Enterisches virenpanel Echtzeit-PCR Kit - Diagenode Diagnostics

DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNGDiagenode DBDG-10-4-L096 Version 1BD 442987 Ausgabedatum: 28.03.2013Enterisches virenpanelEchtzeit-PCR KitGebrauchsanleitungVertrieben durchZUR VERWENDUNG MIT DEM BD MAX TM SYSTEM

DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG1. EINLEITUNG .................................................................................................................................... 32. ALLGEMEINE INFORMATIONEN ...................................................................................................... 42.1 VERWENDUNGSZWECK ....................................................................................................................... 42.2 INFORMATIONEN ZUM KRANKHEITSERREGER ........................................................................................ 42.3 INHALT DES KITS ............................................................................................................................... 43. MATERIAL ....................................................................................................................................... 53.1 BENÖTIGTES MATERIAL (NICHT MITGELIEFERT) ..................................................................................... 53.2 AUSRÜSTUNG UND MATERIAL IN KOMBINATION MIT DIAGENODE ENTERISCHES VIRENPANEL ECHTZEIT-PCRKIT (NICHT MITGELIEFERT) .................................................................................................................. 54. ÜBERPRÜFUNG............................................................................................................................... 55. QUALITÄTSKONTROLLE .................................................................................................................. 66. LAGERUNG DER REAGENZIEN, HANDLING UND STABILITÄT .......................................................... 77. PROBENAHME, LAGERUNG UND TRANSPORT ................................................................................ 77.1 ART DER PROBENAHME ...................................................................................................................... 77.2 PROBENLAGERUNG ............................................................................................................................ 77.3 PROBENTRANSPORT .......................................................................................................................... 78. WARN- UND VORSICHTSHINWEISE ................................................................................................. 89. PROTOKOLL .................................................................................................................................... 99.1 PROBEN- UND KONTROLLVORBEREITUNG ............................................................................................ 99.2 ECHTZEIT-PCR MISCHUNGSVORBEREITUNG ........................................................................................ 99.3 BD MAX TM SYSTEMVERSTÄRKUNG .................................................................................................... 1010. ERGEBNISSE ............................................................................................................................... 1311. ANLEITUNG ZUR PROBLEMLÖSUNG ........................................................................................... 1412. LEISTUNGSBEWERTUNG ............................................................................................................. 1512.1 ANALYTISCHE SENSITIVITÄT ............................................................................................................ 1512.2 PRÄZISION .................................................................................................................................... 1512.3 ANALYTISCHE SPEZIFIZITÄT............................................................................................................. 1612.4 KLINISCHE LEISTUNGSFÄHIGKEIT .................................................................................................... 1713. TESTBESCHRÄNKUNGEN ............................................................................................................ 1814. QUALITÄTSZERTIFIZIERUNG ....................................................................................................... 1815. REFERENZEN .............................................................................................................................. 1916. SYMBOLERKLÄRUNG .................................................................................................................. 2017. KAUFHINWEIS ............................................................................................................................ 21

Page | 3Die Polymerase Kettenreaktion (PCR), auch quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR) genannt, isteine Nukleinsäureamplifikationstechnik, welche verwendet wird, um bestimmte DNA-Sequenzierungenaufzufinden und zu quantifizieren.Diese Quantifizierung kann in absoluter oder relativer Anzahl von Kopien gemessen werden.Diese Echtzeit-PCR-Technologie ermöglicht eine schnelle, genaue und quantitative Messung der Gene,welche von ansteckenden Krankheiten, Krebs oder genetischen Anormalitäten betroffen sind.Diese beeindruckende Technologie wird in Kits der Firma Diagenode für eine genaue Erkennung vonKrankheitserregern genutzt.Eine der markanten Eigenschaften der qPCR Technologie ist, dass die amplifizierte DNA während derVermehrung in der Echtzeit-Reaktion für jeden PCR Zyklus quantifiziert wird, was wiederum weitausgenauere Messungen als mit herkömmlichen Endpunkt-PCR erlaubt. Die Quantifizierung von Signalen,die von fluoriszierenden Farbstoffen abgegeben werden, welche mit der je Zyklus entstehendenDoppelstrang-DANN interkalieren, ermöglichen diese Echtzeitmessungen. Alternativ kann man doppeltmit fluoriszierenden Farbstoffen (z.B. TaqMan ® Sonde) markierte DNA (Oligonukleotide) als Sondenverwenden, welche sich dann mit der komplementären DNA kreuzen, um die Echtzeitmessung währendder qPCR zu ermöglichen. Die dann folgenden fluoriszierenden Signale können mit einem Instrument,wie etwa einem für die qPCR programmierten Thermalzykler, genau beobachtet und gemessen werden.Abbildung 1: Technologie unter Nutzung von dual-labeled HydrolyseprobenAbbildung 2: Spezifische Hybridisierung von Primer und Sonden zum gesuchten GenAbbildung 3: Verlängerung und Freisetzung des Reporterfarbstoff durch Taq-PolymeraseDiagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 – 3.Stock // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgien // Telefon: (+32) 4 364 20 50// E -Mail: info@diagenodediagnostics.com

DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG2.1 VerwendungszweckDas Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR Kit wie es im BD MAX System implementiert ist,ist ein automatisiertes in-vitro Diagnostikprodukt für die qualitative Erkennung der Norovirus(Genogruppen I und II) und Rotavirus Spezies in Stuhlproben von Patienten mit Anzeichen undSymptomen von Gastroenteritis. Die Erkennung von Noroviren- und Rotaviren-Nukleinsäure vonsymptomatischen Patienten hilft bei der Diagnose von vermuteten Margen-Darm-Infektionen. DieserTest ist nicht zur Unterscheidung von Genogruppen von Noroviren bestimmt.2.2 Informationen zum KrankheitserregerRotaviren sind die häufigste Ursache für schwere Durchfallerkrankungen bei Neugeborenen und jungenKindern (1), und zählt zu jenen Viren, die oft als „Magengrippe” bezeichnete Infektionen, die allerdingsnichts mit der Influenza-Grippe zu tun haben, auslösen können. Es ist eine Gattung vondoppelsträngigem RNA-Virus und zählt zur Familie der Reoviridae. Mit einem Alter von 5 Jahren warweltweit bereits fast jedes Kind zumindest einmal mit einem Rotavirus infiziert. (2). Allerdings entwickeltsich mit jeder Infektion eine Immunität wodurch folgende Infektionen weniger stark ausfallen (3), undErwachsene kaum mehr betroffen sind (4). Es gibt 5 Spezies dieses Virus welche mit A,B,C,D und Ebezeichnet werden. Rotavirus A, welcher am häufigsten auftritt, verursacht mehr als 90% allerInfektionen an Menschen.Norovirus ist ein RNA Virus welcher in etwa 90% aller epidemischen nicht-bakteriellen Ausbrüche vonGastroenteritis weltweit verursacht (5), und außerdem für vermutlich 50% aller lebensmittelbedingtenAusbrüche von Gastroenteritis in den USA verantwortlich ist. (6). Norovirus I und II sind die beidenwichtigsten Genogruppen beim Menschen und betreffen Leute aller Altersschichten. Die Viren werdenüber mit Fäkalien verseuchtes Wasser oder Nahrung, von Mensch zu Mensch oder durch Aerosolbildungdes Virus und daraus folgende Kontamination von Gebieten, übertragen.2.3 Inhalt des KitsDas Kit wird mit dem BD MAX TM System verwendet.Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR Kit für 96 PCR Reaktionen (12,5 µL PCR Volumen),eine Box :I. Enteric Viral Panel and internal control RNA double-dye probe & primers (4 Röhrchen):Enterisches Virenpanel mit doppelgefärbten Sonden & Primern mit Noro I (FAM, 520 nm),Noro II (YD, 549 nm), Rota (TR, 603 nm), und RNA Extraktions- und Inhibitionskontrolle mitdoppelt gefärbte Sonden & Primer (Cy5, 662 nm): 65 µL je rotem Röhrchen.II. Enteric Viral Panel positive control (positivkontrolle): 120 µL, grünes Röhrchen.III. Enteric Viral Panel negative control (H2O PCR grade)(Negativkontrolle): 120 µL, himmelblauesRöhrchen.IV. H2O (PCR grade): 500 µL, himmelblaues Röhrchen.V. Optima PLUS Master Mix: 720 µL, weißes RöhrchenVI. RNA virus culture inactivated (interne Kontrolle): 1000 µL, gelbes Röhrchen

Page | 53.1 Benötigtes Material (nicht mitgeliefert)• Phosphate Buffered Saline (PBS)• Mikrozentrifuge• Pipetten (präzise zwischen 1-1000 µL)• Sterile Pipettenspitzen mit Filtern• Puderfreie Handschuhe• Vortex-Mixer• Arbeitsmantel• RNase/DNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 und/oder 2 ml)• RNase/DNase-freies Wasser• Laminar-Flow-Haube• Trockene Sterilisationsbehälter für die Sammlung von Stuhlproben• Stoppuhr oder Timer• Präzisionswaage3.2 Ausrüstung und Material in Kombination mit Diagenode Enterisches VirenpanelEchtzeit-PCR Kit (nicht mitgeliefert)• Echtzeit-PCR Instrument: BD MAX System (Ref: 441916)• BD MAX RNA Extraktions-Kit RNA-3 (Ref : 437522): RNA Extraktionsreagenz (E2-R)RNA Probenvorbereitungsreagenz (SP2-R)DNase Reagenz (D1)RNA vereinheitlichte Reagenzstreifen• BD MAX PCR Kartuschen (Ref : 437519)Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR Kit wurde auf die Einhaltung der unten angegebenenParameter hin überprüft:Gesammelte ProbenPCR PlattformStuhlmassenBD MAX TM SystemDiagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 – 3.Stock // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgien // Telefon: (+32) 4 364 20 50// E -Mail: info@diagenodediagnostics.com

DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG- Anforderungen an die Qualitätskontrolle sind in Übereinstimmung mit örtlichen, Landesund/oderBundesrichtlinien oder Zulassungsbestimmungen und den in Ihrem Laboratoriumüblichen Verfahren zur Qualitätskontrolle zu erfüllen.- Qualitätskontrollverfahren sind dazu bestimmt, Reagenzien- und Test-Performance-Kontrollenzu überwachen.KontrolltypPositivNegativInternZur Überwachung der folgenden Reagenzien und Test-PerformanceElementares Versagen der Reagenzien inklusive Primer und Integrität der SondeReagenz- und/oder UmweltkontaminationVersagen bei Lyse- und ExtraktionsverfahrenPCR-Hemmung bei Einzelproben und Reagenzienversagen oder Prozessfehler• Überprüfen Sie alle Positivkontrollen und die interne Kontrolle bevor Sie Proben mit jedem neuen Kitdurchführen, um die einwandfreie Funktion aller Reagenzien und Kit-Bestandteile sicherzustellen.• Gemäß guter Laborpraxis sollte die interne Kontrolle in jedem Nukleinsäure-Isolationsverfahreninkludiert werden. Die interne Kontrolle sollte als Probe behandelt werden.• Die Positivkontrolle darf niemals durch ein Nukleinsäure-Isolationsverfahren geführt werden.• Inklusion einer Negativkontrolle und zumindest einer Positivkontrolle wird für jeden durchgeführtenVerstärkungs-/Erkennungsdurchlauf empfohlen.• Das Versagen von Kontrollen macht den Durchlauf ungültig und die Ergebnisse sollten nicht gewertetwerden.- Falls die Positivkontrolle nicht innerhalb der spezifizierten Ct-Bandbreite positiv ist, aber dieNegativkontrolle gültig ist, sollte eine Wiederholungsprüfung ausgeführt werden, die mit derOriginalprobe beginnt und aliquote neue Anteile der Positivkontrolle nutzt. Falls dieWiederholungsergebnisse noch immer ungültig sind, sollten die Ergebnisse nicht berichtet undder Test wiederholt werden. Eine neue Probe sollte gesammelt und getestet werden.- Falls die interne kontrolle nicht innerhalb der spezifizierten Ct-Bandbreite positiv ist oder dieNegativkontrolle ungültig ist, sollte eine Wiederholungsprüfung mit Beginn der Originalprobeunter Verwendung einer neuen internen Kontrolle und einer neuen Negativkontrolle durchgeführtwerden. Falls Wiederholungsergebnisse noch immer ungültig sind, sollten die Ergebnisse nichtberichtet werden und eine neue Probe sollte gesammelt und getestet werden (siehe Punkt11.Anleitung zur Problemlösung).

Page | 7Lagern Sie alle Reagenzien (geöffnet oder ungeöffnet) bei ≤ -20°C bis zum Verfallsdatum wienachstehend definiert:Zustand Lagertemperatur StabilitätUngeöffnete Reagenz≤ -20°CVerfallsdatum auf PackungangegebenAchten Sie immer auf das Verfallsdatum auf den Reagenzetiketten.Es wird empfohlen, die Reagenz nicht mehr als 6 Einfrier-/Abtauzyklen auszusetzen um die Zersetzungder Komponenten zu verhindern.Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit wird eingefroren versandt, sollte eingefrorengeliefert werden und sollte nach Erhalt eingefroren bei ≤-20°C gelagert werden. Falls die Inhalte desKits nicht eingefroren sind, kontaktieren Sie bitte Ihren lokalen BD Vertreter.Die Reagenzien vor Licht schützen.VorsichtLagerung des Kit bei Raumtemperatur kann zum Abbau der Komponenten des Kits führen. Dies führt zueiner reduzierten Sensibilität weshalb die Verwendung eines neuen Kit dringendst empfohlen wird.7.1 Art der ProbenahmeDer PCR-Test wird durchgeführt unter Verwendung von flüssigen oder weichen Stuhlproben.Standard Sammelverfahren sind geeignet um rohen Stuhl zu sammeln. Roher Stuhl sollte in ein sterilesund fest schließendes Schraubglas gegeben werden.7.2 ProbenlagerungStuhlproben müssen bei 2 bis 8°C für bis zu 24 Stunden oder gefroren bei -20°C bis -70°C für Lagerunglänger als 24 Stunden aufbewahrt werden.Stuhlproben sollten in sterilem Behälter mit Schraubverschluss gelagert werden.Die Empfindlichkeit des PCR könnte durch wiederholtes Auftauen und Einfrieren der Stuhlprobenreduziert werden; daher vermeiden Sie bitte Einfrier-/Auftauzyklen.7.3 ProbentransportDie Stuhlproben müssen in einem Sterilisationsbehälter transportiert werden.Die Proben müssen gemäß den lokalen und nationalen Vorschriften für den Transport von ätiologischenMitteln verpackt werden.Um den Abbau von Nukleinsäure zu vermeiden empfehlen wir den Versand bei -20°C falls dieTransportzeit mehr als 24 Stunden beträgt.Im Labor können die Proben bei Raumtemperatur transportiert werden.Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 – 3.Stock // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgien // Telefon: (+32) 4 364 20 50// E -Mail: info@diagenodediagnostics.com

