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Synthese von Nucleotid-Derivaten mit Phosphorsäureamid ...

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Synthese von Nucleotid-Derivaten mit Phosphorsäureamid

Synthese von Nucleotid-Derivaten mit Phosphorsäureamid-Verknüpfung: Fluoreszenz-Markierung für die quantitative Bestimmung und neuartige P2Y-Rezeptor-Liganden DISSERTATION Zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn vorgelegt von Christiane Danhauser aus Mindelheim Bonn 2009

  • Seite 3: Angefertigt mit Genehmigung der Mat
  • Seite 7: Für meinen Vater Heinz Joachim Dan
  • Seite 10 und 11: 5.2 Umsetzung von Nucleotiden mit D
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  • Seite 14 und 15: 2 Glasröhre wurde 1967 von Hjerté
  • Seite 16 und 17: 4 2 Theoretischer Hintergrund 2.1 K
  • Seite 18 und 19: 6 hydrodynamischen Flüssen, wo das
  • Seite 20 und 21: 8 Dadurch ist es möglich durch gee
  • Seite 22 und 23: 10 erzeugt. Wenn das Inlet in ein P
  • Seite 24 und 25: 12 Probenkomponenten eingeführt. 2
  • Seite 26 und 27: 14 • eine ausreichende Fluoreszen
  • Seite 28 und 29: 16 ausgelöstes Quenchen der Fluoro
  • Seite 30 und 31: 18 2.3.2 Malaprade-Spaltung Eine ei
  • Seite 32 und 33: 20 B 0 B 0 L HO OH OH O O B OH OH B
  • Seite 34 und 35: 22 4 Fluoreszenzmarkierung von Nucl
  • Seite 36 und 37: 24 Diese Methode sollte auf die Kap
  • Seite 38 und 39: 26 AU 0,10 0,05 0,00 A B 4 5 6 7 8
  • Seite 40 und 41: 28 durch diesen Effekt ein positive
  • Seite 42 und 43: 30 Die Verschiebungen der Emissions
  • Seite 44 und 45: 32 Tabelle 4.5: Migrationszeiten be
  • Seite 46 und 47: 34 H 2N (H 3C) 2N N H O P O - OH O
  • Seite 48 und 49: 36 - O O P O - R' = O OH O R O NH O
  • Seite 50 und 51: 38 5.2.2 Umsetzung von AMP mit Dans
  • Seite 52 und 53:

    40 AU 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 A B

  • Seite 54 und 55:

    42 Je 30 µl der Stammlösungen wur

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    44 Bei einer Konzentration der EDC-

  • Seite 58 und 59:

    46 Ein Volumen von 300 µl an 50 mM

  • Seite 60 und 61:

    48 5.2.6 Validierung der Derivatisi

  • Seite 62 und 63:

    50 Die Peakflächen der Referenz un

  • Seite 64 und 65:

    52 5.2.6.5 Präzision der Migration

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    54 5.2.6.7 Validierungsdaten von Da

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    56 5.3 Verknüpfung von Nucleotiden

  • Seite 70 und 71:

    58 HO COOH O O Isobutylchloroformia

  • Seite 72 und 73:

    60 O O N H Boc-Schutzgruppe O O N H

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    62 In einem letzten Schritt wurde d

  • Seite 76 und 77:

    64 5.3.3.2 Ergebnisse Wie sich in d

  • Seite 78 und 79:

    66 RFU EDC - Konzentration 1000 [M]

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    68 Aus der obigen Tabelle ist sehr

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    70 Derivatisierungsreagenz und dess

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    72 RFU 3 2 1 0 A 2 4 6 8 10 12 14 1

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    74 Innendurchmesser) verwendet. Zur

  • Seite 88 und 89:

    76 5.4.2.1 Durchführung Für die A

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    78 RFU 150 100 50 0 A B 2 4 6 8 10

  • Seite 92 und 93:

    80 5.4.4 Bestimmung der Umsetzungsr

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    82 AU 0,006 0,005 0,004 0,003 0,002

  • Seite 96 und 97:

