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Molekulare KlonierungPraktikum2013


PraktikumsaufgabeLigation<strong>1.</strong> Zusammensetzung des Ligationsreaktions-ansatzes :1 l Vektor DNA1 l Insert DNA2 l 10X Ligase Puffer15 l destillertes Wasser1 l Ligase2. Mischen und Zentrifugieren (1-2 sec).3. Inkubation bei 10°C für 1,5 Stunden (Kühlschrank).MaterialenEcoRI verdaute pUC19 PlasmidTubulin Genfragment mit EcoRI-klebrigen Enden10x Ligase Puffer: 660mM Tris-HCI pH 7.5, 5mM MgCl 2 , 10mM DTT, 1mM ATP,destilliertes WasserT4 DNA-Ligase (0.2 Unit/µl)


- die einzelnenOkazaki-Fragmentedes verzögertenStranges werdendurch Phosphodiesterbindungenmiteinanderverbunden- diese Reaktion istdurch das EnzymLigase katalysiertLIGASE


DNA KLONIERUNG: LIGATION- DNA-Ligase: ein Enzym, das DNA-Moleküle zwischen einem 5’-Phosphat-Ende und einem 3’-OH-Endemiteinander verbinden kann- DNAs mit komplementäreneinzelsträngigen Enden könnenBasenpaarung eingehen- die Enden werden als kohäsiv oderklebrig bezeichnet, über sie könnenDNAs durch die DNA-Ligase festverbunden werden- die DNA-Ligase katalysiert dieBildung neuer Phosphodiesterbrücken- die Ligierung wird bei 5 bis 15ºCdurchgeführt. Bei dieser relativ tiefenTemperatur ist gewährleistet, dass diebeiden komplementären EndenBasenpaare ausbilden und das Enzym(Ligase) noch arbeitet.


Kompetente Zellen- die meisten Bakterien (auch E.coli) nehmen DNA unternormalen Bedingungen nur inbegrenztem Umfang auf- um diese Bakterien wirksamzu transformieren, muss mandie Zellen chemisch und/oderphysikalisch behandeln- so wird ihre Fähigkeitverstärkt, DNA aufzunehmen- Zellen, die eine solcheBehandlung durchlaufen haben,bezeichnet man als kompetenteZellen


PraktikumsaufgabeMaterialen:Escherichia coli Zellen in logaritmischer WachstumphaseLB Platten die 100 µg/ml Ampicillin enthalten0,1M MgCl 2 , 0,1M CaCl 2 ,2,5% IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)2,5% X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)42°C WasserbadthermostatTransformation:6. Geben Sie 10 µl von dem Ligationsansatz zu den kompetentenZellen. Lassen Sie das Röhrchen auf Eis für weitere 30 min. Währenddieser Zeit verteilen Sie 40 µl IPTG und 40 µl X-gal an der Oberflächevon festem ampicillinhaltigen Medium in einer Petrischale.7. Inkubieren Sie die Zellen für 1,5 min bei 42°C (in Wasserbad).8. Inkubieren Sie die Zellen für 2 min auf Eis.9. Geben Sie 300 µl SOB Medium zu den Zellen und plattieren sie dieZellsuspension mithilfe einer Trigalsky-Spatel aus auf die Oberflächevon festem Medium (mit 40l IPTG und 40l X-gal) in der Petrischale.10. Inkubieren sie die Platten über Nacht bei 37ºC.


Vektorkarte des pUC18/19 Plasmids


LacZ Gen- X-Gal chromogenes SubstratDNAPreplacI C E O lacZ lacY lacATDNARepressor CAP-Stelle pol-Bindestelle Operator StrukturgeneTerminatorIPTGindoxylGalactoseX-Gal


LacZ Gen- X-Gal chromogenes SubstratDNA PreplacI C E O lacZ lacY lacATDNARepressor CAP site pol binding site Operator Strukturgene Terminatorpol-galpermeasetransacetylase


lacZ Gen beim Klonen10DNAlacZDNARepressor CAP-Stelle pol-Bindestelle Operator Strukturgene TerminatorlacZ -Fragmentfremde DNAlacZ lacZ


DNA KLONIERUNG: TRANSFORMATIONGen von InteresseRekombinantPlasmidlacZVerdauungLigationTransformationAmpicillinresistenzgenVerteilung derBakterien an derOberfläche vonfestem Medium,das Ampicillin,IPTG und X-GalenthältIsolierung derweißen KolonienNachtsüberWachsenlassenIsolierung derPlasmid DNAWeiße Kolonien: keine X-galAbbau, rekombinantes PlasmidPlasmid mit dem lacZ Gen


RESTRIKTIONSKARTIERUNGUnabhängige undParallelverdauung mitzwei oder mehrerenRestriktionsendonukleasenwirdgemacht um die Positionder Schnittstellen zubestimmen, eineRestriktionskartezusammenzustellenRE1RE2 RE1+RE2


Restriktionskartierung 2.Die Abbildung zeigt die Restriktionskarte von einem DNA-Abschnitt, dieSchnittstellen von 3 Restriktionsendonukleasen sind markiert: = EcoRI = HindIII = BamHIZeichnen Sie die Bandenmuster der Gelelektrophorese(i) Im Fall einer separaten Verdauung mit den 3 Restriktionsenzymen(ii) Im Fall einer Parallelverdauung mit 2 aus den 3 Enzymen in allenmöglichen Kombinationen(iii) Im Fall einer Parallelverdauung mit allen 3 Enzymen1,23,851,619,4 2,224,2


Hausaufgabe:BeispielRestriktionskartierungDas pRIT450 Plasmid hat eine Länge von 7,0 kb und hat je eine PstI,EcoRI, und BamHI Restriktionssstelle. Durch Verdauung mit PstI wird indas Plasmid ein 4,0 kb Fragment inseriert. Definieren sie die Karte desentstandenen rekombinanten Plasmids aus den folgenden Daten!PstI 7.0 4.0EcoRI 6.0 5.0BamHI 8.9 2.1PstI + EcoRI, 4.3 3.3 2.7 0.7PstI + BamHI 6.1 2.8 <strong>1.</strong>2 0.9EcoRI + BamHI 5.0 2.1 2.1 <strong>1.</strong>8

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