Bacher - LC/MS
Bacher - LC/MS
Bacher - LC/MS
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Applikationen der <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong> aus Zulassungsstudien für<br />
Pflanzenschutzmittel<br />
Vortrag zum <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong><br />
Anwendertreffen,<br />
Wuppertal, 29.11.2005<br />
Dr. Reiner <strong>Bacher</strong><br />
Dipl. Ing. (FH) Ulrike Dorn<br />
PD Dr. Thomas Class<br />
PTRL Europe GmbH<br />
Helmholtzstrasse 22<br />
D-89081 Ulm
Übersicht der diskutierten <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> Applikationen<br />
� Begleitende Analytik für die Charakterisierung des<br />
Abbauverhaltens von Pyraclostrobin und Boscalid in<br />
Gemüseproben<br />
� Analytische Methodik für Ethylenthioharnstoff (ETU) in<br />
pflanzlichen Matrizes<br />
� Bestimmung von Glyphosate und seines Metaboliten<br />
AMPA in Pflanzenmaterial<br />
� Bestimmung von Verunreinigungen in technischen<br />
Pflanzenschutzmittel-Formulierungen (Stichworte:<br />
5-Batch Analyse, Impurity Profile)
Cl<br />
N<br />
N<br />
O<br />
Applikation N 1: Abbauverhalten von Boscalid und<br />
Pyraclostrobin in Gemüseproben<br />
CH 3 O CO 2 CH 3<br />
Cl<br />
N<br />
N<br />
O<br />
Pyraclostrobin<br />
N<br />
CH 3 O CO 2 CH 3<br />
� Häufige Aufgabenstellung bei Zulassungsverfahren für<br />
Pflanzenschutzmittel:<br />
Fungizide<br />
Erstellung Abbaukurven (Applikation - Ernte) zur Ermittlung von<br />
neuen Höchstmengen bzw. Anpassung der<br />
Applikationsbedingungen an bestehende Höchstmengen.<br />
� Einfache Analysenmethode: Extraktion mit einem Gemisch aus<br />
Methanol/Wasser/HCl, Verteilung in Cyclohexan, <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> (ESI + )<br />
N<br />
O<br />
Cl<br />
N<br />
H<br />
Cl<br />
Boscalid
Cl<br />
N<br />
N<br />
O<br />
Applikation N 1: Abbauverhalten von Boscalid und<br />
Pyraclostrobin in Gemüseproben<br />
CH 3 O CO 2 CH 3<br />
Rückstand [mg/kg]<br />
Beispiel für eine typische Abbaukurve<br />
1.4<br />
1.2<br />
1<br />
0.8<br />
0.6<br />
0.4<br />
0.2<br />
0<br />
Tag 0, letzte<br />
Applikation<br />
Abbaukurve für Boscalid<br />
Tag 7 Tag 10 Tag 14 Tag 21,<br />
Ernte<br />
Tage nach letzter Applikation<br />
Vorgeschlagene Höchstmenge: 0,05 mg/kg
Applikation 1: Abbauverhalten von Boscalid und<br />
Pyraclostrobin in Gemüseproben<br />
� Beispiel für eine <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> (ESI + ) Kalibrierkurve von Pyraclostrobin<br />
(externe Kalibrierung mit Standards in Lösungsmittel)<br />
BoscalidPyraclostrobinset02.rdb (Pyraclostrobin): "Linear Through Zero" Regression ("1 / x" weighting): y = 1.34e+004 x (r = 0.9970)<br />
2.7e6<br />
2.6e6<br />
2.4e6<br />
2.2e6<br />
2.0e6<br />
1.8e6<br />
1.6e6<br />
1.4e6<br />
1.2e6<br />
1.0e6<br />
8.0e5<br />
6.0e5<br />
4.0e5<br />
2.0e5<br />
0.0<br />
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200<br />
Concentration, ng/mL<br />
Wichtiger Aspekt: „In-Matrix“Kalibration für Zulassungsstudien<br />
in USA (EPA) nicht anwendbar<br />
� Kalibrierkurve über<br />
mindestens drei<br />
Größenordnungen<br />
linear (0.2 ng/mL<br />
bis 200 ng/mL) !<br />
R 2 = 0.9940
Applikation 1: Abbauverhalten von Boscalid und<br />
Pyraclostrobin in Gemüseproben<br />
� <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> Chromatogramme von zwei <strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> Übergängen -<br />
Pyraclostrobin<br />
S a m p l e N a m e : " P 7 1 2 - 1 3 3 " S a m p l e I D : " " F i l e : " P 7 1 2 b o s p y r # 1 0 5 . w i f f "<br />