    84 5.4.5.1.2 Ergebnisse Das Verhäl

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    86 5.4.6.3 Linearität und Wiederfi

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    88 5.4.6.5 Valdierungsdaten der Bes

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    90 Die Umsetzung von UDP mit Verbin

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    92 5.4.7 Messung an Tagen mit Tempe

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    94 Die Migrationszeit dieser Substa

  • Seite 108 und 109:

    96 AU 0,004 0,002 0,000 3,0 3,5 4,0

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    98 Peakfläche (%) 15 10 5 ATP 0 0

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    100 Peakfläche [%] 7.5 5.0 2.5 UDP

  • Seite 114 und 115:

    102 Die Validierung der Bestimmung

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    104 Die Validierungsdaten der Deriv

  • Seite 118 und 119:

    106 6 P2-Rezeptoren Extrazelluläre

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    108 Die P2Y2-, P2Y4- und P2Y6-Rezep

  • Seite 122 und 123:

    110 Rezeptor Therapeutisches Potent

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    112 6.3 Variation der Phosphatkette

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    114 N NH 2 N HN N N O O N O OH OH O

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    116 7 Synthese von Nucleotid-Deriva

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    118 7.1.2 Umsetzung von ATP Durch d

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    120 N H N H O O P P P O O O- O- O-

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    122 O O P O Cl N H O P O - O N H O

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    124 O O O O O O O O O O O O O O O N

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    126 N H O O P P P O O O- O- O- Stru

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    128 H 3C H 3C N R = N H O * n n = 3

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    130 AU 0,020 0,015 0,010 0,005 0,00

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    132 H 3C H 3C _ N N H 3C H 3C - O O

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    134 AU AU AU 0,100 0,075 0,050 0,02

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    136 O O N H -O O P O 17 O P O O P O

  • Seite 150 und 151:

    138 Hydrolyse wurde bei pH-Werten u

  • Seite 152 und 153:

    140 - O O P O P O - O - - O O O O P

  • Seite 154 und 155:

    142 bei der für die Synthese der P

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    144 7.2.1 Aufreinigung von Adenosin

  • Seite 158 und 159:

    146 Die Nucleobase Uracil zeigte im

  • Seite 160 und 161:

    148 E H F G I Q+N J CH 2-Triethylam

  • Seite 162 und 163:

    150 Tabelle 7.7: Signalverschiebung

  • Seite 164 und 165:

    152 C N H O P O P O P O- O- O- C B

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    154 8 Zusammenfassung und Ausblick

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    156 Ein Schwerpunkt dieser Arbeit b

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    158 Ausgehend von ATP oder UTP konn

  • Seite 172 und 173:

    160 9 Experimenteller Teil 9.1 Allg

  • Seite 174 und 175:

    162 Bedingungen der Ionenaustauschc

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    164 Methode E Elutionsmittel: Ammon

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    166 eingesetzt. Die Anregungswellen

  • Seite 180 und 181:

    168 9.2 Synthesen 9.2.1 Darstellung

  • Seite 182 und 183:

    170 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ

  • Seite 184 und 185:

    172 1 H-NMR (500 MHz, D2O) δ 2.82

  • Seite 186 und 187:

    174 Hydroxybenzotriazol wurden in e

  • Seite 188 und 189:

    176 LC/ESI-MS: [M+H] + : 472.4 Abbi

  • Seite 190 und 191:

    178 Ausbeute: 18%, 26,5 mg Aussehen

  • Seite 192 und 193:

    180 1 H-NMR (500 MHz, D2O), δ 1.26

  • Seite 194 und 195:

    182 Reinheit CE: 99% AU 0,0100 0,00

  • Seite 196 und 197:

    184 [M-H] - : 677.0 Abbildung 9.17:

  • Seite 198 und 199:

    186 Glu); 67.99 (C-5’); 73.20 (C-

  • Seite 200 und 201:

    188 9.2.4.5 Darstellung von α-((2R

  • Seite 202 und 203:

    190 LC/ESI-MS: [M+H] + : 693.3 [M-H

  • Seite 204 und 205:

