Olfaktorische Rezeptoren mit speziellen topographischen ...

Olfaktorische Rezeptoren mit speziellen 

topographischen Expressionsmustern 

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades 

der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) 

Fakultät Naturwissenschaften 

Universität Hohenheim 

Institut für Physiologie 

vorgelegt von 

Torben Feistel 

aus Stuttgart 

2006

Dekan: Prof. Dr. Breer 

1. berichtende Person: Prof. Dr. Breer 

2. berichtende Person: PD. Dr. Strotmann 

Eingereicht am: 11.12.2006 

Mündliche Prüfung am: 30.01.2007 

Die vorliegende Arbeit wurde am 12.12.2006 von der Fakultät der Naturwissenschaften 

der Universität Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Doktorgraddes der Natur- 

wissenschaften“ angenommen.

Erklärung 

Ich versichere, dass ich diese Dissertation selbständig 

gemäß der Promotionsordnung angefertigt, keine 

anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel 

benutzt und wörtlich oder inhaltlich übernommene 

Stellen als solche kenntlich gemacht habe. 

Torben Feistel

Inhaltverzeichnis 

Inhaltsverzeichnis 

I Einleitung............................................................................................. 1 

II Material und Methoden....................................................................... 4 

1. Material.................................................................................................. 4 

1.1 Allgemeine Laborgeräte........................................................................ 4 

1.2 Geräte zur Elektrophysiologie............................................................... 5 

1.3 Verbrauchsmaterial............................................................................... 5 

1.4 Software................................................................................................ 6 

1.5 Allgemeine Chemikalien........................................................................ 6 

1.6 Duftstoffe............................................................................................... 8 

1.6.1 Allgemeine Duftstoffe............................................................................ 8 

1.6.2 Komponenten des Körpergeruchs von Mäusen.................................... 9 

1.7 Enzyme................................................................................................. 10 

1.8 Verwendete Kits.................................................................................... 10 

1.9 Antikörper und Seren............................................................................ 11 

1.9.1 Primäre Antikörper................................................................................ 11 

1.9.2 Sekundäre Antikörper........................................................................... 11 

1.9.3 Seren..................................................................................................... 11 

1.10 Zellkulturmedien.................................................................................... 11 

1.11 Oligonukleotide...................................................................................... 12 

1.12 Versuchstiere......................................................................................... 15 

1.13 Lösungen............................................................................................... 16 

2. Methoden............................................................................................... 20 

2.1 Allgemeine Methoden............................................................................ 20 

2.1.1 Agarose Gelelektrophorese................................................................... 20 

2.1.2 Qualitative und quantitativeAnalyse von RNA und DNA....................... 20 

2.2 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen mit Hilfe der „Polymerase- 

Kettenreaktion (PCR)............................................................................ 21 

2.3 Klonieren von DNA Fragmenten............................................................ 23 

2.3.1 Aufreinigen von DNA mit Qiaex II.......................................................... 23 

2.3.2 A-Tailing................................................................................................ 23 

i


2.3.3 Ligation in pGEM-T................................................................................ 23 

2.3.4 DNA Transformation.............................................................................. 24 

2.3.4.1 Herstellen kompetenter Bakterien......................................................... 24 

2.3.4.2 Elektro-Transformation in XL1-blue....................................................... 24 

2.4 Herstellen von cDNA............................................................................. 25 

2.4.1 Gewebepräparation und Isolierung von RNA........................................ 25 

2.4.2 Synthese von cDNA.............................................................................. 26 

2.5 DNA Isolierung...................................................................................... 26 

2.5.1 Isolierung genomischer DNA aus Mäusen............................................ 26 

2.5.2 Isolierung und Reinigung rekompinanter Plasmid-DNA........................ 27 

2.6 Restriktionsanalyse............................................................................... 27 

2.7 Oligozell-RT.PCR.................................................................................. 27 

2.7.1 Dissotiation von vomeronasalem Gewebe........................................... 27 

2.7.2 Isolierung kleiner Zellgruppen............................................................... 28 

2.7.3 Synthese und Aufreinigung der cDNA.................................................. 28 

2.7.4 Amplifikation von V1-Rezeptoren.......................................................... 28 

2.8 Sequenzieren klonierter DNA (nach Sanger)........................................ 29 

2.9 Sequenzanalysen................................................................................. 29 

2.10 Locianalysen und Erstellen von Genkarten........................................... 30 

2.11 Vergleichende Sequenzanalysen.......................................................... 30 

2.12 Anfertigen von Gefrierschnitten............................................................. 31 

2.12.1 Präparation............................................................................................ 31 

2.12.2 Einbetten und Schneiden...................................................................... 32 

2.13 In situ Hybridisierung............................................................................. 32 

2.13.1 PCR-reaktion auf den Transkriptoinsplasmiden.................................... 32 

2.13.2 Synthese Digoxigenin/Biotin markierter RNA-Sonden.......................... 33 

2.13.3 Vorbereiten der Gefrierschnitte zur Hyridisierung................................. 33 

2.13.4 Hybridisierung....................................................................................... 33 

2.13.5 Waschen nach der Hybridisierung......................................................... 34 

2.13.6 Immunhistochemischer Nachweis der Sonden..................................... 35 

2.13.7 Färbung von in situ Hybridisierungen.................................................... 35 

ii


2.13.7.1 Nachweis der alkalischen Phosphatasemit NBT/BCIP......................... 35 

2.13.7.2 Nachweis der alkalischen Phosphatase und Peroxidase durch 

fluoreszierende Farbstoffe.................................................................... 36 

2.14 Nachweis von molekularen Zellmarkern............................................... 36 

2.14.1 Immunhistochemischer Nachweis von EYFP, EGFP und β- 

Galaktosidase....................................................................................... 

2.14.2 Enzymatischer Nachweis der β-Galaktosidase..................................... 37 

2.15 Nachweis des Rezeptors mOR256-17.................................................. 37 

2.16 Elektrische Ableitung von Elektroolfaktogrammen (EOG).................... 37 

2.16.1 Aufbau der Messapparatur.................................................................... 37 

2.16.2 Präparation............................................................................................ 38 

2.16.3 Messung................................................................................................ 38 

2.16.4 Auswahl der Kontrollduftstoffe.............................................................. 39 

2.16.5 Auswertung........................................................................................... 40 

III Ergebnisse........................................................................................... 41 

3.1 Expression von Odorantrezeptorgenen im Vomeronasalorgan............ 41 

3.2 Identifikation von Klasse-II Odorantrezeptoren..................................... 42 

3.3 Nachweis von Klasse-I Odorantrezeptoren in cDNA des VNO............. 45 

3.4 Expression von ORs im sensorischen Epithel des VNO....................... 46 

3.5 Expression der im VNO identifizierten Rezeptoren im 

hautolfaktorischen Epithel..................................................................... 49 

3.6 Spezifische Auswahl der ORs aus der gesamten Gendiversität........... 50 

3.7 Kondensation der im VNO exprimierten ORs im Genom...................... 54 

3.8 Keine zonierte Expression individueller Odorantrezeptoren im VNO.... 56 

3.9 Geschlechtsdimorphismus in der OR Expression im VNO................... 57 

3.10 Translation von OR-mRNA im VNO...................................................... 58 

3.11 Expression des Rezeptor-Transport-Proteins 1 (RTP1)....................... 59 

3.12 Charakterisierung von OR exprimierenden Zellen des VNO................ 60 

3.12.1 OR exprimierende Zellen des VNO besitzen die morphologie von 

VSNs..................................................................................................... 60 

3.12.2 Nachweis des Transduktionselementes TRP2..................................... 61 

36 

iii


3.13 Spezifische Amplifikation mit Primern gegen die Subfamilie V1Ra...... 62 

3.13.1 Co-Expression von mOR18-2 und V1Ra3/4......................................... 63 

3.13.2 Synthese spezifischer Sonden gegen V1Ra3 und V1Ra4.................... 64 

3.13.3 Hybridisierung mit spezifischen Sonden gegen V1Ra4, V1Ra3 und 

mOR18-2............................................................................................... 65 

3.13.4 Spezifische Co-Expression von mOR18-2 und V1Ra3......................... 67 

3.13.5 Vergleich der Expression von mOR18-2 und V1Ra3 während der 

Entwicklung........................................................................................... 69 

3.13.6 Vergleich der Expression von V1Ra3 und V1Ra4................................ 70 

3.14 Untersuchung des Expressionsmodus von mOR18-2.......................... 70 

3.15 Untersuchung des Expressionsmodus von mOR18-2 im 

Sphenopalatinum.................................................................................. 71 

3.16 Eingliederung des OR37 Subsystems in die Architekur des 

hauptolfaktorischen Systems................................................................ 74 

3.16.1 Kompartimentierung der Rezeptorexpression innerhalb des OR37 

Subsystems........................................................................................... 76 

3.16.2 Gleichförmige Architektur des Epithels in der medialen Zone.............. 78 

3.16.3 Weniger Zellen exprimieren zonal organisierte Rezeptoren im 

„Cluster“................................................................................................. 80 

3.17 Transkription von OR37C im gesamten medio-lateralen Epithel.......... 81 

3.18 Ausprägung des „Clusters“ während der Entwicklung.......................... 86 

3.19 Ektopische positionierte YFP + Zellen entwickeln sich zu reifen OSZ.... 88 

3.20 Expression von OR37C in SO und VNO............................................... 89 

3.21 Identifizierung von Liganden für geclustert exprimierte Rezeptoren..... 95 

3.21.1 Duftstoffe induzieren Depolarisationen des olfaktorischen Epithels..... 95 

3.21.2 Verstärkte Stimulation des „Clusters“ durch Einstreu........................... 99 

3.21.3 Verstärkte Stimulation des „Clusters“ durch 6-Hydroxy-6-methyl-3- 

heptanon............................................................................................... 100 

3.21.4 Stimulation mit „nicht Pheromonen“ aus Urin bzw. dem Körpergeruch 103 

3.21.5 Verstärkte Stimulation des „Clusters“ durch Eukalyptol........................ 104 

3.21.6 Gleiche Dosis-/Wirkungskurven für Eukalyptol und Heptanal in und 

außerhalb des „Clusters“...................................................................... 106 

iv


IV Diskussion........................................................................................... 108 

V Zusammenfassung.............................................................................. 115 

VI Summary.............................................................................................. 117 

VII Literaturverzeichnis............................................................................ 119 

v

I Einleitung 

Einleitung 

Die Detektion chemischer Komponenten aus der Umwelt ist für Tiere einer der 

ältesten und wichtigsten Sinne. Ihre Vorläufer sind bereits in einfachen, 

phylogenetisch ursprünglichen Organismen zu finden. Das chemosensorische 

System dient nicht nur der Wahrnehmung flüchtiger Substanzen aus der Umwelt z.B. 

zum Auffinden von Nahrung. Es dient ebenso der Anpassung des Verhaltens von 

Tieren unterschiedlicher Arten durch sog. Ektohormone, sowie der Steuerung und 

Abstimmung des Sozialverhaltens innerhalb einer Art durch Pheromone. Zur 

Wahrnehmung und Verarbeitung dieses breiten Spektrums an Informationen ist der 

chemosensorische Sinn der meisten Säugetiere in drei Organe untergliedert. 

Das strukturell dominierenste, chemosensorische Organ ist das olfaktorische 

Epithel (OE). Das OE überspannt die Oberfläche knöcherner Turbinalstrukturen in 

der Nasenhöhle, und beherbergt die olfaktorischen Sinneszellen (OSZ), die mit 

olfaktorischen Rezeptoren (OR) ausgestattet sind. Diese Art von Rezeptoren 

gehören zur Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) (Buck & Axel, 

1991) und stellen, mit ca. 1-2% der Gene, die größte Superfamilie im Genom von 

Säugern dar (Zhang & Firestein, 2002; Zhang et al., 2004; Qignon et al., 2005). 

Diese große Diversität dieser Rezeptoren erlaubt es den OSZ eine wahrscheinlich 

unbeschränkte Vielfalt flüchtiger Substanzen zu detektieren (Mombaerts, 2004). 

Jedes Neuron exprimiert ein Allel eines Rezeptors (Chess et al., 1994; Serizawa et 

al., 2005; Shykind, 2005), der spezifisch aufgrund der dorso-ventralen Position der 

Sinneszelle im Epithel ausgewählt wird (Shikind, 2005). Basierend auf dieser 

Auswahl entstehen im OE rezeptorspezifische Expressionsmuster, die zonal von 

anterior nach posterior verläufen und dorsal sowie ventral mit den 

Expressionsbereichen anderer Rezeptoren überlappen (Ressler et al., 1993; Vassar 

et al., 1993; Scott et al., 1997; Schönfeld & Cleland, 2005; Miyamichi et al., 2005). 

Ein von diesem Muster abweichendes Expressionsprinzip beschrieben Strotmann et 

al. (1992, 1999) für eine Gruppe von acht ungewöhnlichen olfaktorischen 

Rezeptorgenen. Diese Rezeptoren der Genfamilie OR37 weisen anstatt einer 

zonalen Expression eine rostro-caudal beschränkte Expression in einem zentralen 

Epithelabschnitt, dem sog. „Cluster“ auf. OSZ die den gleichen Rezeptor exprimieren 

konvergieren mit ihren Axonen in einen von zwei Glomeruli, von denen einer auf der 

lateralen und der andere auf der medialen Seite des olfaktorischen Bulbus (OB) 

1

Einleitung 

positioniert ist (Stewart et al., 1979; Lancet et al., 1982; Potter et al., 2001; 

Mombaerts et al., 2006). Die rezeptorspezifische Konvergenz der olfaktorischen 

Sinneszellen in Glomeruli des olfaktorischen Bulbus stellt die strukturelle Grundlage 

der Geruchswahrnehmung dar. Die so mit den Glomeruli im Gehirn verschlüsselte 

„Duftstoffkarte“ (Leon & Johnson, 2006; 2003) wird durch Mitralzellen entlang des 

lateralen olfaktorischen Trakt in höhere Gehirnzentren des olfaktorischen Cortex 

weitergeleitet (Zou et al., 2001). Dem OE wird die Detektion von leicht flüchtigen 

Duftstoffen zugeschrieben, um mit seinem breiten Repertoire von Rezeptorgenen ein 

möglichst weitgefächertes olfaktorisches Abbild der Umwelt darstellen zu können 

(Malnic et al.,1999, Mori et al., 1999, Dulac, 2006). 

Das zweite chemosensorische Organ, das Septal Organ (SO), ist eng an das OE mit 

angeschlossen. Es besteht aus einem kleinen Bereich olfaktorischen Epithels, das 

von respiratorischen Epithel umgeben im ventralen Teil des Septums positioniert ist. 

OSZ im SO exprimieren eine kleine Gruppe olfaktorischer Rezeptoren (Kaluza et al., 

2004; Tian & Ma, 2004) und projizieren ebenfalls in Glomeruli des olfaktorischen 

Bulbus (Kaluza et al., 2004). Die Funktion des SO ist bisher ungeklärt. Aufgrund 

seiner exponierten Lage im Luftstrom, wurde in frühen Studien dem SO eine 

alarmierende Funktion bei flacher Atmung zugeschrieben (Rodolfo-Masera, 1943). 

Das dritte chemosensorische Organ ist das accessorische olfaktorische 

Organ. Der sensorische Teil, das Vomeronasalorgan (VNO), wurde ursprünglich 

nach seinem Entdecker Ludwig Levin Jacobson benannt. Das VNO wird vom Vomer 

eingeschlossen und ist paarig hinter den Nasenöffnungen am ventralen Ende des 

Septums, unterhalb der Nasenhöhle positioniert. Das posterior blind endende Organ 

ist mit Mucus gefüllt und besitzt bei Mäusen anterior über den Ductus incisivus 

Zugang zur Nasenhöhle. Chemosensorische Neurone des VNO exprimieren ein 

Mitglied von zwei weiteren, VNO typischen Familien von Chemorezeptorgenen, den 

V1R oder V2R Genen (Dulack & Axel, 1995; Matsunami & Buck, 1997; Del Punta et 

al., 2000). Vomeronasale Sinneszellen (VSZ) projizieren in einen vom 

hauptolfaktorischen Bulbus getrennten Teil des Vorderhirns, den accessorischen 

olfaktorischen Bulbus (AOB). Dort konvergieren sie im Gegensatz zu OSZ in mehrere 

kleine, glomerulus-artige Strukturen (Rodriguez et al., 1999, Wagner et al., 2006). 

Mitralzellen des AOB leiten die Informationen entlang des accessorischen 

olfaktorischen Traktes weiter in die Amygdala und den Hypothalamus (Yoon et al., 

2005). Die bisherige Meinung über die Funktionsweise des accessorischen Systems 

2

Einleitung 

unterscheidet sich grundlegend von der Funktionsweise des OE. Anstatt einer 

Kodierung von Duftstoffen in der Kombinatorik der unspezifisch aktivierten 

Rezeptoren in der „Duftstoffkarte“ im OB geht man im VNO von einer hoch 

spezifischen Erkennung spezieller, nicht flüchtiger Moleküle durch die V1 und V2 

Rezeptoren aus (Leinders-Zufall et al., 2000), denen die Funktion von Pheromonen 

und Ektohormonen zugeschrieben wird (Halpern & Martinez-Marcos, 2003; Buck, 

2000). 

In neuesten Untersuchungen des VNO wurde jedoch unerwartet gezeigt, dass 

Substanzen, die bisher für „gewöhnliche“ Duftstoffe gehalten wurden, ebenfalls mit 

Hilfe des accessorischen Systems detektiert werden können (Sam et al., 2001; Trinh 

& Storm, 2003; 2004). Weitere Versuche zeigten, dass das Entfernen einer 

Subfamilie von V1R Genen aus dem Genom der Maus (Del Punta et al., 2002) zwar 

das Verhalten verändert, aber sogar das Entfernen des gesamten VNO, die 

Steuerung des Sozialverhaltens von Mäusen nicht zum Erliegen bringt (Pankewich et 

al., 2004, Keller et al., 2006). Diese Befunde weisen darauf hin, dass zwischen den 

strukturell getrennten chemosensorischen Organen funktionelle Überschneidungen 

bestehen, deren molekularen Grundlagen dafür bisher unbekannt sind. In der 

vorliegenden Arbeit wurden olfaktorische Rezeptoren untersucht, die sich durch 

besondere Expressionsmuster in chemosensorischen Subsystemen auszeichnen 

und somit möglicherweise eine besondere Rolle in der Detektion von Duftstoffen 

spielen. 

3

II Material und Methoden 

1 MATERIAL 

1.1 Allgemeine Laborgeräte 

Absorptions-Photometer Biophotometer, Eppendorf 

Material und Methoden 

Autoklav 3850 ELC, Systec Labor-Systemtechnik 

Bakterien-Inkubationsschüttler G 24, New Brunswick Scientific 

Fluoreszenzmikroskop Axiophot, Carl Zeiss Jena 

Gefriermikrotom CM30505, Leica Microsystems 

Geldokumentation LFT Labortechnik 

Inverses MiKroskop IX70, Olympus 

Kameras Soundvision, SV Micro 

Axiocam, Carl Zeiss Jena 

SensiCam, PCO 

Konfokale Mikroskpie LSM 510 Meta, Zeiss Jena 

PeltierThermocycler PTC-200, MJ Research 

pH-Meter φ32, Beckman 

Sequenzierautomat ABI 310, PE Biosystems 

Speed-Vac - Konzentrator Savant 

Stereomikroskop Stemi 2000-C, Leica 

Lumar, Carl Zeiss Jena 

Thermomixer 5437, Eppendorf 

Tischzentrifuge 5417, Eppendorf 

Ultrazentrifuge Minifuge RF, Heraeus 

Vortex Genie 2, Mo Bio Laboratories Inc. 

Warmluftschüttler G24, New Brunswick Scientific 

4

1.2 Geräte zur Elektrophysiologie 

optische Bank LT 100/80, Barry Controls 


Farradey Käfig Eigenbau, Prof Hanke, Inst. für Physiologie 

Mikromanipulator 3465 Isert-Elektronik 

Verstärker DP-304, Warner Instrument 

elektronischer Tiefpass Filter Helmut Singer Elektronik 

Oszilloskop HM 205-3, Hameg 

Analog/Digital-Wandler mem A, bmcm 

Digitalkamera CCD iris, Sony 

Monitor TM A10-E, JVC 

Video/Digital-Wandler Terratec 

PicoSpritzer II Parker Instrumentation 

Stereomikroskop M3C, Wild 

Pipetten-Puller 750, David Kopf Instruments 

Computer AMD Athlon, MaxData 

1.3 Verbrauchsmaterial 

Kapillaren GC100FS-10 Bohrsilicat, Harvard Apparatus 

Pipetten ISO 9001, Hirschmann Laborgeräte 

Filterpapier 1001 090, Whatman 

Heidelberger Verlängerung Braun 

Elektrodendraht 0,5 mm Silberdraht, Ticar-Versand 

Einbettmedium Tissue Tek, Miles Inc. 

Objektträger SuperFrost�, Menzel-Gläser 

Polysin�, Menzel-Gläser 

SterFrost, Knittel Gläser 

5

1.4 Software 

EOG, Signalaufzeichnung NextView NT, bmcm 

EOG, Bildverarbeitung Videostudio 7SE DVD, Ulead Systems 

EOG, Auswertung Origin 

Labview 

EOG, Statistische Auswertung Prism 


Sequenzanalyse Chromas; C. McCarthy, Brisbane, Australia 

Identifizierung von Gen-Loci Ensemble Genome Broser 

Erstellen von Primersequenzen Genamics Expression 1,080 

Erstellen von Genkarten Genomics Expression 1,080 

Erstellen von Abbildungen Illustrator, Adobe 

Erstellen von Grafiken Excel, Microsoft 

Bearbeiten von Bildern Axiovision LE ,Carl Zeiss Zeiss Jena 

1.5 Allgemeine Chemikalien 

LSM5 Image Broser, Carl Zeiss Jena 

Photoshop 7, Adobe 

5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP) Roche 

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galaktosid (X-Gal) Roth 

Agarose Typ II Sigma 

Ammoniumacetat Roth 

Amoniumhydrogencarbonat Roth 

Ampicillin Sigma 

Bromphenolblau Sigma 

Calziumchlorid Fluka 

Chloramphenicol Sigma 

Chloroform Merk 

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma 

Dinatriumhydrogenphosphat Merk 

Dithiotreitol (DTT) Sigma 

6

DNA aus Heringsperma Sigma 

Einbettmedium für Cryoschnitte Leica Microsystems 

Essigsäure Fluka 

Ethanol T.J.Baker 

Ethidiumbromid Sigma 

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Sigma 

Ficoll 400 Sigma 

Formaldehyd Merk 

Formaldehyd Sigma 

Formamid Sigma 

Glucose Fluka 

Isopropanol Merk 

Kaliumacetat Fluka 

Kaliumchlorid Fluka 

Kaliumhydroxyd Fluka 

Lichrosolv Wasser Merk 

Lihiumchlorid Merk 

low melting Agarose Sigma 

Magnesiumchlorid Fluka 

Magnesiumsulfat Sigma 

Maleinsäure Merk 

Methanol Merk 

N,N Dimethylphormamid Sigma 

Natriumacetat Fluka 

Natriumcarbonat Fluka 

Natriumdodecylsulfat (SDS) Sigma 

Natriumhydroxyd Fluka 

Natriumjodid Merk 

Nitroblautetrazoliumchlorid Hydrat (NBT) Roche 

Rinderserumalbumin (BSA) Sigma 

Salzsäure (HCl) Fluka 

Succrose Merk 

Tris Roth 

Triton X-100 Sigma 


7

Tween 20 Merk 

Zinkchlorid Sigma 

1.6 Duftstoffe 

1.6.1 Allgemeine Duftstoffe 

Benzaldehyd Sigma 

Citral Sigma 

Eukalyptol Drom 

Heptanal Sigma 

gamma Terpine Sigma 

alpha Terpineol Sigma 


endo Brevicomin zur Verfügung gestellt von Dr. Till Tolasch 

exo Brevicomin zur Verfügung gestellt von Dr. Till Tolasch 

2-Heptanon Sigma 

Carvon Sigma 

Ethylacetat Sigma 

beta Pinen Sigma 

Borneol Sigma 

Dihydrocarveol Sigma 

Geraniol Sigma 

Linalool Sigma 

8

1.6.2 Komponenten des Körpergeruchs von Mäusen 

Peak Duftstoff Peak Duftstoff 


4 Nitromethan 27 6-Hydroxy-6-methyl-3-heptanon 

6 Acetic acid 30 3-Methyl-buttersäure 

7 2-Methyl-3-buten-2-ol 31 3-Methyl-cyclopentanon 

8 3-Methyl-2-butanon 32 2-Methyl-buttersäure 

10 1-Methoxy-2-propanol 33 2-Furanmethanol 

11 2-Pentanon 38 Bis-(methylthio)methan 

14 3- Hydroxy-2-butanon 43 3-Hepten-2-ol 

17 3-Methyl-3-buten-1-ol 57 2,3-Dehdro-exo-brevicomin 

18 3-Penten-2-one 59 4-Methylphenol 

22 3-Methyl-2-buten-1-ol 69 (E,E)-α-Farnesen 

25 1-Octen 

Alle Komponenten wurden von Prof. em. Overath (Max-Plank-Institut für Biologie, 

Tübingen) zur Verfügung gestellt. Die Nummer des Peaks gibt die Reihenfolge der 

Substanzen während der gaschromatographischen Auftrennung an (Röck et al, 

2006). 

9

1.7 Enzyme 

Apa I NEB 

Pst I NEB 

DNase I Amersham 

Reverse Transkriptase Invitrogen 

T4 Ligase Promega 

DNA Polymerase MasterTaq Eppendorf 

DNA Polymerase Titanium Taq Clontech 

DNA Polymerase Taq CORE-Kit MP Qbiogene 

Collagenase Sigma 

Proteinase K MP Qbiogene 

RNase H Invitrogen 

1.8 Verwendete Kits 

SuperScript II Invitrogen 

GeneRacer II Invitrogen 

Qiaex II-Gelextraktionskit Qiagen 

QIAquick PCR Purification-Kit Qiagen 

ABI PRISM Dye Terminator Cycle 

Sequencing Ready Reaction Kit 

pGEM-T Vektor System I Promega 

RNA Labeling-Kits Roche 

Sephaglas Plasmid Mini-Kit Pharmacia 

RNA-Extraction-Kit PALM 

TSA TM Fluorescence Systems Perkin Elmer 

HNPP Fluorescent Detection Roche 


Perkin Elmer, Applied Biosystems 

RNA-Extraction-Kit Absolurly RNA TM NanoprepKit Stratagene 

Nucleo-Spin RNA II Clontech Laboratories, Inc. 