P e a k N a m e : " P y r a c lo s tr o b i n " M a s s ( e s ) : " 3 8 8 .1 / 1 9 4 . 1 a m u "<br />
C o m m e n t : " S ta n g e n s e l le r i e U K " A n n o t a ti o n : " P 7 1 2 b o s p y r 0 2 . d a m "<br />
S a m p l e I n d e x : 1<br />
S a m p l e T y p e :<br />
C o n c e n t r a t i o n :<br />
U n k n o w n<br />
N / A<br />
7 4 0 0<br />
C a l c u l a t e d C o n c :<br />
A c q . D a t e :<br />
0 . 1 4 8<br />
3 0 . 1 0 . 2 0 0 3<br />
n g / m L<br />
7 2 0 0<br />
A c q . T i m e : 0 6 : 1 1 : 4 2<br />
7 0 0 0<br />
M o d i f i e d : Y e s<br />
B u n c h i n g F a c t o r : 2<br />
N o i s e T h r e s h o l d : 9 3 . 2 8 c p s<br />
A r e a T h r e s h o l d : 4 6 6 . 3 9 c p s<br />
N u m . S m o o t h s : 2<br />
R T W i n d o w : 3 0 . 0 s e c<br />
E x p e c t e d R T : 6 . 0 7 m i n<br />
S e p . W i d t h : 0 . 2 0<br />
S e p . H e i g h t : 0 . 0 1<br />
E x p . P e a k R a t i o : 5 . 0 0<br />
E x p . A d j . R a t i o : 4 . 0 0<br />
E x p . V a l . R a t i o : 3 . 0 0<br />
U s e R e l a t i v e R T : N o<br />
I n t . T y p e : M a n u a l<br />
R e t e n t i o n T i m e : 6 . 0 3 m i n<br />
A r e a : 1 . 9 9 e + 0 0 3 c o u n t s<br />
H e i g h t : 3 . 3 4 e + 0 0 2 c p s<br />
S t a r t T i m e : 5 . 9 9 m i n<br />
E n d T i m e : 6 . 1 4 m i n<br />
Intensity,cps<br />
6 8 0 0<br />
6 6 0 0<br />
6 4 0 0<br />
6 2 0 0<br />
6 0 0 0<br />
5 8 0 0<br />
5 6 0 0<br />
5 4 0 0<br />
5 2 0 0<br />
5 0 0 0<br />
4 8 0 0<br />
4 6 0 0<br />
4 4 0 0<br />
4 2 0 0<br />
4 0 0 0<br />
3 8 0 0<br />
3 6 0 0<br />
3 4 0 0<br />
3 2 0 0<br />
3 0 0 0<br />
2 8 0 0<br />
2 6 0 0<br />
2 4 0 0<br />
2 2 0 0<br />
2 0 0 0<br />
1 8 0 0<br />
1 6 0 0<br />
1 4 0 0<br />
1 2 0 0<br />
1 0 0 0<br />
8 0 0<br />
6 0 0<br />
4 0 0<br />
2 0 0<br />
0<br />
4 . 4 7<br />
5 . 1 9<br />
6 . 0 3<br />
2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1<br />
T im e , m i n<br />
S a m p l e N a m e : " P 7 1 2 - 1 3 3 " S a m p l e I D : " " F i l e : " P 7 1 2 b o s p y r # 1 0 5 . w i f f "<br />
P e a k N a m e : " P y r a c l o s t r o b i n 2 . U e b e r g a n g " M a s s ( e s ) : " 3 8 8 . 1 / 1 6 3 . 3 a m u "<br />
C o m m e n t : " S t a n g e n s e l l e r i e U K " A n n o t a t i o n : " P 7 1 2 b o s p y r 0 2 . d a m "<br />
S a m p l e I n d e x : 1<br />
S a m p l e T y p e :<br />
C o n c e n t r a t i o n :<br />
U n k n o w n<br />
N / A<br />
2 6 0<br />
C a l c u l a t e d C o n c : 0 . 1 9 1 n g / m L<br />
A c q . D a t e : 3 0 . 1 0 . 2 0 0 3<br />
2 5 0<br />
A c q . T i m e : 0 6 : 1 1 : 4 2<br />
M o d i f i e d : Y e s<br />
B u n c h i n g F a c t o r : 2<br />
N o i s e T h r e s h o l d : 6 7 . 0 4 c p s<br />
A r e a T h r e s h o l d : 3 3 5 . 1 9 c p s<br />
N u m . S m o o t h s : 2<br />
R T W i n d o w : 3 0 . 0 s e c<br />
E x p e c t e d R T : 6 . 0 7 m i n<br />
S e p . W i d t h : 0 . 2 0<br />
S e p . H e i g h t : 0 . 0 1<br />
E x p . P e a k R a t i o : 5 . 0 0<br />
E x p . A d j . R a t i o : 4 . 0 0<br />
E x p . V a l . R a t i o : 3 . 0 0<br />
U s e R e l a t i v e R T : N o<br />
I n t . T y p e : M a n u a l<br />
R e t e n t i o n T i m e : 6 . 0 2 m i n<br />
A r e a : 1 . 7 7 e + 0 0 3 c o u n t s<br />
H e i g h t : 2 . 3 3 e + 0 0 2 c p s<br />
S t a r t T i m e : 5 . 8 8 m i n<br />
E n d T i m e : 6 . 2 6 m i n<br />
Intensity,cps<br />
2 4 0<br />
2 3 0<br />
2 2 0<br />
2 1 0<br />
2 0 0<br />
1 9 0<br />
1 8 0<br />
1 7 0<br />
1 6 0<br />
1 5 0<br />
1 4 0<br />
1 3 0<br />
1 2 0<br />
1 1 0<br />
1 0 0<br />
