Chemistry and

Biodiversity 5: 862-886.

In Vorbereitung

1) Veitinger T., Riffell JA., Triller A., Neuhaus EM., Wunder F., Zimmer RK., Spehr M.,

Hatt H. (2009) Odorant receptors govern distinct motility patterns in human sperm.

2) Triller A., Spehr M., Hatt H. (2009) Biophysical properties of cultured mouse

spermatogonia.

Kongressbeiträge (Poster)

1) Triller A., Schwane K., Riffell JA., Panten J., Zimmer RK., Spehr M., Hatt H.

Characterization of a novel human testicular odorant receptor. Jahrestagung der Association

for Chemoreception Sciences, AchemS 2006, Sarasota, Florida.

2) Triller A., Schwane K., Riffell JA., Panten J., Zimmer RK., Spehr M., Hatt H. One Cell –

Multiple Receptors: Identification of Novel Testicular Odorant Receptors that Mediate

Distinct Sperm Motility Patterns. 17 th Jahrestagung der European Chemoreception Research

Organisation, ECRO 2006, Granada, Spain.

3) Triller A., Riffell JA., Veitinger T., Schwane K., Zimmer RK., Spehr M., Hatt H. Odorant

receptor expression profiles in human sperm – Part I: from gene to function. Jahrestagung der

Association for Chemoreception Sciences, AchemS 2007, Sarasota, Florida.

4) Veitinger T., Riffell JA., Triller A., Schwane K., Zimmer RK., Spehr M., Hatt H. Odorant

receptor expression profiles in human sperm – Part II: from function to behavior.

Jahrestagung der Association for Chemoreception Sciences, AchemS 2007, Sarasota, Florida.

5) Triller A., Veitinger T., Riffell JA., Zimmer RK., Spehr M., Hatt H. Dissecting the

functional role of odorant receptors in mammalian sperm, Part I: from gene to function.

Gordon Research Conference: FERTILIZATION & ACTIVATION OF DEVELOPMENT

(GRC) 2007.

6) Veitinger T., Riffell JA., Triller A., Schwane K., Zimmer RK., Spehr M., Hatt H.

Dissecting the functionality of ectopically expressed odorant receptors – Part II: from function

to behavior. Gordon Research Conference: FERTILIZATION & ACTIVATION OF

DEVELOPMENT (GRC) 2007.

158


Anhang-Publikationen

7) Triller A., Hatt H., Spehr M., Sell CS. Receptor ligand interactions in olfaction : The

OR1D2 receptor as an example. International Symposium on Olfaction and Taste, ISOT 2008,

San Francisco, California.

159


11. Erklärung

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät

eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es

handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um fünf in Wort und Bild völlig

übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur in originalen Daten enthalten sind und in

keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den 01.07.2009

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