10

1.9 Antikörper und Seren 

1.9.1 Primäre Antikörper 

rabbit-anti-EGFP/EYFP Molecular Probes 

mouse-anti-β Galactosidase monoklonal, Promega 

rabbit-anti-β Galactosidase polyklonal, ACRIS-Antikörper 


anti-mOR256-17 zur Verfügung gestellt von Dr. Jörg 

goat-anti-OMP Wako Chemicals 

Strotmann, (Strotmann et al. 2004) 

goat-anti-DIG-AP Roche Diagnistics 

1.9.2 Sekundäre Antikörper 

donkey-anti-mouse-Ax569 Molecular Probes 

goat-anti-rabbit-Ax488 Molecular Probes 

goat-anti-rabbit-Cy3 Molecular Probes 

donkey anti-rabbit-Ax488 Molecular Probes 

donkey-anti-goat-Ax569 Molecular Probes 

1.9.3 Seren 

normal goat Serum Jackson Immunoreserch 

normal donkey Serum Jackson Immunoreserch 

1.10 Zellkulturmedien 

D-MEM Glutamax Gipco 

LB Medium Roth 

11

1.11 Oligonucleotide 


Amplifikation von Odorantreceptoren Erwartete Fragmentlänge 

3.1 GCN ATG GCN TAY GAY MGN TA 

7.1 ARN SWR TAD ATR AAN GGR TT 

P28 RAA IGG RTT IAR CAT IGG 

classI GGR TTI ADI RYI GGN GG 

P26 GCI TAY GAY CGI TAY GTI GCI ATITG 

745 bp 

534 bp 

511 bp 

Amplifikation von V1 Rezeptoren Erwartete Fragmentlänge 

V1a for WRG TCT CAT GBK CCT CTC 

V1a rev CAT CAG CAV AAA GAA GST 

V1c for ATG AGA GGN HTC TCW VTB 

V1c rev ACC CAG TAC ATR ACC ACA 

V1d for TGG TTG TTC AGT GTC TTA 

V1d rev TGG TCC AKR CYA TGA TGC 

V1e for AYC TGY YTC YTG AGT GTY 

V1 e rev CTK YTT GTG THY RWR HAG 

V1h for AGC AGT CTC CTC ACT GTG 

V1h rev CTG GCC CCT CCC ATR GCA 

Herstellung von Sonden zur in situ Hybridisierung 

Sp6out 

T7out 

CCA AGC TAT TTA GGT GAC ACT ATA 

AAT TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG 

Klonierung von 3’UTR V1Ra3 

3’ V1Ra3 for GAA GAG CTA ATA ACA GCG GCC TAA 

3’ V1Ra3 rev TCC TAA GTT CGG CGG GTC TC 

Klonierung von 3’UTR V1Ra4 

3’ V1Ra4 for TAA GGT CCA TGT GTG AGT GG 

3’ V1Ra4 rev CTT ACA TTA CCT TTC ATT GAG 

Klonierung von M71/M72 (mOR171-2/mOR171-3) 

160bp 

473bp 

181 bp 

342 bp 

302 bp 

287 bp 

269 bp 

12

M71 for TGT CCA TGC TGG CAA TGA CTG 

M71 rev CTC CGT AGA CAA TGG GGT TCA 

Kontrolle gegen Kontaminationen durch genomische DNA 

L8 for1 CCT ACG TGC TGT GGA CTT CGC 

L8 rev1 TCT GTT GGC AGA GGA AAT GAC C 

L8 for2 AGC GAC ACG GCT ACA TTA AAG G 

L8 rev2 AGG CAG CTT CAC TCG AGT CTT C 

Genotypisierung der Mauslinie B136 

G3A AAGAAGGCCTTCTCCACCTG 

G63 AAGGCTATGCTGAATGATTGA 

Genotypisierung der Mauslinie Y68 


G68 

Genotypisierung der Mauslinie V37 


G15A TCCCGGGTGATGGGTGATGTT 

Genotypisierung der Mauslinie H26 


G68 GGCACAGATCTCTGGAAAGAT 

Genotypisierung der Mauslinie O44 



Genotypisierung der Mauslinie FD258 

824 ACATACTTCCGGCCACGCTCA 

CZ 69 A CCCTGGAAGAGTAGCCACTTG 

Genotypisierung der Mauslinie CreMol2.3 


703 bp 

RNA: 418 bp 

DNA: 661bp 

RNA: 364bp 

DNA: 607 bp 

220bp transgen 

500bp wildtyp 


400bp wildtyp 


550bp wildtyp 


400bp wildtyp 


220bp wildtyp 


G71 GAGCGAGCTAAGGCATTTG 600bp wildtyp 

13


G72 ACATTATAGCTAAACAATAGC 400bp transgen 

Genotypisierung der Mauslinie M55 

Tac 17 GAAGAAGCAGGATGGTGAGA 

Tac 18 ACATGACCTTGCGGATCTTG 

Genotypisierung der Mauslinie RF1 



Genotypisierung der Mauslinie Rosa26-LacZ bzw. EYFP 

ROSA1 AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT 

ROSA2 GCGAAGAGTTTGTCCTCAACC 

300bp wildtyp 

keine Bande, transgen 

400bp wildtyp 

230pb transgen 

600bp wildtyp 

350pb transgen 

14

1.12 Versuchstiere 


Alle verwendeten Mauslinien wurden aus dem Institut für Physiologie der Universität 

Hohenheim bezogen. 

Bezeichnung Transgen 

M55 OMP→EGFP 

Mol2.3 mOR18-2-IRES-GFP-IRES-tauLacZ 

O44 OR37C-IRES-tauGFP 

Y68 OR37A-IRES-tauLacZ 

B136 OR37B-IRES-tauLacZ 

V37 OR37C-IRES-tauLacZ 

H26 OR37B-IRES-tauEGFP 

FD 258 P2-IRES-tauLacZ 

RF1 OR37C IRES-cre 

Rosa26 LacZ LoxP-STOP-LoxP-LacZ 

Rosa26 EYFP LoxP-STOP-LoxP-EYFP 

Zur Bestimmung des Repertoire an Odorantrezeptoren im VNO wurde RNA aus 

folgenden Tieren isoliert. 

Tabelle1: Tiere zur Bestimmung der im VNO exprimierten Odorantrezeptoren. 

Maus Maus-Linie Geschlecht Alter 

1 V37 männlich P33 

2 Mol2.3 männlich P19 

3 Mol2.3 männlich P19 

4 C57 Wildtyp männlich P23 


6 C57 Wildtyp weiblich P14 


8 C57 Wildtyp weiblich P296 

15

1.13 Lösungen 

6 fach Probenpuffer: 

TBE-Puffer: 

25% Ficoll 

PWL-Puffer: 

Ringer: 

3 fach TBE Puffer 

0,025% Bromphenolblau 

90 mM Tris-HCl pH 7,4 

2 mM EDTA, 

90 mM Borsäure 

0,5 M Tris 

5 mM EDTA 

0,2% SDS 

80,2 M NaCl 

138 mM NaCl 

5 mM KCl 

2 mM CaCl2 

1,5 mM MgCl2 

10 mM HEPES 

10 mM D-Glucose 

Lösungen für in situ Hybridisieruneng: 

Fixierlösung: 

4% Paraformaldehyd 


in 0,1 M Carbonat-Puffer (0,1 M NaHCO3 mit 0,1 M Na2CO3 auf pH9,5) 

16

10 fach PBS: 

Tris: 

1,45 M Natriumchlorid 

1,4 mM Kaliumhydrogenphosphat 

8 mM Di-Natriumhydrogenphosphat, 

Einstellen auf pH 7,1 

100 mM Tris 

20 fach SSC: 

150 mM Natriumchlorid 

Einstellen auf pH7,4 

3 M Natriumchlorid 

0,3 M Na-Citrat, 


Hybridisierungspuffer: 

50% Dextransulfat 

10 vol% 20 fach SSC 

4 vol% Heringssperma (5 mg/ml) 

50 vol% Formamid 

0,1% Hefe t RNA 

mit Bidest auffüllen 

Blocklösung (Stammlösung): 

10% Blocking-Pulver 

in Maleinsäurelösung (0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH9,5) 

Blocklösung (Gebrauchslösung): 

10% Blocklösung (Stammlösung) 

0,3% TritonX-100 

in Tris-Puffer 


17

DAP: 

100 mM Tris 

100 mM Natriumchlorid 

50 mM Magnesiumchlorid 


NBT/BCIP Färbelösung: 

0,016% NBT-Lösung (5% BCIP in 70% Dimethylformamid) 

0,008% BCIP-Lösung (5% BCIP in Dimethylformamid) 

in DAP pH9,5 

Carbonatpuffer zur Sondenverkürzung: 

80 mM NaHCO3 

120 mM Na2CO3 

auf pH10,2 einstellen 

X-Gal Färbung: 

Phosphatpuffer 

1 M Na2HPO4 wird mit 

1 M NaH2PO4 auf pH 7,4 eingestellt 

4% Fixierlösung: 

Puffer A: 

10,8% Formalin (37%iges Formaldehyd), 

0,1% 2 M MgSO4, 

1% 0,5 M EGTA 

10% Phosphatpuffer 

0,1% 1 M MgCl 

1% 0,5 M EGTA 


18

Puffer B: 

Puffer C: 


0,2% 1 M MgCl 

0,1% 10%iges Na-Deoxycholat 

0,2% 10%iges IGEPAL 


0,2% 1 M MgCl 

0,1% 10%iges Na-Deoxycholat 

0,2% 10%iges IGEPAL 

1% 500 mM K3Fe(CN)6 

1% 500 mM K4Fe(CN)6 

0,5% 2%iges XGal in DMSO 

Bakterienkultur und Plasmid-Transformation: 

Substanzen und Medien für die Bakterienkultur: 

SOB: 


Von Life Technologies wurden Agar und Bactotrypton 

(Caseinhydrolysat/Pepton 140) bezogen. Die Firma Merck lieferte granulierten 

Hefeextrakt. 

1% Trypton 

1%NaCl 

0,5% Hefeexktrakt 

2% Trypton 

0,5% Hefeextrakt 

10 mM NaCl 

2,5 mM KCl 

10 mM MgCl2 

10 mM MgSO4 

19

SOC: 

2% Trypton 

0,5% Hefeextrakt 

10 mM NaCl 

2,5 mM KCl 

10 mM MgCl2 

10 mM MgSO4 

20 mM Glucose 

2 METHODEN 

2.1 Allgemeine Methoden 

2.1.1 Agarose-Gelelektrophorese 


Diese Methode wurde zur Analyse von DNA-Fragmenten eingesetzt. Dazu wurden 2 

µl Reaktionsansatz mit 5 µl Probenpuffer versetzt und die DNA Fragmente in einem 1 

bis 1,5%igen Agarosegel mit 1xTBE-Puffer bei 100 bis 200 V elektrophoretisch 

aufgetrennt. Zur Visualisierung der DNA wurde dem Gel 1 µg/ml Ethidiumbromid 

zugesetzt. Anschließend wurde die DNA in einer Gel-Dokumentationseinheit mit UV- 

Licht (302 nm) analysiert. 

2.1.2.Qualitative und quantitative Analyse von RNA und DNA 

Die Konzentration von gelösten Nukleinsäuren kann durch eine photometrische 

Bestimmung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt 

werden (Sambrook et al., 1989). Die Extinktion von 1 OD260 entspricht einer 

Konzentration von 50 µg/ml DNA bzw. 40 µg/ml RNA. Die Reinheit der 

Nukleinsäurelösung wird über den Quotienten der Extinktionenn bei 260 nm und 280 

nm (OD260/OD280) ermittelt. Bei einer reinen DNA/RNA Lösung liegt der Quotient 

20


zwischen 1,8 und 2,2. Niedrigere Werte deuten auf eine Kontamination durch 

Proteine oder organische Lösungsmittel hin. 

2.2 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen mit Hilfe der ”Polymerase- 

Kettenreaktion” (PCR) 

Die Amplifikation von DNA durch PCR erfolgt mit Hilfe von Oligonukleotiden mit 

spezifischen Eigenschaften: Die Spezifität der Reaktion wird durch die Homologie der 

Primer zur jeweiligen Zielsequenz der DNA sowie über den GC-Gehalt der Primer 

bestimmt. Primer dürfen weder ausgeprägte Sekundärstrukturen bilden noch sollten 

sie mit sich selbst oder mit dem jeweiligen gemeinsam verwendeten Primer zur 

Dimerisierung neigen. Typischerweise werden synthetische Oligonukleotide mit 

einer Länge von 17 bis 18 bp und einem GC-Gehalt von ca. 50% eingesetzt. 

Abhängig von der jeweils verwendeten DNA-Polymerase erfolgten die Reaktionen in 

unterschiedlichen Reaktionen: 

Tabelle 2: Reaktionenlösungen der verwendeten DNA-Polymerasen. 

Eppendor Master Taq Titanium Taq 

Tris-HCl pH8 20 mM 20 mM 

KCl 50 mM 50 mM 

dNTPs 0,4 mM 2 mM 

Primer je 100 pM 100 pM 

Template ca. 100 ng ca. 100 ng 

Die Reaktion erfolgten in einem Volumen von 20 µl bzw. 50 µl und wurden bis zum 

Start der PCR auf Eis gekühlt. Die Amplifikation erfolgte in einem Thermo Cycler. 

Die Temperatur für die Elongationsschritte müssen an das verwendete Enzym 

angepasst werden. Sie erfolgte bei 72°C bei Verwendung der Master Taq und bei 

68°C bei Verwendung der Titanium Taq. Für den Ablauf der Reaktionen wurden 

folgende Temperaturprofile verwendet: 

21

x34 

x40 

x40 

A) Programm Tail1 60/55, 34 Cyclen 


Abschnitt Zeit [min] Temperatur [°C] 

1: Initiale Denaturiewrung 2 94 

2: Cyclische Denaturierung 1 94 

3: Annealing 1 60/55 

4: Elongation 1 72 

5: Finale Elongation 10 72 

6: Abkühlen unendlich 8 

B) Programm Titan55/65, 40Cyclen 



2: Cyclische Denaturierung 0,5 95 

3: Annealing 1 55/65 




C) Programm 3.1/7.1 40, 40Cyclen 



2: Cyclische Denaturierung 0,75 96 

3: Annealing 3 40 




22


Alle DNA-Amplifikationen wurden durch eine Agarose-Gelelektrophorese überprüft. 

Zur Klonierung wurde die Bande der erwarteten Größe mit Hilfe des Qiaex II- 

Gelextraktionskit isoliert. Die Klonierung erfolgte anschließend in den pGEM-T-Vektor 

der Firma Promega. 

2.3 Klonieren von DNA Fragmenten 

2.3.1 Aufreinigen von DNA mit Qiaex II 

Die DNA-Banden der erwarteten Größe wurden aus einem 1,5%igem Agarosegel 

ausgeschnitten und mit dreifachem Volumen QX1-Puffer versetzt. Nach Zugabe von 

2 bis 10 µl Qiaex II-Partikel und 800 µl Lysepuffer (QX-1) inkubierte das Agarosegel 

bei 50°C bis zur vollständigen Auflösung. Zur verbesserten Adsorbtion der DNA an 

den Silicapartikeln wurde die Probe gevortext. Nach kurzem Zentrifugieren wurde der 

Überstand vollständig abgenommen, das Pellet einmal mit QX1-Puffer sowie zweimal 

mit PE-Puffer gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet. Abschließend wurde 

die DNA 5 Minuten bei mit 10 bis 20 µl H2O bei Raumtemperatur eluiert. Die 

Bestimmung der Konzentration der DNA erfolgte anschließend photometrisch. 

2.3.2 A-Tailing 

Ein A-Tailing dient dem Anhängen von Adenin-Überhängen an PCR-Fragment zur 

Verbesserung der Insertionsfrequenz bei der Ligation in den pGEM-T Vektor. Dazu 

wurde das aufgereinigte PCR-Amplifikat in einem 50 µl Ansatz in 1 fach PCR- 

Reaktionspuffer mit 2,5 µl 2 mM dATP und 0,5 unit Taq-Polymerase 20 Minuten auf 

72°C erhitzt und erneut mit dem Qiaex II Kit aufgereinigt. 

2.3.3 Ligation in pGEM-T 

Zur Klonierung aufgereinigter PCR-Produkte wurde das pGEM-T Vektor System von 

Promega verwendet. Das Einfügen der PCR-Amplifikate in den Vektor erfolgte in 

einem Gesamtvolumen von 10 µl. Die Reaktion bestand aus 25 ng pGEM-T Vektor, 

einer unit T4 DNA-Ligase sowie aus 2 fach rapid Ligasepuffer. Die Reaktion erfolge 

23


über Nacht bei 4°C. Zur Inaktivierung der Reaktion wurde die Reaktion für 10 

Minuten auf 65°C erhitzt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. 

2.3.4 DNA-Transformation 

Zur Trennung und Vermehrung unterschiedlicher PCR-Fragmente der gleiche Größe, 

wurden die rekombinanten Vektoren aus den Ligationen in kompetente Bakterien 

transformiert. Dabei nimmt jedes Bakterium ein Plasmid auf und vermehrt es. Der 

verwendete Bakterienstamm war der Escherichia .coli Labor-Sicherheitsstamm 

XL1blue. 

2.3.4.1 Herstellen kompetenter Bakterien 

Die kompetenten Bakterienzellen wurden in Anlehnung an die von Hanahan (1983) 

entwickelte Methode hergestellt. Dazu wurden 5 ml einer Bakterien-Übernachtkultur 

(drei bis fünf Bakterienkolonien in 50 ml Medium über Nacht bei 37 C und 200 rpm 

im Warmluftschüttler inkubiert) zu 500 ml LB-Medium in einen 1000 ml 

Schikanekolben gegeben und bei 37°C und 200 rpm bis zu einer OD600 von 0,5 

inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien auf Eis abgekühlt, auf vier 250 ml 

Gefäße aufgeteilt und 15 Minuten in der Ultrazentrifuge bei 4000 g zentrifugiert. 

Danach wurden sie zweimal in eiskaltem, autoklaviertem, zweifach destilliertem 

Wasser (Bidest) und einmal mit eiskaltem 1 mM Hepes gewaschen, vereinigt und in 

2 ml 1 mM Hepes mit 10% Glycerin aufgenommen. Aliquote zu je 100 µl der 

kompetenten Bakterien wurden direkt in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei 

minus 70°C bis zur Verwendung aufbewahrt. 

2.3.4.2 Elektro-Transformation in XL1-blue 

Für die Transformation der Ampicillin-Resistenz tragenden rekombinanten Vektoren 

wurden kompetente E. coli eingesetzt. Dafür wurden 3 µl des Ligationsansatzes 

(siehe 2.3.2) mit 100 µl kompetenten Bakterien (siehe. 2.3.3.1) versetzt und 1 Minute 

auf Eis inkubiert. Zur Transformation wurden die Bakterien in eine eiskalte Metal- 

Küvette gegeben und für 4,3 bis 4,5 msec einer Spannung von 2 kV bei 200 Ohm 

und 25 µF ausgesetzt. Unmittelbar anschließend wurden die Bakterien für 1 Stunde 

24


bei 37°C in 1 ml SOC zum Aufbau der Ampicilin-Resistenz kultiviert. 200 µl der 

Transformation wurden auf LB/Amp-Platten (LB-Medium mit 1,5% Agar und 

100µg/ml Ampicillin) ausplattiert. Zur blau/weiß-Selektion rekombinanter Kolonien 

wurden die Agar-Platten zwei Stunden vor dem Ausplattieren mit 70 µl 100 mM IPTG 

in H2O und 70 µl 2% X-Gal in DMSO beschichtet. Die Kultivierung der Bakterien 

erfolgte bei 37°C über Nacht. 

2.4 Herstellen von cDNA 

Eine genetische Analyse der Expression von Genen zu bestimmten Zeitpunkten oder 

Stadien kann nur durch die Identifizierung der jeweils transkribierten und gereiften 

RNA im jeweiligen Gewebe durchgeführt werden. Dafür wird die gesamte im Gewebe 

vorliegende RNA isoliert und in die enzymatisch weniger anfällige cDNA 

umgeschrieben. 

2.4.1 Gewebepräparation und Isolierung von RNA 

Die in dieser Arbeit entnommenen Gewebe waren das hauptolfaktorisches Epithel 

und das Vomeronasalorgan. Zur Isolierung des Gewebes wurde der RNA- 

Extraktions-Kit der Firma Palm bzw. Stratagene verwendet. Das entnommene 

Gewebe wurde in ein RNase freies Eppendorf Reaktionsgefäß gegeben und mit 

Lysepuffer bis zur vollständigen Auflösung inkubiert. Knochen des 

hauptolfaktorischen Epithels und des Vomeronasalorgans wurden zuvor mit RNase 

freien Miniaturpottern zerrieben. Die Isolierung der RNA erfolge über die Bindung von 

RNA und DNA an eine Matrix in Zentrifugenröhrchen (Palm/Stratagene). Die DNA 

wurde 30 Minuten durch Zugabe einer DNase verdaut und mit Hilfe der im Kit 

enthaltenen Puffern zusammen mit den im Gewebe enthaltenen Proteinen von der 

Matrix abzentrifugiert. Abschließend wurde die RNA mit 70%igem Ethanol 

gewaschen und mit 70 µl Bidest bei 55°C eluiert. Für die darauffolgende cDNA- 

Synthese wurden 20 µl RNA Lösung verwendet. RNA Proben der VNOs wurden 

zuvor mit der Speed-Vac Konzentrator auf 20 µl eingeengt. 

25

2.4.2 Synthese von cDNA 


Zur Synthese von Erst-Strang-cDNA von Poly(A) + -RNA aus isolierter gesamt RNA 

wurde die SuperScriptII Reverse Transkriptase von Invitrogen eingesetzt. Dafür 

wurden 20 µl RNA mit 2,4 µl 20 mM dNTPs, 4 µl oligo-d(T)18-Primer (3 pmol/µl) und 

66 µl H2O versetzt, 5 Minuten bei 65°C inkubiert und sofort auf Eis gestellt. 

Anschließend wurden 9,3 µl DTT (100 mM), 1,2 µl RNasin, 7,2 µl MgCl2 (50 mM) und 

28 µl 5 fach Erstrangsynthese-Puffer zugegeben; der Ansatz wurde gemischt und die 

Reaktion durch Zugabe von 2 µl SuperScriptII gestartet. Die reverse Transkription 

wurde 50 Minuten bei 42°C durchgeführt. Zur Inaktivierung wurde die Reaktion 15 

Minuten auf 70°C erhitzt. Der Ansatz wurde auf Eis abgestoppt und bis zum 

Gebrauch bei –20°C gelagert. 

2.5 DNA Isolierung 

In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Arten von DNA verwendet. Zum Einen 

genomische DNA aus Mäusen, zum Anderen bakterielle, rekombinante Plasmid- 

DNA. 

2.5.1 Isolierung genomischer DNA aus Mäusen 

Zur Genotypisierug transgener Tiere wurde genomische DNA verwendet. Die 

Isolierung der DNA erfolgte aus 2 bis 3 mm langen Schwanzstücken. Die 

Schwanzstücke wurden mit 4 µl Proteinase K in 500 µl PWL-Puffer für mindestens 5 

Stunden bei 55°C inkubiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die 

DNA mit 400 µl Isopropanol gefällt. Nach dem Zentrifugieren der Probe in der 

Tischzentrifuge (14000 rpm für 5 Minuten) wurde das Pellet verworfen und die sich 

im Überstand befindende DNA in 500 µl 70% Ethanol übertragen, nochmals 

gewaschen, getrocknet und in 200 µl Bidest gelöst. 

26

2.5.2 Isolierung und Reinigung rekombinanter Plasmid-DNA 


Rekombinante Bakterienkolonien werden aufgrund einer blau/weiß Selektion 

identifiziert. Bei der Insertion des Fragments in die „multiple cloning site“ wird die 

codierende Sequenz der β-Galaktosidase unterbrochen. Als Folge sind die 

rekombinanten, weißen Kolonien von den nicht-rekombinanten, blauen Kolonien zu 

unterscheiden. Für die Isolierung von Plasmid-DNA wurde eine alkalische Lyse mit 

auf SDS basierender Fällung von genomischer DNA und Protein mit anschließender 

Sephaglas-aufreinigung gewählt. Die Aufreinigung erfolgte mit dem Kit für Mini- 

Präparationen der Firma QIAGEN. Bei der Klonierung von PCR-Produkten kommt es 

jedoch auch zum Auftreten von pseudo-positiven Kolonien, d.h. weißen Kolonien, 

deren Bakterien nicht-rekombinante Plasmide enthalten. Erst nach der Isolierung der 

Plasmide kann durch einen enzymatischen Verdau des Vektors mit geprüft werden, 

ob es sich wirklich um rekombinante Plasmide handelt. 

2.6 Restriktionsanalyse 

Um die Insertion des amplifizierten Fragments zu überprüfen, wurde die isolierte 

Plasmid-DNA an der „multiple cloning site“ geschnitten. Dafür wurden 0,2 bis 1 ng 

DNA mit fünf Einheiten der Restriktionsenzyme Apa I und Pst I in einem 10 µl 

Reaktionsansatz geschnitten bei 37°C geschnitten. Anschließende wurde der 

Restrikionsverdau auf ein Agarosegel aufgetragen. Die Größe des ausgeschnittenen 

Fragments war ein Hinweis, ob es sich bei der Insertion um das gewünschte PCR- 

Fragment handelte. 

2.7. Oligozell-RT-PCR 

2.7.1 Dissotiation von vomeronasalem Gewebe 

Zur Identifikation von mOR18-2 exprimierenden Zellen wurden für Oligozell-RT-PCR 

Versuche Mol2.3-IGITL-Mäuse verwendet. Das sensorische Epithel des VNO wurde 

27


direkt nach der Entnahme 15 Minuten in 50%igem EDTA-Trypsin bei 37°C und 

anschließend für 30 Minuten in DMEM (Dulbecco’s modified Eagle Medium) mit 

0,1% Collagenase A gegeben. Zur vollständigen Dissotiation wurde das Gewebe 

vorsichtig trituiert und nach vollständiger Dissotiation in eine Zellkulturschale mit 

DMEM gegeben. 

2.7.2 Isolierung von kleinen Zellgruppen 

Die Identifizierung EGFP-markierter Zellen erfolgte mit Hilfe eines inversen 

Mikroskops mit Fluoreszenzeinrichtung. EGFP-markierte Zellen wurden mit Hilfe von 

Glaskapillaren in 8 µl DEPC behandeltes Wasser (GeneRacer-Kit II) überführt und 

direkt in flüssigem Stickstoff eingefroren. Zur weiteren Zerstörung der 

Zellmembranen wurden die Zellen aufgetaut und nochmals bei –70°C eingefroren. 

Bis zur Verwendung der Zellen wurden sie bei –70°C gelagert. 

2.7.3 Synthese und Aufreinigung der cDNA 

Nach dem Auftauen wurden die Ansätze mit 0,5 µl DNase 20 Minuten bei 37°C 

inkubiert. Es folgte ein Hitzeinaktivierung der DNase bei 82°C für 11 Minuten. Der 

anschließenden cDNA Synthese mit Hilfe von SuperScript II-Kit folgte der Verdau der 

RNA durch die Inkubation der Reaktion mit 0,5 µl RNase H für 25 Minuten bei 37°C. 