9 0<br />
8 0<br />
7 0<br />
6 0<br />
5 0<br />
4 0<br />
3 0<br />
2 0<br />
1 0<br />
0<br />
2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1<br />
T i m e , m i n<br />
� Quantifizierung auf intensivstem Übergang durch Matrixinterferenzen gestört<br />
� 2 <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> Übergänge sind zuletzt für Überwachungsmethoden gefordert<br />
(BfR: veröffentlicht in Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. 57 (2005): S. 157)
Applikation 2: Analyse von ETU in Gemüseproben mit<br />
<strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> Bestimmung<br />
HN NH<br />
S<br />
Ethylenthioharnstoff (ETU)<br />
Problematik:<br />
�ETU ist ein toxisches Abbau- und Zersetzungsprodukt von<br />
wichtigen Dithiocarbamat-Fungiziden wie Mancozeb, Thiram<br />
etc.<br />
�Höchstmenge: 0.05 mg/kg (LOQ damit ≤0.02 mg/kg<br />
anzustreben)<br />
�Klassische Analysenmethoden (z.B. DFG Methode 389-1 /<br />
S15) beinhalten aufwändige Verteilungsschritte und<br />
Säulenchromatographie als Clean-up<br />
�Selektive Bestimmungsverfahren (GC/FPD Schwefel-Mode,<br />
HP<strong>LC</strong>/UV) vorhanden<br />
�GC Bestimmung aufgrund thermischer Zersetzung des<br />
Analyten problematisch
Applikation 2: Analyse von ETU in Gemüseproben mit<br />
<strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> Bestimmung<br />
Lösungsansatz: Adaptierte vereinfachte Analysenmethode mit spezifischer<br />
<strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong>-Bestimmung<br />
� Extraktion analog zu klassischen Verfahren wegen erwiesener<br />
Extraktionseffizienz:<br />
Extraktion (10 g Probe) mit Methanol/Wasser (1/1 v/v), wässriger<br />
Natriumascorbat (10%), Thioharnstoff (1%) und Ammoniumchlorid-<br />
Lösung, Methanol<br />
� Einengen auf wässrigen Rückstand, Flüssig/Flüssig-Verteilung an<br />
Extrelut mit Elution des Analyten durch Dichlormethan<br />
� Einrotieren zur Trockne, Umlösen in Methanol/Wasser 2/8 v/v<br />
� <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong>-Bestimmung (APCI + )<br />
� Analytik von ETU: Licht- und oxidationsempfindliche Substanz.
Applikation 2: Analyse von ETU in Gemüseproben mit<br />
<strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> Bestimmung<br />
Prinzipien der <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong>-Bestimmungstechnik<br />
� HP<strong>LC</strong>-Säule Aquasil RP C 18, 150 x 3 mm, 3 µm<br />
� Gradientenelution, A: Methanol 2 mM Ammoniumformiat,<br />
B: 2 mM wässrige Ammoniumformiat von 10% A / 90 % B auf<br />
80 % A / 20 % B<br />
� Triple Quad <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> mit API 3000, Heated Nebulizer Quelle<br />
(APCI- Detektion, positive Ionen)<br />
Mutterion (M+H) + , 2 <strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> Übergänge: 103 m/z > 60 m/z (Quantifizierung)<br />
und 103 m/z > 44 m/z (Bestätigung)<br />
� Detektion mit APCI wesentlich empfindlicher als entsprechende<br />
ESI-Technik (mindestens Faktor 5 !)<br />
� Externe Kalibrierung mit Standards in Lösungsmittel möglich
Applikation 2: Analyse von ETU in Gemüseproben mit<br />
<strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> Bestimmung<br />
Beispiel für die Nachweisstärke der Triple-Quad <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong><br />
Sample Name: "K793-89" Sample ID: "" File: "P793etu#076.wiff"<br />
Peak Name: "ETU" Mass(es): "103.0/59.8 amu"<br />
Comment: "Cal 5.0 ng/mL" Annotation: "P793etu-05d.dam"<br />
Sample Index: 1<br />
Sample Type:<br />
Concentration:<br />
Standard<br />
