Immuntherapie mit Dendritischen Zellen - biomed-austria

10 wissenschaft & praxisImmuntherapie mitDendritischen ZellenNeue Erkenntnisse zur Kryokonservierung vonMonozyten und Dendritischen Zellen *Theoretischer Hintergrund undZielsetzungDie Immuntherapie maligner Erkrankungenmit ex vivo generierten Dendritischen Zellen(DC) hat in den letzten zehn bis 15 Jahreneine rasante Entwicklung durchlaufen und ist für das Prostatakarzinomin den USA ein bereits zugelassenes therapeutischesVerfahren. Bei der Immuntherapie mit DC macht mansich die Fähigkeit dieser Zellen zunutze, (Tumor-)Antigeneaufzunehmen, sie zu verarbeiten und in Form von kleinerenEinheiten, sogenannten Epitopen, gemeinsam mit HLA-Molekülenund kostimulatorischen Molekülen (CD40, CD80,CD86, IL-12 etc.) auf der Zelloberfläche den Effektoren deradaptiven Immunantwort, den CD4 + - und CD8 + -T-Zellen,zu präsentieren [1, 2]. Ein vorteilhafter Nebeneffekt von exvivo generierten DC ist, dass hier der Einfluss unerwünschterimmunmodulatorischer Stoffe, wie IL-10, IL-6, TGF-ßoder VEGF, die im Tumor häufig und in signifikanter Konzentrationvorhanden sind, umgangen wird.Dendritische Zellen zur Immuntherapiekönnen direkt aus dem Blutoder aus CD34 + -Vorläuferzellen generiertwerden, die Ausbeute ist hieraber sehr gering. Zumeist werden daherMonozyten verwendet, die durchIn-vitro-Inkubation mit GM-CSFund IL-4 zu unreifen DendritischenZellen (imDC) differenziert werden[3]. Durch Behandlung mit TNF-a,IFN-g und LPS können imDC zu reifenDendritischen Zellen (mDC) prozessiertwerden. Für die Isolierungder Monozyten gibt es unterschiedlicheMethoden. Weit verbreitet ist dieimmunomagnetische Isolation, dabeiwerden die Monozyten mit Hilfe vonAntikörpern, die gegen das auf Monozytenexprimierte Molekül CD14gerichtet und an mikroskopisch kleine magnetische Teilchengekoppelt sind, isoliert. Seit einiger Zeit ist es auch möglich,Monozyten durch Apherese und Elutriation zu gewinnen. Eshandelt sich dabei um eine Methode, die in ähnlicher Weiseauch bei der Thrombozytenspende eingesetzt wird. Unklarwar bis dato, ob Monozyten, die immunomagnetisch isoliertworden sind, und Monozyten, die durch Apherese undElutriation gewonnen worden sind, vergleichbare Präparationenan Dendritischen Zellen liefern – das ist zugleich dieerste Fragestellung dieser wissenschaftlichen Arbeit.* Zusammenfassung der Publikation „Cryopreservation of Monocytesis Superior to Cryopreservation of Immature or Semi-matureDendritic Cells for Dendritic Cell-based Immunotherapy“, erschienenim Journal of Immunotherapy, 2009 Jul-Aug; 32(6): 638-54.Im Vergleich zur peripheren Blutabnahmemit anschließender immunomagnetischerIsolation haben Apherese und Elutriationden Vorteil, dass eine große Menge an Monozytendurch eine einmalige Punktion gewonnenwerden kann. Daraus lässt sich einegroße Zahl an DC generieren, die gleich füreine Serie von mehreren Impfungen verwendetwerden kann – Qualitätsunterschiedezwischen verschiedenen Chargen können sohintangehalten werden und der/die PatientIn muss nur einmalzur Punktion erscheinen. Die gewonnenen Zellen müssenaber bis zu ihrer weiteren Verwendung kryokonserviert(d.h. in flüssigem Stickstoff gelagert) werden. Hinsichtlichder Kryokonservierung gibt es Arbeiten, die zeigen, dass dasEinfrieren von unreifen oder bereits ausgereiften DC keinenNachteil im Vergleich zu frisch hergestellten, nicht kryokonserviertenDC hat [4,5]. Gerade diesen Punkt hat unsere