Kasper III TE 2010 LS - TCI @ Uni-Hannover.de - Leibniz Universität ...

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Kasper III TE 2010 LS - TCI @ Uni-Hannover.de - Leibniz Universität ...

„Auf dem Weg zumErsatzteillager Mensch?“- Tissue Engineering –Status und PerspektivenPD Dr. Cornelia KasperUniversität HannoverInstitut für Technische ChemieCallinstr. 530167 HannoverTCI Institut fürTechnische ChemieGliederungEinführung und Definition TEPrinzip des TE und BeispieleArbeiten im TCI im Bereich TEKnochen TE (Biomaterialtestung, Bioreaktorentwicklung)Nerven DFG Forschergruppe „polySia“, Stammzellkultivierung„Rebirth“AusblickNameTCI Institut fürTechnische Chemie


Die Farben der BiotechnologieWeiße Biotechnologie (industrielle BT)Grüne Biotechnologie (landwirtschaftliche BT)Blaue Biotechnologie (marine BT)Rote Biotechnologie (medizinische BT)NameTCI Institut fürTechnische ChemieRegenerative Medizin• Wirkstoffe, Proteine und Impfstoffe fürDiagnostik und Therapie• Gentherapie• Tissue engineeringNameTCI Institut fürTechnische Chemie


Der Begriff Tissue Engineering wurde offiziell aufeinem Workshop der National Science Foundation1988 eingeführtDefinition„...the application of principles and methods ofengineering and life sciences towardfundamental understanding of structurefunctionrelationship in normal and pathologicalmammalian tissues and the development ofbiological substitutes to restore, remain orimprove tissue function“.NameTCI Institut fürTechnische ChemieLebenswissenschafteninklusiveZell-, Molekular-, Entwicklungsbiologiemolekulare Genetik, BiochemieImmunologieTissue EngineeringKlinische Disziplinenmedizinische Grundlagenfächerexperimentelle ChirurgieZellkulturtechnikMaterialwissenschaftenBioverfahrenstechnik• Ziel: in vitro Generation von vitalem autologen Gewebe zurRekonstruktion geschädigtem Gewebes, zur Erhaltung oderVerbesserung der Funktion geschädigter oder erkrankter OrganeNameTCI Institut fürTechnische Chemie


Methodik Tissue Engineering• in vitro Kultivierung von autologen Zellenauf organischen, natürlichen odersynthetischen Matrices• in vitro Kultivierung von autologenZellen auf xenogenen Matrices• Gewebezüchtung ausembryonalen StammzellenNameTCI Institut fürTechnische ChemieStrategien• Zellinjektion (Zelltherapie)• geschlossenes extracorporales System• offenes System - biodegradables PolymergerüstNameTCI Institut fürTechnische Chemie


Zellinjektion• Hautzellen werden mit einer Art „Gewebekleber“ (Fibrin) direkt indie Wunde gegeben (Haut aus der Tube)• Autologe Chondrocyten Transplantation ACTDirekte Transplantation von Knorpelzellen z.B. bei BandscheibenoderMeniskusschädenNameTCI Institut fürTechnische ChemieExtracorporales SystemLeberzellen aus Schweinoder Schaf übernehmen indem System die„Entgiftungsfunktion“„Künstliche Leber“NameTCI Institut fürTechnische Chemie


Offene Systeme• Knochen, Knorpel, Sehnen, Bänder• Herzklappen,Venenklappen• Harnröhren, Harnblasen• Luftröhren• Blutgefäße• NervenfasernNameTCI Institut fürTechnische ChemieKnorpelKnorpelzellen aufKollagenmatricesRekonstruktion einerOhrmuschelNameTCI Institut fürTechnische Chemie


Herzklappe(Gerüst von Rind oder Schwein)BlutgefäßeNameTCI Institut fürTechnische ChemieTissue EngineeringNameRegMed heuteTCI Institut fürTechnische Chemie