Page | 11Channel475/520530/565585/630630/665680/715Gain406060600Threshold150250300150/7. Im « GuardRail », wählen Sie « Default »8. Bei den « Test Details », geben Sie Ihr PCR-Profil ein :New StepCycle 1TypeProfile typeTime (s)1800.0HoldTemp (°C)50.3DetectTypeNew StepCycleProfile typeTime (s)600.0New StepCycle1HoldTemp (°C)95.045DetectTypeProfile type 3-TemperatureTime (s) Temp (°C)30.1 95.030.0 55.030.0 68.0Detect9. Klicken Sie auf das « Spectral Cross Talk » Registerblatt und geben Sie die folgenden Parameterein:ExcitationChannelFalse Receiving Channel475/520 530/565 585/630 630/665 680/715475/520 2.1 0.0 0.0 0.0530/565 1.2 0.0 0.0 0.0585/630 0.0 0.03 2.7 0.0630/665 0.0 0.0 4.9 0.0680/715 0.0 0.0 0.0 4.710. Wählen Sie den « Save Test » Button.Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 – 3.Stock // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgien // Telefon: (+32) 4 364 20 50// E -Mail: info@diagenodediagnostics.com

DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG9.3.2 BD MAX TM System Rack EinstellungenWeitere Informationen hierzu finden Sie in der BD MAX Gebrauchsanweisung.1. Beladen Sie die BD MAX Racks mit der entsprechenden Anzahl an RNA Unitized Reagent Strips(URS).Unter leichtem Anklopfen jedes URS auf eine harte Oberfläche vergewissern Sie sich, dass sich dieFlüssigkeiten am Boden befinden.2. Lassen Sie die RNA Extraktionsreagenzienröhrchen (weiße Folie) und die DNaseReagenzienröhrchen (gelbe Folie) in ihre jeweiligen Positionen in der URS einrasten. (sieheAbbildung 1).3. Pipettieren Sie 12.5 μl des kompletten Master-Mix (vorbereitet in Abschnitt 9.2) in das zumEinrasten vorbestimmte RNA Röhrchen (Position 3) des RNA URS. Vergewissern Sie sich, dass keineLuftbläschen bestehen und, dass sich die Flüssigkeit sich am Boden befindet.4. Pipettieren Sie für die Positivkontrollprobe des URS 1 μl der Positivkontrolle (grünes Röhrchen) indas dafür vorgesehene RNA Röhrchen (Position 3) zusätzlich zum Mastermix.9.3.3 BD MAX TM Instrumenteinstellung1. Wählen Sie die Registerkarte auf dem Bildschirm des BD MAX Systems.2. Wählen Sie In der “Assay” Auswahlliste den Diagenode EPV (falls dieser noch nicht erstellt wurdegehen Sie bitte zum Abschnitt 9.3.1).3. Geben Sie den Barcode des Probenvorbereitungsreagenzienröhrchens für jede entsprechendeProbe/Patienten oder kontrollieren Sie diesen per Barcodescanner oder manuell. Beginnen Sie mitPosition 1 des Rack A.4. Bringen Sie das Probenvorbereitungsreagenzienröhrchen in seine entsprechende Position im BDMAX TM Rack(s).5. Geben Sie die Informationen zur Identifikation der Proben/Patienten in die Arbeitsliste ein, entwederper Barcodescanner oder manuelle Eingabe. Setzen Sie diesen Vorgang fort bis alleProbenvorbereitungsreagenzienröhrchen eingegeben wurden. Vergewissern Sie sich, dass dieProben/Patienten-ID und Probenvorbereitungsreagenzienröhrchen richtig übereinstimmen.