Arbeitsgruppeimmer wieder kritisch hinterfragt. In den letztenJahren wurden nämlich am Patienten eine Reihe klinischerStudien unter Verwendung von differenzierten kryokonserviertenDC durchgeführt. Diese Studien hatten im Vergleichmit den zuvor im Tiermodell erfolgreich durchgeführtenVersuchen nur mäßigen Erfolg. Unsere berechtigte zweiteFragestellung war nun zu prüfen, ob es wirklich sinnvoll ist,bereits differenzierte (unreife oder reife) Dendritische Zelleneinzufrieren oder ob es nicht von Vorteil wäre, die Zellendoch gleich nach ihrer Isolation, d.h. im Monozytenstadiumeinzufrieren und dann batchweise bei Bedarf zu DC zudifferenzieren.Abb. 1: Überblick über die untersuchten Präparationen von DC und deren Generierung.MethodikMonozyten der ProbandInnen wurden sowohl mithilfevon immunomagnetischen Beads als auch per Aphereseund Elutriation isoliert und entweder sofort zu reifen DCgeneriert oder im Stadium der Monozyten, unreifer (imDC),halbreifer (smDC) oder reifer Dendritischen Zellen (fmDC)kryokonserviert, um nach deren Wiederauftauen zu reifenDC differenziert zu werden. Eine Übersicht über die untersuchtenPräparationen und deren Benennung ist aus Abb. 1ersichtlich. Zur Herstellung aller DC-Präparationen wurdeein Protokoll verwendet, das von unserer Forschungsgruppeentwickelt wurde und es erlaubt, DC ohne Zusatz von fetalemKälberserum zu generieren [6].

wissenschaft & praxis11Abb. 2, a+b: Ausbeute (Recovery, a) und Viabilität (b) verschiedenerDC-Präparationen. Ein repräsentatives Experiment (von insgesamt3) ist gezeigt.Abb. 3: Morphologie verschiedener DC Präparationen. Reife DCaus CD14 + -isolierten Monozyten (a), reife DC aus elutrierten nichtkryokonservierten Monozyten (b), reife DC aus elutrierten kryokonserviertenMonozyten (c), reife DC aus kryokonservierten imDC (d),reife DC aus kryokonservierten smDC (e), unreife DC (f).In der hier vorgestellten Arbeit wurden die diversen PräparationenDendritischer Zellen hinsichtlich der Parameter derZellausbeute, Reinheit und Viabilität, ihrer phänotypischenMerkmale (Expression von Zelloberflächenmolekülen, Produktionvon IL-12p70) und ihrer funktionellen Eigenschaften(Stimulation von T-Zellen zur Zytokinproduktion und Proliferation,Aktivierung regulatorischer T-Zellen) analysiert.Resultatemit Clusterbildung, während sich das Clustering von reifenDC aus kryokonservierten imDC und kryokonserviertensmDC nur mäßig präsentierte und eher dem Bild unreiferDC glich (Abb. 3).Ausbeute, Viabilität und MorphologieIn unreifem Zustand am Tag 3 zeigtenalle DC-Präparationen vergleichbareAusbeuten. Nach Ausreifung mit TNF-a,IFN-g und LPS am Tag 4 betrug die Ausbeutezwischen 22,2 und 28,5 Prozent(bezogen auf die Anzahl der eingesetztenMonozyten). Eine Ausnahme stelltenreife DC, die aus kryokonserviertensmDC generiert wurden, mit 2,6 ProzentAusbeute dar (Abb. 2a). Alle Präparationenan unreifen DC zeigten vergleichbareWerte hinsichtlich der Viabilität (92,6bis 96,1%). Nach Ausreifung fiel dieViabilität von DC aus kryokonserviertenimDC und von DC aus kryokonserviertensmDC deutlich ab, während die Werte beianderen Präparationen fast unverändertblieben (Abb. 2b).Vergleichbare Ergebnisse wurdenbezüglich der Morphologie der untersuchtenDC-Entitäten gefunden. ReifeDC aus immunomagnetisch isoliertenMonozyten sowie aus elutrierten nichtkryokonservierten Monozyten undelutrierten kryokonservierten Monozytenzeigten eine typischen MorphologieTab. 