Was wird benötigt ?ZellenPhysikalischeStimulierungZell-Zell-KontakteMatrixBioreaktorWachstumsfaktorenNameTCI Institut fürTechnische ChemieDifferenzierungspotenzial von StammzellenPotenz Fähigkeiten der Zelle BeispielTotipotenzPluripotenzMultipotenzOligopotenzUnipotenzAufbau eines kompletten,lebensfähigenOrganismusFähigkeit in nahezu alleZelltypen einesOrganismusdifferenzieren zu könnenDifferenzierung in Vielzahlvon ZelltypenDifferenzierung in geringeAnzahl ZelltypenBildung nur eines ZelltypsBefruchtete EizelleEmbryonaleStammzellenHämatopoetischeStammzellen,mesenchymaleStammzellenLymphoide oderMyeloide StammzellenStammzellen derHornhautNameTCI Institut fürTechnische Chemie


Adulte Stammzellenkommen in differenzierten Gewebe oder Organ vorAdulteStammzellenHämatopoetischeStammzellenNeuraleStammzellenHauptquelleKnochenmarkGehirnDifferenzierungspotentialAlle Typen der BlutzellenNeurone, Astrozyten,OligodendrozytenEpithelstammzellen Darm, Epidermis Epidermis, EpithelMesenchymaleStammzellenKnochenmarkKnochen, Knorpel, Sehnen,Bänder, Fettgewebe,Muskel, stromale Zellen desKnochmarksNameTCI Institut fürTechnische ChemieDifferenzierungsfaktorenMSCBMP-2TGF-β+ AscorbinsäureDexamethason+ InsulinBMP-125-AzacytidineKnochen(Osteoblasten)Knorpel(Chondrozyten)Fett(Adipocyten)Sehnen(Fibroblasten)Muskel(Myoblasten)Differenzierungsfaktoren (Zytokine, Hormone, etc.)NameTCI Institut fürTechnische Chemie


Ansätze im TCI• Entwicklung und Opt. geeigneter Bioreaktoren für TE• Optimierung von Medium und Zusatzstoffen (z.B.Serumersatz)•Funktionalisierung von Biomaterial undTestung/Biokompatibilität• Kontrollierte Differenzierung der Zellen• Physiologische Konditionierung• 3 D Strukturausbildung und Blutversorgung derGewebe/Organkonstrukte• Herstellung von Wachstums- und DifferenzierungsfaktorenNameTCI Institut fürTechnische ChemieQuellen der mesenchymale StammzellenNachteile:• Gewinnung stellt ein Risikofaktorfür den Patienten/Spender dar,• Anzahl der Zellen, die man auseiner Gewebeprobe gewinnenkann, ist sehr geringFrequenz der MSC im Knochenmark:nur ca. 1-10 Zellen von 1 000 000 Knohenmarkszellenweisen die Eigenschaften einer mesenchymalenStammzelle auf.KnochenmarkKnochenKnorpelFettgewebeMuskelBlutgefäßeBlutLungeHerzLeberPancreasNierenNameTCI Institut fürTechnische Chemie


Mesenchymale Stammzellen in denextra-embryonalen GewebenPlazentaFukuchi Y. et al. Human placenta-derivedcells have mesenchymal stem/progenitor cellpotential. Stem Cells 2004, 22(5): 649-658.AmnionFruchtwasserRoubelakis M.G. et al. Molecular and proteomiccharacterization of human mesenchymal stemcells derived from amniotic fluid: comparisonto bone marrow mesenchymal stem cells.Stem Cells Dev 2007, 16(6): 931-952.Sakuragawa N. et al. Human amnion mesenchymalcells express phenotypes of neuroglial progenitorcells. J Neurosci Res 2004, 78: 208-214.NameNabelschnurRomanov Y.A. et al. Searching for alternativesources of postnatal human mesenchymalstem cells: candidate MSC-like cells fromumbilical cord. Stem Cells 2003, 21(1):105-110.Frequenz der MSC in den extra-embryonalen Geweben:ca. 1 Zelle von 300 Zellenbesitzt die Eigenschaften einer mesenchymalenStammzelle.Vorteile gegenüber adulten undembryonalen Stammzellen:• Gewinnung ethisch unbedenklich,• Gewinnung stellt keine zusätzlicheBelastung für den Spender dar,• Anzahl der mesenchymalenStammzellen, die man aus einerGewebeprobe gewinnen kann, ist deutlichhöherTCI Institut fürTechnische ChemieIsolation und Kultur mesenchymaler Stammzellenaus der NabelschnurExplantat-Kultur, Tag 1200 µmHerauswachsen der Zellen, Tag 10Zellen vomTyp IIZellen vomTyp INameKultur der MSC, Passage 0200 µmTCI 100 µmPhänotypische CharakterisierungInstitut fürTechnische Chemie