5.00 ng/mL<br />
1200<br />
Calculated Conc: 5.19<br />
Acq. Date: 10-Mar-05<br />
Acq. Time: 22:45:04<br />
ng/mL 1150<br />
1100<br />
Modified: Yes<br />
Bunching Factor: 2<br />
Noise Threshold: 11.32 cps<br />
Area Threshold: 56.58 cps<br />
Num. Smooths: 2<br />
RT Window: 30.0 sec<br />
Expected RT: 3.87 min<br />
Sep. Width: 0.20<br />
Sep. Height: 0.01<br />
Exp. Peak Ratio: 5.00<br />
Exp. Adj. Ratio: 4.00<br />
Exp. Val. Ratio: 3.00<br />
Use Relative RT: No<br />
Kalibrierlösung ETU, 5 ng/mL �0.004 mg/kg LOD (20 % LOQ)<br />
Int. Type: Manual<br />
Retention Time: 3.85 min<br />
Area: 1.36e+004 counts<br />
Height: 1.10e+003 cps<br />
Start Time: 3.67 min<br />
End Time: 4.25 min<br />
In te n s ity , c p s<br />
1050<br />
1000<br />
950<br />
900<br />
850<br />
800<br />
750<br />
700<br />
650<br />
600<br />
550<br />
500<br />
450<br />
400<br />
350<br />
300<br />
250<br />
200<br />
0.71<br />
150 0.28 0.95 1.70<br />
1.98<br />
100<br />
3.26<br />
5.98<br />
50<br />
0<br />
3.85<br />
1 2 3 4 5 6 7<br />
Time, min<br />
Übergang 103 > 60 m/z<br />
7.71<br />
Sample Name: "K793-89" Sample ID: "" File: "P793etu#076.wiff"<br />
Peak Name: "ETU 2. Übergang" Mass(es): "103.0/44.0 amu"<br />
Comment: "Cal 5.0 ng/mL" Annotation: "P793etu-05d.dam"<br />
Sample Index: 1<br />
Sample Type: Standard<br />
Concentration:<br />
Calculated Conc:<br />
5.00<br />
5.19<br />
ng/mL<br />
ng/mL<br />
500<br />
Acq. Date: 10-Mar-05<br />
480<br />
Acq. Time: 22:45:04<br />
460<br />
Modified:<br />
Bunching Factor:<br />
Yes<br />
2<br />
440<br />
Noise Threshold: 10.91 cps<br />
420<br />
Area Threshold:<br />
Num. Smooths:<br />
54.57<br />
2<br />
cps<br />
400<br />
RT Window:<br />
Expected RT:<br />
Sep. Width:<br />
30.0<br />
3.88<br />
0.20<br />
sec<br />
min<br />
380<br />
360<br />
Sep. Height:<br />
Exp. Peak Ratio:<br />
0.01<br />
5.00<br />
340<br />
Exp. Adj. Ratio: 4.00<br />
320<br />
Exp. Val. Ratio:<br />
Use Relative RT:<br />
3.00<br />
No<br />
300<br />
Int. Type: Manual<br />
Retention Time: 3.88 min<br />
Area: 4.45e+003 counts<br />
Height: 3.56e+002 cps<br />
Start Time: 3.66 min<br />
End Time: 4.22 min<br />
In te n sity , c p s<br />
280<br />
260<br />
240<br />
0.28<br />
220<br />
200<br />
180<br />
0.96<br />
2.05<br />
2.99<br />
2.66<br />
3.05<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
3.88<br />
4.68<br />
5.26<br />
6.19 6.82<br />
1 2 3 4 5 6 7<br />
Time, min<br />
Übergang 103 > 44 m/z<br />
7.55
Applikation 2: Analyse von ETU in Gemüseproben mit<br />
<strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> Bestimmung<br />
Dotierte Probe, Grünkohl 0.02 mg/kg LOQ<br />
Sample Name: "P793-305" Sample ID: "" File: "P793etu#068.wiff"<br />
Peak Name: "ETU" Mass(es): "103.0/59.8 amu"<br />
Comment: "Gruenkohl LOQ" Annotation: "P793etu-05d.dam"<br />
Sample Index: 1<br />
Sample Type:<br />
Concentration:<br />
Unknown<br />
N/A<br />
5500<br />
Calculated Conc: 24.4 ng/mL<br />
Acq. Date: 10-Mar-05<br />
Acq. Time: 21:02:31<br />
5000<br />
Modified: No<br />
Bunching Factor: 2<br />
Noise Threshold: 11.32 cps<br />
Area Threshold: 56.58 cps<br />
Num. Smooths: 2<br />
RT Window: 30.0 sec<br />
Expected RT: 3.87 min<br />
Sep. Width: 0.20<br />
Sep. Height: 0.01<br />
Exp. Peak Ratio: 5.00<br />
Exp. Adj. Ratio: 4.00<br />
Exp. Val. Ratio: 3.00<br />
Use Relative RT: No<br />
Int. Type: Base To Base<br />
Retention Time: 3.85 min<br />
Area: 6.42e+004 counts<br />
Height: 5.32e+003 cps<br />
Start Time: 3.67 min<br />
End Time: 4.25 min<br />
In te n sity , c p s<br />