Zur Verbesserung der folgenden PCR wurde die cDNA durch eine Aufreinigung mit 

dem QiaQick-Kit von den Produkten der vorhergehenden Reaktionen gereinigt. Am 

Schluss wurde die cDNA in ein Gesamtvolumen von 60 µl aufgenommen. 

2.7.4 Amplifikation von V1-Rezeptoren 

Die Amplifikation von V1Rs erfolgte mit degenerierten Primern, spezifisch für die . 

Subfamilien a, c, d und h. (Die Primer wurden von Dr. Patricia Widmayer, Institut für 

Physiologie der Universität Hohenheim zur Verfügung gestellt). In die Reaktionen 

wurden 12 bis 14 µl cDNA eingesetzt. Die Amplifikation erfolgte mit der MasterTaq 

von Eppendorf mit dem Temperaturprofil „Tail1-55“. 

28

2.8 Sequenzieren klonierter DNA (nach Sanger) 


Die nicht-radioaktiven Multi-Color-CE-DNA-Sequenzierungen wurde mit Hilfe des 

Dye-Terminator-Sequencing-Kits durchgeführt und mit einem automatischen 

Sequencer (ABI 310, Perkin Elmer) ausgelesen. Das cycle Sequencing erfolgete in 

einem Volumen von 10 µl. Die Reaktion beinhaltete 400 ng Plasmid-DNA, 0,32 pmol 

Primer, 2 µl 5 fach Sequenzierpuffer (PE Applied Biosystems) und 0,5 µl BigDye- 

Terminator Ready Reaktion Mix (PE Applied Biosystems). Der Ansatz wurde im 

Thermo-Cycler mit folgendem Profil inkubiert: 

x30 

Programm Abi Prism, 30 Cyclen 

Durch Zugabe von 5 µl 3 M Natriumacetat (pH 5,2), 5 µl 125 mM EDTA (pH8) und 

150 µl 100%igem Ethanol wurde die Reaktion 15 Minuten bei Raumtemperatur 

gefällt und bei 4°C und 3000 g in einer Tischzentrifuge für 30 Minuten zentrifugiert. 

Anschließend in 150 µl 70%igem Ethanol gewaschen und nochmals bei 4°C bei 1700 

g zentrifugiert. Das Pellet wurde nach entfernen des Überstandes im Speed-Vac 

Konzentrator getrocknet und in 25 µl Lichrosolv Wasser bei 65°C 2 Minuten gelöst. 5 

µl dieser Lösung wurden in weiteren 20 µl Lichrosolv Wasser verdünnt, in 0,5 µl 

Sequenzier-Gefäße (Sample Tubes, PE Applied Biosystems) überführt, mit Septen 

verschlossen (PE Applied Biosystems) und zur automatischen Sequenzierung 

gegeben. Die Auswertung der Sequenzdaten erfolgte durch manuelle Kontrolle der 

ausgelesenen Sequenz in Cromas. 

2.9 Sequenzanalysen 

Zeit [sec] Temperatur [°C] 

1: Denaturierung 30 96 

2: Cyclische Deaturierung 10 96 

3: Cyclisches Annealing 5 50 

4: Cyclische Elongation 4 60 


Zur Identifizierung der klonierten Fragmente wurden die ermittelten Sequenzen mit 

Hilfe des Programms BlastN mit den in der Datenbank der NCBI zugänglichen 

29


Nukleotidsequenzen verglichen. Die Ähnlichkeit von Sequenzen zeichnen sich durch 

einen hohen HSP (high-scording segment pair)-Wert zu den bekannten Sequenzen 

für olfaktorische Rezeptoren aus. Dieser HSP-Wert wird anhand des BLAST (basic 

local alignment search tool)-Algorithmus (Altschul et al., 1990) berechnet. 

2.10 Locianalysen und Erstellen von Genkarten 

Die Identifizierung von Genloci im Genom der Maus wurde mit dem Programm 

„Ensemble“ (www.ensembl.org/index.html) durchgeführt. Zur Erstellung von 

Genkarten wurden die entsprechenden Chromosomabschnitte aus „Ensemple“ 

exportiert und im Programm „Genamics Expression“ graphisch dargestellt. Weitere 

Bearbeitungen der Karten erfolge im „Adobe Illustrator“. 

2.11 Vergleichende Sequenzanalysen 

Vergleichende Sequenzanalysen von Odorantrezeptoren wurden mit dem Programm 

ClustalW (Thompson et al., 1994) durchgeführt. Das Programm errechnet die 

Ähnlichkeiten aller Sequenzpaarungen und erstellt daraus eine Dayhoff-PAM-Matrix 

(Dayhoff et al., 1978). Diese dient als Grundlage für das multiple Alignment. Die in 

dieser Arbeit verwendeten Alignments wurden mit Hilfe des Programms „Genebee“ 

erstellt. (www.genebee.msu.su/clustal/advanced.html). Dafür wurden folgende 

Einstellungen gewählt: 

30

Alignment slow 

K-Tube 1 

Window length 5 

Top diag 5 

Pairgap 3 

Score Type percent 

DNA weight matrix IUB 

gap open 10 

gap extention 0,05 

Treetype neighbour joining (nj) 


Die errechneten Alignements wurden rechtwinkelig dargestellt und gegebenenfalls in 

„Adobe Illustrator“ bearbeitet. 

2.12 Anfertigung von Gefrierschnitten 

2.12.1 Präparation 

Die Tiere wurden mit CO2 getötet, dekapitiert und das Kopffell abgezogen. Der 

Unterkiefer, die Augen mit dem sie umgebenden Os Jugale, die Backenzähne sowie 

die Schneidezähne, das häutige Gaumendach und die Os Nasale wurden entfernt. 

Der hintere Teil des Kopfes wurde bis zum Bulbus olfaktorius abgetrennt. Zur 

Präparation des VNOs wurden lediglich die Verbindungen der Pramaxillare zum 

Vomer getrennt und die Os Prämaxillare mit den Os Maxillare von Kopf entfernt. Zur 

Präparation der Turbinalen blieben hingegen die Knochen des vorderen Oberkiefers 

erhalten, während die Os Frontale, die Os Lacrimale sowie Teile der Os Maxillare 

entfernt wurden. 

31

2.12.2 Einbetten und Schneiden 


Präparate die für eine Immunhistochemiesche Untersuchung vorgesehen waren 

wurden vor dem Überführen in Einbettmedium zusätzlich 1-3h in 4% 

Paraformaldehyd bei 4°C fixiert und über Nacht in 25%iger Saccharose in PBS bei 

4°C entwässert. Das Einbetten der Präparate erfolge in Formen aus Aluminiumfolie 

auf einer mit flüssigem Stickstoff gekühlten Metallplatte. Der gefrorene Block mit dem 

Präparat wurde in das Gefriermikrotom eingespannt und orientiert. Präparate, die zur 

in situ Hybridisierung vorgesehen waren wurden in einer Dicke von 12µm angefertigt, 

auf silanisierte Objektträger übertragen und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert. 

Für eine Immunhistochemie verwendeten Präparate wurden zwischen 12 und 25 µm 

dick geschnitten, mit polylysin-beschichteten Objektträgern abgenommen und vor der 

Inkubation mit Antikörpern 2 h bei 37°C getrocknet. 

2.13 In situ-Hybridisierung 

Für die im folgenden Abschnitt aufgeführten Methoden waren RNase-freie 

Bedingungen notwendig um einen Abbau der eingesetzten antisense-RNA und der 

nachzuweisenden zellulären mRNA durch RNasen auszuschließen. Um weitgehend 

RNAse freie Bedingungen zu erreichen wurden alle Glasgeräte und Lösungen 50 

Minuten bei 121°C und 1,2 bar autoklaviert. 

2.13.1 PCR-Reaktion auf Transkriptionsplasmiden 

Um die Problematik einer nicht vollständigen Linearisierung der 

Transkriptionsplasmide zu umgehen wurde mit Hilfe der PCR-Technik (siehe 2.2) die 

gewünschte Insertionen mit den RNA-Polymerasen Erkennungssequenzen Sp6 und 

T7 von den Transkriptionsplasmiden (pGEM-T) amplifiziert. Die Amplifikation erfolgte 

mit MasterTaq mit dem Temperaturprofil Tail1 60. Die verwendeten Primer waren 

SP6out und T7out. Das Amplifikat wurde auf einem 1%igem Agarosegel auf seine 

korrekte Länge überprüft und anschließend mit Hilfe des QiaEx II-Kits aufgereinigt. 

Die Konzentration des Amplifikates wurde photometrisch bestimmt. 

32

2.13.2 Synthese von Digoxigenin/Biotin markierten RNA-Sonden 


Für die in vitro Synthese von nichtradioaktiv-markierten RNA-Sonden wurde der 

”DIG/Biotin RNA-Labeling Kit verwendet. Der Transkriptionsansatz bestand aus 250 

ng PCR-Amplifikat (2.13.1), 2 µl 10 fach konzentriertem Digoxigenin-NTP- 

Markierungsgemisch (je 10 mM ATP, CTP und GTP sowie 6,5 mM UTP und 3,5 mM 

DIG-UTP), 2 µl 10 ach konzentriertem Transkriptionspuffer, 2 µl DTT, 2 µl RNA- 

Polymerase und wurde auf ein Endvolumen von 20 µl mit Bidest eingestellt. Nach 

zweistündiger Inkubation bei 37°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 2,5 µl 5 M 

LiCl und 75 µl 100%igem Ethanol gestoppt und bei –20°C über Nacht gefällt. Nach 

anschließender Zentrifugation bei 14000 U/Min für 30 Minuten in der Tischzentrifuge 

wurde das Pellet mit 100 µl eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen und nochmals 

zentrifugiert. Nach dem Trocknen der pelletierten RNA bei Raumtemperatur wurde 

sie in 50 µl Bidest gelöst. Die Konzentration der RNA wurde ebenfalls photometrisch 

bestimmt. Die Sonden wurden in 500 µl Hybridisierungspuffer aufgenommen und bei 

–20°C bis zum Gebrauch gelagert. 

2.13.3 Vorbereitung Gefrierschnitte zur Hybridisierung 

Um für die in situ Hybridisierung die mRNA in den Zellen zu fixieren, wurden die 

Schnitte für 30 Minuten in einer 4%igen Paraformaldehyd-Lösung in 0,1 M NaHCO3 

eingetaucht und anschließend 1 Minute in PBS gewaschen. Während der weiteren 

Behandlung wurden die Schnitte 10 Minuten in einer 0,2 M HCl-Lösung die inkubiert, 

um die enthaltenen Proteine zu denaturieren und anschließend 2 Minuten mit 

1%igem Triton X-100 in PBS behandelt. Nach zweimaligem Waschen in PBS für 

jeweils 30 Sekunden wurden die Gefrierschnitte für 5 Minuten in 50% Formamid / 5 x 

SSC vorhybridisiert. 

2.13.4 Hybridisierung 

Die Stabilität von Nukleinsäure-Hybriden ist abhängig von der Länge der 

eingesetzten Probe, ihres G/C-Gehaltes, der Ionenkonzentration, der Konzentration 

an helixdestabilisierenden Agenzien (z.B. Formamid) und der Temperatur. Zur 

33


Berechnung der Schmelztemperatur von Nukleinsäure-Hybriden wurde die von 

Meinkoth und Wahl (1984) bestimmte Formel verwendet. 

Tm = 81,5°C + 16,6 log M + 0,41 (% G+C) – (500/n) - 0,61 (% Formamid) 

Tm = Schmelztemperatur der Hybride in C 

M = Molarität an NaCl 

G+C = Basenzusammensetzung der verwendeten RNA-Sonde 

n = Länge der eingesetzten RNA-Sonde 

Die Schmelztemperatur gibt an, bei welcher Temperatur 50% der Basenpaarungen 

zwischen Sonde und Zielsequenz gelöst sind. Aus der Formel wird ersichtlich, dass 

zum Einen durch Erhöhung des Formamid-Gehalts die Schmelztemperatur 

erniedrigt, zum Anderen auch durch hohe Hybridisierungs- bzw. Waschtemperaturen 

die Bedingungen stringenter werden. Bei den in dieser Arbeit durchgeführten in situ- 

Hybridisierungen wurden stets Bedingungen hoher Stringenz angewandt, d.h. 

hochstringente Hybridisierungsbedingungen (50% Formamid, bei 55°C) sowie 

hochstringente Waschbedingungen (0,1 fach SSC bei 60°C). Zur Denaturierung von 

Sekundärstrukturen wurden die RNA-Sonden in Hybridisierungspuffer für 10 Minuten 

bei 65°C erhitzt und danach sofort 5 Minuten auf Eis abgekühlt, um ein Renaturieren 

der RNA zu verhindern. Auf jeden Objektträger wurden etwa 3 ng DIG bzw. Biotin 

markierte RNA in 100 µl Hybridisierungspuffer gegeben und ein Deckglas blasenfrei 

aufgelegt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 55°C in einer mit 50% Formamid 

befeuchteten Kammer. 

2.13.5 Waschen nach der Hybridisierung 

Die Schnitte wurden unter leichtem Schütteln zweimal 30 Minuten mit 0,1 fach SSC 

bei 60°C gewaschen. 

34

2.13.6 Immunhistochemischer Nachweis der Sonden 


Die Visualisierung DIG bzw. Biotin markierter RNA-Hybride erfolgte indirekt durch 

einen ”enzyme-linked immunoassay” unter Verwendung des anti-DIG-AP Konjugats 

bzw. mit dem gegen Biotin gerichteten, mit Meerrettich Peroxidase markiertem, 

Streptavidin. Die Schnitte wurden zunächst in TRIS-Puffer äquilibriert und 

anschließend 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 1%iger Blockierungslösung in 

einer Feuchtkammer inkubiert. Dadurch wurden unspezifische Bindungsstellen für 

die Antikörper blockiert. Für einfache in situ Hybridisierungen mit Dig-markierten 

Sonden wurden 100 µl Antikörperlösung (1:750 in 1%iger Blockierungslösung) auf 

jeden Objektträger gegeben. Für doppel in situ Hybridisirungen mit Dig und Biotin- 

markierten Sonden wurden 100 µl des 1:500 verdünnten anti-DIG-AP Konjugates 

und des 1:100 ebenfalls in Blocklösung verdünnten Peroxidase-Streptavidin auf 

einen Objektträger gegeben. In beiden Fällen wurde anschließend ein Deckglas 

luftblasenfrei aufgelegt und die bei 37 C inkubiert (30 Minuten für einfache in situ 

Hybridisierungen, 60 Minuten für doppel in situ Hybridisierungen). Nach zweimaligem 

Waschen für 15 Minuten in TRIS-Puffer wurden die Schnitte gefärbt. 

2.13.7 Färbung von in situ-Hybridisierungen 

2.13.7.1 Nachweis der alkalischen Phosphatase mit NBT/BCIP 

Bei einfachen in situ Hybridisierungen mit DIG-markierten Sonden erfolgte die 

Färbung über den enzymatischen Umsatz von NBT und BCIP in der Färbelösung. 

Die Reaktion erfolgte bei 37°C und wurde nach ausreichender Färbung durch 

Waschen in Bidest gestoppt. Zur Aufbewahrung wurden die Schnitte getrocknet. 

35


2.13.7.2 Nachweis der alkalischen Phosphatase und der Peroxidase durch 

fluoreszierende Farbstoffe 

Zur Färbung von doppel in situ Hybridisierung wurde zuerst das HNPPD-Kit (Umsatz 

durch alkalische Phosphatasen) und dann das TSA-Kit (Umsatz durch Peroxidasen) 

verwendet. Die Tyramide das TSA-Kits wurden 1:50 im mitgeliefertem Puffer 

verdünnt. Vor der Färbung wurden die Schnitte mit 0,05% Tween in Tris gewaschen 

und permeabilisiert. Die Färbung erfolgte während der Inkubation von 100 µl 

komplettiertem HNPP-Kit pro Objektrträger 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 

dreimaligem Waschen in 0,05% Tween in Tris inkubierten die Schnitte 20 Minuten 

mit 100 µl TSA-Kit Färbelösung pro Objektträger bei Raumtemperatur. Nach 

weiterem Waschen in 0,05%igem Tween in Tris und in Wasser wurden die Schnitte 

in 75%igem Glycerin eingebettet. Zur Lagerung wurden die Schnitte bei –20°C 

eingefroren. 

2.14 Nachweis von molekularen Zell-Markern 

2.14.1 Immunhistochemischer Nachweis von EYFP, EGFP und β-Galaktosidase 

Die von den transgenen Tieren M55, Mol2.3 und RF1XRosa26EYFP exprimierten 

molekularen Marker wurden durch immunhistochemische Methoden detektiert. Zum 

Nachweis dienten die unter 1.9 aufgeführten primären und sekundären Antikörper. 

Die getrockneten Schnitte wurden mit 100 µl 1:1000 verdünnten primären Antikörper 

2 h bei Raumtemperatur inkubiert, 15 Minuten in PBS gewaschen und wieder 2 h mit 

100 µl 1:500 verdünntem sekundär Antikörper bei Raumtemperatur inkubiert. Die 

Verdünnung von primären und sekundären Antikörpern erfolgte in 0,3%igem Triton 

X-100 in PBS mit 5% Serum. Nach wiederholtem Waschen in PBS wurden die 

Schnitte in 75%igem Glycerin in PBS eingebettet. Zur Lagerung wurden die Schnitte 

bei –20°C eingefroren. 

36

2.14.2 Enzymatischer Nachweis der β-Galaktosidase 


Der Nachweis von enzymatischer Aktivität der als molekularer Marker in transgenen 

Mäusen verwendete β-Galaktosidase erfolge durch den Umsatz von X-Gal. Dafür 

wurden die Präparate 1 h auf Eis fixiert, 30 Minuten in Puffer A, 10 Minuten in Puffer 

B und bis zur gewünschten Färbung bei 37°C in Puffer C inkubiert. Zur Lagerung 

wurden die Präparate bei Raumtemperatur in Fixierlösung gelegt. 

2.15 Nachweis des Rezeptorproteins mOR256-17 

Präparierte VNOs wildtypischer Mäuse im Stadium P12 wurden 2 h in 4% PFA auf 

Eis fixiert und anschließend über Nacht in 25%iger Succrose bei 4°C entwässert. 

Nach dem Einfrieren in Einbettmedium wurden von den Präparaten 25 µm dicke 

Schnitte angefertigt und zur besseren Adhäsion an die Objektträger 3 h bei 

Raumtemperatur getrocknet. Die Inkubation des Primärantikörpers (Strotmann et al., 

2004) erfolgte in 0,3%igem Triton X-100 in PBS mit 10% NGS über Nacht bei 4°C. 

Nach dreimaligem waschen in PBS erfolgte die Inkubation mit dem 

Sekundärantikörper in 0,3%igem Triton X-100 in PBS mit 10% NGS zwei Stunden 

bei Raumtemperatur. Abschließend wurden die Schnitte erneut mit PBS gewaschen 

und mit 75%igem Glycerin eingedeckelt. 

2.16 Elektrische Ableitung von Elektroolfaktogrammen (EOG) 

2.16.1 Aufbau der Messapparatur 

Als Grundlage der Messstandes diente ein schwingungsgedämpfter optischer Tisch. 

Die Dämpfung erfolgte durch automatisch gesteuerte Pressluftzylinder, die mit ca. 2 

Bar betrieben wurden. Zur elektrische Abschirmung wurde ein selbstgebauter, nach 

vorne offener Drahtgitterkäfig verwendet. Der Boden des Käfigs bildete eine 

Aluminiumplatte. Das Präparat wurde mit Hilfe einer Krokodielklemme an einem 

Kreuztisch befestigt, der wiederum unter einem Stereomikroskop positioniert wurde. 

37


Das Signal der Messelektrode wurde 100 fach. Anschließend durchlief das Signal 

einen 20 Hz Tiefpassfilter und wurde direkt in den Analog/Digitalwandler 

eingeschleust. Ein Signal des Picospritzers wurde zur Bestimmung des Zeitpunks der 

Duftstoffzugabe ebenfalls in den Analog/Digitalwandler eingeschleust und im 

Computer aufgezeichnet. 

2.16.2 Präparation 

Die Mäuse wurden durch Genickbruch getötet um eine pH-Wert Änderung im Mucus 

des Nasenepithels durch eine CO2 Begasung zu vermeiden. Nach dem Abtrennen 

des Kopfes wurden die Schädel halbseitig aufpräpariert um die medial gelegenen 

Anteile der Turbinale offenzulegen. Dabei wurden ebenfalls beide Os Nasale sowie 

die contralateralen Os Lacrimale und Os Frontale um den Bulbus olfactorius entfernt. 

Auf diesen wurde zur besseren elektrischen Leitung der Referenzelektrode ein 

Tropfen 1%iger Agarose in Ringer aufgetragen. Während der gesamten Messung 

wurde das Epithel mit einem Strom wasserdampfgesättigter Luft (2L/min) überströmt. 

Die feuchte Luft wurde in zwei in Reihe geschalteten Waschflaschen generiert. 

2.16.3 Messung 

Die Messung erfolge mit einer chlorierten Silberelektrode die in eine mit 1%igem „low 

melting Agarose“ gefüllte Glaskapillare eingeführt wurde. Als Referenz diente eine 

chlorierte Silberelektrode in einer mit Ringer gefüllten Glaskapillare, die in einem 

Agarosetropfen auf dem contralateralen Bulb eingestochen wurde. Die Widerstände 

der Glaskapillaren betrugen zwischen 2 und 5 MOhm. Nach Berühren des Epithels 

mit der Glaskapillare der Messelektrode wurde das Epithel zur Regeneration 5 

Minuten nur mit feuchter Luft überströmt. Die Zugabe des Duftstoffes erfolge 100 

msec lang direkt in den permanenten Strom wasserdampfgesättigter Luft mit 4 

ml/min. Dazu wurde 1 µl des Duftstoffes auf ca. 1 cm 2 Filterpapier in einer 

Pasteurpipette aufgetragen. Die Steuerung der Duftstoffzugabe erfolge mit einem 

Picospritzer II. 

Zur Bestimmung der Reaktion des haupolfaktorischen Epithels innerhalb und 

außerhalb des Patches auf die ausgewählten Duftstoffe wurde folgendes 

Messprotokoll verwendet: 

38

Messreihe: 

1: 3x Benzaldehyd 

2: 3x zu bestimmender Duftstoff oder Duftstoffgemisch 


4: 3x Citral 


6: 3x 1-Heptanal 

7: 3x Kontolle 



Das Messprotokoll wurde in jeder Maus im „Cluster“ und in der Vergleichsposition 

gemessen. Jeder Duftstoff wurde dreimal im Abstand von je einer Minute appliziert. 

Zwischen der Zugabe von zwei verschieden Duftstoffen wurde die Zuleitung vom 

Picospritzer 10 sec mit reiner Pressluft durchblasen. Vor der ersten Zugabe eines 

Duftstoffes wurde der Duftstoff dreimal direkt in die Abluft injiziert, um die 

gleichmäßige Verteilung des Duftstoffes in der Pasteurpipette sicherzustellen. 

2.16.4 Auswahl der Kontroll-Duftstoffe 

Gesucht wurden Duftstoffe oder Duftstoffgemische, die im Bereich der Expression 

der OR37 Subfamilie, dem „Cluster“ (Strotmann et al,1999) eine größere Reaktion 

hervorrufen als außerhalb dieser Region. Um die in verschiedenen Mäusen 

gemessenen Reaktionen vergleichen zu können, wurden alle Reaktionen auf die 

Reaktion auf Benzaldehyd normiert. Benzaldehyd ist als ein Ligand des in der 

dorsalen Zone exprimierten Rezeptors M71 bekannt (Bozza et al, 2002). Im Verlauf 

der Messungen wurde angenommen, dass beide Messpunkte im Epithel („Cluster“ 

und Vergleichspunkt) von der dorsalen Zone gleichweit entfernt waren. Als zweiter 

Kontrollduftstoff diente 1-Heptanal. 1-Heptanal ist als ein Ligand des lateral 

exprimierten Rezeptors mI7 bekannt (Krautwurst et al., 1999) Auch hier wurde im 

Verlauf der Messungen angenommen, dass der Expressionsbereich von mI7 von 

beiden Messpunkten gleich weit entfernt ist. Von beiden Duftstoffen ist jedoch 

bekannt, dass sie als Stoffwechselendprodukt auch im Urin von Mäusen vorkommen 

(Röck et al., 2006). Daher wurde als dritter Referenzduft Citral gewählt, für den kein 

39


Rezeptor bekannt war, aber von dem ausgegangen wurde, dass er nicht als 

Stoffwechselprodukt von Mäusen exkretiert oder sekretiert wird. 

Eine Grundannahme der durchgeführten Messungen war, dass die Reaktionen für 

Benzaldehyd, 1-Heptanal und Citral im Patch und in der Vergleichsregion gleich groß 

sind. 

2.15.6 Auswertung 

Bei der Auswertung der gemessenen Ableitungen wurden nur die maximalen 

Gewebe-Depolarisationen berücksichtigt. Diese wurden typischerweise als 

Negativausschlag gemessen, der Wert aber als Betrag angegeben. Von jeder 

Dreifachbestimmung der Reaktion für die Duftstoffe wurde der Mittelwert und die 

Standardabweichung errechnet. Diese Standardabweichung wurde nicht beim 

Vergleich verschiedener Epithelien verwendet. Sie wurde bei der nachfolgenden 

Normierung prozentual angepasst. Der erste Wert für Benzaldehyd jeder Messreihe 

diente der Normierung aller nachfolgender Reaktionen der selben Messreihe. Dieser 

ersten Reaktion für Benzaldehyd wurde dabei der Wert 1 zugewiesen. Die 

Normierung auf Benzaldehyd ermöglichte es Messungen in mehreren Epithelien mit 

verschiedenen Duftstoffen zu vergleichen. Bei Vergleichen mehrerer Epithelien 

wurde aus allen Werten (Bestimmung durch Mittelung von Dreichfachmessungen) 

der Mittelwert und die Standardabweichung bestimmt.Zur Berechnung statistischer 

Signifikanzen wurde der paired bzw. unpaired T-Test angewendet. Der Unterschied 

zweier zu vergleichender Werte galt als signifikant für P < 0,05. Die Berechnung 

erfolgte im Programm Prism. 

40

III Ergebnisse 

3.1 Expression von Odorantrezeptorgenen im Vomeronasalorgan 

Ergebnisse 

Zur Beantwortung der Frage nach dem Repertoire an olfaktorischen Rezeptorgenen, 

das im VNO exprimiert wird, wurden RT-PCR-Experimente mit Hilfe von 

degenerierten Primern und cDNA aus dem VNO durchgeführt. Die Analyse mittels 

„nested PCR“ resultierte in allen untersuchten Individuen (n=8) in einem 

Amplifikationsprodukt in der erwarteten Größe von 527 bp, wie es beispielhaft in 

Abbildung 1 gezeigt wird. 