Rotating Bed BioreactorFütterungsrohr®Sponceram -ScheibenDrehbettreaktor500 ml ReaktorvolumenAbluftWelleAnalytikDrehbett aus porösenKeramikscheiben (Sponceram)BegasungMediumPumpeMediumumwälzsystemFütterungs- und MedienrohrBegasung mit Druckluft und CO 2NameTCI Institut fürTechnische Chemieexhaust airshaftair/mediumanalyticsseptumsamplingpumpmediumpH-electrodeair/O 2NameTCI Institut fürTechnische Chemie


exhaust airshaftseptumair/mediumanalyticssamplingpumpmediumpH-electrodeair/O 2NameTCI Institut fürTechnische ChemieRed Point System –dynamische BedingungenNameTCI Institut fürTechnische Chemie


Mechanischer StressMechanische Belastung/Stress wichtig für die Entwicklungvieler Gewebe “Knochenbruch heilt langsamer im Liegen”Verschiedene Möglichkeiten mechanische Belastung zuinduzieren Zug, DruckStressed?NameTCI Institut fürTechnische Chemie„Fitness Kammer“Zellen:• BMSCs oder adSCsKonditionen:• 1 Hz• Dehnung 5 %Silikon SchaleNameTCI Institut fürTechnische Chemie


„Fitness Center“NameTCI Institut fürTechnische ChemieRelease SystemeZusammenarbeit mit Prof. Marcelle Machluf, Haifa, IsraelBMP Freisetzung abhängig von der Polymerzusammensetzung120Cumulative release(% w/w)10080604020505075258515NamePolymerDrug loading% (w/w)Releaseperiod00 5 10 15 20 25 30 35 40Time (days)% Loading efficiencyPLGA5050 0.5 17 days 55±0.5PLGA7525 0.5 17 days 15±2PLGA8515 0.5 30 days 57±0.8TCI Institut fürTechnische Chemie


BeispielKnochen Tissue EngineeringNameTCI Institut fürTechnische ChemieMedizinische NotwendigkeitTrauma/UnfallInfektionTumor/ZysteAltersbedingter VerschleißNameTCI Institut fürTechnische Chemie


MatrixWelche Eigenschaften sollte eine Matrix für dasTissue Engineering von Knochen haben ?Poröse 3D-StrukturBiokompatibilitätGeeignete Oberflächen-ChemieMechanische StabilitätNameTCI Institut fürTechnische ChemieSponceram ®Statische BedingungenDynamische BedingungenMikroporöse Struktur besteht ausdotiertem Zr0 2Hydroxylapatit BeschichtungVerschiedene Porengrößen200 µmREMNameTCI Institut fürTechnische Chemie


Was wurde untersuchtZellen Matrix Medium Beding.MC3T3-E1-cells(Vorläuferzellen)HumaneOsteoblastenHumane adMSCsund uc MSCsSponceram ®1. Standard2. Differenzier.*3. BMP-2Sponceram ® 1. StandardSponceram/HA 2. Differenzier.Sponceram ® 1. StandardSponceram/HA 2. Differenzier.StatischDynamischStatischDynamicStatischDynamisch* Zusatz von Dexamethason (Differenzierung), Vitamin C (Für Kollagen I Synthese), beta-Glycerolphosphat (Phosphat Ionen für Mineralisierung)NameZell Viability/ProliferationDifferenzierungMineralisierungREMTCI Institut fürTechnische Chemieexhaust airshaftair/mediumanalyticsseptumsamplingpumpmediumpH-electrodeair/O 2NameTCI Institut fürTechnische Chemie


exhaust airshaftseptumair/mediumanalyticssamplingpumpmediumpH-electrodeair/O 2NameTCI Institut fürTechnische ChemieFütterungsrohr/BesiedelungNameTCI Institut fürTechnische Chemie