4500<br />
4000<br />
3500<br />
3000<br />
2500<br />
2000<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
0<br />
1 2 3 4 5 6 7<br />
Time, min<br />
ETU,<br />
Übergang 103 > 60 m/z<br />
3.85<br />
5.85<br />
7.41<br />
7.58<br />
Grünkohl-Probe mit Rückstand < LOD<br />
Sample Name: "P793-301" Sample ID: "" File: "P793etu#088.wiff"<br />
Peak Name: "ETU" Mass(es): "103.0/59.8 amu"<br />
Comment: "Gruenkohl Bl" Annotation: "P793etu-05d.dam"<br />
Sample Index: 1<br />
Sample Type: Unknown<br />
Concentration:<br />
Calculated Conc:<br />
N/A<br />
0.333 ng/mL<br />
2800<br />
Acq. Date: 11-Mar-05<br />
Acq. Time: 01:18:55<br />
2600<br />
Modified: No<br />
Bunching Factor: 2<br />
Noise Threshold: 11.32 cps<br />
Area Threshold: 56.58 cps<br />
Num. Smooths: 2<br />
RT Window: 30.0 sec<br />
Expected RT: 3.87 min<br />
Sep. Width: 0.20<br />
Sep. Height: 0.01<br />
Exp. Peak Ratio: 5.00<br />
Exp. Adj. Ratio: 4.00<br />
Exp. Val. Ratio: 3.00<br />
Use Relative RT: No<br />
Int. Type: Base To Base<br />
Retention Time: 3.93 min<br />
Area: 8.76e+002 counts<br />
Height: 8.90e+001 cps<br />
Start Time: 3.73 min<br />
End Time: 3.96 min<br />
In te n sity , c p s<br />
2400<br />
2200<br />
2000<br />
1800<br />
1600<br />
1400<br />
1200<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
6.28<br />
2.33<br />
3.86 7.22<br />
2.87 4.99<br />
0.46 0.94 1.31 1.79<br />
3.53<br />
5.19<br />
1 2 3 4 5 6 7<br />
Time, min<br />
ETU,<br />
Übergang 103 > 60 m/z<br />
5.88<br />
7.40<br />
7.58
Applikation 3: Analyse von Glyphosate und AMPA in<br />
Pflanzenmaterial mit <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong><br />
HO<br />
HO<br />
O<br />
P<br />
H<br />
N<br />
Glyphosate<br />
O<br />
O<br />
HO<br />
OH P<br />
HO<br />
Problematik:<br />
NH 2<br />
Aminomethylphosphonsäure<br />
(AMPA)<br />
�Glyphosate (bekannte Formulierungen: z.B. Rodeo,<br />
Roundup) ist ein sehr wirksames systemisches Herbizid mit<br />
relativ geringer Toxizität für Mensch und Tier und schneller<br />
Abbaubarkeit in der Umwelt<br />
�Der Wirkstoff und der Hauptmetabolit sind sehr polar und<br />
damit gut wasserlöslich<br />
�Auf GC Bestimmung basierende Analysenverfahren<br />
erfordern einen aufwändigen Clean-up einschließlich<br />
mehrerer Derivatisierungsschritte
Applikation 3: Analyse von Glyphosate und AMPA in<br />
Pflanzenmaterial mit <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong><br />
Prinzipien der für <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> Bestimmung adaptierten<br />
Analysenmethode für Pflanzenmaterial<br />
� Extraktion von Pflanzenmaterial mit 0.1 N Salzsäure<br />
� Verteilung eines Aliquotes mit Dichlormethan zur Aufreinigung<br />
(organischer Extrakt wird verworfen)<br />
� Neutralisation der wässrigen Phase (pH 8), Zugabe von kommerziell<br />
erhältlichen, isotopenmarkierten internen Standards<br />
( 13 C 2- 15 N-Glyphosate und 13 C- 15 N-AMPA)<br />
� Direkte Bestimmung mit <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> ohne vorherige Derivatisierung (in<br />
der Literatur beschrieben) wurde wegen unzureichender<br />
Detektionsempfindlichkeit und Probleme mit der HP<strong>LC</strong> nicht<br />
weiterverfolgt<br />
� Lösungsansatz: Derivatisierung mit FMOC zur Erzeugung stabiler, leicht<br />
mit HP<strong>LC</strong> chromatographierbarer und <strong>MS</strong>-geeigneter Derivate<br />
Derivatisierungsausbeuten sind stark matrixabhängig !<br />
� <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong>-Bestimmung (ESI mit Detektion von negativen Ionen).