Abbildung 1: Amplifikation von Klasse II Rezeptoren 

Amplifikation von Klasse-II Odorantrezeptoren aus VNO cDNA mit Hilfe von RT-PCR mit 

degenerierten Primern gegen die Transmembranregionen 3 und 7. (A) Die erstrunden PCR mit den 

Oligonukleotidprimern 3.1//7.1 resultierte in keinem PCR-Produkt. (B) Die Nested PCR mit den 

Oligonukleotidprimern 3.1/P28 resultierte in der Amplifikation eines PCR-Produkts der erwarteten 

Größe von 527 bp. (C) PCR zur Überprüfung der cDNA gegen genomische Kontaminationen mit 

den intronüberspannenden Primern L8for und L8rev. Die Amplifikation der cDNA zeigt ein cDNA- 

spezifisches Fragment der erwarteten Größe von 402 bp ohne Anzeichen einer Kontamination 

durch DNA. M, 100bp-Marker; VNO, Ansatz mit cDNA aus VNO; K -, Wasserkontrolle ohne cDNA, K + 

Kontrolle mit genomischer DNA. 

41

Ergebnisse 

Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass mRNA für olfaktorische Rezeptoren im VNO 

in geringer Menge vorhanden ist. Um zu zeigen, dass die Amplifikationen nicht aus 

einer Kontamination mit genomischer DNA resultierten, wurden PCRs mit Primern 

gegen das Gen für das ribosomale Protein L8 durchgeführt. In allen Proben wurde 

ausschließlich ein Amplifikationsprodukt von 402 bp erhalten, während ein Produkt 

von 632 bp, wie es für eine Amplifikation des Gens von genomischer DNA zu 

erwarten gewesen wäre, nicht zu beobachten war (Abbildung 1). Dieses Ergebnis 

zeigt, dass die cDNA aller Proben frei von genomischer DNA waren, d.h. dass die 

Amplifikationsprodukte für olfaktorische Rezeptorgene spezifisch aus RNA- 

Präparationen resultierten. 

3.2 Identifikation von Klasse-II Odorantrezeptoren 

Die Klonierung und Sequenzierung der Amplifikationsprodukte aus den cDNA 

Proben der VNOs aller Individuen ergab, dass in diesen Banden tatsächlich 

Sequenzen für olfaktorische Rezeptorgene enthalten waren (Tabelle1). 

Insgesamt umfasste das klonierte Repertoire 30 Gene. Interessanterweise wurde 

mehr als ein Drittel von diesen Genen (36%) in mehreren Individuen identifiziert. Vier 

Rezeptoren konnten aus mehr als zwei Tieren erfasst werden und ein Rezeptor 

(mOR135-12) wurde in sechs von acht Tieren nachgewiesen. 

42

Tabelle 1: Identifizierte Odorantrezeptoren der Klasse-II 

Identifizierte Klasse-II Rezeptoren in den Mäusen 1 bis 8. n, Anzahl analysierter OR-Klone; P, 

Pseudogen (OR-Nomenklatur nach Zhang und Firestein, 2002) 

mOR 

Maus 1 

n = 24 

Maus 2 

n = 14 

Maus 3 

n = 13 

Maus 4 

n = 10 

103-1 X 

103-4 X 

111-5 X 

Maus 5 

n = 25 

114-3 X 

129-3 X X 

135-1 X X 

Maus 6 

n =15 

135-12 X X X X X X 

135-20P X 

135-27 X 

Maus 7 

136-12 X 

139-1 X 

139-3 X 

139-5 X 

n = 5 

Ergebnisse 

Maus 8 

139-5P X X 

139-6 X 

140-1 X X 

171-19 X X X 

171-41P X 

171-42 X 

171-43P X X 

171-6 X X 

175-3 X 

177-7 X 

179-5P X X 

202-7 X 

218-8 X 

219-1 X 

261-6 X 

263-5 X X X 

281-1 X X X 

n = 4 

43

Ergebnisse 

Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass ein relativ kleines Repertoire von 

exprimierten Odorantrezeptoren im VNO exprimiert wird und dieses in allen 

Individuen zur Ausprägung kommt. Kontrollexperimente mit cDNA aus dem 

hauptolfaktorischen Epithel unter den gleichen Bedingungen ergaben eine große 

Zahl und Diversitäten an Rezeptoren (Daten nicht gezeigt, Kaluza, 2004), so dass 

Präferenzen der Primer für die amplifizierten Sequenzen der cDNA aus dem VNO 

ausgeschlossen werden können. In situ Hybridisierungstudien mit spezifischen 

Sonden der aus den RT-PCR Analysen stammenden Gene ergaben, dass 

exprimierende Zellen in der Regel in allen untersuchten Individuen detektiert werden 

konnten. Insgesamt bestätigen diese Ergebnisse die These, dass ein kleines 

Repertoire von Odorantrezeptoren im VNO der Maus exprimiert wird. Ein 

gemeinsames Merkmal dieser bisher klonierten Rezeptoren ist die Zugehörigkeit zur 

Klasse-II der Odorantrezeptorgene. 

44

3.3 Nachweis von Klasse-I Odorantrezeptoren in cDNA des VNO 

Ergebnisse 

Zur Überprüfung, ob auch Mitglieder der Klasse-I Rezeptoren, dem phylogenetisch 

älteren Zweig der Odorantrezeptorfamilie, im VNO exprimiert werden, wurde die 

cDNA von 5 Individuen mit Primern für diese Klasse-I Rezeptoren analysiert. Erneut 

führte eine „einfache PCR“ nicht zu einem spezifischen Amplifikat (Abbildung 2A); 

nach Ablauf weiterer 40 Zyklen mit dem selben Primerpaar konnte jedoch ein PCR- 

Produkt in der erwarteten Größe von 512 bp nachgewiesen werden. 

Abbildung 2: Amplifikation von Klasse I Rezeptoren. 

Amplifikation von Klasse-I Odorantrezeptoren aus cDNA des VNO nach 80 Zyklen. (A) Erstrunden 

PCR (1. bis 40. Zyklus) mit den Oligonukleotiden ClassR_1 und P26 (B): Zweitrunden PCR (41. 

bis 80. Zyklus) mit den Oligonukleotiden ClassR_I und P26. M, 100bp Marker; VNO, Ansatz mit 

cDNA aus gesamt VNO; K - , Wasserkontrolle ohne cDNA. 

Die Klonierung und Sequenzierung der Amplifikate führte zur Identifizierung von vier 

Klasse-I Rezeptoren sowie einem Klasse-II Rezeptor (mOR218-8) (Tabelle 2). Der 

Rezeptor mOR33-1 konnte in allen Ansätzen identifiziert werden. 

45

Tabelle 2: Identifizierte Odorantrezeptoren der Klasse-I 

Ergebnisse 

Identifizierte Rezeptoren der Klasse-I in den Mäusen 1 bis 5. n, Anzahl analysierter OR-Klone 

(OR-Nomenklatur nach Zhang und Firestein, 2002) 

mOR 

Maus 1 

n = 6 

Das Ergebnis zeigt, dass sowohl Klasse-II als auch Klasse-I Odorantrezeptoren im 

VNO exprimiert werden. Aus dem ca. 120 Gene umfassenden Pool von Klasse-I 

Rezeptoren wurden nur wenige Vertreter im VNO nachgewiesen. 

3.4 Expression von ORs im sensorischen Epithel des VNO 

Zur Klärung der Frage, in welchem Gewebe des VNO die klonierten 

Odorantrezeptoren exprimiert werden, wurden in situ Hybridisierungen mit antisense 

RNA Sonden durchgeführt. 

Maus 2 

n = 7 

Maus 3 

n = 5 

14-4 X 

17-7P X 

Maus 4 

n = 6 

Maus 5 

33-1 X X X X X 

31-8 X 

218-8 X 

n = 6 

Abbildung 3: Expression von Odorantrezeptoren im sensorischen Epithel des VNO 

Coronarschnitte des VNO nach in situ Hybridisierung mit RNA-Sonden gegen mOR281-1 (A), 

mOR135-12 (B) und mOR263-5 (C). Die OR exprimierenden Zellen liegen im sensorischen 

Epithel des VNO. Maßstab 100 µm. 

46

Ergebnisse 

Auf coronaren Schnitten durch das VNO resultierten die Hybridisierungen in Signalen 

ausschließlich im sensorischen Epithel des Organs (Abbildung 3). Für 22 der 

insgesamt 24 analysierten Gene konnten reaktive Zellen im sensorischen Epithel 

visualisiert werden. 

Quantifizierungen von OR exprimierenden Zellen für unterschiedliche Rezeptoren 

zeigten, dass die Rezeptoren in unterschiedlich vielen Zellen des VNO exprimiert 

werden. Viele Rezeptoren kommen in nur 1 bis 10 Zellen, weitere in 20 bis 70 und 

wenige Rezeptoren in über 100 Zellen vor (Tabelle 4). Um zu untersuchen, ob es im 

VNO wie im Septalorgan (SO) einen „dominierenden“ Rezeptortyp gibt der in der 

Mehrheit der Zellen vorkommt (Kaluza et al., 2004; Tian & Ma, 2004), wurde ein 

weiteres RT-PCR Experiment mit nur wenigen Zellen anstatt mit dem gesamten 

Organ durchgeführt. Dazu wurde eine OMP-GFP transgene Mauslinie verwendet, bei 

der reife olfaktorische Sinnesneurone durch GFP markiert waren (Potter et al., 2001). 

In einer cDNA Probe, die aus einer kleinen Gruppe von ca. 8 Zellen generiert wurde, 

konnte in der Tat eine Bande der erwarteten Größe amplifiziert werden. 

Abbildung 4: Oligo-Zell RT-PCR 

RT-PCR zur Amplifikation von Odorantrezeptoren der Klasse-II aus fünf bis acht 

OMP + Zellen des VNO. (A) Amplifikation von Odorantrezeptoren der Klasse-I mit 

den Oligonucleotiden 3.1 und P28 (B) RT-PCR mit Primern gegen das ribosomale 

Protein L8 zur Kontrolle gegen eine Kontaminationen mit DNA. M, 100bp Marker; 

K - , Wasserkontrolle ohne cDNA; K + , Positivkontrolle mit genomischer DNA. 

47

Ergebnisse 

Eine PCR zur Kontrolle gegen genomische Kontamination zeigte erneut, dass die 

Probe keine solche Kontamination enthielt. Die Klonierung und Sequenzierung 

resultierte in insgesamt 12 Odorantrezeptorgenen. 

Tabelle 3: Odorantrezeptoren aus oligo-Zell RT-PCR 

Nomenklatur der Rezeptoren nach Zhang und Firestein (2002). Die 

Bestimmung des Genlocus mit wurde mit Hilfe des „Ensemble Genome 

Browser“ durchgeführt (www.enseble.org). Die Anzahl der Zellen wurde durch 

in situ Hybridisierung bestimmt (n=1). 

mOR Locus Anzahl der Zellen im VNO 

135-11 11B4 n.d. 

135-12 11B4 n.d. 

139-5P 10C1 7 

161-6 9A5 20 

173-3 2E1 2 

187-1 2E1 n.d. 

188-3 2E1 n.d. 

206-4 2E1 6 

215-2 19B n.d. 

215-4P 19B 2 

239-5 19B n.d. 

284-1P 11B2 n.d. 

Diese Gene repräsentieren erneut Klasse-II Rezeptoren; darunter die Rezeptoren 

mOR135-12 und mOR139-5P, die bereits durch RT Analysen identifiziert wurden 

(Tabelle 1). In situ Hybridisierungsexperimente auf Schnittserien durch das VNO 

zeigten, dass diese Rezeptoren ebenfalls in nur wenigen (zwei bis 20) Zellen des 

VNO exprimiert wurden. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass es im VNO, im 

Gegensatz zum SO, keinen dominierenden Rezeptor gibt. Das Finden von 10 

weiteren Rezeptoren zeigt, dass das bisher identifizierte Repertoire nicht das 

vollständige Set exprimierter ORs angibt. Die Amplifikation von bereits bekannten 

Rezeptoren in einem weiteren unabhängigen Versuch gibt aber wiederum einen 

Hinweis darauf, dass das Repertoire begrenzt ist. 

48

3.5 Expression der im VNO identifizierten Rezeptoren im 

hauptolfaktorischen Epithel 

Ergebnisse 

Der Nachweis der Expression definierter Gene für Odorant-Rezeptoren im VNO 

eröffnete die Frage, ob diese ausschließlich im VNO vorkommen, oder ob es sich um 

Gene handelt, die auch im hauptolfaktorischen Epithel exprimiert werden. 

Abbildung 5: Expression von Odorantrezeptoren im olfaktorischen Epithel 

Im VNO identifizierte Odorantrezeptoren werden im olfaktorischen Epithel 

exprimiert. (A) Expression von mOR103-4 im lateralen Epithelbereich. Maßstab 

500µm. Vergrößerte Darstellung des Umrahmten Bereichs in A’. Maßstab 200 

µm. (B) Expression von mOR281-1 im medialen Bereichen des olfaktorischen 

Epithels (Maßstab 500 µm). Vergrößerte Darstellung des umrahmten Bereichs in 

B’. Maßstab 200 µm. 

49

Ergebnisse 

In situ Hybridisierungsexperimente mit den entsprechenden Sonden gegen 

Rezeptoren resultierten in allen Fällen auch in Markierungen von olfaktorischen 

Sinneszellen (Abbildung 5). Auf Querschnitten durch die nasale Höhle war zu 

erkennen, dass die rezeptorexprimierenden Zellen die für das OE typische Zonalität 

aufwiesen. Von den im VNO exprimierten Rezeptoren konnten sieben der dorsalen 

Zone zugewiesen werden, darunter die Klasse-I Rezeptoren und zwei Klasse-II 

Rezeptoren. Die anderen Gene wurden in Zellpopulationen mit daran angrenzenden 

medialen und lateralen Verteilungsmustern exprimiert. 

3.6 Spezifische Auswahl der ORs aus der gesamten Gendiversität 

Im Hinblick auf die Frage, wie das Repertoire der im VNO exprimierten OR Gene 

organisiert ist, wurden die Gene zunächst einer detaillierten phylogenetischen 

Analyse unterzogen. Es zeigte sich, dass 34 identifizierte Gene der Klasse-I und 

Klasse-II Rezeptoren Vertreter aus 22 Rezeptorfamilien repräsentieren (Tabelle 4). 

Eine Untersuchung der Verteilung über die Diversität der Superfamilie zeigte, dass 

die im VNO vertretenen Familien sich in fünf Gruppen aus zwei bis fünf Familien und 

zwei einzelne Familien einteilen lassen (Abbildung 6). 

50

Abbildung 6: Odorantrezeptor-Familien im Genom der Maus 

Ergebnisse 

Auflistung aller Odorantrezeptor-Familien der Maus (1 bis 42 Klasse-I ORs, 101 bis 286 

Klasse-II ORs). Die den Familien zugeordneten Balken geben die Anzahl der funktionellen 

Gene (blau) und Pseudogene (rot) an. Die im VNO identifizierten Familien sind sieben 

Gruppen und zwei einzelnen Familien zugeordnet, die über das gesamte Spektrum der 

Rezeptor-Familien verteilen. Verändert nach Zhang und Firestein (2002). 

51

Ergebnisse 

Die Familien stammten aus den verschiedensten Claden des Stammbaums der 

Rezeptorgene (Zhang & Firestein, 2002); sie repräsentieren also ein diverses 

Spektrum an Sequenzen. Mit wenigen Ausnahmen wurden aus den Familien jeweils 

nur ein oder zwei Vertreter identifiziert. Ausnahmen bildeten die Familien 135, 139 

und 171 mit jeweils fünf exprimierten Genen. 

Rezeptorfamilie 171 besitzt 47 Mitglieder, Familie 139 dagegen nur sieben; es 

existiert also kein Zusammenhang zwischen der Größe einer Familie und der Anzahl 

der daraus im VNO exprimierten Mitglieder. Auch bei den mit mehreren Genen 

vertretenen Familien wurden jedoch nicht alle, sondern nur bestimmte Mitglieder zur 

Expression ausgewählt. 

Tabelle 4: Eigenschaften der im VNO exprimierten Rezeptorgene 

mOR 

Anzahl der 

Mitglieder 

Expressions 

Zone 

genomischer 

Position 

14-4 10 7F1 

14-7P 10 7F1 

Anzahl der 

Zellen 

Anzahl der 

untersuchten 

Organe 

18-2 3 Dorsal 7F1 89 ± 28 11 

31-8 15 7F1 

33-1 3 Medial 7F1 17 1 

103-4 16 Lateral 7F2 29 1 

111-5 13 Medial 10D3 4 1 

114-3 12 10D3 0 

129-3 4 Dorsal 11B1.3 21 1 

135-1 28 Medial 11B4 60 1 

135-11 11B4 

135-12 Medial 11B4 69 1 

135-20P Medial 11B4 40 1 

135-27P 11B4 

136-12 18 2B 

139-1 7 Medial 10C1 87 ± 4 3 

139-3 10C1 

139-5 10C1 

139-5P Lateral 10C1 7 1 

52

139-6 10C1 

140-1 1 16B1 

161-6 6 Medial 9A5 20 1 

171-6 47 Medial 9A5 5 1 

171-19 Medial 9A5 3 1 

171-42 9A5 

171-41P 9A5 

171-43P Medial 9A5 3 1 

173-3 3 Medial 2E1 2 1 

175-3 9 2E1 0 1 

177-7 12 Medial 2E1 1 1 

179-5P 7 Medial 2E1 6 1 

187-1 5 2E1 

188-3 5 2E1 1 

202-7 36 19B 

206-4 6 2E1 6 1 

215-2 19B 1 

215-4P 4 Medial 19B 2 1 

218-8 11 Dorsal 17B3 

219-1 5 7E1 

239-5 8 19B 

261-6 13 Medial 6B2 130 ± 64 6 

263-5 (P2) 11 Medial 7F2 17 1 

281-1 2 Medial 11B2 71 ± 42 3 

284-1P 2 11B2 

Ergebnisse 

Eine detaillierte Analyse der phylogenetischen Beziehungen dieser 

Familienmitglieder zeigte, dass diese eine enge Beziehung zueinander aufweisen, 

während Gene mit geringerem Verwandtschaftsgrad nicht zur Expression kamen. 

53

Abbildung 7. Stammbäume der Familien 171 und 135 

Ergebnisse 

Position der im VNO exprimierten Mitglieder der Familien 171 (A) und 135 (B) innerhalb der 

phylogenetischen Stammbäume. Die im VNO exprimierten Mitglieder (Pfeilspitze) gruppieren 

sich in den phylogenetischen Stammbäumen in Untergruppen. Rezeptoren außerhalb dieser 

Untergruppen werden nicht im VNO exprimiert (Asterisk). 

Insgesamt ergaben sich aus diesen Daten Evidenzen dafür, dass die Auswahl der im 

VNO exprimierten Gene dieser Familien nicht einem stochastischen Prinzip 

unterliegt. 

3.7 Kondensation der im VNO exprimierten ORs im Genom 

Um Einblicke in die zugrundeliegenden Mechanismen der Expressionskontrolle von 

OR Genen im VNO zu erhalten, wurde ihre genomische Organisation analysiert. Es 

zeigte sich, dass die Gene über neun Chromosomen verteilt vorlagen (Tabelle 4). 

Eine Konzentrierung der im VNO exprimierten Rezeptoren in einem Bereich des 

Cromatins war nicht erkennbar. 

Eine detaillierte Analyse der genomischen Organisation der Familien 135, 139 und 

171 (Abbildung 8) ergab, dass diese jeweils an einem Genort gruppiert waren. 

Innerhalb dieser Cluster waren jeweils auch OR-Gene anderer Familien positioniert. 

Für die im VNO exprimierten Gene konnte eine Tendenz zur genomischen 

Nachbarschaft beobachtet werden, die sich auch in ihrer phylogenetischen 

Verwandtschaft widerspiegelt. 

54

Abbildung 8: Verteilung der ORs innerhalb der Gencluster 

Ergebnisse 

Im VNO exprimierte Mitglieder der Familien mOR135, mOR139 und mOR171 befinden sich auf 

den jeweilige Genomabschnitten 11B4 16C1 und 9A5. (A) Im VNO exprimierte Mitglieder der 

Familie 135 liegen als Gruppe im Gencluster. (B) Familie 139 stellt alle Gene (außer mOR142-1 ) 

des OR-Gencluster auf dem Chromosomabschnitt 16C1. (C) Die im VNO exprimierten Mitglieder 

der Subfamilie 171 liegen ebenfalls eng gruppiert auf Abschnitt 9A5. mOR161-6 liegt ebenfalls im 

selben Chromosomenabschnitt. Nomenklatur der Rezeptoregene nach Zhang und Firestein 

(2002). 

In zwei Genloci (2E1 Abbildung 9A und 19B, Abbildung 9) wurden vermehrt OR 

Gene, die im VNO exprimiert werden, lokalisiert. Insgesamt 11 der im VNO 

vorkommenden Odorantrezeptoren aus 10 unterschiedlichen Familien waren allein in 

diesen beiden Clustern gruppiert. Eine direkte Nachbarschaftsbeziehung der Gene 

war in diesen Fällen allerdings nicht zu beobachten. 

Abbildung 9: Zusammenstellung der ORs in Gencluster 

Zusammenfassung der im VNO exprimierten ORs unterschiedlicher Familien in den Genclustern 2E1 

(A) und 19B (B). 11 der im VNO exprimierten Gene sind unabhängig ihrer Familienzugehörigkeit in 2 

Genclustern positioniert. Nomenklatur der ORs nach Zhang und Firestein (2002). 

55

Ergebnisse 

3.8 Keine zonierte Expression individueller Odorantrezeptoren im VNO 

Der Befund, dass OR exprimierende Sinneszellen im OE generell charakteristische 

Verteilungsmuster aufweisen (Miyamichi et al., 2005) wirft die Frage auf, ob dies 

auch für die OR exprimierenden Zellen im VNO zutrifft. Auf Schnittserien durch das 

VNO wurde deshalb die Verteilung von OR exprimierenden Zellen untersucht. 

Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 10 gezeigt. 

Abbildung 10: Räumliche Verteilung OR exprimierender Zellen im VNO 

Anzahl der markierten Zellen auf Coronarschnitten durch das VNO nach in situ Hybridisierung mit 

RNA-Sonden gegen mOR261-6 (A, B), mOR18-2 (C) und mOR33-1 (D) in 2-3 Wochen alten 

Mäusen. OR + Zellen sind gleichmäßig über das sensorische Epithel verteilt. 

Alle analysierten Gene wurden in Zellpopulationen exprimiert, die entlang der 

gesamten rostro-caudalen Ausdehnung des sensorischen Epithels verteilt vorlagen. 

In einzelnen Individuen konnte eine leicht erhöhte Anzahl an Zellen in distinkten 

Bereichen beobachtet werden, wobei diese Abschnitte allerdings in ihrer Position 

zwischen verschiedenen Individuen variierten (Abbildung 12 A, B); Verteilungsmuster 

wie sie typisch für das OE sind konnten im VNO jedoch nicht detektiert werden. 

56

3.9 Geschlechtsdimorphismen in der OR Expression im VNO 

Ergebnisse 

Dem VNO kommt bei der innerartlichen Kommunikation eine zentrale Rolle zu. Von 

klassischen Pheromonen ist bekannt, dass sie im VNO detektiert werden. Eine 

Möglichkeit, eine geschlechtsspezifische Wahrnehmung zu regulieren ist die 

unterschiedliche Expression von Rezeptoren. Daher wurde als nächstes die 

Expression von ORs in Organen männlicher und weiblicher Tiere analysiert. Für 

einige repräsentative Vertreter wurden dazu Schnittserien durch das VNO mit 

antisense Sonden hybridisiert und die markierten Zellen quantifiziert. Für die meisten 

Rezeptoren, wie z.B. mOR281-1 und mOR139-1 konnte kein Unterschied in der Zahl 

reaktiver Zellen beobachtet werden. Für den Rezeptor mOR261-6 konnte jedoch in 

weiblichen Mäusen eine deutlich höhere Anzahl positiver Zellen als in männlichen 

Mäusen bestimmt werden (n=3). 

Abbildung 11: Geschlechtsspezifische Expression von mOR261-6 im VNO 

(A) Vergleich der Expression von mOR281-1 (n=1), mOR261-6 (n=3) und mOR139-1 (n=1) in 

männlichen (grauen Balken) und weiblichen (schwarze Balken) Mäusen (Stadium P13-P23). (B) 

Expression von mOR261-6 in männlichen (graue Balken) und weiblichen (schwarze Balken) 

Mäusen während der Entwicklung (n=3). 

Weibliche Tiere besaßen mehr als doppelt so viele mOR261-6 exprimierende Zellen 

im VNO als männliche. Die Untersuchung der Expression von mOR261-6 an 

unterschiedlichen Altersstufen zeigte, dass dieser Unterschied bereits wenige Tage 

nach der Geburt sichtbar und in 2-3 Wochen alten Tieren besonders ausgeprägt war. 

Die Analyse verschiedener Altersstufen ergab weiterhin, dass zum Zeitpunkt der 

Geburt und in adulten Tieren die Zahl rezeptorexprimierender Zellen in beiden 

Geschlechtern deutlich geringer war; dieses Phänomen konnte bereits in einer 

früheren Studie für einige andere Rezeptoren beobachtet werden (Lévai, 2004). 

57

3.10 Translation von OR-mRNA im VNO 

Ergebnisse 

Der Befund, dass Zellen des VNOs Odorantrezeptoren exprimieren deutet darauf hin, 

dass diese Rezeptoren auch im VNO eine Funktion besitzen. Unterstützt würde diese 

These durch den Nachweis entsprechender Rezeptorproteine in den Zellen des 

VNO. Dazu stand nur ein Antikörper gegen den Rezeptor mOR256-17 zur Verfügung 

(Strotmann et al., 2004). Da die Expression des Rezeptors im VNO jedoch nicht 

nachgewiesen war, wurde zuerst die Expression des Genes durch RT-PCR 

untersucht. Bei diesem Ansatz konnte in der Tat die Amplifikation eines spezifischen 

PCR Produktes gezeigt werden (Daten nicht gezeigt). Daher wurde versucht mit Hilfe 

des Antikörpers das Rezeptorprotein nachzuweisen, das auf die Translation der 

Odorantrezeptoren im VNO hinweisen würde. 

Abbildung 12: Nachweis des Odorantrezeptorprotein mOR256-17 

Coronarschnitte durch das VNO nach immunhistochemischer Färbung gegen das 

Rezeptorproteim mOR256-17. Die Markierung schließt neben Zellkörpern ebenfalls Dendriten 

(Pfeil) und Axone (Pfeilkopf) mit ein. (A) Maßstab 10 µm (B) Maßstab 30 µm. 