Page | 136. Laden der Rack(s) in das BD MAX System (Rack A befindet sich auf der linken Seite des BD MAXSystem und Rack B auf der rechten Seite).7. Laden Sie die BD MAX TM PCR Kartusche(n).8. Schließen Sie die Tür des BD MAX System.9. Klicken Sie auf “Start Run”1. Klicken Sie im Hauptmenü auf den “Results” Button.2. Doppelklick auf den Durchlauf in der Liste und klicken Sie auf das neue Registerblatt “Run …..”3. Im “Print” Registerblatt, wählen Sie: Result Protocol Details PCR 4. Klicken Sie auf “Create Report” und dann auf den “Print Report” Button.Ergebnisinterpretation mit der BD MAX-System Software 2.7.4 oder 2.7.01. Damit ein Durchlauf gültig ist (optional):a. Es darf keine BD MAX TM Systemausfälle geben.b. Die Negativkontrolle hat einen CT-Wert von -1 für alle Kanäle außer 630/665.c. Die Positivkontrolle hat einen CT-Wert von 30 ± 3.3 für die Kanäle 475/520, 530/565, und 585/630.2. Falls der Durchlauf gültig ist, bewerten Sie die Probenergebnisse wie in der folgenden Grafikbeschrieben:a. Ein CT-Wert von 0 bedeutet, dass kein CT-Wert berechnet wurde und die Probenkurve manuellüberprüft werden muss mit einer Anpassung der Grenzwertlinie um einen neuen CT-Wert zuberechnen.b. Ein CT-Wert von -1 bedeutet, dass keine Verstärkung passiert ist.c. Jeder andere CT-Wert zeigt, dass seine Verstärkung stattgefunden hat. In der nachfolgendenTabelle finden Sie mehr Informationen zur Ergebnisinterpretation.CT 475/520Norovirus ICT 530/565Norovirus IICT 585/630RotavirusCT 630/665interne KontrolleErgebnisinterpretation-1 -1 -1 ≤ 36 Norovirus I/II und Rotavirus-RNAnicht erkannt.ANY -1 -1 ANY Norovirus I/II-RNA wurden erkannt.Rotavirus-RNA wurde nicht erkannt.-1 ANY -1 ANYNorovirus I/II-RNA wurden erkannt.Rotavirus-RNA wurde nicht erkannt.-1 -1 ANY ANYRotavirus-RNA wurde erkannt.Norovirus I/II-RNA wurden nichterkannt.ANY ANY -1 ANYANY -1 ANY ANYNorovirus I/II –RNA wurden erkannt.Rotavirus-RNA nicht erkannt.Norovirus I/II- und Rotavirus-RNAwurden erkannt.Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 – 3.Stock // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgien // Telefon: (+32) 4 364 20 50// E -Mail: info@diagenodediagnostics.com

DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG-1 ANY ANY ANYANY ANY ANY ANY-1 -1 -1Norovirus I/II- und Rotavirus-RNAwurden erkannt.Norovirus I/II- und Rotavirus-RNAwurden erkannt.Hemmende Probe. **Für hemmende Proben: Wiederholen Sie den Test mit den ursprünglichen Proben, die Sie zwischen 2-8°C gelagert haben indem Sie ein neues Probenvorbereitungsreagenzienröhrchen mit verdünnten (mitPBS) oder unverdünnten Proben vorbereiten. Alternativ können Sie eine neuentnommene Probe testen.> 36oder -1Aus diesem Test kann keineDiagnose abgeleitet werden.Nähere Informationen entnehmen Sie bitte dem Teil zur “Problemlösung” im BD MAX TM SystemBenutzerhandbuch.Beschreibung Mögliche Ursachen KorrekturmaßnahmenPCR wird durch exogeneoder endogeneProbentest wiederholen.Substanzen gehemmtZiel- und interne Kontrolle verstärkensich nicht.Das Ziel verstärkt sich, aber nicht dieinterne Kontrolle.Spikes treten in allenVerstärkungskurven gleichzeitig auf.Sehr geringe Fluoreszenz in allenProben, auch der internen KontrolleLiquid-HandlingProblemeDas Ziel hat die interneKontrolle um dieRessourcen gebrachtwährend der Reaktion.SpannungsschwankungenPrimer oderSondenverfallProblem mit demInstrumentÜberprüfen Sie die URS undMikrofluidik-Kartusche umfestzustellen, wo die Liquid-Handling Probleme aufgetretensind und wiederholen Sie dieProbe. Falls das Problemweiter besteht kontaktieren SieIhren lokalen BD-Vertreter.Verifizieren Sie, dass die Probeeine Frühversorgung hat.Überprüfen Sie, dass dasSystem mit dem URSverbunden ist.Prüfen Sie das Verfallsdatumdes Kits und ob das das Kitkorrekt gelagert wurde.Näheres entnehmen Sie bittedem BD MAXBenutzerhandbuch.Bei weiteren Fragen zu Problemlösung und Problembehebung kontaktieren Sie bitte Ihren lokalenBD Vertreter oder den Diagenode-Kundenservice.