Applikation 3: Analyse von Glyphosate und AMPA<br />
in Pflanzenmaterial mit <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong><br />
O<br />
HO<br />
P<br />
N<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
FMOC-<br />
Glyphosate<br />
HO<br />
P<br />
H<br />
N<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
FMOC-<br />
AMPA
Applikation 3: Analyse von Glyphosate und AMPA<br />
in Pflanzenmaterial mit <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong><br />
FMOC-<br />
Glyphosate<br />
0.1 mg/kg (LOQ)<br />
IS: 13 C 2 - 15 N-<br />
FMOC-<br />
Glyphosate<br />
Sample Name: "P821-64" Sample ID: "" File: "P821api#115.wiff"<br />
Peak Name: "Glyphosate" Mass(es): "390.0/167.9 amu"<br />
Comment: "Olive LOQ" Annotation: "P821-05.dam"<br />
Sample Index: 1<br />
Sample Type: Unknown<br />
Concentration:<br />
Calculated Conc:<br />
N/A<br />
0.105 mg/kg<br />
2800<br />
Acq. Date: 30-Apr-05<br />
2600<br />
Acq. Time: 01:53:54<br />
2400<br />
Modified: Yes<br />
Bunching Factor: 3<br />
2200<br />
Noise Threshold:<br />
Area Threshold:<br />
46.96<br />
234.78<br />
cps<br />
cps<br />
2000<br />
Num. Smooths:<br />
RT Window:<br />
2<br />
30.0 sec<br />
1800<br />
Expected RT: 6.91 min<br />
1600<br />
Sep. Width: 0.20<br />
Sep. Height: 0.01<br />
1400<br />
Exp. Peak Ratio: 5.00<br />
Exp. Adj. Ratio: 4.00<br />
1200<br />
Exp. Val. Ratio:<br />
Use Relative RT:<br />
3.00<br />
No<br />
1000<br />
Int. Type: Manual<br />
Retention Time: 7.06 min<br />
Area: 2.19e+004 counts<br />
Height: 2.20e+003 cps<br />
Start Time: 6.81 min<br />
End Time: 7.33 min<br />
In ten s ity , c p s<br />
Sample Name: "P821-64" Sample ID: ""<br />
0<br />
4.5 5.0 5.5<br />
File: "P821api#115.wiff"<br />
6.0 6.5 7.0<br />
Time, min<br />
7.5 8.0 8.5 9.0<br />
Peak Name: "Glyphosate IS(IS)" Mass(es): "393.0/171.0 amu"<br />
Comment: "Olive LOQ" Annotation: "P821-05.dam"<br />
Sample Index:<br />
Sample Type:<br />
1<br />
Unknown<br />
7000<br />
7.05<br />
Concentration: 0.400 mg/kg<br />
Calculated Conc: N/A<br />
6500<br />
Acq. Date:<br />
Acq. Time:<br />
30-Apr-05<br />
01:53:54<br />
6000<br />
8.24<br />
Modified: Yes<br />
Bunching Factor: 3<br />
Noise Threshold: 17.63 cps<br />
Area Threshold: 88.15 cps<br />
Num. Smooths: 2<br />
RT Window: 30.0 sec<br />
Expected RT: 6.90 min<br />
Sep. Width: 0.20<br />
Sep. Height: 0.01<br />
Exp. Peak Ratio: 5.00<br />
Exp. Adj. Ratio: 4.00<br />
Exp. Val. Ratio: 3.00<br />
Use Relative RT: No<br />
Int. Type: Manual<br />
Retention Time: 7.05 min<br />
Area: 6.98e+004 counts<br />
Height: 7.08e+003 cps<br />
Start Time: 6.83 min<br />
End Time: 7.41 min<br />
In te n sity , c p s<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
5500<br />
5000<br />
4500<br />
4000<br />
3500<br />
3000<br />
2500<br />
2000<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
7.06<br />
7.53<br />
7.85<br />
8.03<br />
0<br />
4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0<br />
Time, min<br />
8.88
Applikation 3: Analyse von Glyphosate und AMPA<br />
in Pflanzenmaterial mit <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong><br />
Interne Standard Kalibrierkurve für Glyphosate (Kalibration<br />
in Matrix !)<br />
sampleset03gly.rdb (Glyphosate): "Linear" Regression ("1 / x" weighting): y = 1.01 x + 0.0564<br />
(r = 0.9992)<br />
Analyte Area / IS Area<br />
50<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50<br />
Analyte Conc. / IS Conc.