Der immunohistochemische Nachweis des Rezeptorproteins mOR256-17 auf 

Coronarschnitten durch das VNO resultierte in der Färbung einzelner Zellen im 

sensorischen Epithel (Abbildung 12). Mit Hilfe des Antikörpers konnte das 

Rezeptorprotein sowohl im Zellkörper als auch im Dendriten (Pfeil) und im Axon 

(Pfeilkopf) nachgewiesen werden. Damit wurde gezeigt, dass olfaktorische 

Rezeptorproteine in Neuronen des VNO generiert werden und die Zellen somit in der 

Tat Duftstoffdetektoren besitzen. 

58

3.11 Expression des Rezeptor-Transport-Proteins 1 (RTP1) 

Ergebnisse 

Der Nachweis des Rezeptorproteins in VNO-Neuronen wirft die Frage auf, ob diese 

Zellen eine Maschinerie zum Transport des Proteins in die Zellmembran in Form des 

Rezeptor Transport Proteins 1 (RTP1) aufweisen. 

Abbildung 13: Expression von RTP1 

Expression des Receptor Transport Protein 1(RTP1) im olfaktorischen Epithel 

und im VNO. (A, B) Coronarschnitt durch das HOE nach in situ Hybridisierung 

mit einer antisense RNA-Sonde (A) und einer sense RNA-Sonde (B) gegen 

RTP1. Maßstab 50 µm (C) Coronarschnitt durch das VNO nach in situ 

Hybridisierung gegen RTP1. Maßstab 100µm 

In situ Hybridisierungen mit einer spezifischen antisense RNA-Sonde zeigten, dass 

RTP1 nicht nur im OE (Abbildung 13A), sondern auch im VNO exprimiert wird 

(Abbildung 13C). Im Gegensatz zum OE wird RTP1 im VNO jedoch nicht im 

gesamten Epithel sondern, wie zuvor für ORs gezeigt, nur in der apikal gelegenen 

Zellschicht exprimiert. 

59

Abbildung 14: Expression von mOR18-2 und RTP 

Ergebnisse 

(A) Coronarschnitt durch das VNO nach doppel in situ Hybridisierung mit RNA Sonden gegen 

mOR18-2 (grün) und RTP (rot). Maßstab 100 µm (B-D) Vergrößerte Darstellung des umrahmten 

Bereichs in A. Maßstab 50 µm. 

Die Doppel in situ Hybridisierungsexperimente zeigten, dass OR positive Zellen im 

VNO RTP1 exprimieren (Abbildung 14). 

3.12 Charakterisierung von OR exprimierenden Zellen des VNO 

Der Befund, dass OR exprimierende Zellen im Vomeronasalorgan existieren wirft die 

Frage auf, ob es sich bei diesen um ektopisch positionierte Zellen des 

hauptolfaktorischen Epithels handelt oder um vomeronasale Rezeptorneurone, die 

Odorantrezeptoren exprimieren. Um diese Frage zu beantworten, wurden die OR 

exprimierenden Zellen des VNO anhand ihrer Morphologie und molekularen 

Ausstattung charakterisiert. 

3.12.1 OR exprimierende Zellen des VNO besitzen die Morphologie von VSNs 

Die chemosensorischen Zellen des VNO und des OE unterscheiden sich in der 

Morphologie ihrer dendritischen Endigung. Während die dendritischen Endigungen 

der Rezeptorneurone des OE mit langen Cilien besetzt sind, besitzen Rezeptorzellen 

des VNO einen Mikrovillisaum am dendritischen Knob (Mendoza, 1993). Um nun 

einen Einblick in die Ausprägung der Endstrukturen OR exprimierender Zellen im 

VNO zu erhalten, wurde die transgene Mauslinie MOL2.3-IGITL eingesetzt, bei der 

unter dem Promotor des Rezeptors mOR18-2 GFP und β-Galaktosidase exprimiert 

wird (Conzelmann et al., 2001). Frühere Studien haben bereits gezeigt dass die 

histologischen Marker, speziell das GFP, in alle Zellkompartimente diffundiert und 

60

Ergebnisse 

diese sichtbar macht. Da das in dieser Mauslinie markierte Gen für den Rezeptor 

mOR18-2 sowohl in Riechsinneszellen des OE, als auch in Zellen des VNOs 

exprimiert wird, sollte ein Vergleich der Morphologie der Zellen in beiden 

Subsystemen möglich sein. 

Der Vergleich von mOR18-2 exprimierenden Zellen des OE (Abbildung 15 C) und 

des VNO (Abbildung 15 A und B) zeigte, dass in beiden Systemen die Zellkörper und 

Dendriten, die zur Oberfläche des Epithels ziehen, eine deutliche Färbung 

aufwiesen. Während jedoch Cilien an den Knobs der mOR18-2 + Zelle im OE sichtbar 

waren, konnten entsprechende Strukturen im Bereich des Knobs der mOR18-2 + Zelle 

im VNO nicht visualisiert werden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass es sich bei 

den mOR18-2 exprimierenden Zellen nicht um ektopisch positionierte 

Riechsinneszellen des OE sondern um typische VNO-Neurone handeln könnte. 

3.12.2 Nachweis des Transduktionselementes TRP2 

Um diese These zu untermauern wurde untersucht, ob die Zellen das für VNO- 

Neurone charakteristische Gen für den Ionenkanal TRP2 exprimieren (Liman et al., 

1999). 

Abbildung 15: Morphologie von mOR18-2 exprimierenden Zellen 

Morphologischer Vergleich der dendritischen Endigung tauEGFP exprimierender 

Zellen in VNO und HOE in mOR18-2-IGITL Mäusen. (A) Coronarschnitt durch das 

VNO. Vergrößerte Darstellung des umrahmten Bereichs in B. (Maßstab 10 µm). (C) 

Hohe Vergrößerung einer GFP + Zelle im HOE. Bei beiden Zellen ist der Dendrit zu 

sehen, Cilien nur bei der Zelle im HOE (Maßstab 10 µm). 

61

Abbildung16: Expression von mOR18-2 und TRP2 

Ergebnisse 

Co-Expression von mOR18-2 und TRP2 (Pfeilkopf). (A) Coronarschnitt nach doppel in situ 

Hybridisierung mit RNA-Sonden gegen mOR18-2 (grün) und TRP2 (rot). (B-D) Vergrößerte 

Darstellung der umrahmten Region in A.. Maßstab, 50 µm. 

Doppel in situ Hybridisierungsexperimente mit Sonden gegen mOR18-2 und TRP2 

zeigten, dass die Subpopulation mOR18-2 exprimierender Zellen auch mRNA für 

TRP2 aufwies (Abbildung 16). Dieses Ergebnis zeigt, dass OR exprimierende Zellen 

des VNO ein typisches Element der Signaltransduktionskaskade vomeronasaler 

Rezeptorneurone besitzen. 

3.13. Spezifische Amplifikation mit Primern gegen die Subfamilie V1Ra 

Die bisherigen Ergebnisse demonstrierten, dass OR exprimierende Zellen in der 

apikalen Schicht des VNO lokalisiert sind, in der auch die Rezeptorgene der V1R 

Familie exprimiert werden. Dies warf die Frage auf, ob diese Rezeptoren 

möglicherweise mit OR Genen in distinkten VNO-Neuronen co-exprimiert werden. 

Zur Beantwortung dieser Frage wurden zunächst Tiere der Mol2.3-IGITL Mauslinie 

eingesetzt, aus denen nach Dissoziation der VNOs die entsprechenden GFP 

exprimierenden, d.h. mOR18-2 exprimierende Zellen, in kleinen Gruppen mit ca. 5-7 

umgebenden Zellen isoliert und einer oligo-Zell-RT-PCR-Analyse zugeführt wurden. 

Die Analyse der cDNA zeigte keine Kontamination mit genomischer DNA (Abbildung 

17 A). RT-PCR Experimente mit subfamilienspezifischen Primern der V1R 

Genfamilie resultierten in einer Bande der erwarteten Größe ausschließlich für die 

Subfamilie a (Abbildung 17 B). 

62

Ergebnisse 

Mit Primern gegen die anderen Subfamilien wurden entweder keine Banden oder 

solche mit abweichender Größe amplifiziert (Daten nicht gezeigt); diese wurden nicht 

näher analysiert. Die Klonierung der für die Subfamilie a spezifischen Bande 

resultierte in 9 Klonen, von denen sechs Sequenzen durch BLAST-Analysen als 

V1Ra4 bzw. V1Ra3 identifiziert wurden. Die Sequenzen dieser Rezeptoren sind zu 

96% identisch. 

Abbildung 17: RT-PCR Analyse GFP exprimierender VNO-Zellen einer 

mOR18-2-IGITL Maus 

(A) RT-PCR mit Primern gegen das ribosomale Protein L8. Die PCR zeigt 

keine Bande für eine Kontamination mit genomischer DNA (B) RT-PCR mit 

Primern gegen die Rezeporsubfamilie V1Ra. Die PCR zeigt ein spezifisches 

PCR Produkt der erwarteten Größe. M, 100bp Marker; L8, Ansatz mit Primern 

gegen das ribosomale Protein L8; a, Ansatz mit Primern gegen V1Ra; K - , 

Wasserkontrolle ohne cDNA 

Die Identifizierung dieser Sequenzen könnte auf eine Co-Expression mit mOR18-2 

hindeuten, muß aber aufgrund der Verwendung von mehreren Zellen zur RNA 

Isolierung, durch doppel in situ Hybridisierungexperimente verifiziert werden. 

3.13.1 Co-Expression von mOR18-2 und V1Ra3/4 

Dazu wurden Hybridisierungen mit einer spezifischen Sonde gegen mOR18-2 und 

einer unspezifischen Sonde gegen V1Ra3 und V1Ra4 durchgeführt (Abbildung 18). 

Als RNA-Sonde für die V1Rs diente der klonierte Bereich von 160 bp. 

63

Abbildung 18: Expression von V1Ra3/4 und mOR18-2 

Ergebnisse 

Coronarschnitte durch das VNO nach doppel in situ Hybridisierung mit RNA Sonden gegen V1Ra3/4 

und mOR18-2. (A) V1Ra3/4 positive Zellen sind rot, mOR18 positive Zellen sind grün markiert. 

Maßstab 100µm. (A’-A’’’) Vergrößerte Darstellung der umrahmten Region in A. Maßstab 50 µm. (B) 

V1Ra3/4 positive Zellen sind grün, mOR18-2 positive Zellen sind rot markiert. Maßstab 100 µm, (B’- 

B’’’) Vergrößerte Darstellung der umrahmten Region in B. Maßstab 50 µm. In beiden Ansätzen sind 

doppelt, sowie einzeln markierte Zellen sichtbar. 

Die doppel in situ Hybridisierung zeigt, dass in der Tat die mOR18-2 + Zellen durch 

die Sonde gegen V1Ra3/4 markiert sind; d.h. dass zumindest einer der Rezeptoren 

mit mOR18-2 co-exprimiert ist. Die V1Ra3/4-Sonde markiert ebenfalls weitere Zellen, 

die nicht durch die Sonde gegen den Rezeptor mOR18-2 markiert sind. Dieses 

Ergebnis spricht dafür, dass nur einer der Rezeptoren mit mOR18-2 co-exprimiert 

wird. 

3.13.2 Synthese spezifischer Sonden gegen V1Ra3 und V1Ra4 

Da die Sequenzhomologie der Rezeptoren V1Ra3 und V1Ra4 sehr hoch ist und die 

RNA Sonde die Subfamilienmitglieder nicht differentiell markieren kann, wurden in 

einem nächsten Schritt Sequenzabschnitte mit niedrigerer Identität im 3’ nicht 

kodierenden Bereich generiert. Die Funktionalität beider Sonden wurden durch in situ 

Hybridisierungen im VNO getestet. 

64

Abbildung 19: Spezifischen Sonden gegen V1Ra3 und V1Ra4 

Ergebnisse 

Coronarschnitte durch das VNO nach in situ Hybridisierung mit spezifischen Sonden 

gegen V1Ra3 (A) und V1Ra4 (B). Maßstab 100µm 

Beide Sonden markierten Zellen im sensorischen Epithel des VNOs; 

Hybridisierungen auf Schnitten des OE resultierten dagegen nicht in markierten 

Zellen (Daten nicht gezeigt). 

3.13.3 Hybridisierung mit spezifischen Sonden gegen V1Ra4, V1Ra3 und 

mOR18-2. 

Zur Identifizierung des mit mOR18-2 co-exprimierten VNO Rezeptors wurden doppel 

in situ Hybridisierungen mit spezifischen Sonden gegen V1Ra4 (Abbildung 20) und 

V1Ra3 (Abbildung 21) durchgeführt. 

65

Abbildung 20: Expression von V1Ra4 und mOR18-2 

Ergebnisse 

Coronarschnitt durch das VNO nach doppel in situ Hybridisierung mit RNA-Sonden gegen mOR18-2 

(grün) und den nichtcodierenden Bereich von V1Ra4 (rot). (A) Expression von mOR18-2. (B) 

Expression von V1Ra4. (C) Überlagerung. Maßstab 100 µm. 

Die doppel in situ Hybridisierung mit Sonden gegen V1Ra4 und mOR18-2 resultierte 

in keiner Überlagerung der Signale beider Sonden. Das Ergebnis zeigt, dass diese 

Rezeptoren nicht innerhalb der selben Zellen exprimiert werden. 

Abbildung 21 zeigt eine doppel in situ Hybridisierung gegen V1Ra3 und mOR18-2. 

66

Abbildung 21: Expression von V1Ra3 und mOR18-2 

Ergebnisse 

Coronarschnitt durch das VNO nach doppel in situ Hybridisierung mit RNA-Sonden gegen 

mOR18-2 (grün) und den nichtcodierenden Bereich von V1Ra3 (rot). (A) Expression von 

mOR18-2. (B) Expression von V1Ra3. (C) Überlagerung. Maßstab 100 µm. 

Die Überlagerung der Bilder zeigt bei dieser Sondenkombination eine Co- 

Lokalisation der Färbungen beider Sonden (Abbildung 26C). Neben den doppelt 

gefärbten Zellen waren jedoch auch einfach gefärbte mOR18-2 + (Abbildung 26 A, 

Pfeilkopf) und V1Ra3 + (Abbildung 26 B, Pfeil) Zellen zu beobachten. 

Die Hybridisierungsexperimente mit den spezifischen Sonden deuten auf eine Co- 

Expression von mOR18-2 und V1Ra3 hin. 

3.13.4 Spezifische Co-Expression von mOR18-2 und V1Ra3 

Der Befund, dass der Odorant Rezeptor mOR18-2 mit dem Rezeptorgen V1Ra3 co- 

exprimiert ist, wirft die Frage nach der Spezifität dieser Rezeptorauswahl auf. Daher 

wurden in situ Hybridisierungen mit Proben für die verwandten Rezeptoren mOR18-1 

und mOR18-3 durchgeführt. Als Sonde gegen das V1R Gen wurde wieder die 

unspezifische Sonde gegen V1Ra3 und V1Ra4 verwendet (Abbildung 22). 

67

Abbildung 22: Expression von V1Ra3/4, mOR18-1 und mOR18-3 

Ergebnisse 

Coronarschnitte durch das VNO nach doppel in situ Hybridisierung mit RNA Sonden gegen 

V1Ra3/4 (grün) und mOR18-1 (rot) (A und B) und V1Ra3/4 (grün) und mOR18-3 (rot) (C und D). 

Maßstab 100 µm, in höheren Vergrößerungen 50 µm. 

Für keine der Sondenpaarungen konnten doppelt markierte Zellen beobachtet 

werden. Das Ergebnis deutet darauf hin, dass es sich bei der Co-Expression des V1 

Rezeptors mit mOR18-2 um eine spezifische Kombination der Rezeptoren handelt. 

68

Ergebnisse 

3.13.5 Vergleich der Expression von mOR18-2 und V1Ra3 während der 

Entwicklung 

Für Odorantrezeptoren wurde bereits gezeigt, dass die Anzahl der OR + Zellen in 

adulten Mäusen absinkt. Durch die Expression von mOR18-2 und V1Ra3 innerhalb 

einer Zelle in jungen postnatalen Stadien, stellt sich die Frage nach dem 

Expressionsverlauf des Rezeptorgens V1Ra3 in adulten Stadien. Daher wurde die 

Anzahl der V1Ra3 + Zellen durch in situ Hybridisierungen bestimmt und mit der 

Anzahl mOR18-2 + Zellen aus der Arbeit von Lévai (2004) verglichen (Abbildung23). 

Der Vergleich zeigt, dass die Anzahl der V1Ra3 exprimierenden Zellen in adulten 

Stadien parallel zur Anzahl der mOR18-2 + Zellen abnimmt. Damit zeigt der Versuch, 

dass die ungleichmäßige Expression der ORs im VNO während der Entwicklung 

keine OR spezifische Eigenschaft ist, sondern ebenfalls auf V1R Gene zutreffen 

kann und damit möglicherweise die gesamte Rezeptorexpression von OR + Zellen 

charakterisiert. 

Abbildung 23: Expression von V1Ra3 und mOR18-2 während der 

Entwicklung 

Die Anzahl der V1Ra3 exprimierenden Zellen (schwarze Balken) folgt dem 

Verlauf der mOR18-2 Expression (graue Balken) während der Entwicklung. 

(mOR18-2 aus Lèvai, 2004; V1Ra3 n=3) 

69

3.13.6 Vergleich der Expression von V1Ra3 und V1Ra4 

Ergebnisse 

Durch die Verringerung von V1Ra3 + Zellen im VNO während der Entwicklung stellt 

sich die Frage, ob dies auch für andere gilt. Zum Vergleich wurde die Expression des 

nah verwandten Genes V1Ra4 untersucht. 

Abbildung 24: Vergleich der Anzahl von V1Ra3 und V1Ra4 exprimierenden Zellen 

Vergleich der Expression von V1Ra3 (graue Balken) und V1Ra4 (schwarze Balken) im 

VNO in 21 Tage alten und adulten Mäusen. Im Gegensatz zur Zuname der V1Ra4 

exprimierenden Zellen ist eine leichte Abnahme der Anzahl V1Ra3 exprimierender 

Zellen zu Beobachten (n=1). 

Der Vergleich der Expressionen beider Gene zeigte das Vorkommen von V1Ra4 in 

der fünf bis siebenfachen Anzahl von Zellen. Die Zahl V1Ra4 + Zellen in adulten 

Mäusen lag ebenfalls höher als die Zahl der V1Ra4 + Zellen in Mäusen im Stadium 

P21. Dies lässt nicht auf ein Abschalten des Genes während der Entwicklung 

schließen. Eine Abnahme der V1Ra + Zellen in adulten Mäusen kann daher nicht als 

generelles Prinzip angesehen werden. 

3.14 Untersuchung des Expressionsmodus von mOR18-2 

Ziel dieser Untersuchung war es, den Expressionsmodus olfaktorischer 

Rezeptorgene im VNO zu bestimmen. Dazu wurden Schnittserien von VNOs aus 

homozygoten und heterozygoten mOR18-2-IGITL Mäusen angefertigt und die Anzahl 

GFP markierter Zellen im VNO und HOE verglichen. 

70

Abbildung 25: Expressionsmodus von mOR18-2 in VNO und HOE 

Ergebnisse 

Vergleich der Anzahl mOR18-2 positiver Zellen in homozygoten und hetrozygoten Tieren. (A) 

Anzahl der GFP + Zellen im gesamten VNO von Mol2.3-IGITL Mäusen. n=5 (B) Anzahl der LacZ 

positiver Zellen in 0,01mm 2 Fläche des OE in Mol2.3-IGITL Mäusen (n=5). 

Der Versuch zeigt, dass in homozygoten Tieren die Anzahl der GFP markierten 

Zellen im OE in der Tat ca. doppelt so groß ist wie die Anzahl der Zellen in 

heterozygoten Tieren. Im VNO konnte dagegen kein Unterschied in der Anzahl GFP 

markierter Zellen in homozygoten und heterozygoten Tieren ermittelt werden. Der 

Versuch zeigt, dass sich die Expressionsmodi von mOR18-2 in VNO und OE 

unterscheiden. Während im OE die Daten für eine mono-allelische Expression 

sprechen, sind im VNO keine Anzeichen für eine solche zu erkennen. 

3.15 Untersuchung Expressionsmodus von mOR18-2 im Sphenopalatinum 

Im Folgenden sollte der Expressionsmodus von mOR18-2 außerhalb des 

olfaktorischen Systems geprüft werden. Dazu wurde der Anteil GFP + 

Sphenopalatinum von homozygoten und heterozygoten MOL2.3-IGITL Mäusen 

untersucht. 

im 

71

Abbildung 26: Expression von mOR18-2 im Sphenopalatinum 

Ergebnisse 

Schnitte durch das Sphenopalatinum einer homozygoten (A) und einer heterozygoten (B) 

CreMol-IGITL Maus. Die Fluoreszenz des unter dem mOR18-2 Promotor exprimierten GFP 

wurde immunhistochemisch verstärkt. Maßstab 50 µm. 

Abbildung 26 zeigt exemplarische Schnitte des Sphenopalatinums einer 

homozygoten und heterozygoten Maus. Durch die Gegenfärbung mit Propidiumjodid 

ist die runde Struktur des Sphenopalatinums deutlich erkennbar und die Zahl der 

Zellen pro Schnitt zu bestimmen. Abbildung 36 zeigt den Vergleich der Anteile GFP + 

Zellen zur Anzahl der Zellen des Sphenopalatinums (n=4). 

72

Abbildung 27: Expressionsmodus von mOR18-2 im 

Sphenopalatinum 

Anteil der GFP positiven Zellen aller Zellen des Sphenopalatinum in 

mOR18-2-IGITL Mäusen (n=4). 

Ergebnisse 

Die Ergebnisse zeigen, dass in beiden Mauslinien etwa 35 bis 40 % der 

ausgewerteten Zellen im Sphenopalatinum den Rezeptor mOR18-2 exprimieren. Der 

Vergleich homozygoter und heterozygoter Mäuse zeigte wie im VNO keinen 

Unterschied. Daher scheint mOR18-2 im Sphenopalatinum ebenfalls einer bi- 

allelischen Expression zu unterliegen. 

73

3.16 Eingliederung des OR37 Subsystems in die Architektur des 

hauptolfaktorischen Systems 

Ergebnisse 

Die bisherigen Analysen haben gezeigt, dass im VNO eine kleine Gruppe von ORs 

exprimiert wird, die die Möglichkeit der Detektion von „herkömmlichen Duftstoffen“ ins 

VNO transferieren. Die Daten haben gezeigt, dass die Expression der ORs auf eine 

kleine Gruppe von Zellen im VNO beschränkt ist. Der gezielte Einbau dieses 

Subsystems ins VNO weist möglicherweise auf eine spezielle Rolle von 

„herkömmlichen Duftstoffen“ im akzessorischen System hin. 

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass es innerhalb des olfaktorischen Systems 

ebenfalls eine kleine Gruppe von acht Odorantrezeptoren gibt, die sich in einigen 

Merkmalen von anderen ORs unterscheiden. Genetische Analysen zeigten, dass sie 

eine Sequenzanomalie in Form einer Verlängerung der letzten extrazellulären 

Proteindomäne um sechs Aminosäuren besitzen, weswegen sie zur Rezeptorfamilie 

OR37 zusammengefasst wurden. Phylogenetische Studien zeigten, dass sie im 

Gegensatz zu anderen ORs während der Evolution stark konserviert wurden (Hoppe 

et al., 2006a); ein Hinweis darauf, dass es sich bei diesem Rezeptortyp ebenfalls um 

Rezeptoren handelt, die besondere Duftstoffe detektieren. Analysen des 

Expressionsmusters der OR37-Subtypen zeigten, dass diese speziellen Rezeptoren, 

im Vergleich zu herkömmlichen Rezeptoren, nicht nach einem zonalem Prinzip, 

sondern geclustert in einem zentralen Bereich der Turbinalen in einer hohen Dichte 

exprimiert werden (Abbildung. 28) (Strotmann et al., 1995, 1999). Die molekularen 

Mechanismen für das besondere Organisationsprinzip sowie die Art und Rolle der 

Duftstoffe, die von diesen Rezeptoren detektiert werden, sind noch unbekannt. Im 

Hinblick auf die Klärung dieser Fragen wurden ausgewählte Vertreter der OR37 

Subfamilie näher analysiert. 

74

Abbildung 28: Topographie der Rezeptorexpression 

Ergebnisse 

Topographisches Muster der Rezeptorexpression im olfaktorischen Epithel. (A) Zonale Expression 

von OR im OE. (Verändert nach Vassar et al. 1993). (B, C) Aufsicht auf die medialen Endoturbinale 

einer P2-LacZ (B) und einer OR37C-LacZ Maus (C) nach X-Gal Färbung. Im Vergleich zu 

„klassischen“ Odorantrezeptoren wie P2 werden OR37 Subtypen geclustert in einem zentralen 

Bereich des olfaktorischen Epithel exprimiert. 

Wie Abbildung 28 zeigt, überschneiden sich die Expressionsbereiche der Rezeptoren 

OR37C und P2. Dies bedeutet, dass geclustert exprimierte Mitglieder der 

Rezeptorfamilie OR37 und zonal exprimierte Rezeptoren im selben Epithelabschnitt 

vorliegen. Es stellt sich die Frage, ob die Expression der OR37 Familie ebenfalls 

nach einem zonalen Prinzip organisiert ist oder ob alle geclustert exprimierten Gene 

im gleichen Bereich exprimiert werden. 

75

3.16.1 Kompartimentierung der Rezeptorexpression innerhalb des OR37 

Subsystems 

Ergebnisse 

Bisher ist es unklar, inwieweit Zellen von distinkten Rezeptortypen in ihrer 

topographischen Position bei unterschiedlichen Individuen variieren. Um dies aber zu 

untersuchen, wurde mit Hilfe von doppelt transgenen Mäusen die Expressionen von 

OR37C und P2 (Abbildung 29 A) sowie von OR37A-LacZ und OR37C-GFP 

(Abbildung 29 B) innerhalb des gleichen Individuums analysiert. Um einen Vergleich 

unterschiedlicher Individuen zu ermöglichen, wurde das Epithel des Turbinals IIb von 

dorsal nach ventral in zehn Areale unterteilt. 

76

Abbildung 29: Zonale Anordnung geclustert exprimierter Rezeptoren 

Ergebnisse 

Die Untersuchung der dorso-ventralen Verteilung geclustert exprimierter Rezeptoren zeigt ebenfalls 

eine zonale Organisation der Genexpression. (A) Aufsicht auf die medialen Endoturbinalen IIb und 

III einer OR37C-GFPxP2-LacZ Maus. Einteilung der dorso-ventralen Achse in 10 Untereinheiten (B) 

Aufsicht auf die medialen Endoturbinalen IIb und III einer OR37C-GFPxOR37A-LacZ Maus. (C). 

Verteilung der OR37A und OR37C positiven Zellen entlag der dorso-ventralen Achse des Turbinals 

2B (n=9). (D) Verteilung der OR37 C und P2 exprimierenden Zellen entlag der dorso-ventralen 

Achse des Turbinals 2B (n=8). 