1: FACS-Analyse verschiedener Präparationen von mDC.(a) Prozentsatz an positiven Zellen,(b) Mean Flourescence Intensity (MFI).Ein repräsentatives Experiment (von insgesamt 3) ist gezeigt.a% positive cellsmDC from CD40 CD1a CD14 CD83 CD80 CD86Phänotypische Merkmale und Reinheit derPräparationenIn Tab. 1 sind die Ergebnisse der FACS-Analyse der Expressionvon Zelloberflächenmarkern auf reifen DC ver-HLA-ABCHLA-DRCD14 + isolatedmonocytes89.2 19.2 4.3 85.8 89.2 90.2 91.5 91.6elutriated freshmonocytes84.3 13.4 6.0 87.4 82.6 84.5 92.4 89.2elutriated frozenmonocytes89.8 41.0 3.0 91.1 89.8 90.7 93.9 92.3frozen imDC 31.2 6.2 5.8 19.7 28.5 40.9 95.6 93.8frozen smDC 49.5 5.4 4.1 24.4 43.9 91.9 96.2 96.2bMFI (mean fluorescence intensity)mDC from CD40 CD1a CD14 CD83 CD80 CD86HLA-ABCHLA-DRCD14 + isolatedmonocytes22.6 8.1 0.6 7.8 12.8 56.2 77.0 50.4elutriated freshmonocytes17.7 4.5 1.0 3.6 10.0 43.2 82.4 29.1elutriated frozenmonocytes13.8 9.4 0.8 4.5 11.3 53.9 68.9 31.4frozen imDC 3.8 1.2 0.7 1.2 2.2 11.3 33.9 16.9frozen smDC 3.7 1.0 0.6 2.1 3.0 21.9 18.5 14.7

12 wissenschaft & praxisschiedener Präparationen dargestellt. Es wurden sowohl dieprozentuelle Expression (Tabelle 1a) als auch die Stärke derExpression (ausgedrückt durch MFI, Tabelle 1b) verschiedenerMarker ermittelt. Hier zeigte sich, dass die Kryokonservierungvon imDC und smDC negative Auswirkungen aufdiese Zellpräparationen hat (reduzierte Anzahl an CD40 + -,CD80 + - und CD83 + -Zellen sowie verringerter MFI-Wert aufausgereiften Zellen), während der Effekt auf DC von kryokonserviertenelutrierten Monozyten geringer ausfiel.Bei der Immuntherapie mit DC ist man bestrebt, die Verunreinigungmit anderen Leukozytenpopulationen möglichstgering zu halten. Die Kontamination aller DC-Präparationenmit T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Granulozyten wargering, wobei die immunomagnetische Isolation etwas bessereWerte liefert als Apherese undElutriation.Abb. 4: Zytokinproduktion von CD3 + -T-Zellen nach 24h Kokultivierung mit verschiedenenDC-Präparationen. Prozentsätze an positiven T-Zellen für IFN-γ, IL-4, IL-10 und CD69 sind in derAbb. ausgewiesen. Ein repräsentatives Experiment (von insgesamt 3) ist gezeigt.Bewertung der Produktion vonIL-12p70Das Zytokin IL-12p70 ist einwesentlicher Faktor für die Aktivierungzytotoxischer T-Zellen.Durch die Ausreifung der DC mitTNF-a, IFN-g und LPS sollen dieDC gedrängt dazu gedrängt werden,möglichst viel von diesem Zytokinzu produzieren.Dabei zeigte sich, dass die Kryokonservierung,egal in welchemStadium der DC-Generierung, dieProduktion von IL-12p70 hemmt.Dies erfolgt jedoch in unterschiedlichemAusmaß. Während dieIL-12p70-Sekretion bei Kryokonservierungim Monozytenstadiumum etwa 40 Prozent zurückgeht(bezogen auf Monozyten, die nichtkryokonserviert wurden), beträgtdie Reduktion bei DC aus kryokonserviertenimDC und DC auskryokonservierten smDC beachtliche75 bzw. 90 Prozent.Abb. 5: Proliferation von CD3 + -, CD4 + - und CD8 + -T-Zellen nach Kokultivierung mit verschiedenenDC-Präparationen. Prozentsätze an proliferierten und nicht proliferierten T-Zellen sind in derAbb. ausgewiesen. Ein repräsentatives Experiment (von insgesamt 3) ist gezeigt.Zytokinproduktion vonCD3 + -T-ZellenDendritische Zellen können T-Zellen nach Aktivierung in zweiunterschiedliche Richtungen polarisieren.Der (erwünschte) T H1-Phänotyp ist charakterisiert durchIFN-g-Produktion und Stimulationzytotoxischer T-Zellen, der (unerwünschte)T H2-Phänotyp durchIL-4- und IL-10-Produktion. Alleuntersuchten DC-Präparationenpolarisieren in vitro kokultivierteT-Zellen in Richtung T H1-Phänotyp– jedoch in unterschiedlichemAusmaß. Werden die Zellen bereitsim Monozytenstadium kryokonserviert,so ist die Produktion vonIFN-g in kokultivierten T-Zellenvergleichbar mit Zellen, die nichtkryokonserviert wurden. EineKryokonservierung im Stadium von imDC oder smDC wirktsich inhibitorisch auf die Stimulation zur IFN-g-Produktionaus (Abb. 4).Proliferation von CD3 + -T-ZellenNachdem die T-Zellen von DC aktiviert wurden, sollensie proliferieren (sich vermehren), um in möglichst hoherAnzahl ihr Ziel, auf das sie geprimt wurden (in Kontext derImmuntherapie: der Tumor), zu bekämpfen. Die Proliferationder T-Zellen wurde mithilfe des FluoreszenzfarbstoffsCFSE determiniert. Frisch isolierte T-Zellen werden mitCFSE gefärbt und anschließend mit reifen DC verschiedenerPräparationen kokultiviert. Bei jeder Zellteilung erhält jedeTochter-T-Zelle die halbe Menge an CFSE der Mutterzelle

wissenschaft & praxis13und fluoresziert deshalb nur halb so stark. Im Flowzytometerlässt sich so die Zellteilung, also die Proliferation, derT-Zellen verfolgen. Auch hier zeigte sich eine verringerte stimulatorischeKapazität von DC aus kryokonservierten imDCund DC aus kryokonservierten smDC gegenüber frisch generiertenDC oder DC aus kryokonservierten elutriertenMonozyten (Abb. 5). Weiters wurden die kokultiviertenT-Zellen auf die Expression von Perforin und Granzyme B,Mediatoren der zytotoxischen T-Zell-Antwort, untersucht.Analog zu den bisher gefundenen Ergebnissen war der Prozentsatzan T-Zellen, die Granzyme B exprimieren, nachKokultivierung mit DC aus nicht kryokonservierten Zellenoder DC aus kryokonservierten Monozyten am höchsten.Die Expression von Perforin war jedoch unabhängig von dergewählten DC-Population.Induktion von regulatorischen T-ZellenDie Aktivierung von regulatorischen T-Zellen ist eineunerwünschte Begleiterscheinung der Immuntherapie mitDendritischen Zellen. Diese T-Zell-Population hat die Fähigkeit,eine T-Zell-Antwort, die gegen den Tumor gerichtetist, zu unterdrücken [7]. Die untersuchten Präparationen vonDC zeigten keine Aktivierung von regulatorischen T-Zellennach 96-stündiger Kokultur.DiskussionUnsere Studie zeigt, dass frisch isolierte Monozyten, egalob immunomagnetisch oder mittels Apherese und Elutriationisoliert, vergleichbare Präparationen an reifen DendritischenZellen liefern. Aufgrund der großen Anzahl an Monozyten,die per Apherese und Elutriation gewonnen werden kann, isteine einzige Blutabnahme ausreichend, um genügend Zellenfür einen kompletten Impfzyklus zu generieren (in der Regelzehn Impfungen). Werden Zellen gleich zu Beginn des Behandlungszyklusdurch Apherese und Elutriation gewonnenund nicht kurz vor jeder geplanten Impfung frisch immunomagnetischisoliert, so hat man die Möglichkeit, die Immuntherapiemit DC auch nach Strahlentherapie oder Chemotherapiedes/der PatientIn durchzuführen. Strahlentherapieund Chemotherapie waren bis jetzt Kontraindikationen fürdie Immuntherapie, weil sie negative Auswirkungen auf diezellulären Blutbestandteile haben – eine Generierung von DCaus strahlen- oder chemotherapierten Monozyten ist schwermöglich. Bei Durchführung von Apherese und Elutriationund Wegfrieren der Zellen vor Stahlen- oder Chemotherapiekann dieses Problem umgangen werden.Unsere Daten zeigen weiters, dass reife DC