Applikation 3: Analyse von Glyphosate und AMPA<br />
in Pflanzenmaterial mit <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong><br />
FMOC-AMPA<br />
0.1 mg/kg (LOQ)<br />
Sample Name: "P821-64" Sample ID: "" File: "P821api#298.wiff"<br />
Peak Name: "AMPA" Mass(es): "332.0/109.8 amu"<br />
Comment: "Olive LOQ " Annotation: "P821-05.dam"<br />
Sample Index: 1<br />
Sample Type: Unknown<br />
Concentration:<br />
Calculated Conc:<br />
N/A<br />
9.46 ng/mL 200<br />
Acq. Date: 09-May-05<br />
Acq. Time: 20:17:15<br />
180<br />
Modified: Yes<br />
Bunching Factor: 3<br />
Noise Threshold: 5.49 cps<br />
Area Threshold: 27.46 cps<br />
Num. Smooths: 2<br />
RT Window: 30.0 sec<br />
Expected RT: 7.96 min<br />
Sep. Width: 0.20<br />
Sep. Height: 0.01<br />
Exp. Peak Ratio: 5.00<br />
Exp. Adj. Ratio: 4.00<br />
Exp. Val. Ratio: 3.00<br />
Use Relative RT: No<br />
Int. Type: Manual<br />
Retention Time: 8.05 min<br />
Area: 2.25e+003 counts<br />
Height: 2.17e+002 cps<br />
Start Time: 7.85 min<br />
End Time: 8.45 min<br />
In te n s ity , c p s<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
8.05<br />
6 7 8 9 10<br />
Time, min<br />
Wegen Störung des internen Standards Auswertung mit<br />
externer Kalibration (Matrix-matched Standards)
Applikation 4: Analyse toxischer Verunreinigungen in<br />
technischen Pflanzenschutzmittel-Formulierungen mit<br />
<strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong><br />
Externe Standard Kalibrierkurve für AMPA (Kalibration in<br />
Matrix !)<br />
Area, counts<br />
ampaset05ext.rdb (AMPA): "Linear" Regression ("1 / x" weighting): y = 178 x + 564 (r = 0.9973)<br />
3.8e4<br />
3.6e4<br />
3.4e4<br />
3.2e4<br />
3.0e4<br />
2.8e4<br />
2.6e4<br />
2.4e4<br />
2.2e4<br />
2.0e4<br />
1.8e4<br />
1.6e4<br />
1.4e4<br />
1.2e4<br />
1.0e4<br />
8000.0<br />
6000.0<br />
4000.0<br />
2000.0<br />
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200<br />
Concentration, ng/mL
Applikation 4: Bestimmung von Verunreinigungen in<br />
technischen Pflanzenschutzmittelformulierungen mit <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong><br />
Problematik:<br />
�Für die Zulassung von Pflanzenschutzmitteln ist nach<br />
SANCO Richtlinie 3030/99 eine qualitative und quantitative<br />
Analyse der Wirkstoff-Hauptkomponente(n) und von<br />
Verunreinigungen ≥0.1 % (1 g/kg) in repräsentativen Batches<br />
von technischen Pflanzenschutzmittel-Formulierungen<br />
gefordert (Stichwort: „Impurity Profile “, „5-Batch Analyse“)<br />
�Bekannte toxische Verunreinigungen müssen dabei neben<br />
den Haupt- und Nebenkomponenten bis in den<br />
Konzentrationsbereich ≥1 ppm bestimmt werden<br />
Beispiele: N-Nitrosoverbindungen wie N-Nitrosoglyphosate,<br />
N-Nitrosoimidacloprid; Dioxine<br />
�Neben klassischen Methoden (Titration/Coulometrie: z.B.<br />
Karl-Fischer Titration zur Wasserbestimmung) und<br />
hochpräzisen chromatographischen Methoden (HP<strong>LC</strong>/UV,<br />
GC/<strong>MS</strong>) wird zunehmend auch die <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong> für Batch-Analysen<br />
eingesetzt
Applikation 4: Bestimmung von Verunreinigungen in<br />
technischen Pflanzenschutzmittelformulierungen mit <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong><br />
Beispiel 1: Spezifische Bestimmung von aktiven Hauptkomponenten<br />
in einem komplexen Wirkstoff-Gemisch<br />
Eingesetzte Technik:<br />
Ion Trap <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong> im Scan-Mode<br />
Für diese Anwendung wichtiger<br />
Vorteil der <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong> Spektren:<br />
Wenig Fragmentierung, d.h.<br />
wenig Überlappung mit<br />
Fragmentionen (Basision<br />
(M+H) + oder (M-H) - )
Applikation 4: Bestimmung von Verunreinigungen in<br />