Abbildungen 29 C und D zeigen die prozentuale Verteilung der Rezeptoren entlang 

der dorso-ventralen Achse. Wie P2 (Abb. 29D) besitzen die Rezeptoren OR37A und 

OR37C definierte Expressionsbereiche (Abb.29 C, D). Obwohl sich die Areale mit 

OR37A und OR37C positiven Zellen überschneiden, kann jedem Rezeptor ein 

eigener Expressionsbereich zugeordnet werden. Wie der Vergleich von OR37C in 

beiden doppelt transgenen Mauslinien zeigt, ist die Verteilung eines Rezeptors auch 

zwischen mehreren Individuen sehr konstant. Um zu untersuchen, ob jeder Rezeptor 

der Familie OR37 in einem individuellen Areal exprimiert wird, wurde ohne eine 

weitere doppelt transgene Maus zu generieren, die Expression von OR37B zur 

weiteren Auswertung mit hinzugefügt und mit der Verteilung von OR37C positiven 

Zellen verglichen (n=2). 

Abbildung 30: Zonale Expression geclusterter und nicht-geclusterter Rezeptoren 

Die geclustert exprimierten Rezeptoren OR37B und OR37C werden im gleichen dorso- 

ventralen Abschnitt exprimiert (A), während OR37A positive Zellen ventraler, in der 

gleichen Region wie P2 positive Zellen positioniert sind (B). 

77

Ergebnisse 

Das Ergebnis veranschaulicht, dass diese beiden Zellpopulationen wiederum im 

identischen Epithelbereich exprimiert werden (Abbildung 30A). Die Daten zeigen, 

dass geclusterter Rezeptoren nicht einheitlich im „Cluster“ verteilt sind, sondern 

ebenfalls nach einem zonalen Prinzip exprimiert werden. Damit ist das „Cluster“ auch 

für die Expression von OR37 Subtypen kompartimentiert, die wiederum eine „rostro- 

caudal-verkürzt-zonale“ Expression aufweisen. 

Um zu überprüfen, ob möglicherweise die Position der OR37 Gene im Genom 

(Reihenfolge im Genom: A-C-B-D-E; OR37C und OR37B liegen benachbart) mit der 

Zonierung im Epithel korreliert, müssten ebenfalls die Expressionsmuster von 

OR37D und OR37E untersucht werden. Für diese Rezeptoren standen jedoch keine 

transgenen Mauslinien zur Verfügung. 

Die Daten zeigen weiterhin, dass der geclustert exprimierte Rezeptor OR37A und der 

zonal exprimierte Rezeptor P2 ebenfalls im gleichen Bereich exprimiert werden 

(Abbildung 30B). Durch die Überlappung der Expressionen stellte sich die Frage wie 

das Epithel im „Cluster“ organisiert ist, um die in diesem Bereich zusätzlichen 

Rezeptoren zu beherbergen. Es wäre denkbar, dass dort zusätzliche Zellen mit 

geclustert exprimierten Rezeptoren vorkommen. 

3.16.2 Gleichförmige Architektur des Epithels in der medialen Zone 

Zur Beantwortung der Frage wurde die Architektur des Epithels an drei Stellen im 

medialen Expressionsbereich verglichen. Die DAPI gefärbten Schnitte in Abbildung 

31 A und B zeigen die anteriore und posteriore Grenze des untersuchten Bereichs. 

Innerhalb dieses Bereichs wurden auf Schnittserien die Regionen, in denen OR37 

exprimierende Zellen lokalisiert sind, mit zwei benachbarten Epithelbereichen 

verglichen. 

78

Ergebnisse 

Abbildung 31: Vergleich des sensorischen Epithels innerhalb und außerhalb des 

„Cluster“ 

(A, B) Querschnitt des OE nach DAPI Färbung; (A) Anteriore Grenze, (B) posteriore Grenze 

des vermessenen Bereichs. Asterisk markiert die vermessenen Regionen. (C) Bestimmung 

der Stärke [L] und der Dichte [d] des Epithels. (D) Bestimmung der Länge [X] und des 

Durchmessers [Y] nach immunhistochemischer Färbung. (E) Vergleich der Epithelstärke auf 

79

Ergebnisse 

dem Septum, im Patch und der dorso-medialen Zone (n=26). (F) Vergleich der Dichte des 

Epithels auf dem Septum, im Patch und der dorso-medialen Zone (n=26). (G) Vergleich 

der Zellmaße von OR37A, mOR18-2 und P2 exprimierenden Zellen (n=50). 

Zunächst wurden die Dicke des Epithels und die Zelldichte bestimmt. Alle drei 

Bereiche wiesen eine durchschnittliche Epitheldicke zwischen 40 und 50 µm 

(Abbildung 31 E) und eine durchschnittliche Zelldichte von 6 Zellen/0,01mm 2 auf 

(Abbildung 31 F). Ein signifikanter Unterschied der Epithelbereiche bezüglich dieser 

Parameter war nicht festzustellen. 

Eine Vermessung der Zellgrößen (Abbildung 31 D) von OR37A, bzw. P2 und 

mOR18-2 exprimierenden Zellen zeigte für alle Populationen eine mittlere Zelllänge 

von 5 bis 6 µm und eine mittlere Zellbreite von 4 µm auf. Auch hier konnte kein 

signifikanter Unterschied zwischen den Zellpopulationen festgestellt werden. 

Das Vorkommen der OR37 exprimierenden Zellen im Bereich des Clusters wird also 

offensichtlich nicht durch eine erhöhte Zellzahl in diesem Epithelbereich erreicht. 

Damit konnten im „Cluster“ keine strukturellen Merkmale gefunden werden, die auf 

zusätzliche Zellen mit geclustert exprimierten Genen in diesem Bereich hinweisen. 

3.16.3 Weniger Zellen exprimieren zonal organisierte Rezeptoren 

Alternativ dazu könnte eine Verminderung der Anzahl von Sinneszellen, die einen 

anderen als einen OR37 Rezeptor exprimieren, in diesem Bereich verwirklicht sein. 

Um diese These zu überprüfen, wurde die Häufigkeit der Expression von P2 entlang 

der anterior-posterioren Achse untersucht. Die Untersuchung erfolgte ebenfalls auf 

„whole-mount” Präparaten der medialen Endoturbinale. Abbildung 32 A zeigt 

exemplarisch die Bestimmung der Expressionshäufigkeit des P2 Rezeptors. 

80

Ergebnisse 

Ein Vergleich der Expressionshäufigkeiten des P2 Rezeptors auf den Endoturbinalen 

IIa, IIb und III zeigte, dass P2 exprimierende Zellen eine geringere Dichte im Bereich 

der geclustert exprimierten Rezeptoren auf Turbinal IIb aufweisen (n=6). Demnach 

erfolgt die Eingliederung geclustert exprimierter Rezeptoren ins Epithel über eine 

seltenere Expression zonal exprimierter Rezeptoren im Patch. 

3.17 Transkription von OR37C im gesamten medio-lateralen Epithel 

Die besondere geclusterte Organisation der OR37- exprimierenden Sinneszellen im 

olfaktorischen Epithel wirft die Frage nach dem dafür verantwortlichen 

Kontrollmechanismus der Expression dieser Gengruppe auf. 

Wie die Auswahl eines OR Gens zur Expression in einer räumlich organisierten 

Sinneszellpopulation erfolgt, ist bislang noch weitgehend unverstanden. Es wurde 

postuliert, dass die topographische Expression von distinkten Transkriptionsfaktoren, 

die in die Expressionskontrolle innerviert sind, zur Ausprägung der räumlichen 

Organisation OR exprimierender Zellen führt (Shikind et al., 2004; Lovardas et al., 

2006). Die Auswahl eines Gens in einem definierten epithelialen Areal einer Zone 

oder dem „Cluster“ durch eine topographische Organisation distinkter 

Transkriptionsfaktoren, würde die selektive Expression eines Gens in diesem Bereich 

ermöglichen; in anderen Epithelbereichen könnte somit die Auswahl des Gens nicht 

erfolgen. 

Abbildung 32: Verteilung P2 positiver Zellen entlang der rostro-caudalen Achse 

(A) Whole mount Präparation einer FD Maus nach X-Gal Färbung. Die Kreise 

repräsentieren die ausgezählten Regionen. Maßstab 500 µm. (B) Anzahl der P2 

exprimierenden Zellen pro 0,01 mm 2 auf den Turbinalen 2a, 2b (Patch) und Turbinal 3 

(n=6). 

81

Ergebnisse 

Um einen Einblick in die zugrundeliegenden Mechanismen zu erhalten, wurde die 

Mauslinie RF1 verwendet, in der alle Zellen auch bei transienten Aktivitäten 

dauerhaft markiert sind. In dieser Mauslinie wurde der Genort für den Rezeptor 

OR37C durch homologe Rekombination so modifiziert, dass in den Zellen eine 

bicistronische mRNA aus der kodierenden Sequenz für OR37C, gefolgt von IRES 

(internal ribosome entering site) Sequenz und der Cre-Rekombinase (Abbildung 33A) 

entsteht. Die bicistronische mRNA führt zur Translation des Rezeptorproteins und der 

Cre-Recombinase. Diese kann die Expression eines Markergens induzieren, in dem 

sie LoxP-flankierte STOP-Sequenzen hinter einem konstitutiv aktiven Promotor 

entfernt (Abbildung 33 B, C). Dieses Markergenkonstrukt befindet sich im Genort 

„ROSA26“, einem zur Transkription geöffneten Bereich des Chromatins. 

Abbildung 33: LacZ-Expression durch Cre vermittelte Rekombination 

(A) Bicistronische Expression des Rezeptors OR37C und der Cre-Recombinase unter der Kontrolle 

des OR37C Promotors (B) LacZ bzw. EYFP unter der Kontrolle des konsitutiv aktiven β-Aktin 

Promotors im ROSA26 Locus. Die Expression des Markers LacZ (EYFP) wird durch eine mit LoxP- 

Sequenzen flankierte STOP Sequenz inhibiert. (C) In Zellen mit aktiviertem OR37C Promotor 

entfernt Cre die LoxP flankierte STOP-Sequenz und ermöglicht die Expression der Zellmarker durch 

den β-Aktin Promotor. (D) Vollständige Hemmung der Markerexpression durch die STOP-Sequenz 

(E) Cre vermittelte Expression von LacZ. TSS, Transkriptionsstartpunkt. 

82

Ergebnisse 

Dieser Prozess läuft in allen OR37C exprimierenden Zellen ab und ist nicht 

reversibel, so dass die Zellen permanent den Marker exprimieren, selbst wenn das 

einmal aktivierte OR37 Gen nicht weiter exprimiert wird. 

In den hier gezeigten Studien wurde die Cre exprimierende Mauslinie RF1 mit den 

Mauslinien Rosa26-LacZ bzw. ROSA26-YFP gekreuzt, die nach der Cre vermittelten 

Rekombination unter dem konstitutiv aktiven Promotor das Markergen β- 

Galaktosidase bzw. YFP exprimieren (Abbildung 33 D, E). 

In den ROSA26 LacZ-Tieren mit den wildtypischen OR37C Allelen konnten nach X- 

Gal Färbung keine markierten Zellen beobachtet werden (Abbildung 33D, n=2); 

dieses Ergebnis zeigt, dass die STOP-Elemente die Expression des Markers β- 

Galaktosidase vollständig inhibieren. Nach Kreuzung der ROSA26-LacZ Linie mit der 

Linie RF1 waren nach X-Gal Färbung Zellen des olfaktorischen Epithels blau markiert 

(Abbildung 33E). 

Interessanterweise waren neben den Zellen im „Cluster“ auch Zellen außerhalb 

dieser Region markiert (Abbildung 33D, 34A, B). Wie der Vergleich mit der Mauslinie 

P2-LacZ zeigte, wies die Positionierung der außerhalb des „Clusters“ gelegenen 

Zellen jedoch keine typische zonale Expression auf (Abbildung 37 C). Die markierten 

Zellen erstreckten sich über den gesamten Bereich des olfaktorischen Epithels mit 

Ausnahme eines Bereichs im dorsalen Epithel. 

83

Ergebnisse 

Die Analyse der transgenen Mauslinie zeigte, dass Faktoren die zur Expression des 

OR37C Gens notwendig sind nicht nur im „Cluster“, sondern auch außerhalb 

vorhanden sind. Trotz der ektopischen Expression des Gens in untypischen 

Epithelbereichen, unterscheidet sich das „Cluster“ durch eine höhere Dichte 

markierter Zellen. 

Abbildung 34: Expression von OR37C 

Vergleich der Expression von OR37C in RF1xROSA26-LacZ Mäusen mit der 

Expression von OR37A-LacZ und P2-LacZ in whole mount Präparaten des 

olfaktorischen Epithels nach X-Gal Färbung. (A) In adulten RF1 X Rosa26- 

LacZ sind neben dem deutlich hervortretenden Patch (Asterisk) viele ektopisch 

positionierte Zellen markiert (Pfeil). (B, C) Langzeit-Expressionen von OR37A 

(B) und P2 (C) mit typisch geclusterten bzw. zonalen Expressionsmuster. 

Um nun zu überprüfen ob die Zellen, die in der RF1 x Rosa26-LacZ Mauslinie das 

OR37C Gen außerhalb des typischen „Clusters“ einschalten, dieses permanent 

beibehalten, wurden auf Folgeschnitten durch das OE die Expression des 

84

Ergebnisse 

Markergens und die Präsenz der mRNA für OR37C mit in situ Hybridisierungen 

analysiert. 

Abbildung 35: Expression von OR37C in RF1xRosa26 LacZ Mäusen 

Folgeschnitte durch das olfaktorische Epithel nach in situ Hybridisierung mit 

einer RNA-Sonde gegen OR37C (A) und nach X-Gal Färbung (B). (A’ und B’) 

Vergrößerte Darstellung des „Patches“ (Asterisk). (A’’ und B’’) Vergrößerte 

Darstellung eines OR37 negativen Bereiches (Pfeilkopf) mit LacZ + Zellen 

(Pfeil). Maßstab: A und B, 500µm; A’,A’’,B’ und B’’, 200µm. 

Das Ergebnis zeigt, dass sowohl die X-Gal gefärbten Schnitte, wie auch die Schnitte 

nach in situ Hybridisierung im „Cluster“ eine hohe Zahl markierter Zellen aufweisen 

(Abb.35 A’, B’ Asterisk). Im Gegensatz dazu waren in Bereichen außerhalb des 

„Clusters“ nur X-Gal gefärbte Zellen (Abb. 35 B’’, Pfeil), jedoch keine mit in situ 

Hybridisierungssignalen markierte Zellen (Abb. 35 A’’, Pfeilkopf) zu visualisieren. 

Damit zeigte der Versuch, dass Zellen außerhalb des „Clusters“ den Rezeptor 

OR37C auswählen, die Expression jedoch nicht zu detektierbaren mRNA- 

Konzentrationen führt. 

Der Befund, dass OR37C außerhalb des „Clusters“ exprimiert wird stellt die Frage, 

ob dieser Prozess zeitlebens erhalten bleibt. 

85

3.18 Ausprägung des „Clusters“ während der Entwicklung 

Ergebnisse 

Um diese Frage zu beantworten wurden Mäuse unterschiedlicher Altersstufen 

untersucht. Mäuse im Stadium P0 (Abbildung 36 A) wiesen ebenfalls LacZ positive 

Zellen außerhalb des Patches auf. In diesem Stadium war jedoch der Bereich 

geclustert exprimierter Zellen nicht aufgrund einer höheren Zelldichte zu erkennen. 

Die LacZ positiven Zellen waren gleichmäßig, mit Ausnahme eines Bereichs im 

dorsalen Epithel, verteilt. 

Abbildung 36: Transkription von OR37C während der postnatalen Entwicklung 

Whole mount Präparaten der medialen Endoturbinale nach X-Gal Färbung von OR37C-IRES-CRE X 

ROSA26-LacZ Mäusen. (A) Gleichförmige Verteilung der Zellen mit initialer Expression von OR37C 

in Mäusen im Stadium P0. Der „Patch“ ist mit einem Asterisk markiert. (B-D) Herausbildung des 

geclusterten Expressionsmuster neben ektopisch positionierten Zellen während der postnatalen 

Entwicklung. Die Expression von OR37C in Zellen außerhalb des „Clusters“ besteht ebenfalls in 

adulten Tieren. 

86

Ergebnisse 

Im Gegensatz dazu war in jungen Tieren (Stadium P20) neben den ektopisch 

positionierten Zellen wiederum der Bereich geclustert exprimierter Rezeptoren, 

aufgrund einer höheren Dichte der markierten Zellen, zu erkennen (Abb. 36 B). In 

adulten Tieren blieb das Verteilungsprinzip der Zellen erhalten (Abb. 36 D). Auch in 

diesen Stadien konnten, neben einer hohen Zahl LacZ positiver Zellen im „Cluster“, 

außerhalb dieser Region markierte Zellen detektiert werden. Dies bedeutet zum 

Einen, dass außerhalb des „Clusters“ einige Zellen zeitlebens die Möglichkeit zur 

Expression des OR37C-Gens besitzen. Zum Anderen zeigte das Ergebnis, dass sich 

in älteren Stadien das Gleichgewicht hinsichtlich der Verteilung LacZ positiver Zellen 

im Epithel in Richtung des „Clusters“ verschiebt. Mit anderen Worten: Das 

Expressionsmuster der geclusterten Rezeptoren bildet sich während der Entwicklung 

heraus. Um diese These zu überprüfen, wurden Tiere im Stadium P0, sowie adulte 

Tiere der Mauslinie OR37-Lacz untersucht (Abb. 37). In dieser Mauslinie wird das 

Markergen β-Galaktosidase direkt unter dem Promotor von OR37C exprimiert. 

Abbildung 37: Ektopische Expression von geclusterten Rezeptoren 

Whole mount Präparationen der medialen Endoturbinalen nach X-Gal Färbungen. Ektopische 

Positionierung geclustert exprimierter OdoratRezeptoren in jungen und adulten Tieren (Pfeil). (A) 

Heterozygore OR37C-LacZ Maus im Stadium P4. (B) Homozygote OR37B-LacZ Maus im adulten 

Stadium. 

In beiden Stadien konnten nach X-Gal Färbung ektopisch positionierte, OR37C 

exprimierende Zellen identifiziert werden. Während sich in adulten Stadien nur sehr 

wenige markierte Zellen außerhalb des „Clusters“ fanden, wurden in perinatalen 

Stadien gleich viele Zellen innerhalb und außerhalb des „Clusters“ nachgewiesen. 

Damit stützt das Ergebnis die These, dass die Expression geclusterter Rezeptoren 

zunächst im gesamten OE stattfindet, während der Entwicklung jedoch auf das 

„Cluster“ eingeschränkt wird. Der zugrundeliegende Mechanismus ist praktisch noch 

völlig unklar. Um erste Einblicke in die Regulation dieses Prozesses zu bekommen, 

87

Ergebnisse 

wurde die Projektion von OR37C exprimierender Zellen in Tieren der RF1 X 

ROSA26-YFP Mauslinie genauer untersucht. 

3.19 Ektopisch positionierte YFP + Zellen entwickeln sich zu reifen OSZ 

Die Projektion olfaktorischer Sinneszellen in Glomeruli des OB wird durch die 

Expression des Rezeptors bestimmt (Mombaerts et al., 1996; Feinstein & Mombaerts 

2004; Feinstein et al., 2004). Sinneszellen die den gleichen OR exprimieren, 

terminieren in einem von zwei Glomeruli. Ein Glomerulus ist auf der medialen Seite 

des Bulbus positioniert, während der andere spiegelbildlich dazu auf der lateralen 

Seite liegt. OSN, die ein Mitglied der Rezeptorfamilie OR37 exprimieren, stellen 

dabei eine Ausnahme dar (Strotmann et al., 2000). Zellen die mit einem dieser 

Rezeptor-Typen ausgestattet sind, projizieren in nur einem Glomerulus auf der 

ventralen Seite des Bulbus. Auf Querschnitten des olfaktorischen Bulbus von RF1 x 

ROSA26-YFP Mäusen konnten Glomeruli identifiziert werden, die sehr stark durch 

YFP + Fasern innerviert werden (Abb.38 A, A’). Die Positionierung der Glomeruli 

führte zu der Annahme, dass es sich bei diesen Zellen um OR37C exprimierende 

Zellen innerhalb des „Clusters“ handelt, die gemäß ihres Rezeptors in den Bulbus 

projizieren. 

88

Abbildung 38: Projektion OR37C exprimierender Zellen in den olfaktorischen Bulb 

Ergebnisse 

Projektion von OR37C expriierenden Zellen in den olfaktorischen Bulbus in einer RF1 X ROSA26- 

YFP Maus. (A) Querschnitt durch den bulfaktorischen Bulbus nach immunhistochemischer 

Verstärkung der YFP Fluoreszenz. Gegenfärbung mit TOTO-3. Maßstab 200 µm. Vergrößerte 

Darstellung des Umrahmten Bereichs in A’. Maßstab 50 µm. (B) Immunhistochemische 

Färbung von OMP (rot) und YFP (grün). Maßstab 20 µm. (D) Querschnitt durch den olfaktorischen 

Bulbus nach immunhistochemischer Verstärkung der YFP Fluoreszenz. Projektion einzelner YFP + 

Fasern in Glomeruli des medialen OB. Gegenfärbung mit TOTO-3. Maßstab 50µm. 

In einem weiteren Ansatz wurden die ektopisch positionierten YFP + Zellen 

charakterisiert. Der immunhistochemische Nachweis des olfaktorischen Marker 

Proteins (OMP), ein Markerprotein für reife chemosensorische Sinnesneurone 

(Farman & Margolis, 1980; Potter et al., 2001), in RF1 X ROSA26-YFP Mäusen 

resultierte in der Doppelfärbung YFP + Zellen (Abb 38, B) und OMP. Der Nachweis 

des OMP in ektopisch positionierten YFP + Zellen gibt einen Hinweis darauf, dass 

diese Zellen trotz Fehlexpression der Rezeptors OR37C ihre Entwicklung zu reifen 

Sinneszellen fortsetzen. Daraus ergibt sich die Frage, ob diese Zellen ebenfalls in 

den olfaktorischen Bulbus projizieren. In Querschnitten des olfaktorischen Bulbus von 

RF1x ROSA26-YFP Mäusen konnten in medialen und lateralen Glomeruli vereinzelte 

YFP + Axone visualisiert werden (Abb. 38 C). In Glomeruli der dorsalen Seite konnten 

hingegen keine Fasern nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, 

dass die OR37C exprimierenden Zellen außerhalb des „Clusters“ während der 

Entwicklung zu reifen Sinnesneuronen einen weiteren OR auswählen und diesem 

Rezeptor entsprechend in den OB projizieren. Damit deuten die Daten daraufhin, 

dass OR37C exprimierende Zellen außerhalb des „Clusters“ die Fehlexpression des 

Rezeptors erkennen, beenden und einen neuen Rezeptor zur Expression auswählen. 

3.20 Expression von OR37C in SO und VNO 

Der Befund, dass Zellen außerhalb des typischen „OR37 Clusters“ das Gen OR37 

zur Transkription auswählen wirft die Frage auf, ob dies auch in anderen 

chemosensorischen Systemen der Fall ist. 

In einem ersten experimentellen Ansatz wurde die Expression des OR37C Gens im 

Septalorgan untersucht. Chemosensorische Zellen des Septalorgans exprimieren ein 

kleines Repertoire olfaktorischer Rezeptoren (Kaluza et al., 2004; Tian & Ma, 2004), 

89

Ergebnisse 

wobei in früheren Studien jedoch keine Mitglieder der OR37 Familie dort 

nachgewiesen werden konnten (Kaluza et al., 2004; Tian & Ma, 2004). 

In RF1 X Rosa26-LacZ Tieren konnte durch X-Gal Färbungen von „whole mount“ 

Präparaten des nasalen Septums nur eine einzige Zelle im SO identifiziert werden 

die OR37C eingeschaltet hatte (n=2) (Abbildung 39 C’). Das Ergebnis zeigt, dass im 

SO die Expression des Gens möglich ist, sich jedoch nur in einer äußerst geringen 

Anzahl von Zellen ereignet. 

Abbildung 39: Initiale Expression von OR37C im SO 

Vereinzelte Expression von OR37C im Septalorgan. (A, B) Septum mit Septalorgan 

(SO) einer OMP-GFP Maus unter UV Beleuchtung (A) und unter Auflicht (B). (C) 

Septum mit SO einer RF1xRosa26-LacZ Maus nach x-Gal Färbung. Vergrößerte 

Darstellung des Septalorgans in C’. Eine LacZ + Zelle (Pfeil) konnte im SO visualisiert 

werden (n=2). 

Im Gegensatz dazu zeigte die Untersuchung der RF1 X Rosa26-LacZ Mauslinie 

überraschenderweise eine sehr hohe Anzahl markierter Zellen im VNO. 

Kontrollexperimente mit ROSA26-LacZ Mäusen zeigten keinerlei Färbung, womit sie 

belegen, dass es sich nicht um eine „leaky expression“ des Transgens in den Zellen 

des VNOs handelt. Damit inhibieren die STOP-Elemente ebenfalls in den Zellen des 

VNOs die Expression des Markers vollständig. Auch in transgenen Tieren, in denen 

90

Ergebnisse 

β-Galaktosidase unter der Kontrolle des OR37C Promotors exprimiert wird, führten 

X-Gal Färbungen zu keinen markierten Zellen. 

Abbildung 40: Initiale Expression von OR37C im VNO 

Whole mount Präparationen des VNO nach X-Gal Färbung zeigen eine initiale, aber 

keine Langzeit-Expression von OR37C. (A, B) VNOs einer RF1 X Rosa26-LacZ Maus 

im Stadium P20 (A) und einer adulten Maus (B). (C) Kontrolle der Expression vom 

Rosa26 Locus mit wildtypischem OR37C Gen. (D) VNO einer adulten OR37C-LacZ 

Maus. 

91

Ergebnisse 

Um die Frage zu beantworten, ob die hohe Anzahl OR37C exprimierender Zellen 

sich wie die Zahl OR exprimierender Zellen während der Entwicklung reduziert, 

wurde die Expression des Gens in adulten Mäusen untersucht. Das Experiment 

zeigte, dass nicht nur in jungen Mäusen, 3 Wochen nach der Geburt, sondern 

ebenfalls in adulten Mäusen sehr viele Zellen das Gen transkribieren. Eine 

Reduzierung der Anzahl war nicht zu erkennen. Dies bedeutet, dass im VNO 

zeitlebens Zellen bestehen, die den Rezeptor OR37C zur Transkription auswählen 

können. 

Querschnitte durch das VNO zeigten, dass die Cre-exprimierenden Zellen ebenfalls 

im sensorischen Epithel positioniert sind (Abbildung 41 A). Dies deutet darauf hin, 

dass es sich bei den OR37C exprimierenden Zellen um Neurone des VNO handelt. 