Mischzeitt = 0 sek t = 5 sek t = 10 sekt = 35 sek t = 2,5 min t = 3 minNameTCI Institut fürTechnische ChemiepH-Wert-Steuerung über CO 2 -ZugabeMedium Zirkulation37 °C3 ScheibenpH = 7.2Photometer/pH-ElektrodepH-Wert7,807,607,407,207,006,80pH-eEektrodePhotometer0,150,130,11Absorptionbei 557 nm6,606,400,090 100 200 300 400 500 600Zeit [min]NameTCI Institut fürTechnische Chemie


Drehbett Bioreaktor – dynamische BedingungenNameTCI Institut fürTechnische ChemieGlucose Verbrauch–dynamische KultivierungPrimäre Osteoblastenglucose consumption[mg]20001800160014001200100080060040020000 5 10 15 20 25 30dayGesamt-Glucoseverbrauch: 14 gNameTCI Institut fürTechnische Chemie


ECM-Bildung - primäre OsteoblastenDynamischStatischSponceram ®Sponceram/HANameTCI Institut fürTechnische ChemieGlucose Verbrauch–dynamische KultivierungHumane adMSCsGlucose consumption [mg/d]80070060050040030020010000 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50dayGesamt-Glucoseverbrauch : 17 gNameTCI Institut fürTechnische Chemie


REM Aufnahmen nach dynamischer KultivierungadMSCsSponceram ®Sponceram/HANameTCI Institut fürTechnische ChemieStrategie zur Herstellung funktionalisierterTrägermaterialienTCPSponceram1 cmMineralisches TrägermaterialPolymersynthetische/keramischeTrägermaterialien zurKnochenzüchtungWachstumsfaktor (BMP-2)Unspezifische Liganden (Lysin-Derivate)Biospezifische Liganden (RGD-Peptide)NameKooperation mit Prof. Tatiana Tennikova (St. Petersburg)TCI Institut fürTechnische Chemie


Release Kinetics120Cumulative release(% w/w)1008060402050507525851500 5 10 15 20 25 30 35 40PolymerTime (days)Drugloading %(w/w)Releaseperiod% LoadingefficiencyPLGA5050 0.5 17 days 55±0.5PLGA7525 0.5 17 days 15±2PLGA8515 0.5 30 days 57±0.8NameKooperation mit Prof. Marcelle Machluf (Haifa, Israel)TCI Institut fürTechnische ChemieBioreaktoren für Tissue EngineeringNameTCI Institut fürTechnische Chemie


Mechanischer StressNameTCI Institut fürTechnische ChemieMechanischer StressMechanische Belastung/Stress wichtig für die Entwicklungvieler Gewebe “Knochenbruch heilt langsamer im Liegen”Verschiedene Möglichkeiten mechanische Belastung zuinduzieren Zug, DruckStressed?NameTCI Institut fürTechnische Chemie


Knochen(Osteoblasten)Spende ausBeckenknochenoderFettgewebeBone MarrowStroma CellBMSCadipose derivedStem Cells adSCKnorpel(Chondrozyten)Fett(Adipocyten)Sehnen(Fibroblasten)Muskel(Myoblasten)Differenzierungsfaktoren (Wachstumsfaktoren, Hormone, etc.)phänotypische Differenzierung ↔ physiologische „Differenzierung“NameTCI Institut fürTechnische Chemie„Fitness Kammer“Zellen:• BMSCs oder adSCsKonditionen:• 1 Hz• Dehnung 5 %Silikon SchaleNameKooperation mit Prof. Martijn van Griensven, WienTCI Institut fürTechnische Chemie


„Fitness Center“NameTCI Institut fürTechnische ChemieAktuelle ArbeitenEntwicklung eines Perfusionssystems für dieparallele Testung von BiomaterialienBiomaterialien:TCP, TCP + bioactive glassAl-oxidCollagenPolysaccharide, PolymereComposit-MaterialienNameTCI Institut fürTechnische Chemie