Page | 1512.1 Analytische SensitivitätDie analytische Nachweisgrenze unter Berücksichtigung des Reinigungsvorgangs (LOD) wurde fürNorovirus I und II in der Stuhl-Matrix bewertet. Die analytische Nachweisgrenze unter Berücksichtigungdes Reinigungsvorgangs wird unter Verwendung von quantifizierten inaktiven Norovirus I und IIKrankheitserregern bewertet. Zum Zeitpunkt der Durchführung des analytischen Empfindlichkeitstestwaren keine Genomstandards für die Rotaviren verfügbar. Daher wurde der LOD für die Rotaviren mitdirekt in die PCR-Master-Mix-Lösung hinzugefügte Plasmid-DNA durchgeführt. Die Anzahl derKopien/Reaktion wurde dann in theoretische Kopien/ml der Probe umgewandelt bei Annahme einerExtraktionseffizienz von 100%.Um die analytische Sensitivität unter Berücksichtigung des Reinigungsvorgangs des DiagenodeEnterisches Virenpanel Echteit-PCR-Kit für die Erkennung von Norovirus (I/II) in den Stuhlproben zuermitteln, wurden Verdünnungsproben in Pools von negativen Stuhlproben durchgeführt.Um die analytische Sensitivität des Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit für dieErkennung von Rotavirus zu ermitteln, wurden Verdünnungsproben eines bestimmten Plasmid, welcherdie Rotavirus-Zielsequenz beinhaltet, direkt in die PCR-Master-Mix-Lösung vermischt.Proben wurden auf dem BD MAX TM –Instrument in Kombination mit dem Diagenode EnterischesVirenpanel Echtzeit-PCR-Kit analysiert. Für Rotavirus wurde der Extraktionsschritt ausgelassen. DasTesten wurde an verschiedenen Tagen mit 24 Replikaten durchgeführt. Die Ergebnisse wurden durcheine Probit-Analyse bestimmt. Analytische Sensitivität (LOD) definiert als die niedrigste Konzentrationbei der ≥ 95% der Replikate positive getestet werden sind der unteren Tabelle zu entnehmen:LOD 95%Kopien/PCRKopien/mLNorovirus I NA 5 151 (312 to 10 000)*Norovirus II NA 587Rotavirus 30 397* Die Sensitivität von Norovirus I ist stark durch die Stuhlprobe beeinflusst.In der vorliegenden Sensitivitätsstudie variierte die Bestimmungsgrenze(LOD) von 312 bis 10 000 Kopien/mL je welches Pool für den Stuhl verwendetwurde12.2 PräzisionDie Präzisionswerte des Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit wurden mittels des BDMAX TM- Instrument gesammelt und ermöglichen die Bestimmung der Variabilität innerhalb derDurchläufe (Variabilität von mehreren Probenergebnissen der selben Konzentration innerhalb einesExperiments) und der Variabilität zwischen der Durchläufe (Variabilität von mehreren Ergebnissen desdurchgeführten Vorgang mittels vier an verschiedenen Tagen gestarteter Durchläufe) von Norovirus I/IIand Rotavirus. Die gesammelten Daten wurden zur Bestimmung der Standardabweichung und demVariationskoeffizienten für die erkannten Erreger verwendet.Präzisionswerte für Norovirus I und II wurden mit Verwendung der Stuhlmatrix unter Hinzugabe von denentsprechenden inaktiven Krankheitserregern bei hoher und niedriger (nahe den entsprechenden LODs)Konzentration der Krankheitserreger bestimmt. Kein quantifizierter Genomstandard für Rotavirus warzum Zeitpunkt der Durchführung der Präzisionstests verfügbar. Daher wurden Präzisionswerte fürRotavirus mittels direkt in den Master-Mix hinzugefügter Plasmid-DNA bei hoher und niedriger (naheden entsprechenden LODs) Konzentration des Rotavirus gesammelt.Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 – 3.Stock // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgien // Telefon: (+32) 4 364 20 50// E -Mail: info@diagenodediagnostics.com

DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNGDie Tests wurden durch verschiedene Mitarbeiter an verschiedenen Tagen durchgeführt. DiePräzisionswerte wurden auf Basis von Ct-Werten der Amplifikationskurven wie folgt berechnet: Intra-Assay Variation = mittlerer Variationskoeffizient (CV) jedes Durchlaufs; Inter-Assay Variation =Variationskoeffizient (CV) des mittleren Ct-Wertes jedes einzelnen Durchlaufs. Die Ergebnisse werden inder nachfolgenden Tabelle dargestellt.Test Matrix KeimkonzentrationVariationskoeffizienzMittlerer Standardabweichung(%) 2Ct-WertIntra-Assay Noro IStuhl 312 k/mL 34.6 1.26 3.54Stuhl 10 000 k/mL 32.5 0.53 0.85Inter-Assay Noro IStuhl 312 k/mL 34.6 1.25 3.62Stuhl 10 000 k/mL 32.5 2.35 0.67Intra-Assay Noro IIStuhl 2500 k/mL 30.6 0.45 1.46Stuhl 625 k/mL 31.5 0.35 1.12Inter-Assay Noro IIStuhl 2500 k/mL 30.6 0.55 1.81Stuhl 625 k/mL 31.5 0.43 1.38Intra-Assay RotaNA 532 k/mL 33.3 0.50 1.51NA 2128 k/mL 31.8 0.25 0.78Inter-Assay RotaNA 532 k/mL 33.3 0.50 1.32NA 2128 k/mL 31.8 0.31 0.971Werte entsprechen der mittleren Standardabweichung jedes einzelnen Durchlaufs nach intra-AssayVariation und der Standardabweichung des mittleren Ct-Wertes jedes einzelnen Durchlaufs für dieinter-Assay Variation2Werte entsprechen dem mittleren Variationskoeffizienten jedes einzelnen Durchlaufs nach intra-AssayVariation und dem Variationskoeffizient des mittleren Ct-Wertes jedes einzelnen Durchlaufes für dieinter-Assay Variation12.3 Analytische SpezifizitätDie Spezifizität des Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit wird zunächst und vor allemdurch die Auswahl an Primern und Sonden gewährleistet, als auch durch die Auswahl an strengenReaktionsbedingungen. Die Primer und Sonden wurden auf mögliche Homologien zu allen in Genbankenveröffentlichen Sequenzen durch Sequenzvergleichsanalyse überprüft .Um die experimentelle Spezifizität des Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit zubestimmen, wurden die in der folgenden Tabelle aufgezählten Erreger auf Kreuzreaktivität getestet.Keiner dieser getesteten Keime war reaktiv.ErregerBacillus cereusCampylobacter jejuniClostridium difficileClostridium perfringensCryptosporidium hominisCryptosporidium parvumEntamoeba disparEntamoeba histolyticaEnterocytozoon bieneusiEnterovirus 71Giardia intestinalisHumanes Coxsavirus B4

Page | 17Humanes Echovirus 13Parechovirus 1Salmonella entericaShigella flexneriStaphylococcus aureusYersinia enterocolitica12.4 Klinische LeistungsfähigkeitDie Leistungsmerkmale des Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit wurden während einerretrospektiven Studie in einem Referenzlabor im Vergleich zu einer validierten PCR-Referenzmethodegetestet.Ingesamt wurden 225 Proben (100 Negativproben, 25 Norovirus I Positivproben, 50 Norovirus-IIPositivproben und 50 Rotavirus Positivproben) retrospektive mit dem Diagenode Enterisches VirenpanelEchtzeit-PCR-Kit auf dem BD MAX TM -System getestet. Die Proben bestanden aus 100 mg Stuhlausgebreitet in 0.4 mL phosphat-gebufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 2% Polyvinylpolypyrolidone fürdie Referenzmethode und in 1mL phosphat-gebufferter Kochsalzlösung (PBS) für das DiagenodeEnterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit. 200 µL Probenüberstand wurden zunächst extrahiert aufMagNa-Pure LC, Roche mittels des TNAI High Performance-Kit (50 µL Eluat) und analysiert mit derMultiplex Echtzeit-PCR-Referenzmethode (9) in Kombination mit dem BioRad CFX96 Echtzeit-System,dem Biorad 5x iScript RT und dem Supermix Qiagen 2x HotStar Mastermix. 500 µL Probenüberstand1/10 vorverdünnt in PBS wurde in die BD MAX TM Kartusche gefüllt. Proben mit invalider Höhe (keine IC-Erkennung und keine zielbestimmte Erkennung) und eine Rotavirus-überladene Probe (die Softwarekonnte keinen Ct-Wert ermitteln, weil die Virusmenge zu hoch war) wurden von der statistischenAnalyse ausgenommen.Diagnostische Sensitivität, diagnostische Spezifizität und Genauigkeit wurden für Rotavirus undNorovirus (I/II) berechnet. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammengefasst:RotavirusEnterisches Virenpanel-Kit auf BD MAX TMPositiv NegativNorovirusEnterisches Virenpanel-Kit auf BD MAX TMPositiv(I/II)Negativ(I/II)ReferenzmethodePositivNegativ49 07 160ReferenzmethodePositiv(I/II)Negativ(I/II)64(21/43)5(4/1)6(0/6)142(N/A)Diagnostische Sensitivität (unterer Grenzwert 95%CI):100% (93%) 91% (83%)Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 – 3.Stock // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgien // Telefon: (+32) 4 364 20 50// E -Mail: info@diagenodediagnostics.com

DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNGDiagnostische Spezifizität (unterer Grenzwert95%CI):96% (92%) 97% (92%)Genauigkeit:Κ = 0.91(nahezu perfekte Abstimmung)Κ = 0.88(nahezu perfekte Abstimmung)• Alle Reagenzien dürfen ausschließlich für in vitro Diagnostik genutzt werden.• Eine strikte Einhaltung der Benutzungsanleitung ist für die Erzielung optimaler Ergebnisse nötig.• Dieser Test wurde für die Verwendung mit flüssigen und weichen Stuhlproben validiert.• Dieser Test wurde für die Verwendung mit dem BD MAX TM -System Version 2.7.0 oder 2.7.4 validiert.• Dieser Test wurde für die Erkennung von Norovirus und Rotavirus validiert und ermöglicht keineUnterscheidung zwischen Norovirus-Genogruppen.• Ein negatives Ergebnis kann eine Infektion nicht ausschließen und sollte nicht als alleinige Grundlagefür Diagnose, Behandlung und weitere Behandlungsentscheidungen herangezogen werden.• Die Erkennung von viralen Nukleinsäuren benötigt eine sachgemäße Entnahme der Proben,Handhabung, Transport, Lagerung und Vorbereitung. Nichtbeachtung von angemessenen Verfahrenbei einem dieser Schritte kann zu falschen Ergebnissen führen. Es besteht die Gefahr von falschnegativen Werten als Ergebnis von unsachgemäß gesammelten, transportierten oder gehandhabtenProben.• Es besteht weiters die Gefahr von falsch negativen Werten aufgrund der Präsenz vonSequenzvarianten in den viral Targets des Verfahrens, Verfahrensfehler, Amplifikationsinhibitoren inProben, oder einer inadäquaten Anzahl von Organismen zur Amplifikation.• Falsch negative Werte können auch durch Verlust von Nukleinsäure entstehen. DieInhibitionskontrolle wurde dem Test hinzugefügt um bei der Identifizierung von Proben zu helfen,welche Inhibitoren zur PCR-Amplifikation beinhalten. Die Kontrolle zeigt nicht an, ob Nukleinsäureaufgrund von unsachgemäßer Sammlung, Transport oder Lagerung der Proben verloren wurde.• Es besteht die Gefahr von falsch positiven Werten als Resultat von Kreuzkontamination durchZielorganismen, deren Nukleinsäure oder amplifiziertes Produkt, oder von nicht-spezifischenSignalen im Verfahren.Diagenode hat das ISO 9001 und das ISO 13485 Zertifikat für Design, Herstellung und Verkauf von IVDGeräten mit Nukleinsäuretechnologie für Infektionskrankheiten erhalten.Das Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR Kit ist auf zuvor festgelegte Spezifikationen hinüberprüft um Produktqualität zu garantieren.

Page | 21Dieses Produkt ist für die Verwendung in der Polymerase Kettenreaktion (PCR) vorgesehen, welchedurch Patente der Roche Molecular Systems, Inc., und F. Hoffmann-La Roche ltd. (Roche) geschütztwird. Durch den Kauf dieses Produktes werden weder direkt noch indirekt Lizenzrechte zur Nutzung desPCR-Verfahrens erworben.Eine Lizenz zur Verwendung des PCR-Prozess für bestimmte Forschung- und Entwicklungstätigkeitengeht mit dem Kauf bestimmter Reagenzien von lizenzierten Lieferanten einher, wenn diese inKombination mit einem genehmigten Thermalzykler verwendet werden bzw. sind diese erhältlich durchApplied Biosystems. Für weitere Informationen zum Erwerb von Lizenzen zur Durchführung des PCR-Prozess wenden Sie sich an den Director of Licensing bei Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Drive,Foster City, California 94404 or at Roche Molecular Systems, Inc, 1145 Atlantic Avenue, Alameda,California 94501.Das BD MAX TM System ist ein Warenzeichen der Becton, Dickinson and Company.Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 – 3.Stock // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgien // Telefon: (+32) 4 364 20 50// E -Mail: info@diagenodediagnostics.com

DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNGMA-Ent-BD-DE-V1-28_03_13Diagenode s.a.Avenue de l’hôpital, 1 • CHU - Tour GIGA - B34 - 3.Stock • 4000 Liège (Sart Tilman)• BelgienTelefon: +32 4 364 20 50 • Fax: +32 4 364 20 51 • info@diagenodediagnostics.com

Page | 23Diagenode saCHU, Tour GIGA B34, 3. StockAvenue de l’hôpital, 14000 Liège (Sart Tilman)BELGIENTelefon. +32 4 364 20 50info@diagenodediagnostics.comwww.diagenodediagnostics.comDiagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 – 3.Stock // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgien // Telefon: (+32) 4 364 20 50// E -Mail: info@diagenodediagnostics.com