aus kryokonserviertenMonozyten vergleichbar sind mit reifen DCaus nicht kryokonservierten Monozyten. Werden Zellen jedochim Stadium unreifer oder reifer DC kryokonserviert,so ergibt sich nach dem Wiederauftauen eine phänotypischund funktionell wesentlich schlechtere Zellpopulation.Die Kryokonservierung von Monozyten hat im Vergleichzur Kryokonservierung von differenzierten Zellen einenweiteren Vorteil. Genauso wie bei Strahlen- und Chemotherapiekann es auch bei der Immuntherapie mit DendritischenZellen zu Resistenzentwicklungen des Tumorsgegen die Therapie kommen. Ein möglicher Ausweg ist es,die Dendritischen Zellen mit einer anderen Tumorantigenmischungzu beladen, um so die T-Zellen gegen andereTumorepitope zu primen. Werden für die Therapie unreifeoder reife DC kryokonserviert, so ist aufgrund des Protokollszur DC-Generierung ein Wechsel der Tumorantigenmischungnicht mehr möglich (weil die Zellen schon vorder Kryokonservierung mit Tumorantigen in Berührunggekommen sind). Ein solcher Antigenwechsel ist aber sehrwohl möglich, wenn anstatt der differenzierten DC frischisolierte Monozyten eingefroren werden, die noch nichtmit den Tumorantigenen konfrontiert worden sind. Einmöglicher Nachteil der Kryokonservierung der Zellen imMonozytenstadium ist die erforderliche batchweise Generierungreifer DC und damit die verbundenen potenziellenBatch-zu-Batch-Variationen.nHubert HaydenBiomedizinischer Analytiker an derMedizinischen Universität WienDie vorgestellte Arbeit entstand in den Forschungslaboratoriender Universitätsklinik für Chirurgie in der Arbeitsgruppe fürklinisch-experimentelle Onkologie unter der Leitung vonUniv.-Prof. Dr. Michael Gnant, Univ.-Prof. Dr. Anton Stift undPriv.-Doz. Dr. Josef Friedl. Die Arbeit belegte den ersten Platzder Ausschreibung „ Abbott-Preis 2011 für wissenschaftlichePublikationen“. Der Preis wurde am 1. April 2011 im Rahmender 19. Jahrestagung der Biomedizinischen AnalytikerInnen inInnsbruck überreicht.Literatur:1) Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control ofimmunity. Nature. 1998;392:245-252.2) Sallusto F, Cella M, Danieli C, et al. Dendritic cells usemacropinocytosis and the mannose receptor to concentratemacromolecules in the major histocompatibility complex classII compartment: downregulation by cytokines and bacterialproducts. J Exp Med. 1995;182:389-400.3) Kiertscher SM, Roth MD. Human CD14 + leukocytes acquirethe phenotype and function of antigen- presenting dendriticcells when cultured in GM-CSF and IL-4. J Leukoc Biol.1996;59:208-218.4) Lewalle P, Rouas R, Lehmann F, et al. Freezing of dendriticcells, generated from cryopreserved leukaphereses, does notinfluence their ability to induce antigen-specific immuneresponses or functionally react to maturation stimuli.J Immunol Methods. 2000;240:69-78.5) Hori S, Heike Y, Takei M, et al. Freeze-thawing procedureshave no influence on the phenotypic and functional developmentof dendritic cells generated from peripheral bloodCD14 + monocytes. J Immunother (1997). 2004;27:27-35.6) Dubsky P, Hayden H, Sachet M, et al. Allogeneic tumor lysatecan serve as both antigen source and protein supplementationfor dendritic cell culture. Cancer Immunol Immunother.2008;57:859-870.7) Banerjee DK, Dhodapkar MV, Matayeva E, et al. Expansion ofFOXP3high regulatory T cells by human dendritic cells (DCs) invitro and after injection of cytokine-matured DCs in myelomapatients. Blood. 2006;108:2655-2661.