technischen Pflanzenschutzmittelformulierungen mit <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong><br />
Beispiel 2: Bestimmung von zwei Verunreinigungen > 0.1 % Gehalt<br />
neben einer Hauptkomponente mittels <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>(<strong>MS</strong>)
Applikation 4: Bestimmung von Verunreinigungen in<br />
technischen Pflanzenschutzmittelformulierungen mit <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong><br />
Beispiel 3: Bestimmung einer toxischen Spurenkomponente (1 ppm) mittels <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong><br />
Eingesetzte Technik: Triple Quad <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> (Konzentration Wirkstoff: 1 mg/mL)<br />
mit Säulenschalttechnik<br />
Sample Name: "P928-141" Sample ID: "" File: "P928api#124.wiff"<br />
Peak Name: "N-Nitrosoimidacloprid" Mass(es): "239.6/209.9 amu"<br />
Comment: "1mg/mL batch 050725" Annotation: ""<br />
Sample Index: 1<br />
Sample Type: Unknown<br />
1250<br />
Concentration: N/A<br />
Calculated Conc: 0.00<br />
Acq. Date: 17-Oct-05<br />
Acq. Time: 16:50:03<br />
ng/mL<br />
1200<br />
1150<br />
1100<br />
1050<br />
Modified: Yes<br />
Bunching Factor: 2<br />
Noise Threshold: 3.11 cps<br />
Area Threshold: 15.57 cps<br />
Num. Smooths: 3<br />
RT Window: 30.0 sec<br />
Expected RT: 16.1 min<br />
Sep. Width: 0.20<br />
Sep. Height: 0.01<br />
Exp. Peak Ratio: 5.00<br />
Exp. Adj. Ratio: 4.00<br />
Exp. Val. Ratio: 3.00<br />
Use Relative RT: No<br />
Int. Type: Manual<br />
Retention Time: 13.6 min<br />
Area: 3.02e+004 counts<br />
Height: 1.25e+003 cps<br />
Start Time: 12.7 min<br />
End Time: 14.4 min<br />
I n te n s ity , c p s<br />
1000<br />
950<br />
900<br />
850<br />
800<br />
750<br />
700<br />
650<br />
600<br />
550<br />
500<br />
450<br />
400<br />
350<br />
300<br />
250<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21<br />
Time, min<br />
N-Nitroso-Verunreinigung (1 ppm)<br />
�1 ng/mL<br />
Sample Name: "K928-127" Sample ID: "" File: "P928api#119.wiff"<br />
Peak Name: "Imidacloprid" Mass(es): "256.0/175.0 amu"<br />
Comment: "Cal.Sol. 100ng/mL imidacloprid" Annotation: ""<br />
Sample Index: 1<br />
Sample Type:<br />
Concentration:<br />
Unknown<br />
N/A<br />
7000<br />
Calculated Conc: 0.00<br />
Acq. Date: 17-Oct-05<br />
ng/mL 6500<br />
Acq. Time: 14:50:42<br />
6000<br />
Modified: Yes<br />
Bunching Factor: 2<br />
Noise Threshold: 0.17 cps<br />
Area Threshold: 0.86 cps<br />
Num. Smooths: 3<br />
RT Window: 30.0 sec<br />
Expected RT: 3.82 min<br />
Sep. Width: 0.20<br />
Sep. Height: 0.01<br />
Exp. Peak Ratio: 5.00<br />
Exp. Adj. Ratio: 4.00<br />
Exp. Val. Ratio: 3.00<br />
Use Relative RT: No<br />
Int. Type: Manual<br />
Retention Time: 15.0 min<br />
Area: 1.19e+005 counts<br />
Height: 7.21e+003 cps<br />
Start Time: 14.4 min<br />
End Time: 16.1 min<br />
I n te n s ity , c p s<br />
5500<br />
5000<br />
4500<br />
4000<br />
3500<br />
3000<br />
2500<br />
2000<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
0<br />
14.98<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22<br />
Time, min<br />
Wirkstoff Kalibrierung (RT + 1 min)
Zusammenfassung<br />
� <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong> und <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>/<strong>MS</strong> ist als vielseitige, spezifische und<br />
hochempfindliche Bestimmungstechnik ein<br />
unverzichtbares Element der Pflanzenschutzmittel-<br />
Rückstandsanalytik<br />
� In vielen Fällen lassen sich Analysenverfahren<br />
hinsichtlich der Probenaufarbeitung mit Hilfe der <strong>LC</strong>/<strong>MS</strong>-<br />
Technik wesentlich vereinfachen, so dass ein wichtiger<br />
Beitrag zur Effizienzsteigerung geleistet werden kann.<br />
Dies rechtfertigt auch die hohen Anschaffungs- und<br />
Unterhaltskosten.