    192 9.2.4.7 Darstellung von α-((2R

  • Seite 206 und 207:

    194 Struktur: O O O P Ausbeute: 30%

  • Seite 208 und 209:

    196 Ausbeute: 30%, 44,4 mg Aussehen

  • Seite 210 und 211:

    198 Ausbeute: 30%, 35 mg Aussehen:

  • Seite 212 und 213:

    200 Adenin); 138.01 (C-8, Adenin);

  • Seite 214 und 215:

    202 Struktur: N H Ausbeute: 36%, 48

  • Seite 216 und 217:

    204 Leicht löslich in: Wasser Schw

  • Seite 218 und 219:

    206 Aussehen: Farbloses Lyophilisat

  • Seite 220 und 221:

    208 Reinheit CE: 93% AU 0,020 0,015

  • Seite 222 und 223:

    210 Reinheit CE: 98% AU 0,006 0,004

  • Seite 224 und 225:

    212 13 C-NMR (125 MHz, D2O), δ 11.

  • Seite 226 und 227:

    214 Reinheit CE: 97% AU 0,020 0,015

  • Seite 228 und 229:

    216 13 C-NMR (125 MHz, D2O), δ 11.

  • Seite 230 und 231:

    218 Ausbeute: 30%, 41 mg Aussehen:

  • Seite 232 und 233:

    220 Aufreinigung: Ionenaustauschchr

  • Seite 234 und 235:

    222 5.99 (m, 2 x 1H, 3 J = 2.85 Hz

  • Seite 236 und 237:

    224 Struktur: O O O O N H Ausbeute:

  • Seite 238 und 239:

    226 Struktur: O O O O N H O P Ausbe

  • Seite 240 und 241:

    228 Reinheit CE: 98% AU 0,015 0,010

  • Seite 242 und 243:

    230 9.2.4.24 Darstellung von α-((2

  • Seite 244 und 245:

    232 13 C-NMR (125 MHz, D2O) δ 11.1

  • Seite 246 und 247:

    234 Reinheit CE: 96% AU 0,02 0,01 0

  • Seite 248 und 249:

    236 LC/ESI-MS: [M+H] + : 670.0 [M-H

  • Seite 250 und 251:

    238 Reinheit CE: 97% AU 0,015 0,010

  • Seite 252 und 253:

    240 1 H-NMR (500 MHz, D2O) δ 1.3 (

  • Seite 254 und 255:

    242 Struktur: O O P O N H Ausbeute:

  • Seite 256 und 257:

    244 9.2.4.29 Darstellung von α-((2

  • Seite 258 und 259:

    246 Reinheit HPLC: 100% Abbildung 9

  • Seite 260 und 261:

    248 Benzylphosphonat); 124.69 (C-4,

  • Seite 262 und 263:

    250 Aussehen: Farbloses Lyophilisat

  • Seite 264 und 265:

    252 [M-H] - : 557,8 Abbildung 9.76:

  • Seite 266 und 267:

    254 13 C-NMR (125 MHz, D2O) δ 11.1

  • Seite 268 und 269:

    256 13 C-NMR (125 MHz, D2O) δ 11.1

  • Seite 270 und 271:

    258 Reinheit CE: 99% AU 0,0100 0,00

  • Seite 272 und 273:

    260 1 H-NMR (500 MHz, D2O) δ 1.27

  • Seite 274 und 275:

    262 Reinheit HPLC: 99% Abbildung 9.

  • Seite 276 und 277:

    264 Struktur: - O O P O P O O O O-

  • Seite 278 und 279:

    266 10 Anhang 10.1 Abkürzungsverze

  • Seite 280 und 281:

    268 10.2 Literaturverzeichnis 1. Ti

  • Seite 282 und 283:

    270 52. Cao, H.; McGill, T.; Heagy,

  • Seite 284 und 285:

    272 99. Suarez-Huerta, N.; Pouillon

  • Seite 286 und 287:

    274 143. Erb, L.; Lustig, K. D.; Su

  • Seite 288 und 289:

    276 10.3 Danksagung Allen denjenige

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