Die Verwendung der Mauslinie RF1 X ROSA26-YFP zeigte, dass die OR37C 

transkribierenden Zellen, wie auch mOR18-2 positive Zellen, ebenfalls 

morphologische Eigenschaften vomeronasaler Rezeptorneurone besitzen. Die Zellen 

entsenden sowohl einen axonalen sowie einen dendritischen Fortsatz an dem keine 

Cilien beobachtet werden konnten (Abb. 41 B). Damit ist OR37C ein Rezeptor, der 

wie andere ORs zur Transkription ausgewählt werden kann. Im Unterschied zu 

anderen Rezeptoren wird die Expression dieses Rezeptors jedoch in allen Zellen 

beendet. 

92

Abbildung 41: Expression von OR37C im VNO 

Ergebnisse 

Expression von OR37C im sensorischen Epithel des VNO. (A) Querschnitt durch das VNO nach 

X-Galfärbung. Maßstab 100µm. (B) Vergleich der Anzahl markierter Zellen in heterozygoten und 

homozygoten Mäusen. (C) Whole mount Fluoreszenzaufnahme einer heterozygoten RF1 Maus. 

(D) Whole mount Ffluoreszenzaufnahme einer homozygoten RF1 Maus. 

Die Untersuchungen der Expression des Rezeptors mOR18-2 im VNO zeigten, dass 

in homozygoten und heterozygoten transgenen Mäusen kein Unterschied in der Zahl 

markierter Zellen zu beobachten war. Dadurch stellte sich die Frage, ob dieses 

Phänomen ebenfalls in Tieren auftritt, deren Zellen nach der Expression von OR37C 

permanent markiert sind. In der Tat konnte auch in diesen Tieren kein Unterschied in 

der Anzahl markierter Zellen im VNO festgestellt werden. Dagegen zeigte die 

Visualisierung YFP markierter Zellen in „whole mount“ Präparaten des OE eine 

erhöhte Anzahl von Zellen in homozygoten RF1 X Rosa26-YFP Tieren. Durch diesen 

Versuch konnte jedoch nicht unterschieden werden, ob beide Allele des Gens 

ebenfalls gleichzeitig oder nacheinander eprimiert wurden. 

Frühere Arbeiten von Lévai (2004) zeigten, dass mOR18-2 exprimierende Zellen in 

den anterioren Teil des AOB projizieren (Abb. 42 A-D) Um die Frage zu beantworten, 

in welchen Bereich des AOB die YFP markierten Axone terminieren, wurden 

Querschnitte des Bulbus untersucht. Dabei wies der anteriore Teil des AOB 

gegenüber dem posterioren Teil eine deutliche Färbung auf. 

93

Abbildung 42: Projektion OR exprimierender Zellen im VNO 

Ergebnisse 

OR-exprimierende Zellen im VNO projizieren in den anterioren Teil des AOB. (A-D) Whole 

mount Präparat einer Mol2.3-IGITL Maus nach X-Gal Färbung. Axone von mOR18-2 

exprimierenden VSN projizieren entlang des Septums (B) über die mediale Seite des Bulbus 

(C) in den anterioren AOB (D). (E) Querschnitt durch das VNO einer RF1 X ROSA26-YFP 

Maus. YFP markierte Zelle im sensorischen Epithel des VNO mit Dendrit (Pfeil) und Axon 

(Pfeilspitze). Maßstab 20 µm (D) Querschnitt durch den AOB einer RF1 X ROSA26-YFP 

Die Ergebnisse zeigen, dass im VNO zeitlebens eine Gruppe von Zellen persistiert, 

die die Möglichkeit einer Expression von OR37C besitzt. Diese Zellen entwickeln sich 

ebenso wie andere Neurone des VNO zu reifen Sinnesneuronen, die in den 

anterioren Teil des AOB projizieren. 

94

Ergebnisse 

3.21 Identifizierung von Liganden für geclustert exprimierte Rezeptoren 

Die Rezeptoren der OR37 Familie besitzen neben dem strukturellen Merkmal 

ebenfalls die Besonderheit, dass sie ausschließlich im Genom der Säuger 

vorkommen (Hoppe et al., 2006a) und im Unterschied zu anderen 

Odorantrezeptoren, eine hohe Sequenzidentität in unterschiedlichen Spezies, vom 

Oppossum bis zum Menschen aufweisen (Strotmann et al., 1999; Hoppe et al., 2003; 

2006a). Diese spezielle Eigenschaft könnte ebenfalls auf eine besondere Rolle der 

Rezeptoren bei der Detektion von säugerrelevanten Duftstoffen hindeuten. 

3.21.1 Duftstoffe induzieren Depolarisationen des olfaktorischen Epithels 

Eine Möglichkeit, Liganden geclustert exprimierter Rezeptoren zu identifizieren, ist 

das Nutzen der räumlichen Verteilung der Rezeptoren im Epithel. Liganden dieser 

Rezeptoren müssten bevorzugt die Zellen innerhalb des „Clusters“ aktivieren. Eine 

Möglichkeit, die Reaktion des OEs auf Duftstoffe zu messen, ist die 

Oberflächenableitung des Summenpotentials (Elektroolfaktogramm, EOG) der 

epithelialen Zellen. Aufgrund der hohen Dichte OR37 exprimierender Zellen sollten 

entsprechende Liganden größere Depolarisationen im „Cluster“ als außerhalb 

auslösen. Um mögliche Liganden für Mitglieder der Rezeptorfamilie OR37 zu 

bestimmen, wurde die Methode zur Ableitung von Elektroolfaktogrammen etabliert. 

95

Abbildung 43: Duftstoffe induzieren Depolarisationen im Epithel 

Ergebnisse 

Ableitungen der Oberflächenspannung zeigen die Depolarisation des Epithels nach 

Applikation von Duftstoffen. (A) Stimulation des Epithels mit Benzaldehyd und Kontrolle 

ohne Duftstoff. Die Form der Reaktion wird bestimmt durch die Latenzzeit (1), die 

maximale Deploarisation (2); Die Zeit zum Erreichen der max. Depolarisation (3) und die 

zur Repolarisation benötigte Zeit (4). (B) Konzentrationsabhängigkeit der Reaktionen am 

Beispiel für Heptanal. 

Die Stimulation mit Duftstoffen resultierte in robusten Reaktionen des Epithels, 

während die Zugabe von reiner Pressluft nur geringste Schwankungen im 

Ruhesummenpotential auslöste (Abbildung 43 A). Die Messungen zeigten 

außerdem, dass die Amplitude der Reaktionen von der Konzentration des Duftstoffes 

abhing (Abbildung 43 B). Hohe Konzentrationen der Duftstoffe lösten größere 

Reaktionen aus. Diese Versuche belegten, dass die gemessenen Depolarisationen 

im OE eine Antwort auf die Duftstoffe und keine mechanischen Artefakte darstellten. 

96

Ergebnisse 

Eine Reaktion wird durch unterschiedliche Parameter definiert. Die Latenzzeit (1) 

beschreibt die Zeit, die nach der Applikation des Duftstoffes bis zur Reaktion des 

Epithels vergeht. Die maximale Depolarisation (2) beschreibt die Stärke der 

Reaktion. Die Zeit bis zum Erreichen der maximalen Depolarisation (3) nach dem 

Start der Reaktion gibt die Aktivierungsgeschwindigkeit wieder. Die Geschwindigkeit 

der Repolarisation des Gewebes wird durch die Zeit angegeben, die von der 

maximalen Depolarisation bis zum Wiedererreichen des halben Ruhepotentials 

vergeht (4). Zur Auswertung wurde die maximale Depolarisation der Reaktionen 

innerhalb und außerhalb des „Clusters“ bestimmt (Abbildung 44). 

Abbildung 44: Position der Messpunkte im Epithel 

Die Ableitungselektroden sind innerhalb bzw. außerhalb des Clusters, jedoch innerhalb der selben 

dorso-ventralen Zone positioniert. (A) Geclusterte Expression von OR37-Subtypen (B) Zonale 

Expression von des Rezeptors P2 (C) Position der Ableitungselektrode innerhalb des „Clusters“ in 

der Expressionszone des Rezeptors P2 (D) Position der Ableitungselektrode auußerhalb des 

„Clusters“, aber innerhalb der Expressionszone des Rezeptors P2. 

97

Ergebnisse 

Die Mittelwerte der Antworten auf jeden Duftstoff wurden auf den Mittelwert der 

ersten drei Stimulationen mit Benzaldehyd normalisiert. Die Normalisierung half 

technische Unterschiede, die durch das Platzieren der Kapillaren im Epithel 

auftraten, auszugleichen. 

Abbildung 45: Normierung der Reaktionen auf Benzaldehyd 

Die Normierung der Werte auf die ersten Reaktionen auf Benzaldehyd (Benzaldehyd=1) 

erlaubt den Vergleich der Reaktioen auf unterschiedliche Substanzen, in unterschiedlichen 

Regionen des Epithels sowie in unterschiedlichen Individuen. Die Duftstoffe induzieren 

über den gesamten Messzeitraum robuste Reaktionen. (A) Reaktionen der 

Kontrollsubstanzen während des Messzeitraums (n=3). (B) Strukturformeln der 

verwendeten Kontrollsubstanzen. Normierung der Reaktionen auf Benzaldehyd. 

Abweichung als Standardabweichung angegeben. 

Die Stimulationen mit den Kontrollsubstanzen Citral und Heptanal zeigten zum Einen, 

dass selbst nach einer Stunde das Epithel in der Lage war, robuste Antworten zu 

generieren. Zum Anderen wiesen die Substanzen beim Vergleich des „Clusters“ mit 

dem Turbinal III keine signifikanten Unterschiede auf, obwohl Heptanal zu etwas 

größeren Reaktionen im Patch tendierte. Damit zeigten die Kontrollversuche, dass 

mit Hilfe des experimentellen Aufbaus die Duftstoffantworten des Epithels zuverlässig 

über den Zeitraum der Versuchsreihen gemessen werden konnten. Weiterhin zeigte 

der Versuch, dass „klassische“ Duftstoffe keine signifikant unterschiedlichen 

Reaktionen in den Epithelabschnitten entlang der Expressionszonen der ORs 

auslösten. 

98

3.21.2 Verstärkte Stimulation des „Clusters“ durch Einstreu 

Ergebnisse 

Frühere Untersuchungen zeigten, dass Säuger Duftstoffe mit biologisch relevanten 

Funktionen über eine Reihe unterschiedlichster Mechanismen an die Umwelt 

abgeben. Quellen für solche Substanzen können z.B. Urin, Schweiß, Milchdrüsen 

oder auch Tränendrüsen sein (Novotny et al.,1985, Moss et al., 1997, Schäfer et al., 

2002, Coureaud et al., 2004, Lin da et al., 2005, Spehr et al., 2006). In einem ersten 

Ansatz wurden zwei Quellen solcher Duftstoffgemische überprüft, ob sie den Bereich 

geclusterter Rezeptoren verstärkt aktivieren. Als eine Quelle für „klassische“ 

Pheromone wurde frischer Urin von Mäusen verwendet. Als ein weiterer Träger von 

„funktionellen Duftstoffen“ wurde Einstreu von Nestmaterial männlicher Mäuse 

verwendet (Abbildung 46). 

Abbildung 46: Stimulation mit komplexen Duftstoffgemischen 

Reaktionen im „Cluster“ und im dritten Turbinal nach Stimulation mit Urin und 

Einstreu. Berechnung der Signifikanz durch den paired t-Test (p= 0,026). Alle 

Reaktionen wurden auf Benzaldehyd normiert. Abweichung als 

Standardabweichung angegeben. 

99

Ergebnisse 

Die Ergebnisse zeigten, dass die Reaktionen auf alle komplexen Stimuli wesentlich 

kleiner waren, als die Reaktion nach Applikation eines einzelnen Duftstoffes. Die 

Stimulation mit frischem Urin männlicher und weiblicher Mäuse resultierte in keiner 

verstärkten Reaktion des „Clusters“. Im Gegensatz dazu erzeugten die Stimulationen 

mit Nestbaumaterial verstärkte Reaktionen im Bereich geclustert exprimierter 

Rezeptoren in Epithelien weiblicher Tiere, jedoch nicht in Epithelien männlicher Tiere. 

Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass in der Tat eine oder mehrere Substanzen 

aus dem komplexen Körpergeruch von Mäusen, Liganden für geclustert exprimierte 

Rezeptoren darstellen könnten. Der Befund lieferte einen ersten Hinweis, dass 

möglicherweise tatsächlich eine Komponente mit biologischen Funktionen durch 

geclustert exprimierte Rezeptoren detektiert wird. Der Versuch gab jedoch keinen 

Hinweis darauf, um welche Substanz oder Substanzen es sich handeln könnte oder 

wie sie in das Nestbaumaterial gelangten. 

Eine mögliche Gruppe von Substanzen könnten „klassische“ Pheromone sein, die 

zwar durch Urin ausgeschieden werden, jedoch erst beim Trocknen des Urins von 

ihren Trägermolekülen, sog. MUPs (Major Urinary Proteins) freigegeben werden 

(Hurst et al., 1998, Armstrong et al., 2005). 

3.21.3 Verstärkte Stimulation des „Clusters“ durch 6-Hydroxy-6-methyl-3- 

Heptanon 

Pheromone wurden erstmals von Karlson et al. (1959) als Substanzen definiert, die 

von einem Individuum abgeben und von einem anderen Individuum derselben Art 

detektiert werden, in dem sie spezifische Reaktionen hervorrufen (Baxi et al., 2005). 

In einem weiteren Ansatz wurde mit einigen Pheromonen und dazu verwandten 

Substanzen gezielt untersucht, ob eine dieser biologisch aktiven Substanzen den 

Epithelbereich mit geclustert exprimierten Rezeptoren verstärkt stimuliert. 

Endo-Brevicomin und Exo-Brevicomin wurden von Dr. Till Tolasch (Institut für 

Zoologie, Universität Hohenheim), 2,3-Dehydro-Exo-Brevicomin, 6-Hydroxy-6- 

methyl-3-Heptanon und α-Farnesen von Prof. Peter Overath (Max-Planck-Institut für 

Biologie, Tübingen) zur Verfügung gestellt. 

100

Abbildung 47: Struktur und voraussichtliche Funktion der verwendeten Pheromone. 

Ergebnisse 

Die Ableitungen zeigten, dass alle getesteten Pheromone im OE Reaktionen 

auslösten und somit über die Nase detektiert werden können (Abbildung 48). Jedoch 

lösten die Stimulationen mit den meisten Substanzen keine verstärkten Reaktionen 

des OE im Bereich geclustert exprimierter Rezeptoren auf. Die detaillierte Analyse 

zeigte, dass die Reaktionen innerhalb des „Clusters“ sogar kleiner waren. Eine 

Ausnahme stellt jedoch das Pheromon der Maus 6-Hydroxy-6-methyl-3-Heptanon 

dar. Nach Applikation dieses Pheromons ist die Depolarisation des „Clusters“ 

tendenziell größer als in der Vergleichsregion des dritten Turbinals (P=0,046). 

101

Abbildung 48: Stimulation mit Pheromonen 

Ergebnisse 

(A,B) Alle Reaktionen wurden auf Benzaldehyd normiert. Abweichung als Standardabweichung 

angegeben (6-Hydroxy-6-methyl-3-heptanon, P=0,046). 

Das Ergebnis zeigte, dass die hier getesteten Pheromone nicht grundsätzlich durch 

geclustert exprimierte Rezeptoren detektiert werden. Demnach ist das „Cluster“ kein 

Epithelbereich, der generell der Detektion von Pheromonen dient. Das abweichende 

Ergebnis für 6-Hydoxy-6-methyl-3-Heptanon ist möglicherweise ein Indiz für die 

Detektion der Substanz im „Cluster“. Um die Vermutung zu erhärten müssten weitere 

Untersuchungen auf zellulärer Ebene, z.B. durch Ca + -Imaging durchgeführt werden. 

102

Ergebnisse 

3.21.4 Stimulation mit „nicht Pheromonen“ aus Urin bzw. dem Körpergeruch. 

Pheromone, Substanzen zur chemischen Kommunikation innerhalb einer Art, stellen 

nicht die einzige Gruppe von Schlüsselkomponenten die der Kommunikation 

zwischen Organismen dienen. Eine weitere Gruppe sind „Semiochemicals“, 

Ektohormone, die allgemein zum Signalaustausch zwischen Organismen genutzt 

werden. Eine Funktion von Ektohormonen ist z.B. das Erkennen und Unterscheiden 

von Individuen. Die dafür verwendeten Substanzen stammen aus Urin und sind im 

Körpergeruch enthalten (Singer et al. 1997, Spehr et al, 2006). Ob dies jedoch durch 

eine bestimmte Gruppe von Substanzen geschieht und welche dies sein könnten, ist 

bislang unklar (Singer et al., 1997, Röck et al., 2006). Die detaillierte 

Zusammensetzung von Urin oder des Körpergeruchs ist bislang ebenfalls unbekannt. 

In vorhergehenden Studien wurden jedoch durch gaschromatographische Analysen 

einige volatile Komponenten von Urin und Körpergeruch von Mäusen bestimmt 

(Singer et al, 1997 und Röck et al., 2006). Aus der Studie von Röck et al. (2006) 

wurden einzelne Komponenten zur weiteren Analyse zur Verfügung gestellt. 

103

Abbildung 49: Stimulation mit Komponenten des Körpergeruchs 

Alle Reaktionen wurden auf Benzaldehyd normiert. Abweichungen sind als 

Standardabweichung angegeben. Die Duftstoffe wurden von Prof. em. Overath zur 

Verfügung gestellt. 

Ergebnisse 

Die Untersuchung von 18 Substanzen zeigte, dass alle Komponenten Reaktionen im 

OE von Mäusen auslösen. Keine der hier untersuchten Substanzen zeigte jedoch 

das Potential das „Cluster“ stärker zu aktivieren als die Vergleichsregion auf dem 

dritten Endoturbinal. Damit gaben die Versuche keinen Hinweis darauf, dass eine der 

getesteten Substanzen ein Mitglied der Rezeptorfamilie OR37 aktiviert. 

3.21.5 Verstärkte Stimulation des „Clusters“ durch Eukalyptol 

Eine weitere Strategie um Liganden geclusterter Rezeptoren zu identifizieren ist die 

Analyse von duftstoffinduzierten Aktivitätsmustern in ventralen Teil des Bulbus, dem 

Projektionsgebiet der OR37-Subtypen (Strotmann et al., 1999). Eine frühere Analyse 

von Ho et al. (2006) zeigte, dass durch Pentadekan, einem langkettigen 

Kohlenwasserstoff, speziell Glomeruli im ventralen Bereich des Bulbus aktiviert 

werden. Auch von cyclischen Monoterpenen war bekannt, dass sie ein solches 

Aktivitätsmuster im Bulbus induzieren (persönliche Korrespondenz mit M. Leon und 

B. Johnston, University of California, USA). Daher wurde in einem weiteren Ansatz 

104

Ergebnisse 

das Epithel mit Pentadekan und einer Reihe unterschiedlicher mono-, bicyclischer 

sowie acyclischer Terpene stimuliert. 

Abbildung 50 : Strukturformeln der verwendeten Duftstoffe 

Für Pentadekan konnten keine stärkeren Reaktionen innerhalb des „Clusters“ 

registriert werden. Ebenso lösten auch die meisten anderen Substanzen, außer 

Eukalyptol, vergleichbare Reaktionen innerhalb und außerhalb des „Clusters“ aus. 

Dabei lösten fast alle Substanzen außerhalb des „Clusters“ etwas stärkere 

Reaktionen aus. Die einzigen Ausnahmen dazu stellten Heptanal und Eukalyptol dar 

wobei jedoch ausschließlich die durch Eukalyptol ausgelösten Reaktionen einen 

signifikanten Unterschied aufwiesen (paired T-Test; p=0,0082). Dies deutet darauf 

hin, dass Eukalyptol tatsächlich ein Ligand für einen geclustert exprimierten Rezeptor 

darstellen könnte. 

105

Abbildung 51: Stimulation mit Pentadekan und Terpenen 

3.21.6 Gleiche Dosis-/Wirkungskurven für Eukalyptol und Heptanal in und 

außerhalb des „Clusters“ 

Ergebnisse 

Vergleich der normierten Reaktionen nach der Stimulation mit Terpenen Pentadekan innerhalb 

des „Clusters“ und im medialen Bereich des Endoturbinals III. Berechnung der Signifikanz durch 

den paired t-Test (P=0,0082). Alle Reaktionen wurden auf Benzaldehyd normiert. Die Abweichung 

ist als Standardabweichung angegeben. 

Odorantrezeptoren besitzen ein breit gefächertes Spektrum an Liganden (Malnic et 

al., 1999). Dabei ist die Aktivierung des Rezeptors abhängig von der Konzentration 

des Liganden. Je spezifischer ein Rezeptor auf einen Duftstoff reagiert, desto 

niedrigere Konzentrationen des Duftstoffes reichen aus, um den Rezeptor zu 

aktivieren (Krautwurst et al., 1998). Das Ergebnis, dass das OE im „Cluster“ verstärkt 

auf Eukalyptol reagiert wirft die Frage auf, ob dieser Epithelbereich ebenfalls 

sensitiver auf die Applikation von Eukalyptol reagiert. Diese Frage sollte mit Hilfe von 

Dosis-/Wirkungskurven für Eukalyptol und Heptanal beantwortet werden. 

106

Abbildung 52: Dosiswirkungskurven für Eukalyptol und Heptanal 

Ergebnisse 

Die Reaktionen des Epithels folgt nach der Stimulation mit Heptanal (schwarz) in beiden Regionen 

des Epithels einem sigmoidalen Dosis/Wirkungsverlauf. Die Reaktionen für Eukalyptol (grau) 

gehen in keine Sättigung. Beide Epithelbereiche besitzen für beide Substanzen die gleiche 

Sensitivität. Alle Reaktionen wurden auf Benzaldehyd normiert. Abweichungen als 

Standardabweichung angegeben. Heptanal, n=3; Eukalyptol, n=8. 

Bei der Stimulation mit niedrigen Konzentrationen von Eukalyptol zeigte das „Cluster“ 

keine höheren Reaktionen als die Kontrollregion des dritten Endoturbinals. Dieses 

Ergebnis bedeutet , dass der Epithelberich mit geclustert exprimierten Rezeptoren 

nicht sensitiver auf Eukalyptol reagiert. Das gleiche Ergebnis gilt für die Detektion 

von Heptanal. In beiden Regionen des Epithels wurde für Heptanal die gleiche 

Nachweisgrenze ermittelt. Beide Substanzen unterscheiden sich jedoch in der Form 

des jeweiligen Kurvenverlaufs. Während für Heptanal ein klassischer, sigmoidaler 

Kurvenverlauf bestimmt wurde, zeigen die Stimulationen mit Eukalyptol ein weiteres 

Ansteigen der Reaktion nach Applikation von unverdünntem Eukalyptol. 

107

IV Diskussion 

Diskussion 

Das Vomeronasalorgan (VNO) gilt als hochspezialisierter Sensor für die Detektion 

von chemischen Komponenten, die der innerartlichen Kommunikation dienen, 

sogenannten Pheromonen (Wysocki et al., 1973; Beauchamp et al., 1982; Wekesa & 

Anholdt. 1997; Buck et al., 2000; Halpern & Martinez-Marcos, 2003). Frühere Studien 

führten zur Entdeckung zweier Familien von G-Protein gekoppelten Rezeptoren 

(GPCR) in diesem Organ, den V1- und V2-Rezeptoren (V1R bzw. V2R) (Dulac & 

Axel, 1995; Matsunami & Buck, 1997; Herrada et al., 1997; Ryba et al., 1997) und zu 

dem Konzept, dass diese Rezeptoren für die Detektion von Pheromonen 

verantwortlich sind (Dulac & Axel, 1995). Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen 

Daten haben nun gezeigt, dass auch aus dem Repertoire der mehr als tausend 

Gene, die für Odorant-Rezeptoren (OR) kodieren und typischerweise in Sinneszellen 

des olfaktorischen Epithels exprimiert werden, distinkte Mitglieder auch im VNO 

exprimiert werden. Damit konnten frühere Beobachtungen (Royal & Key, 1999; 

Zhang et al., 2004; Levai, 2004) bestätigt und erweitert werden. Die in dieser Arbeit 

erstmals durchgeführte vergleichende Analyse mittels RT-PCR Studien und gezielter 

in situ Hybridisierung hat ergeben, dass in allen Individuen das gleiche Set an Genen 

zur Expression kommt; die Auswahl dieser Gene erfolgt also offenbar ganz gezielt, 

und nicht nach einem stochastischen Prinzip. Kürzlich publizierte Studien gelangten 

zu einem vergleichbaren Ergebnis für das Septalorgan (SO), einem vom 

olfaktorischen Epithel separierten chemosensorischen Epithel am nasalen Septum 

(Kaluza et al., 2004; Tian & Ma, 2004); hier wurden ebenfalls etwa 50 ORs 

nachgewiesen, die teilweise mit dem Repertoire im VNO überlappen. Die im VNO 

exprimierten OR-Gene kodieren sehr unterschiedliche Rezeptoren-Subtypen der 

Rezeptorsuperfamilie (Zhang und Firestein, 2002; Zhang et al., 2004); dies könnte 

darauf hindeuten, dass ein Spektrum von strukturell sehr verschiedenartigen 

Liganden mit Hilfe dieser ektopisch exprimierten OR-Rezeptoren vom VNO erfaßt 

werden können (Vaidehi et al., 2002). Diese These wird noch dadurch unterstützt, 

dass im olfaktorischen Epithel die entsprechenden OR Gene in unterschiedlichen 

Zonen exprimiert werden (Vassar et al., 1993; Ressler et al., 1993; Miyamichi et al., 

2005); jüngste Arbeiten weisen darauf hin, dass entlang der dorso-ventralen Achse 

des Epithels z.B. Duftstoffe mit unterschiedlicher Hydrophobizität registriert werden 

(Scott & Brierley, 1999; Scott et al., 2000; Schönfeld & Cleland, 2005, 2006; Scott, 

108

Diskussion 

2005). Die vergleichenden Analysen der im VNO exprimierten OR Gene haben 

gezeigt, dass aus einigen Genfamilien nicht nur ein Mitglied, sondern eine kleine 

Gruppe verwandter Gene mit hoher Sequenzhomologie zur Expression kommt. Es 

wird davon ausgegangen, dass solche Rezeptor-Gruppen ein ähnliches 

Ligandenspekrum besitzen und eine feine Diskriminierung strukturell ähnlicher 

Duftmoleküle erlauben (Krautwurst et al., 1999; Malnic et al., 1999; Araneda et al., 

2000; Araneda et al. 2004; Olender et al., 2004). 