AusblickKombinationMechanical stimulationDynamic cultivationNameTCI Institut fürTechnische ChemieDFG-Forschergruppe „Polysialinsäure“als Matrix für Zellwachstum(am Bsp. Nervenzellen)Hier enge Kooperation mit:OCACMHHKautschukinstitutWerkstoffkundeNameTCI Institut fürTechnische Chemie


Sialinsäure / N-Acetyl-Neuraminsäure (Neu5Ac)C9-ZuckerCarboxy-Gruppe an C1N-acetyliert an C5polsNameTCI Institut fürTechnische ChemieFernzielpolKaum bis keine Regeneration peripherer Nerven nach großemSubstanzverlust. - >Autologe Nerventransplantate überbrücken dieUnterbrechung.sOP-Bild mit Ausriß (*) der dorsalenund ventralen Wurzel;daneben die schematische Darstellungverletzter Nerven und derEinsatz eines Interponats.NameTCI Institut fürTechnische Chemie


NameTCI Institut fürTechnische ChemieSchwannzellenModifikationSubstratNameTCI Institut fürTechnische Chemie


SchwannzellenModifikationSubstratImplantationdurchtrennteNervenfaserdurchtrennteNervenfaserNameTCI Institut fürTechnische ChemieSchwannzellenModifikationSubstratImplantationdurchtrennteNervenfaserdurchtrennteNervenfaserNameTCI Institut fürTechnische Chemie


ProjektstrukturBereitgestellteMaterialiendirektModifizierungMaterialtestingVorscreeningOptimierungderStruktur / FormScreening(Material / Form)MikroarraysImmuncytochemieMorphologie/MorphometrieOptimierungderModifizierungNameAuswertungTCI Institut fürTechnische ChemieTestungVorscreening Materialscreening ScreeningForm, 3-D-StrukturVitalität / ProliferationVitalität / ProliferationMicroarrayImmuncytochemie / Morphologie /MorphometrieVitalität / ProliferationMicroarrayImmuncytochemie / Morphologie /MorphometrieNameTCI Institut fürTechnische Chemie


DFG-Exzellenzcluster„Rebirth“From Regenerative Biology to Reconstructive TherapyKooperation von MHH mit Uni HannoverPartner Tiho, Uni Münster, HZI, MarienseeNameTCI Institut fürTechnische ChemieTechnische Chemie•Scaffold Entwicklung, Testung, Funktionalisierung•Bioreaktor Design•Bioprozeßentwicklung•Large Scale Produktion von Wachstumsfaktoren•Large Scale Stammzellkultivierung•DNA ChiptechnologieNameTCI Institut fürTechnische Chemie


Niedersächsisches GMP MusterlaborTissue EngineeringGMP Model Lab Tissue EngineeringNameLeibniz Universität HannoverMedizinische Hochschule HannoverSartorius Stedim BiotechKöttermanncorlifeTCI Institut fürTechnische ChemieGMP MusterlaborCellsHornhautHautNervenEndothelgewebe/BlutgefäßeTissueHerzklappenLeberNiereProcessingMatrixDonorMuskeln, Knochen,KnorpelPatient“in-vitro”cultivationGMP-Model LabNameTCI Institut fürTechnische Chemie


corlifePatienten spezifischeGewebeKöttermannSartoriusGrundlagenforschungNameTCI Institut fürTechnische ChemieGMP MusterlaborTissue EngineeringNameTCI Institut fürTechnische Chemie


Ziele- Herzklappen- Dialyse Shunts- KnochensegmenteNameTCI Institut fürTechnische ChemieAufgabenEntwicklung von Produktionsprozessenfür die Herstellung von TissueEngineering ProduktenTestung der Prozeduren in einer„Muster-Umgebung“Transfer der Prozeduren in ein„richtiges“ Reistraum-Produktionslabor(2010/2011)NameTCI Institut fürTechnische Chemie


Zukunftstechnologie ErsaztteilzüchtungOrgane aus dem Reagenzglas„Turning blood into brain“Organ-Designer im Labor„Scientists find way to fix broken hearts“Organe von der StangeHigh Tech KörperHaut aus der TubeNameTCI Institut fürTechnische Chemie„Early Tissue Engineering“NameLucas Cranach d. Ä. 1546: JungbrunnenTCI Institut fürTechnische Chemie

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