Insgesamt könnte die Expression von distinkten OR-Subtypen Genen im VNO die 

molekulare Grundlage für die Beobachtungen darstellen, dass chemische 

Komponenten, die als klassische Duftstoffe gelten und vom MOE registriert werden, 

auch vom VNO detektiert werden können (Sam et al., 2001; Trinh & Storm, 2003; 

2004). Bislang wurde spekuliert, dass die Rezeptoren der V1R- oder V2R- Familien 

des VNOs auch diese Duftmoleküle detektieren können (Trinh & Storm, 2003; Baxi et 

al., 2005). Dies steht jedoch nicht im Einklang mit Befunden, nach denen typische 

VNO-Neurone in der Regel ein sehr enges Ligandenspektrum aufweisen (Leinders- 

Zufall et al., 2000), duftstoff-sensitive Zellen im VNO jedoch ein breites 

Ligandenspektrum besitzen (Sam et al., 2001). Ein solch breites Ligandenspektrum 

ist dagegen ein Charakteristikum aller bislang analysierten ORs (Krautwurst et al., 

1999; Bozza et al., 2002; Araneda et al., 2000, 2004). 

Unklar ist bislang, auf welche Art und Weise die ORs in den Zellen des VNO die 

Transduktion des Signals in der Zelle induzieren. Die für olfaktorische Sinneszellen 

typischen Komponenten der Signaltransduktionskaskade, wie die G-Protein 

Untereinheit Gαolf, der Adenylatcyclase Subtyp III (ACIII) und der cyclisch-Nukleotid- 

gesteuerte Ionenkanal (CNGA2) sind in sensorischen Zellen des VNOs nicht 

nachzuweisen (Berghardt et al.,1996). Es wäre allerdings denkbar, dass die ORs in 

den Zellen des VNOs an andere G-Protein Subtypen als an Gαolf koppeln. Jüngste 

Studien haben gezeigt, dass ORs in der Tat auch Gαs aktivieren können (Imai et al., 

2006), dessen Expression ist im VNO allerdings nicht nachgewiesen. Weitere 

Kandidaten für die Initiierung der Transduktionskakade sind die G-Protein Isoformen 

Gαq bzw. Gα11, deren Expression im VNO kürzlich nachgewiesen werden konnte, und 

an das ORs ebenfalls koppeln können (Wekesa et al., 2003; Liu et al., 2006). 

Vor Kurzem wurde gezeigt, dass VNO-Neurone, die ORs exprimieren nicht wie 

erwartet rezeptorspezifisch in den olfaktorischen Bulbus projizieren, sondern in den 

accessorischen Teil des Bulbus (AOB) (Levai, 2004; Breer et al., 2006), wo sie 

109

Diskussion 

glomeruläre Strukturen in der anterioren Region bilden. Diese Beobachtungen 

wurden dahingehend diskutiert, dass neben dem olfaktorischen Rezeptortyp weitere 

molekulare Determinanten entscheidend an der Wegfindung des Axons mitwirken 

(Levai et al. 2006); dies gilt auch für die Projektion olfaktorischer Sinneszellen des 

MOEs (Feinstein et al., 2004; Feinstein & Mombaerts, 2004). Die in dieser Arbeit 

vorgestellten Daten zeigen nun erstmals ein Beispiel für die Co-expression von 2 

unterschiedlichen Rezeptortypen; es zeigte sich, dass die mOR18-2 exprimierenden 

Zellen zusätzlich einen V1R-Rezeptor exprimieren; in allen Zellen jeweils ein und 

denselben V1R-Rezeptor. Dies deutet auf eine strikte Kopplung der Expression von 

zwei unterschiedlichen Rezeptortypen in distinkten VNO Neuronen hin. Eine Co- 

expression von zwei Rezeptortypen in VNO-Neuronen wurde auch für die V2R- 

Familie gezeigt (Martini et al., 2001). Basierend auf dieser Beobachtung erscheint es 

möglich, dass für die Wegfindung des Axons der V1R verantwortlich ist und die 

Axone entsprechend in den AOB projizieren. Frühere Studien haben gezeigt, dass 

V1Rs diese Rolle wahrnehmen können (Rodriguez et al., 1999; Belluscio et al., 

1999). Die These, dass im VNO die ORs nicht an der „Verdrahtung“ der Axone mit 

dem Bulbus beteiligt sind, könnte durch den Befund unterstützt werden, dass im VNO 

die OR-Gene offenbar nicht monoallelisch exprimiert werden. Ähnliche Ergebnisse 

wurden zuvor in einem „Swap“-Experiment beschrieben, in dem die kodierende 

Sequenz eines V1R-Genes durch den Odorantrezeptor M71 ersetzt wurde 

(Rodriguez et al., 1999). Dieser Expressionsmodus, bei dem entweder das maternale 

oder das paternale Allel eines OR-Gens in einer Sinneszelle eingeschaltet wird 

(Chess et al., 1994), scheint für die präzise Verdrahtung der olfaktorischen 

Sinneszellen von entscheidender Bedeutung zu sein (Mombaerts, 2006), da nur so 

gewährleistet wird, dass trotz des ausgeprägten Polymorphismus von OR-Genen 

eine Zellpopulation nur einen einzigen Rezeptortyp aufweist. In der Tat konnte 

kürzlich gezeigt werden, dass schon geringfügige Unterschiede in der 

Aminosäuresequenz zu einer Veränderung in der Projektion der entsprechenden 

Sinneszellen führen können (Feinstein & Mombaerts, 2004). Die Steuerung der 

Projektion durch einen co-exprimierten V1-Rezeptor könnte eine strikte 

monoallelische Expression des ORs in vomeronasalen Sinneszellen überflüssig 

machen. 

Insgesamt zeigen die Befunde zur Expression von OR Genen im VNO, dass distinkte 

OR-Subtypen im chemosensorischen System offenbar eine besondere Stellung 

110

Diskussion 

einnehmen, die vermuten lässt, dass ihnen eine spezielle funktionelle Rolle 

zukommt. Eine seit geraumer Zeit bekannte und bereits intensiv studierte Gruppe 

von olfaktorischen Rezeptoren mit besonderen Eigenschaften stellt die OR37 

Subfamilie dar. Diese bei der Maus 12 Gene umfassende Subfamilie zeichnet sich 

durch eine um 6 Aminosäuren verlängerte dritte extrazelluläre Domäne aus und 

unterscheidet sich so strukturell von allen anderen ORs (Strotmann et al., 1999; 

Hoppe et al., 2003). Gene der OR37-Familie werden nur von Zellen exprimiert, die im 

zentralen Bereich des OE geclustert positioniert sind. Die Studien zur Ausprägung 

des besonderen topographischen Expressionsmusters der OR37 Gene haben 

gezeigt, dass diese nicht völlig gleichmäßig im Epithel verteilt sind, sondern ein für 

jeden Rezeptortyp typisches Subkompartiment einnehmen. Damit scheint für die 

Sinneszellen innerhalb des kleinen Epithelareals ein vergleichbares räumliches 

Ordnungsprinzip zu gelten, wie es für die zonal organisierten Sinneszellen kürzlich 

beschrieben worden ist (Miyamichi et al., 2005). Entgegen der früheren 

Beschreibung, nach der Gruppen von Sinneszellen mit distinkten Rezeptoren in 

definierten Zonen des Epithels lokalisiert sein sollten (Ressler et al., 1993; Vassar et 

al. 1993), sprechen neueste Erkenntnisse für individuell ausgeprägte rezeptor- 

spezifische Verteilungsmuster (Miyamichi et al., 2005). Dieses Prinzip gilt nach den 

hier ermittelten Daten auch für die Gene der geclustert arrangierten OR37 

exprimierenden Subpopulationen. Dabei ist bemerkenswert, dass die relative 

Positionierung der Zellpopulationen mit definierten OR37 Subtypen in 

unterschiedlichen Individuen konserviert ist, da im Gegensatz dazu diese relative 

Positionierung der Rezeptorzellpopulationen auf Ebene der Glomeruli im 

olfaktorischen Bulbus nicht erhalten bleibt, wie es einer „zone-to-zone-Projektion“ 

entsprechen würde (Mori et al., 1999; Mombaerts, 2001). Die Glomeruli, die von den 

verschiedenen OR37 Subpopulatonen gebildet werden zeichnen sich durch eine 

ausgeprägte Variabilität in ihrer relativen Positionierung aus (Strotmann et al., 2000). 

Die molekularen Mechanismen, die den rezeptor-spezifischen topographischen 

Verteilungsmustern von OSZs im OE zugrunde liegen führen, sind noch weitgehend 

unbekannt. Als eines der Prinzipien wird eine entsprechende topographisch 

organisierte Expression von distinkten Transkriptionsfaktoren (TF) diskutiert, die 

adäquate Gene in definierten Epithelabschnitten aktivieren. Die Identifizierung von 

TFs, für die Gradienten im olfaktorischen Epithel nachgewiesen wurden (Norlin et al., 

2001; Tietjen et al., 2005) scheint diese These zu unterstützen; ebenso die Befunde, 

111

Diskussion 

nach denen OR Gene mit gleichartigem Expressionsmuster konservierte DNA- 

Elemente in der Promotoren-Sequenz aufweisen (Hoppe et al., 2006b; Michaloski et 

al., 2006). Die Untersuchungen an der Mauslinie, bei der die Inition der Transkription 

des OR37C-Genes zu einer permanenten Markierung der Zellen führt, sprechen für 

ein anderes Prinzip. Die Beobachtung, dass außerhalb des typischen OR37 Clusters 

eine große Zahl von Zellen dieses Gen vorübergehend aktiviert hatte spricht dafür, 

dass es zu einer selektiven topographischen Inaktivierung des 

Transkriptionsprozesses kommt und dass nur im zentralen Areal die Expression 

persistiert. Transient transkribierende Zellen waren relativ weit verstreut im Epithel 

aber nicht im Bereich der dorsalen Zone (Tsuboi et al., 2006). Diese Beobachtung 

spricht gegen die Annahme, dass es sich bei der „transienten“ Transkription um eine 

„leaky expression“ des Genortes handelt, wie es für Gene mit einem starken 

Promotor denkbar wäre (Serizawa et al., 2003); solch ein unspezifischer Effekt sollte 

für alle Sinneszellen gleichermaßen gelten. 

Der Nachweis einer Aktivierung des OR37-Genes in Zellen außerhalb des Clusters, 

in denen jedoch keine entsprechende mRNA nachweisbar war spricht für die These, 

dass in diesen Zellen das Gen nur kurzfristig aktiviert war. Das Phänomen einer 

Inaktivierung von bereits aktivierten OR-Genen wurde erst kürzlich für andere, zonal 

exprimierte OR-Gene beschrieben (Shykind et al., 2004). Dabei wurde in 

individuellen Zellen sowohl ein Wechsel des exprimierten Allels (Shykind et al., 2004, 

2005), als auch ein Wechsel zu einem anderen OR-Gen beobachtet (Shykind et al., 

2004). In diesen Studien wurde allerdings ausschließlich ein Wechsel zu einem OR 

mit vergleichbaren Expressionsmustern beobachtet. Es wird davon ausgegangen, 

dass jeweils ein Set von Genen für die Expression in einer spezifischen Zone prä- 

selektiert wird. Diese Auswahl von Genen könnte z.B. durch Umstrukturierungen des 

Chromatins (Serizawa et al., 2003) oder durch die Existenz von proximal gelegenen 

regulatorischen Sequenzen (Tietjen et al., 2005; Tsuboi et al., 2006) realisiert 

werden. Aus diesem prä-selektierten Pool wird in einem zweiten Schritt stochastisch 

ein Gen zur Expression ausgewählt (Lomvardas et al., 2006). 

Das Prinzip eines Wechsels des OR Gens das in individuellen Sinneszellen 

exprimiert wird, gilt als entscheidend für die Ausstattung der Zellen mit einem 

funktionellen Rezeptor (Shikind et al., 2004), da bei der Maus etwa 10% des OR 

Genrepertoires aus sogen. Pseudogenen besteht, die für nichtfunktionelle Proteine 

kodieren. OSZs besitzen nach neuesten Erkenntnissen offenbar einen 

112

Diskussion 

Rückkopplungsmechanismus, der erkennt, ob ein nichtfunktioneller Rezeptor 

generiert wird (Shykind et al., 2004; Imai et al., 2006); in diesen Fällen erfolgt die 

Auswahl eines anderen OR-Gens. Auf diese Weise kann offenbar sichergestellt 

werden, dass alle Sinneszellen funktionsfähige Rezeptorproteine aufweisen. 

Unsere Ergebnisse bezüglich der Expression eines OR37 Gens dokumentieren, dass 

außerhalb des typischen zentralen Zellclusters keine Zelle nachweisbare Mengen an 

spezifischer OR mRNA besitzt; diese Zellen sind trotzdem überlebensfähig und 

entsenden ihre Axone in Glomeruli des Bulbus. Dies legt den Schluss nahe, dass die 

Zellen das ursprünglich ausgewählte OR37 Gen inaktiviert haben und statt dessen 

ein anderes OR-Gen exprimieren. Die Projektion der Axone in mediale und laterale 

Bereiche des Bulbus deutet darauf hin, dass es sich um Rezeptoren handelt, die in 

den entsprechenden zonalen Abschnitten des Epithels typischerweise exprimiert 

wurden. Damit scheint für die Regulation der topographischen Expressionsmuster 

von OR37-Genen ein spezieller Kontrollmechanismus verantwortlich zu sein. 

Insgesamt spricht die initiale, weiträumige Verteilung von Zellen, die OR37 Gene 

exprimieren gegen die Theorie einer lokalen Ausprägung von entscheidenden 

Faktoren. Vielmehr scheint ein sekundär aktiver Mechanismus verwirklicht zu sein, 

der die Expression außerhalb des Gebietes wieder unterdrückt. 

Diese Entdeckung, dass die Organistion der OR37 exprimierenden Sinneszellen in 

einem zentralen Zellcluster erst im Verlauf der ontogenetischen Entwicklung aus 

einem zunächst zonalen Muster entsteht, könnte ein Hinweis darauf sein, dass sich 

die OR37 Genfamilie während der Evolution aus OR Genen entwickelt hat, die ein 

solches zonales Expressionsmuster aufwiesen. Studien zur phylogenetischen 

Entwicklung der OR37 Genfamilie haben gezeigt, dass sie während des Übergangs 

der ursprünglichsten, noch eierlegenden Säugetiere (Monotremata) zu den 

Beuteltieren (Marsupialia) entstanden sind (Hoppe et al., 2006a). Detaillierte 

Analysen des Ursprungsgens und dessen Expressionsmuster könnten 

weitergehende Einblicke in die speziellen Kontrollmechanismen geben, die der 

speziellen Topographie von Sinneszellen mit distinktenRezeptoren zugrunde liegen. 

Die einzigartigen strukturellen Eigenschaften der OR37 Rezeptoren und die 

Tatsache, dass diese Genfamilie exklusiv in Säugerspezies existiert (Strotmann et 

al., 1999; Hoppe et al., 2003; Hoppe et al., 2006a), haben zu der Annahme geführt, 

dass es sich bei den Liganden für diese Rezeptoren möglicherweise um für Säuger 

besonders relevante chemische Komponenten handelt. Die im Rahmen dieser Arbeit 

113

Diskussion 

durchgeführte Ansätze zur Identifizierung von aktivierenden Substanzen haben 

gezeigt, dass Verbindungen aus dem Lebensraum von Mäusen in Betracht kommen. 

Die Beobachtung, dass der ‘head-space‘, d.h. die flüchtige Phase von der Einstreu 

des Käfigs, Substanzen enthält, die eine relativ starke elektrische Antwort auf der 

zentralen Turbinale auslöst, unterstreicht diese These. Erste Analysen von 

Einzelkomponenten, die durch Fraktionierung aus dem komplexen Gemisch isoliert 

wurden (Overath), führte zur Identifizierung von einer Komponente dieses 

Gemisches (6-Hydroxy-6-methyl-3-heptanon). Dabei handelt es sich um eine 

Verbindung, die als Pheromon der Maus angesehen wird (Novotny et al., 1999; 

Leinders-Zufall et al., 2000; Restrepo et al., 2004). 

Ein weiterer Duftstoff, der ebenfalls eine besonders ausgeprägte Reaktion im „OR37 

Areal“ auslöste war das Eukalyptol. Damit wurden frühere Studien bestätigt, die 

ebenfalls eine besonders starke Reaktion eines zentralen Turbinalabschnitts auf 

diese Substanz beschrieben hatten (Scott & Brierley, 1999). Eukalyptol wurde 

bislang zwar nicht als ein Bestandteil der komplexen Duftstoff-Mischung aus 

Käfigeinstreu identifiziert (pers. Mitteilung, Prof. Overrath), es ist aber denkbar, dass 

eine dem Eukalyptol strukturell verwandte Substanz aus dem Duftgemisch als 

relevanter Ligand für OR37 Rezeptoren fungiert. In diesem Zusammenhang ist von 

besonderem Interesse, dass Pheromone der Maus wie z.B. das Brevicomin, 

strukturelle Gemeinsamkeiten mit dem Eukalyptol aufweisen. 

Insgesamt unterstützen die Befunde dieser Arbeit die These, dass VNO und 

olfaktorisches Epithel zwar strukturell separierte chemosensorische Systeme 

darstellen, funktionell jedoch offenbar eine deutliche Überlappung zwischen beiden 

existiert (Baxi et al., 2005; Xu et al., 2005; Lin da et al., 2005; Shepard 2006). Auf der 

einen Seite könnte die Expression von distinkten ORs im VNO es ermöglichen, dass 

flüchtige Substanzen, die einerseits Duftstoffe für das hauptolfaktorische System 

darstellen, durch die Wirkung im Vomeronasalorgan zusätzlich als „Pheromone“ 

fungieren. Dieses duale Prinzip der Prozessierung von chemosensorisch erfassten 

chemischen Verbindungen sollte dazu beitragen, dass die Säuger spezifisch auf 

biologisch relevante Duftstoffe sehr spezifisch reagieren (Pankewich et al., 2004; Lin 

da et al., 2005; Boehm et al., 2005; Stowers & Marton, 2005; Fitchett et al., 2006). 

114

V Zusammenfassung 

Zusammenfassung 

In der vorliegenden Arbeit wurden olfaktorische Rezeptoren (OR) untersucht, die sich 

durch besondere Expressionsmuster in chemosensorischen Subsystemen 

auszeichnen. Es hat sich gezeigt, dass von den mehr als tausend OR Genen eine 

kleine Gruppe (etwa 50) nicht nur im olfaktorischen Epithel exprimiert wird, sondern 

auch im Vomeronasalorgan (VNO), das generell durch die Expression der 

Vomeronasal-Rezeptoren V1R und V2R charakterisiert. Die „ektopisch“ im VNO 

exprimierten OR Gene repräsentieren unterschiedliche Rezeptor-Familien und 

umfassen Gene aus unterschiedlichen Genclustern, die auf verschiedenen 

Chromosomen lokalisiert sind. Allerdings wurde in allen untersuchten Individuen 

offenbar das gleiche „Set“ an Genen exprimiert. Die Mehrzahl der OR Gene wurde in 

relativ wenigen VNO Neuronen exprimiert, einige wenige Gene jedoch jeweils in 

mehr als 100 Zellen. Dabei wurde ein distinktes OR Gen (mOR261-6) im VNO 

weiblicher Tiere in deutlich mehr Zellen exprimiert als in dem männlicher Tiere. Die 

höchste Anzahl OR exprimierender VNO Neuronen war in einer kurzen postnatalen, 

präpubertären Phase zu beobachten. Für VNO Neurone, die den Rezeptor mOR18-2 

exprimieren, konnte gezeigt werden, dass sie gleichzeitig ein V1R-Gen co- 

exprimieren. Für das OR Gen mOR18-2 wurde im Gegensatz zur typischen mono- 

allelischen Expression in den Sinneszellen des olfaktorischen Epithels in den 

Neuronen des VNOs die Expression von beiden Allelen (bi-allelisch) nachgewiesen. 

Die funktionellen Implikationen der Expression von zwei Rezeptortypen sind unklar. 

Die ausschließlich im olfaktorischen Epithel exprimierte Genfamilie der OR37 

Rezeptoren zeichnet sich ebenfalls durch ein besonderes topographisches 

Expressionmuster aus. Diese Gene werden nur in Zellen exprimiert, die in einem 

zentralen, eng umgrenzten Areal der nasalen Turbinalen lokalisiert sind. Detaillierte 

Analysen zum Expressionsmuster von distinkten OR37-Subtypen ergaben 

charakteristische Subkompartimentierungen in diesem zentralen Zellcluster. Die 

relativ hohe Zahl von OR37 exprimierenden Zellen in diesem zentralen Epithelareal 

resultiert in einer deutlich geringeren Zelldichte für andere Rezeptortypen in dieser 

Region; d.h. Zellen in diesem epithelialen Areal exprimieren bevorzugt OR37 Gene. 

Die Mechanismen, die zur Ausbildung dieses speziellen Expressionsmusters 

im OE führen sind bisher unbekannt. Analysen einer neuen transgenen Mauslinie, in 

der alle Zellen, die ein definiertes Mitglied der OR37 Genfamilie zur Expression 

115

Zusammenfassung 

auswählen permanent markiert werden, haben gezeigt, dass die Transkription von 

OR37 Genen auch in Zellen außerhalb des „Clusters“ induziert werden kann; in 

diesen Regionen wird die Expression offenbar kurzfristig wieder beendet. Diese 

Befunde sprechen dafür, dass die geclusterte Organisation von OR37 

exprimierenden Sinneszellen auf einen Mechanismus zurückzuführen ist, der eine 

Initiation der Transkription von OR37 Genen in verschiedenen Arealen des Epithels 

ermöglicht, die Aufrechterhaltung der Transkriptionsprozesse aber exklusiv auf den 

zentralen Turbinalbereich beschränkt. 

Die einzigartigen Eigenschaften der OR37 Rezeptoren führten zur Annahme, dass 

sie u.U. auf chemische Verbindungen reagieren die für Säuger besonders relevant 

sind. Daher wurden flüchtige Verbindungen aus komplexen Gemischen chemischer 

Komponenten aus dem unmittelbaren Lebensraum von Mäusen untersucht. Elektro- 

Olfaktogramme von verschiedenen Regionen des Riechepithels haben gezeigt, dass 

‘head-space‘ von Einstreu im zentralen Bereich des Turbinals IIb eine stärkere 

elektrische Antwort auslöste als in anderen Epithelbereichen. Einzelne Verbindungen 

aus dem Gemisch lösten in verschiedenen Epithelabschnitten vergleichbare 

elektrische Antworten aus; allerdings wurde für 6-Hydro-6-methl-3-heptanon eine 

stärkere Reaktion in der zentralen Turbinalregion registriert; diese Verbindung wird 

als ein Pheromon von Mäusen betrachtet. 

Die Daten zur Expression und zum Reaktionspektrum distinkter olfaktorischer 

Rezeptoren unterstützen die These, dass VNO und olfaktorisches Epithel zwar 

strukturell separate Systeme darstellen, ihre Reaktionsspektren und Funktionen 

allerdings überlappen, insbesondere bei der Registrierung von komplexen Substanz- 

Gemischen mit weitreichender biologischer Relevanz. 

116

VI Summary 

Summary 

In the present study, olfactory receptors (ORs) featuring special expression patterns 

in chemosensory subsystems were analyzed. The data showed that out of a 

repertoire of about 1000 ORs a restricted group (about 50) was not only expressed in 

the olfactory epithelium but also in the vomeronasal organ, which is generally defined 

by the expression of characteristic V1R and V2R receptors. The “ectopically“ 

expressed OR genes represent different receptor families including genes from gene- 

clusters located on different chromosomes. However, in all individuals the same set 

of genes seemed to be expressed. The majority of the expressed ORs was present in 

only a small number of VNO cells, however some were found to be expressed in 

more than 100 cells. One distinct OR gene (mOR261-6) was expressed in many 

more cells of female VNOs than in males. The highest number of OR expressing 

cells was observed in a short postnatal, pre-pubertal period. Cells with mOR18-2- 

receptors were also found to express a V1R gene. In these cells the OR18-2 gene 

did not show a mono-allelic expression as compared to expression in the main 

olfactory system but rather was transcribed from both alleles (bi-allelic) in the 

vomeronasal neurons. The functional implication of receptor coexpression and bi- 

allelic OR-expression are unknown. 

Receptors of the OR37 gene family are exclusively expressed in the olfactory 

epithelium, in which they are expressed in a special pattern in a central area of the 

nasal turbinate. Detailed analysis of the spatial distribution of cells equipped with 

distinct OR37 subtypes revealed that these cells were positioned in specific sub- 

compartments within this central region. The high number of OR37 expressing cells 

resulted in the lower number of cells with receptors which are zonally distributed. This 

implies that cells in a small circumscribed area preferentially expressed OR37 genes. 

The mechanisms underlying this unique spatial expression pattern of OR37 

genes in the olfactory epithelium are currently unknown. A newly generated mouse 

line was arranged in which even very transient transcription of a OR37 gene is 

visualized by permanent label in the expressing cells. The examination showed that 

cells outside of the OR37 cluster did express a OR 37 family member, yet 

transcription in these cells was rapidly terminated. These results suggest a 

mechanism which allows an initial transcription of these genes in different areas of 

117

Summary 

the epithelium, but a sustained expression of OR37 genes is restricted exclusively to 

the central recess of the turbinate. 

The special features of the OR37 subtypes have led to the hypothesis that 

these receptors possibly react to chemical compounds relevant for mammalian 

species. Thus complex mixtures of volatile compounds from the habitat of mice were 

examined. Electroolfactograms from different regions of the olfactory epithelium 

showed that the “head-space” of the embedding from mice cages elicited a stronger 

response in the central area of the turbinate IIb than in areas outside of this region. 

Single substances out of this complex mixture induced similar responses in different 

epithelial recesses. However, 6-hydro-6-methyl-3-heptanon elicited stronger 

responses within the central OR37 expressing region. This substance is considered 

to be a mouse pheromone. 

Taken together, these data on expression and ligand specificity of distinct 

olfactory receptors suggest, that the vomeronasal organ and the olfactory epithelium 

although structurally separated chemosensory systems, overlap in their response, 

spectrum and in their functions, particularly in detecting compounds with biological 

relevance. 

118

VII Literaturverzeichnis 

Literaturverzeichnis 

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reveals a stereotyped sensory map in the olfactory cortex. Nature 414:173- 

179. 

126

Danksagung 

Herrn Prof. Dr. Breer danke ich für die Überlassung des faszinierenden Themas und 

des Arbeitsplatzes sowie für die vielfältige Unterstützung und Diskussionen, ohne die 

diese Arbeit nicht entstanden wäre. 

Besonderer Dank gilt auch meinem Betreuer Dr. Jörg Strotmann für seine unendliche 

Geduld und seine umfangreiche Unterstützung, die maßgeblich zum Erfolg dieser 

Arbeit und zur Gestaltung weiterer Arbeiten beigetragen haben und werden. 

Ein ganz herzliches Dankeschön gilt all meinen Kollegen der gesamten 

Arbeitsgruppe und den Mitarbeitern des Instituts für die Zusammenarbeit und 

Hilfsbereitschaft, die unglaubliche Nachzucht von Mäusen sowie den Humor an der 

Grenze zum Wahnsinn. 

Vor allem aber danke ich meinen Eltern und meiner Frau, ohne deren langjährige 

Hilfe diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.

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